Abstract

Η απόζευξη πρωτεΐνη-2 (UCP2) είναι γνωστό ότι καταστέλλει μιτοχονδριακό αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή και απασχολείται από τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο για την άμβλυνση οξειδωτικό στρες. Χρησιμοποιώντας τα ευαίσθητα σε φάρμακο κύτταρα HL-60 και του φαρμάκου ανθεκτική υπογραμμή MX2 ως συστήματα μοντέλα, δείχνουμε ότι genipin, ένας αναστολέας UCP2, ευαισθητοποιεί κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Αυξημένη θάνατος ΜΧ2 κύτταρο παρατηρήθηκε κατά τη συν-θεραπεία με genipin και διάφορες δόσεις μεναδιόνης, δοξορουβικίνη, επιρουβικίνη και. DCFH-DA φθορισμομετρία αποκάλυψε ότι η αύξηση του ΜΧ2 κυτταρικό θάνατο συνοδεύεται από ενισχυμένη κυτταρικά επίπεδα ROS. Η επαγόμενη από φάρμακα αύξηση του ROS συνδέθηκε με genipin μεσολάβηση αναστολή της μιτοχονδριακής διαρροή πρωτονίων. Μέλος 4 και ακουμπά κυτταρική ρυθμοί αναπνοής ήταν υψηλότερα στα κύτταρα ΜΧ2 σε σύγκριση με τα κύτταρα HL-60, και η αυξημένη αναπνοή εύκολα καταστέλλεται από genipin στα κύτταρα ΜΧ2. UCP2 αντιπροσώπευε ένα αξιοσημείωτο 37% της ηρεμίας κυτταρική κατανάλωση οξυγόνου που δείχνει ότι τα κύτταρα MX2 είναι λειτουργικά εξαρτώνται από αυτή την πρωτεΐνη. Μεγαλύτερες ποσότητες UCP2 πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στην ΜΧ2

έναντι

τα HL-60 μιτοχόνδρια. Οι παρατηρούμενες επιδράσεις του genipin ήταν απούσες στα κύτταρα HL-60 που δείχνουν προς την εκλεκτικότητα αυτού του φυσικού προϊόντος για κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο. Η εξειδίκευση των genipin για UCP2 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα CHO που εκφράζουν σταθερά UCP2 στην οποία genipin προκάλεσε μια μείωση ~ 22% στην κρατική 4 αναπνοή. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν απούσα στο κενό φορέα κύτταρα CHO που εκφράζουν καμία UCP2. Έτσι, η χημική αναστολή της UCP2 με genipin ευαισθητοποιεί πολυανθεκτικά καρκινικά κύτταρα να κυτταροτοξικών παραγόντων

Παράθεση:. Mailloux RJ, Adjeitey CN-K, Harper ME (2010) Genipin-Induced Αναστολή της αποσύζευξης Πρωτεΐνη-2 ευαισθητοποιεί ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα να κυτταροτοξικών παραγόντων. PLoS ONE 5 (10): e13289. doi: 10.1371 /journal.pone.0013289

Επιμέλεια: Μαρία Moran, Νοσοκομείο 12 Octubre Μαδρίτη, Ισπανία

Ελήφθη: May 27, 2010? Αποδεκτές: 14η, Σεπτεμβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Mailloux et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν παρέχεται από τις καναδικές Ινστιτούτα Υγείας Έρευνα: Ινστιτούτο Διατροφής, μεταβολισμού και διαβήτη για την Mary-Ellen Harper, και ο Δρ Ράιαν Mailloux είναι ο αποδέκτης μιας μεταδιδακτορικής έρευνας από καρδιά και εγκεφαλικό επεισόδιο Ίδρυμα του Καναδά πρόγραμμα επιχορήγησης, που απονέμεται από το Μοριακής Λειτουργία και απεικόνισης ομάδα του Πανεπιστημίου της Οτάβα Heart Institute. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Εγγενής ή επίκτητη αντοχή στα φάρμακα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες αποτελεί ένα μεγάλο εμπόδιο που αντιμετωπίζει την επιτυχή εξάλειψη των καρκίνων [1]. Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να αποφύγουν την τοξικότητα του φαρμάκου αποδίδεται στην επαγωγή της περίτεχνα μηχανισμών αποτοξίνωσης. Πράγματι, η χρόνια έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν αντιδράσεις προ-επιβίωσης που χαρακτηρίζεται από την αυξημένη ικανότητα να καταστήσει αβλαβή χημειοθεραπευτικά [2], [3]. Παρά το γεγονός ότι τα καρκινικά κύτταρα να επικαλεστεί πολλές στρατηγικές για να αποτρέψουν τις τοξίνες, αυστηρό έλεγχο των επιπέδων ROS αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό προσαρμοστική απάντηση [4]. Διασφάλιση ότι τα επίπεδα ROS παραμένουν στο μη τοξικό εύρος είναι μια συνεχής πρόκληση για καρκινικά κύτταρα Πράγματι, τα καρκινικά κύτταρα συνεχώς εκτίθενται σε υψηλά επίπεδα των ROS παράγονται από μειωμένη αερόβιο μεταβολισμό, χημειοθεραπευτικά, θρεπτικών στέρηση, και να φιλοξενήσει ανοσολογικές αποκρίσεις [5], [ ,,,0],6], [7]. Αν αφεθεί ανεξέλεγκτο αυτών απλή φορείς ηλεκτρονίων μπορεί να βλάψει την απαραίτητη κυτταρικά μακρομόρια που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [8], [9]. Ως εκ τούτου, μια σουίτα των στρατηγικών αντι-οξειδωτικό άμυνας γίνεται επίκληση από τα καρκινικά κύτταρα για να διατηρήσουν τα επίπεδα ROS σε ανεκτά όρια.

Η επαγωγή της UCP2 αποτελεί ένα από τα πολλά προσαρμοστικών μηχανισμών που επικαλείται κύτταρα ανθεκτικά στα φάρμακα για τη διατήρηση της ομοιόστασης ROS [10], [11]. UCP2 ανήκει στην υπεροικογένεια μιτοχονδριακή φορέα ανιόν και κατέχει υψηλή ομολογία με το πρωτότυπο μιτοχονδριακή αποσύνδεσης πρωτεΐνη η οποία είναι εξαιρετικά επιλεκτικά εκφράζεται σε καφέ λίπος, UCP1 [12]. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι UCP2 μπορεί να αποτρέψει το οξειδωτικό στρες με την αύξηση της ροής των πρωτονίων εντός της μήτρας, καθιστώντας έτσι τη ροή ηλεκτρονίων μέσω της αναπνευστικής σύμπλοκα πιο αποτελεσματική [13], [14], [15]. Αυτή η λειτουργία του UCP2 μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε καρκινικά κύτταρα από το μιτοχόνδρια τους είναι μεταβολικά ανώμαλη [16].

ROS είναι ένα εγγενές παραπροϊόν της αερόβιας αναπνοής από το μιτοχονδριακό αναπνευστικής συγκροτήματα Ι και ΙΙΙ μπορούν να συμμετάσχουν στην ηλεκτρονική μονάς μείωση του διατομικού οξυγόνου [17]. Περίπου 0,2-2% του O

2 μεταβολίζεται από τα μιτοχόνδρια μετατρέπεται σε ROS [18]. Ωστόσο, η παραγωγή ROS μπορεί να ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες ότι υπερπροσφορά αναγωγικά ισοδύναμα προς τις αναπνευστικές σύμπλοκα αυξάνοντας έτσι το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (

Δψ

m). Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί σε αρκετές μελέτες που σχηματισμό ROS από την αναπνευστική αλυσίδα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από

Δψ

m [19], [20]. Έτσι, ακόμη και μικρή εκπόλωση του

Δψ

m μπορεί να ενισχύσει τη ροή ηλεκτρονίων μέσα από τα συγκροτήματα και μειώνει την παραγωγή ROS μιτοχονδριακή. UCP2 μπορεί να εκπληρώσει αυτή την αποσύνδεση ρόλο στον καρκίνο κύτταρα? άλλες εκθέσεις περιγράφουν την έκφραση άλλων αποσύνδεση πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης UCP3 και UCP5 σε αδενοκαρκίνωμα και κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [21], [22]. Πράγματι, διάφορες

in vivo

και

in vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι UCP2 είναι ένα

bona fide

αποζεύκτης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και περιορίζει την οξειδωτική βλάβη των ιστών, ενώ απώλεια της λειτουργίας UCP2 αυξάνει την παραγωγή ROS μιτοχονδριακή [13], [23], [24], [25], [26]. Επιπλέον, η αποσύνδεση δραστηριότητα των UCP2 πιστεύεται ότι παρέχει ένα αρνητικό βρόχου ανάδρασης για την οξεία έλεγχο του σχηματισμού ROS από τα μιτοχόνδρια [27]. Έτσι, UCP2 μπορεί να παίζει καθοριστικό ρόλο στην προσαρμοστική απόκριση των καρκινικών κυττάρων να χημειοθεραπευτικά.

Η αναστολή των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε φάρμακα αντιπροσωπεύει μια μέθοδο για την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων να χημειοθεραπευτικά [21], [22]. UCP2 υπερέκφραση έχει περιγραφεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων λευχαιμικών κυττάρων, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου, όγκους του θυρεοειδούς, και ηπατώματα [28], [29], [30], [31]. Πολύ πρόσφατα, UCP2 knock-down έχει επίσης δειχθεί ότι ενισχύει τα τοξικά αποτελέσματα του χημειοθεραπευτικού σισπλατίνης [32]. Πιο περίεργο τρόπο, UCP2 υπερέκφραση έχει προταθεί να είναι μέρος της προσαρμοστικής μηχανισμού που απαιτείται για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε δυσμενή περιβάλλοντα [11]. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση του UCP2 σε HCT116 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα ελαττώνει τις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της χημειοθεραπευτικών, ετοποσίδη και δοξορουβικίνη [33]. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης και με L1210 κύτταρα λευχαιμίας /DDP ανθεκτικά σε φάρμακο που χρησιμοποιούν UCP2 για τη σβέση που προκαλείται από χημειοθεραπεία ROS μέσω ενός μηχανισμού πρωτόνιο διαρροή [10]. Έτσι, UCP2 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό στόχο για την ευαισθητοποίηση των κυττάρων ανθεκτικών στο φάρμακο να χημειοθεραπευτικά. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ελέγξει την υπόθεση ότι genipin, ένα απόσπασμα από το

Gardenia jasminoides

η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει UCP2 και να βελτιώσει την έκκριση ινσουλίνης, μπορεί να εμποδίσει UCP2 στα καρκινικά ανθεκτικοί στα φάρμακα MX2 κύτταρα για να αυξήσει το οξειδωτικό στρες και ευαισθησία σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Genipin έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας του UCP2. Πράγματι, αρκετές μελέτες έχουν δώσει ενδείξεις ότι genipin παρεμποδίζει ειδικά τη μεσολάβηση UCP2 διαρροή πρωτονίων σε παγκρεατικά β-κύτταρα, τα μιτοχόνδρια των νεφρών, και σε εγκεφαλικό ιστό [34], [35]. Αξιοσημείωτη είναι επίσης το γεγονός ότι genipin είναι μια παραδοσιακή κινεζική θεραπεία για τη θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2 [35].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Genipin ευαισθητοποιεί ανθεκτικά στα φάρμακα λευχαιμία κυττάρων σε τοξικότητα ROS

Η εμφάνιση ανθεκτικών στα φάρμακα φαινοτύπων του καρκίνου συνοδεύεται από την απόκτηση του αποτελεσματικού ελέγχου επί της ομοιόστασης ROS. UCP2 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της παραγωγής ROS σε ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα [10], [11]. Αυτή η μιτοχονδριακή εσωτερική πρωτεΐνη μεμβράνης εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο και έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην περιστολή του οξειδωτικού στρες [10], [36]. Έτσι, επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε εάν χημική αναστολή UCP2 θα μπορούσε να καταστήσει ανθεκτικά στα φάρμακα κύτταρα πιο ευαίσθητα σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Τα κύτταρα MX2 ανθεκτικά σε φάρμακο επέδειξαν αυξημένη αντίσταση στην μενακινόνη υπεροξειδίου που παράγουν, menadione (Σχήμα 1Α). Μεναδιόνη παράγει ROS από ταχεία ποδηλασία μεταξύ της κινόνης και ημικινόνες κατάσταση και χρησιμοποιείται συχνά για να μιμηθούν το οξειδωτικό στρες [37]. Πράγματι, HL-60 βιωσιμότητα μειώθηκε σημαντικά κατά την αγωγή με 10 μΜ μεναδιόνη. Περαιτέρω, η έκθεση των κυττάρων HL-60 στα 100 μΜ menadione οδήγησε σε μείωση κατά 90% της βιωσιμότητας των κυττάρων. Ωστόσο, τα κύτταρα που διατηρούνται ΜΧ2 η βιωσιμότητα των κυττάρων με συγκεντρώσεις μεναδιόνης μέχρι 100 μΜ (Σχήμα 1Α). αναλύσεις ανοσοστυπώματος αποκάλυψε ότι τα μιτοχόνδρια από τα κύτταρα ΜΧ2 περιείχαν υψηλότερες ποσότητες πρωτεΐνης UCP2 (Σχήμα 1Β). Σε αντίθεση με άλλες μελέτες, διαπιστώσαμε ότι το αντίσωμα αντι-Ν19 παρέχεται ένα πολύ σαφές σήμα χημικής φωταύγειας [38]. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του UCP2 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας λύμα σπλήνα. Το αντίσωμα αντι-C20 δεν παρέχουν ένα σήμα, ακόμη και με το προϊόν της λύσης σπλήνα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι αναλύσεις ανοσοστυπώματος αποκάλυψαν μόνο ελαφρές αυξήσεις σε άλλα αντι-οξειδωτικά ένζυμα άμυνα στα κύτταρα ΜΧ2 (Σχήμα 1Β). Ως εκ τούτου, αν και οι ανθεκτικές στα φάρμακα κυττάρων MX2 αυξάνονται αρκετές αντι-οξειδωτική άμυνα ένζυμα για να αυξήσει το χειρισμό ROS, UCP2 εμφανίζει τη μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση, σε σύγκριση με το φάρμακο-ευαίσθητες HL-60 ομόλογό. Η εξειδίκευση των genipin για UCP2 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας CHO κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με είτε UCP2 ή κενό φορέα ελέγχου. Ανοσοκηλίδωση επιβεβαίωσε ότι UCP2 εκφράζεται μόνο στα κύτταρα ΟΗΟ-UCP2 (Σχήμα 1 C). Η μονή ζώνη σε κάθε λωρίδα των ανοσοστυπωμάτων ευθυγραμμίζονται επίσης σε ~32 KDa υποδεικνύοντας την ειδικότητα του αντισώματος για UCP2 πρωτεΐνη.

In situ

βιοενεργειακό προσδιορισμοί σε κύτταρα CHO σταθερά επιμολυσμένα με UCP2 ή κενό φορέα χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η εξειδίκευση των genipin. Μέτρηση της βασικής OCR πριν genipin θεραπεία έδειξε ότι οι ΟΗΟ-UCP2 κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό κατανάλωσης οξυγόνου που ήταν περίπου 18% πιο αυξημένα από τα κύτταρα CHO-EV (852.523 ± 45.838 OCR /mg πρωτεΐνης ΟΗΟ-UCP3 vs 721.352 ± 15.050 OCR /mg πρωτεΐνης CHO-EV, ρ & lt? 0,05, η = 3). Ωστόσο, genipin θεραπεία (20 και 50 μΜ) να οδηγήσει σε μια μείωση 12 και 22% του OCR των ΟΗΟ-UCP2 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ΟΗΟ-EV (Σχήμα 1 C). Ως εκ τούτου, τα στοιχεία αυτά δείχνουν σαφώς την ειδική ανασταλτική δράση της genipin για UCP2. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία genipin δεν είχε καμία επίδραση στην OCR των κυττάρων ΟΗΟ-EV που απεικονίζει την ειδικότητα των genipin για UCP2.

Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων HL-60 (γεμάτα διαμάντια) και ΜΧ2 (γεμάτα τετράγωνο) μετά από έκθεση σε menadione. Τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις μεναδιόνης (0-100 μmol /L) ακολουθούμενη από την εκτίμηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων. Η βιωσιμότητα εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής ελέγχου. Kruskall-Wallis με post-hoc τεστ Mann-Whitney, η = 3, p & lt? 0,05. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα για HL-60 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο και # υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα για ΜΧ2 σύγκριση με τον έλεγχο. Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των ενζύμων άμυνα αντι-οξειδωτικό και UCP2. Τα μιτοχόνδρια από ΜΧ2 (Μ) και τα κύτταρα HL-60 (H) απομονώθηκαν και αναλύθηκαν για UCP2, MnSOD, και GPx4. Η κυτοσόλη χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμούς G6PDH. NADP-ICDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης για το κυτοσόλιο και μιτοχονδριακή κλάσματα. Σπλήνα λύμα (100 μg) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος UCP2 φόρτωσης. Το μοριακό βάρος του UCP2 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας δείκτες μοριακής μάζας. Γ)

Επί τόπου

ανάλυση της ειδικότητας του genipin για UCP2. Μετά τον καθορισμό των βασικών συντελεστών της κατανάλωσης οξυγόνου, αξιολογήθηκε ο αντίκτυπος της genipin για OCR σε ΟΗΟ-UCP2 (λευκές ράβδοι) κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε (0-50 μΜ) genipin για 15 λεπτά και στη συνέχεια OCR ελέγχθηκε. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό% του ΟΗΟ-EV OCR.

INSET

: ανάλυση ανοσοστυπώματος των UCP2 σε κύτταρα CHO-UCP2 και ΟΗΟ-EV. SDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Kruskall-Wallis με post-hoc τεστ Mann-Whitney, η = 3, p & lt? 0,05. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο. Δ) Εκτίμηση της τοξικότητας genipin και η ανταπόκριση των κυττάρων HL-60 και ανθεκτικά σε φάρμακο MX2 φάρμακο ευαίσθητη σε ταυτόχρονη θεραπεία με μεναδιόνη και genipin. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε genipin (0-500 μmol /L) παρουσία ή απουσία 20 μΜ μεναδιόνης για 24 ώρες. Μετά την έκθεση, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε. ♦ και ▪ αντιπροσωπεύουν την έκθεση είτε genipin ή genipin + μεναδιόνης. Η βιωσιμότητα εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις εκατό του ελέγχου. Kruskall-Wallis με post-hoc τεστ Mann-Whitney, η = 3, p & lt? 0,05. * Αντιστοιχεί σε στατιστική σημασία όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε τόσο μεναδιόνη και genipin συγκρίθηκαν με τον έλεγχο. # Αντιστοιχεί σε στατιστική σημασία όταν τα κύτταρα genipin εκτεθειμένη συγκρίθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου. Ε) Η θεραπεία με genipin και μεναδιόνη αυξάνει MX2 κυτταρικό θάνατο. κύτταρα ΜΧ2 εκτέθηκαν σε 20 μmol /L μεναδιόνη και genipin (0-500 mmol /L) για 24 ώρες. Η ποσότητα του κυτταρικού θανάτου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΡΙ. 1-way ANOVA με post-hoc τεστ του Tukey, n = 5, ρ & lt? 0.05. * Αντιπροσωπεύει σημασία σε σύγκριση με 0 μΜ.

Η

Είναι σαφές από τα παραπάνω στοιχεία ότι τα κύτταρα MX2 εκφράζουν υψηλά ποσά UCP2 και genipin αναστέλλει ειδικά UCP2. Στη συνέχεια θα αξιολογηθεί εάν genipin θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει τα MX2 κύτταρα σε τοξικότητα μεναδιόνη. Καθώς και τη χρήση της στη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2, genipin έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία γλοιώματος, ηπατώματα, και έχει αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [35], [39], [40], [41]. Ωστόσο, η έλλειψη πληροφοριών δεν υφίσταται για genipin τοξικότητα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι genipin συγκεντρώσεις υψηλότερες από 50 μΜ είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας σε αμφότερες τις HL-60 και MX2 καλλιέργειες (Σχήμα 1 D). Αυτό είναι πιο πιθανό να οφείλεται στις ικανότητες πρωτεϊνικής διασταύρωσης της. Genipin αποτελέσματα εγκάρσιας σύνδεσης στην παραγωγή ενός μπλε χρωστική. Ωστόσο, δεν μπλε χρωστική παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις genipin & lt? 100 μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συγκεντρώσεις κάτω των 50 μΜ δεν είχε σημαντική επίπτωση στην βιωσιμότητα είτε της MX2 ή HL-60 κύτταρα. Το πιο σημαντικό, η έκθεση των κυττάρων ΜΧ2 σε ένα συνδυασμό 20 μΜ μεναδιόνης και genipin (συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 10 μΜ) οδήγησε σε απότομη πτώση της βιωσιμότητας του κυττάρου (Εικόνα 1D). Υπήρξε μια αύξηση της βιωσιμότητας MX2 κατά την έκθεση στο & lt? 100 μΜ genipin σε συνδυασμό με μεναδιόνη όμως υπήρχε ακόμα μια σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο. Η δράση ευαισθητοποίησης της genipin να menadione επιβεβαιώθηκε με χρήση της ανάλυσης ΡΙ. Η έκθεση των κυττάρων ΜΧ2 για 24 ώρες σε 20 μΜ menadione παρουσία 10 ή 20 μΜ genipin οδήγησε σε 2-πλάσια και 8-πλάσια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο, αντίστοιχα (Σχήμα 1 Ε). Σε αντίθεση, οι συγκεντρώσεις του μεναδιόνης ≥50 μΜ απαιτείται για να προκαλέσει το θάνατο ΜΧ2 όταν genipin απουσίαζε (Σχήμα S1). Επιπλέον, η αύξηση του κυτταρικού θανάτου ήταν αρκετές φορές υψηλότερη όταν συμπεριλήφθηκε genipin. πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου μπορεί να συμβεί και στις δύο νεκρωτικό και αποπτωτικά κύτταρα. Έτσι, μετράται αρκετές δείκτες απόπτωσης. Αριθ δραστική κασπάση-3 ανιχνεύθηκε και κυτόχρωμα C ήταν απούσα από το κυτοσόλιο συνεπής με την επαγωγή της νέκρωσης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αν και αυτές οι δύο βιοδείκτες απόπτωση δεν ανιχνεύθηκαν, απαιτείται μια πιο σε βάθος ανάλυση του μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου. Εκτιμήσαμε επίσης την επίδραση των διαφορετικών ποσοτήτων genipin σχετικά με τη μη-καρκινικές C2C12 μυοβλαστών κυτταρική σειρά. C2C12 μυοβλάστες εμφανίζεται μία αύξηση σε κυτταρικό θάνατο όταν θεραπεύτηκαν με ≥50 μΜ genipin (Σχήμα S1). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι genipin δεν προκαλεί σημαντική απώλεια στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεντρώσεις κάτω των 50 μΜ και τις επιπτώσεις των genipin στα κύτταρα MX2 οφείλονται σε αλληλεπιδράσεις του με UCP2. Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, περισσότερο

in vivo

αναλύσεις σχετικά με την τοξικότητα του genipin και τη δυνατότητα εφαρμογής της στην αγωγή του καρκίνου στο κλινικό περιβάλλον απαιτούνται. Έτσι, genipin ευαισθητοποιεί ανθεκτικών στα φάρμακα κυττάρων που εκφράζουν UCP2 σε παράγοντες ROS που παράγουν.

Genipin ευαισθητοποιεί τα κύτταρα MX2 με ανθρακυκλίνη τοξικότητα

Μεναδιόνη έχει αποδειχθεί ότι έχει αντικαρκινική δράση και έχει χρησιμοποιηθεί με μιτομυκίνη C σε δοκιμές φάσης ΙΙ για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του πνεύμονα [42]. Ωστόσο, μεναδιόνη δεν χρησιμοποιείται σήμερα ως ένα χημειοθεραπευτικό του καρκίνου. Έτσι, καθορίζεται αν genipin θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει τα κύτταρα MX2 να χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικά, ειδικά το κινόνης που βασίζεται ανθρακυκλίνες, δοξορουβικίνη και επιρουβικίνη. κύτταρα ΜΧ2 είναι καλά γνωστό ότι είναι ανθεκτικές σε αυτή την κατηγορία χημειοθεραπευτικών [43]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τα κύτταρα ΜΧ2 ήταν πιο ανθεκτικά σε αυξημένες συγκεντρώσεις epirubicin (0,5 μΜ) σε αντίθεση με τα ναρκωτικά ευαίσθητα ομόλογό τους. Ωστόσο, απότομη αυξήσεις σε κυτταρικό θάνατο παρατηρήθηκαν στα κύτταρα MX2 genipin επεξεργασμένα εκτίθενται σε αυξανόμενες ποσότητες epirubicin (Εικόνα 2Α). Περιέργως, genipin και επιρουβικίνη (0,05-0,1 μΜ) συν-θεραπεία αυξημένο κυτταρικό θάνατο στις HL-60 κύτταρα, αλλά αυτή η απόκριση ήταν καταλυθεί σε υψηλότερες δόσεις epirubicin (0,5 μΜ, τα κύτταρα ΜΧ2 εμφανίζεται μια 4 φορές αύξηση ενώ τα κύτταρα HL-60 εμφανίζεται μια αύξηση κατά 2-φορές). κύτταρα ΜΧ2 ήταν επίσης ανθεκτικά στη θεραπεία δοξορουβικίνη (Σχήμα 2Β). Περιέργως, τα κύτταρα HL-60 εμφανίζεται μόνο μια τάση προς αυξημένο κυτταρικό θάνατο, ωστόσο στατιστική σημαντικότητα δεν επετεύχθη (0,05-0,5 μΜ δοξορουβικίνη, μόνο μια αύξηση 20-40%? P & gt? 0,05). Η κύρια παρατήρηση στην Εικόνα 2Β είναι η σημαντική αύξηση του κυτταρικού θανάτου ΜΧ2 κατά την κατεργασία με genipin και δοξορουβικίνη (0,05-0,5 μΜ? ~50-110%? Ρ & lt? 0,05). Η δράση ευαισθητοποίησης της genipin δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα HL-60 που έλαβαν θεραπεία με δοξορουβικίνη το οποίο είναι σύμφωνο με την ανασταλτική δράση του genipin επί UCP2. Χρήση της epirubicin και δοξορουβικίνη συγκεντρώσεις πάνω από 1 μΜ σε συνδυασμό με genipin οδήγησε σε δραστικές αυξήσεις στο κυτταρικό θάνατο των HL-60 και τα κύτταρα ΜΧ2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, genipin αφοπλίζει χημειοθεραπευτική αντοχή σε κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο που υπερεκφράζουν UCP2.

HL-60 και MX2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή και μετά εκτέθηκαν σε είτε epirubicin (0-0,5 μΜ) ή δοξορουβικίνη (0-0,5 μΜ) απουσία ή παρουσία 20 μΜ genipin. Ποσό κυτταρικού θανάτου προσδιορίστηκε με δοκιμασία PI. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό επί τοις εκατό του ελέγχου. Α) ♦ epirubicin μόνο, ▪ επιρουβικίνη + genipin. 1-way ANOVA με δοκιμή post-hoc κατά Tukey, η = 5, * ρ & lt? 0.05. * Αντιστοιχεί σε στατιστική σημασία όταν epirubicin και κύτταρα επεξεργασμένα genipin συγκρίθηκαν με τον έλεγχο. # Αντιστοιχεί σε στατιστική σημασία όταν τα κύτταρα επιρουβικίνη επεξεργασμένα συγκρίθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου. Β) ♦ δοξορουβικίνη μόνο, ▪ δοξορουβικίνη + genipin. 1-way ANOVA με post-hoc τεστ του Tukey, n = 5, ρ & lt? 0.05. * Αντιστοιχεί σε στατιστική σημαντικότητα όταν epirubicin και τα κύτταρα αντιμετωπίζονται genipin συγκρίθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου.

Η

θεραπεία Genipin διαταράσσει την αερόβια αναπνοή σε κύτταρα ανθεκτικά στα φάρμακα

Παρά το γλυκολυτικό φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων, η ενζυματική μηχανήματα που απαιτούνται για την αερόβια αναπνοή παραμένει συχνά άθικτη [44]. Συντήρηση λειτουργικά μιτοχόνδρια είναι ζωτικής σημασίας για το καρκινικό κύτταρο,

π.χ.

, Τα ένζυμα του κύκλου του Krebs παρέχουν αναβολικά πρόδρομοι για ταχέως διαιρούμενα κύτταρα [6]. Η ομάδα μας έχει δείξει στο παρελθόν ότι τα μιτοχόνδρια σε κύτταρα λευχαιμίας ανθεκτικά σε φάρμακο αποσυνδέονται και ότι αυτό σχετίζεται με μειωμένα κυτταρικά επίπεδα ROS [10]. Έτσι, υποτίθεται ότι η δράση ευαισθητοποίησης του genipin οφείλεται στην ικανότητά του να εμποδίζει UCP2 μεσολάβηση αποσύνδεση του

Δψ

m. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, ο βασικός ρυθμός της κατανάλωσης οξυγόνου ήταν υψηλότερος στην ΜΧ2, σε σύγκριση με κύτταρα HL-60 (~54% μεγαλύτερη, ρ & lt? 0,05). Αυτό υποδεικνύει ότι τα μιτοχόνδρια των κυττάρων ΜΧ2 είναι περισσότερο μεταβολικά δραστική από HL-60 μιτοχόνδρια. Θεραπεία της HL-60 και MX2 κυττάρων με ολιγομυκίνη μειωμένη αναπνοή κατά ~ 60% και ~38% αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Αυτό δείχνει ότι ~62% του ηρεμία κυτταρικής O

2 κατανάλωσης στα κύτταρα ΜΧ2 οφείλεται στην αποσύζευξη της αναπνοής (

π.χ.

Μη-ΑΤΡ που παράγουν δραστηριότητες). Sharp αποκλίσεις στο μιτοχονδριακό μεταβολισμό συχνά συνοδεύουν την απόκτηση του επιθετικού καρκίνου φαινοτύπων [6]. Πράγματι, στοχευμένη διάρρηξη του μιτοχονδριακού μεταβολισμού του έχει περιγραφεί ως μια πιθανή θεραπεία του καρκίνου [2]. Προεπεξεργασία με genipin μειωθεί σημαντικά βασική αναπνοή στα κύτταρα ΜΧ2 (Σχήμα 3Α). Αυτές οι επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν στα κύτταρα HL-60. Genipin προκαλούμενη μείωση ~37% στο αναπνευστικό ρυθμό αποκαλύπτοντας ότι UCP2 είναι ποσοτικά σημαντική για τη διατήρηση ενός αποσυνδεθεί μιτοχονδριακό φαινότυπο, ακόμη και υπό κανονικές συνθήκες επώασης. Σε σύγκριση, τα κύτταρα CHO-UCP2 παρουσίασαν πτώση ~ 22% το OCR μετά από θεραπεία με 50 μΜ genipin (Σχήμα 1 C). Η διαφορά μεταξύ των κυττάρων CHO και ΜΧ2 είναι πιθανότατα λόγω των διαφορών στη δόση και τον χρόνο έκθεσης μεταξύ των δύο χωριστών κυτταρικές σειρές. Η παρατήρηση αυτή δείχνει γενικά ότι UCP2 είναι μια σημαντική συμβολή στην ΜΧ2 κυτταρική βιοενεργητική. Επιπλέον, μετά την προσθήκη του genipin να ολιγομυκίνη κατεργασμένα κύτταρα MX2, ο ρυθμός αναπνοής ήταν ταυτόσημη με εκείνη του HL-60 κύτταρα (Σχήμα 3Α). Αυτό δείχνει ότι UCP2 ήταν απόλυτα υπεύθυνη για την αύξηση της αναπνοής των κυττάρων ΜΧ2. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η genipin ειδικώς αναστέλλει UCP2 μεσολάβηση αποσύνδεση [34], [45]. Για παράδειγμα, ο Ζανγκ

et al

φαίνεται ότι διαρροή πρωτονίων δεν επηρεάζεται από genipin στο UCP2

– /- κύτταρα και ιστούς που δεν εκφράζουν UCP2 [35]. Παρατηρήσαμε παρόμοιες τάσεις στα κύτταρα CHO που εκτίθενται σε genipin (Σχήμα 1 C). Ως εκ τούτου, genipin εντελώς αναστέλλει την αυξημένη κυτταρική αναπνοή στα κύτταρα ΜΧ2, ενώ δεν έχει καμία επίδραση επί των HL-60 γονικά κύτταρα.

μετρήσεων Α) Η κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα που εκτίθενται σε 20 μΜ genipin 24 έκθεση h. Μετρήσεις Η κατανάλωση οξυγόνου πραγματοποιήθηκαν μετά από μια 30 λεπτών επώαση σε μέσο αντίδρασης υπό την απουσία (λευκές ράβδοι) ή παρουσία (γκρι ράβδοι) του ολιγομυκίνη. 1-way ANOVA με δοκιμή post-hoc κατά Tukey, η = 6, ** ρ & lt? 0,01. Αντιμετωπίζονται MX2 ή HL-60 κύτταρα μόνο σε σχέση με τις αντίστοιχες του ελέγχου τους μέσες τιμές. Β) Μετρήσεις Η κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα που εκτίθενται σε genipin (20 μΜ) και /ή menadione (20 μΜ) για 24 ώρες. 1-way ANOVA με post-hoc δοκιμασία του Tukey, n = 4, * ρ & lt? 0,05,

Η

UCP2 είναι γνωστό ότι είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της μιτοχονδριακής παραγωγής ROS, μια ιδιότητα που αποδίδεται στα ήπια αποσύνδεση της δραστηριότητα. Σε δύο κομψά μελέτες, Echtay

et al

παρέχονται πειστικές αποδείξεις ότι UCP2 με τη μεσολάβηση αγωγιμότητα πρωτονίων μέγιστα ενεργοποιείται από το οξειδωτικό στρες στα μιτοχόνδρια [27], [46]. Αυτό το είδος της διαρροής «επαγώγιμου» πρωτονίων έχει περιγραφεί ως μια σημαντική εγγύηση για την πρόληψη αυξήσεις των μιτοχονδρίων των εκπομπών ROS. Έτσι, εξετάσαμε αν η θεραπεία ROS θα μπορούσε να αυξήσει διαρροή πρωτονίων στα κύτταρα ΜΧ2. θεραπεία Μεναδιόνη δεν μετέβαλε την κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα ΜΧ2 (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ROS δεν προκάλεσε περαιτέρω αυξήσεις που εξαρτώνται από πρωτόνιο διαρροή αναπνοή. Ωστόσο, στα κύτταρα HL-60, θεραπεία μεναδιόνη μειωθεί σημαντικά η κατανάλωση οξυγόνου, ίσως λόγω της μειωμένης ικανότητας των κυττάρων αυτών για τον έλεγχο των κυτταρικών επιπέδων ROS (Σχήμα 3Β). Μιτοχονδριακό μεταβολισμό (

π.χ.

, Ένζυμα κύκλο του κιτρικού οξέος και των πρωτεϊνών αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων) είναι ένας σημαντικός στόχος για τοξικότητα ROS. Έτσι, η μείωση της κατανάλωσης οξυγόνου που παρατηρείται στα κύτταρα HL-60 που εκτίθενται σε menadione δείχνει αυτά τα κύτταρα έχουν μικρότερη ικανότητα να διατηρούν ανεκτά επίπεδα κυτταρικής ROS παρουσία κυτταροτοξικών παραγόντων. Τα παραπάνω στοιχεία αποδεικνύουν ότι UCP2 αποτρέπει ROS προκαλείται από βλάβες στο μιτοχονδριακό μεταβολισμό. Με άλλα λόγια, η χαμηλή αφθονία των UCP2 στα κύτταρα HL-60 μπορεί να σημαίνει ότι δεν είναι σε θέση να αποτοξινώσει το ROS. Στα κύτταρα MX2, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι UCP2 ήδη μέγιστα ενεργοποιηθεί. Πράγματι, σε δύο ξεχωριστά πειράματα (Σχήμα 3Α και 3Β) genipin μειωθεί κατανάλωση οξυγόνου από ~37% σε κύτταρα κάτω από πρότυπες συνθήκες επώασης. Επιπλέον, nonphosphorylating αναπνοή αντιπροσώπευαν ~62% του O

2 κατανάλωση στα κύτταρα ΜΧ2 και genipin ανέστειλαν πάνω από το μισό αυτής της αναπνοής, με αποτέλεσμα την εξομάλυνση των μη-φωσφορυλίωσης αναπνοή (

δηλαδή

, να HL -60 τιμές). Ως εκ τούτου, UCP2 αντιπροσωπεύει ένα μεγάλο κλάσμα του nonphosphorylating αναπνοής στα κύτταρα ΜΧ2. Έτσι, ο μοναδικός μεταβολικό προφίλ των καρκινικών κυττάρων ανθεκτικών στο φάρμακο φαίνεται να περιλαμβάνουν ενισχυμένη UCP2 μεσολάβηση μιτοχονδριακής αποσύνδεση να αποφευχθούν τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του ναρκωτικά και μιτοχονδριακής μεταδίδονται ROS.

Η θεραπεία με genipin ενισχύει προκαλούμενη από φάρμακο ROS

παραγωγή

Τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι η αναστολή των UCP2 από genipin αποτελέσματα στην επαγωγή του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από φάρμακα σε πολυανθεκτικής κύτταρα ΜΧ2. Επειδή η αναστολή UCP2 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε παράγοντες ROS παραγωγής, τότε να ελεγχθεί αν genipin θεραπεία ενισχυμένο σχηματισμό ROS που προκαλείται από φάρμακα. HL-60 κύτταρα κατεργασμένα με μεναδιόνη μόνο παρήγαγε πολύ περισσότερο από ό, τι ROS ανθεκτικών στα φάρμακα ομόλογό τους (Σχήμα 4Α). Αυτή η παρατήρηση είναι συνεπής με την ενισχυμένη ικανότητα χειρισμού ROS κυττάρων ανθεκτικών στα φάρμακα. Ωστόσο, η συν-επεξεργασία των κυττάρων με MX2 genipin και μεναδιόνη αυξημένα επίπεδα ROS. Πράγματι, η έκθεση των genipin επεξεργασμένα MX2 κυττάρων σε διαφορετικές ποσότητες μεναδιόνης οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα ROS (Σχήμα 4Β). Στα 50 μΜ menadione, υπήρξε μια απότομη αύξηση των επιπέδων ROS στα genipin-εκτεθειμένα κύτταρα MX2. Μόνο μέτριες αυξήσεις στην παραγωγή ROS παρατηρήθηκαν στα κύτταρα HL-60 που έλαβαν θεραπεία με μεναδιόνη και genipin (Σχήμα 4Β). Η θεραπεία με genipin μόνη της σε κύτταρα ΜΧ2 δεν αύξησε τα επίπεδα ROS (Σχήμα 4Β). Έτσι, genipin καθιστά τα κύτταρα MX2 πιο ευαίσθητα στη θεραπεία με ROS παράγοντες που παράγουν παρεμβαίνοντας με διαρροή πρωτονίων.

επίπεδα ROS αξιολογήθηκαν σε άθικτα HL-60 και MX2 κύτταρα χρησιμοποιώντας DCFH-DA. Α) Τα επίπεδα ROS στα κύτταρα που εκτίθενται σε αποκλειστικά menadione (0-50 μΜ) για 24 ώρες. 1-way ANOVA με δοκιμή post-hoc κατά Tukey, η = 5, * ρ & lt? 0.05. Β) Τα επίπεδα ROS στα κύτταρα που εκτίθενται σε 0 ή 20 μΜ genipin και μεναδιόνης (0-50 μΜ) για 24 ώρες. 1-way ANOVA με post-hoc δοκιμασία του Tukey, n = 5, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν με δοξορουβικίνη. Δοξορουβικίνη κλασικά αναφέρεται ως αναστολέας της τοποϊσομεράσης II [47]. Ωστόσο, άλλοι μηχανισμοί της τοξικότητας, όπως η παραγωγή ROS, έχουν προταθεί [48]. Η θεραπεία με ντοξορουμπικίνη μόνο είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στα επίπεδα ROS σε κύτταρα HL-60 (Σχήμα 5Α). Σε αντίθεση, δεν υπάρχουν αυξήσεις στην ROS παρατηρήθηκαν στα κύτταρα ΜΧ2 ακόμη και σε 1 μΜ. Ωστόσο, όταν genipin συμπεριλήφθηκε με την δοξορουβικίνη, αυξήσεις στα επίπεδα ROS παρατηρήθηκαν στα κύτταρα ΜΧ2 (Σχήμα 5Β). Πράγματι, η έκθεση της genipin-φορτωμένο κύτταρα σε συγκεντρώσεις της doxorubicin τόσο χαμηλά όσο 0,1 μΜ οδήγησε σε απότομη αύξηση των επιπέδων ROS. Παρά το γεγονός ότι η δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως ως αντικαρκινικός παράγοντας, ο μηχανισμός δράσης της δεν είναι πλήρως κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα ROS στα κύτταρα MX2 κατόπιν συν-θεραπεία με genipin. Είναι πολύ πιθανό ότι η τοξικότητα ντοξορουμπικίνης στοχεύει τα μιτοχόνδρια. Οι ανθρακυκλίνες είναι κινόνης μόρια, όπως menadione, τα οποία είναι ικανά να καταλύουν την απλή μείωση ηλεκτρόνιο του διατομικού οξυγόνου προς υπεροξειδίου. Υπεροξειδίου, σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις, παρεμποδίζει την ορθή λειτουργία των μιτοχονδρίων. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη η παραγωγή ROS από doxorubicin και μεναδιόνης σε κύτταρα ΜΧ2 απαιτείται genipin θεραπεία. Είναι εξ ολοκλήρου δυνατό ότι οι ανθεκτικές στα φάρμακα κυττάρων αντιμετωπίσουν τις ανασταλτικές επιδράσεις της δοξορουβικίνης και κινόνες διατηρώντας μιτοχόνδρια σε κατάσταση αποζεύξεως περιορίζοντας το σχηματισμό ROS.

επίπεδα ROS αξιολογήθηκαν σε άθικτα HL-60 και MX2 κύτταρα χρησιμοποιώντας DCFH -DA. Α) Τα επίπεδα ROS σε HL-60 κύτταρα και τα κύτταρα που εκτίθενται σε ΜΧ2 δοξορουβικίνη (0-1 μΜ) για 24 ώρες. 1-way ANOVA με post-hoc τεστ Tukey, το η = 5, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01. Β) Τα επίπεδα ROS σε HL-60 κύτταρα και τα κύτταρα που εκτίθενται σε ΜΧ2 20 μΜ genipin και δοξορουβικίνη (0-1 μΜ) για 24 ώρες. 1-way ANOVA με post-hoc δοκιμασία του Tukey, n = 5, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η φυσική genipin προϊόν μπορεί να καταστήσει τον καρκίνο ανθεκτικών στα φάρμακα κύτταρα πιο ευαίσθητα σε παράγοντες ROS παραγωγής. Η κλινική εφαρμογή του genipin ως πιθανός παράγοντας φάρμακο ευαισθητοποιήσεως απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Πράγματι, το φάρμακο-ευαισθητοποιητικές επιδράσεις του genipin εξετάστηκαν εδώ με κοινώς μελετηθεί γραμμές των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, για να παρέχει μεγαλύτερη σαφήνεια σχετικά με το δυνητικό ρόλο της genipin στη θεραπεία του καρκίνου, ολοκληρωμένη

in vivo

αναλύσεις απαιτούνται τώρα (

π.χ. Μελέτες

, ζώων). Ωστόσο, η μελέτη αυτή παρέχει κάποιες σημαντικές προκαταρκτικές πληροφορίες για την πιθανή χρήση των genipin στη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, η επίδραση ευαισθητοποίησης του genipin αποδόθηκε αλληλεπίδρασή της με UCP2, μία πρωτεΐνη εκφράζεται σε αφθονία στα ΜΧ2 μιτοχόνδρια των κυττάρων. Η εξειδίκευση των genipin για UCP2 επιβεβαιώθηκε με κύτταρα CHO που εκφράζουν σταθερά UCP2. HL-60 κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε θεραπεία genipin οποίο πιθανότατα οφείλεται στις χαμηλές ποσότητες UCP2 που εκφράζονται σε αυτά τα κύτταρα. Η ειδική ανασταλτική δράση του genipin επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας CHO κύτταρα είτε εκφράζουν ή που δεν εκφράζουν UCP2. Έτσι, τα ευρήματά μας συνάδουν με μια συγκεκριμένη επίπτωση της genipin για UCP2. UCP2 εκφράζεται σε ένα αριθμό φυσιολογικών σωματικών κυττάρων (σπληνοκύτταρα, παγκρεατικά κύτταρα β, θύμο κύτταρα και διάφορα άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού-τύπου) [26]. Το ποσό που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο υπερβαίνει κατά πολύ τα επίπεδα πρωτεΐνης στα μη καρκινικά κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα σε φάρμακο. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης χαμηλή UCP2 διατηρείται από σφιχτό μεταφραστικό έλεγχο και την ταχεία υποβάθμιση [49]. Περιέργως, γλουταμίνη έχει εμπλακεί στην επαγωγή του mRNA UCP2 μετάφρασης [50] και τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο έχουν ενισχυμένη πρόσληψη γλουταμίνης και του μεταβολισμού, μια διαδικασία που προκαλείται από Myc [51]. Έτσι, είναι πιθανό ότι η εξάρτηση γλουταμίνη παίζει ρόλο στην ενίσχυση της έκφρασης πρωτεΐνης UCP2 σε κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο. Θα ήταν ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν UCP2 μπορεί να επαχθεί με Myc. Σε αυτή τη μελέτη, ο μηχανισμός για την UCP2 μεσολάβηση μείωση ROS πηγάζει από αποσύνδεση της δραστηριότητα.