Αφηρημένο

Η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT) έχει αναδειχθεί ως μια αποτελεσματική θεραπεία για διάφορους συμπαγείς όγκους. Η NRF2 παράγοντας μεταγραφής που είναι γνωστό για την προστασία έναντι του οξειδωτικού στρες και ηλεκτρόφιλο? Ωστόσο, συστατική δραστικότητα του στον καρκίνο του προσδίδει αντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε σηματοδότησης NRF2 ως πιθανή μοριακή καθοριστικός παράγοντας της φαιοφορβιδίου α (ΡΒΑ) -με βάση PDT χρησιμοποιώντας

NRF2

-knockdown καρκίνωμα κυττάρων του μαστού MDA-MB-231. Κύτταρα με σταθερή

NRF2

knockdown έδειξαν αυξημένη κυτταροτοξικότητα και αποπτωτικών /νεκρωτικό θάνατο κυττάρου μετά PDT μαζί με αυξημένα επίπεδα μονήρους οξυγόνου και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Μια συνεστιακή μικροσκοπική οπτικοποίηση του φθορογόνου Pba έδειξε ότι

NRF2

-knockdown κύτταρα συσσωρεύουν περισσότερο Pba από κύτταρα ελέγχου. Μια επακόλουθη ανάλυση της έκφρασης των μεταφορέων φαρμάκου μεμβράνης έδειξε ότι η βασική έκφραση του

BCRP

είναι NRF2-εξαρτώμενη. Μεταξύ μετριέται μεταφορείς ναρκωτικών, η βασική έκφραση της πρωτεΐνης αντοχής στον καρκίνο του μαστού (BCRP? ABCG2) ελαττώθηκε μόνο από

NRF2

-knockdown. Επιπλέον, μετά την επώαση με το ειδικό αναστολέα BCRP, διαφορική κυτταρική συσσώρευση Pba και ROS σε δύο κυτταρικές γραμμές καταργήθηκαν. Επιπλέον,

NRF2

-knockdown κύτταρα εκφράζουν χαμηλό επίπεδο peroxiredoxin 3 σε σύγκριση με τον έλεγχο, πράγμα που σημαίνει ότι μειωμένη μιτοχονδριακή αμυντικό σύστημα ROS μπορεί να συμβάλλει στην ευαισθητοποίηση PDT. Ο ρόλος του μονοπατιού NRF2-BCRP σε απόκριση ΡΒΑ PDT επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα κόλου ΗΤ29 καρκινώματος. Συγκεκριμένα,

NRF2

νοκ ντάουν οδήγησε σε αυξημένη κυτταρικό θάνατο και αυξημένο οξυγόνο απλής και τα επίπεδα ROS μετά από PDT μέσω της μειωμένης έκφρασης BCRP. Παρομοίως, PDT επαγόμενη παραγωγή ROS αυξήθηκε σημαντικά με επεξεργασία με

NRF2

shRNA στο καρκίνωμα του μαστού MCF-7 κύτταρα, κύτταρα HCT116 καρκινώματος κόλου, νεφρικά κύτταρα Α498 καρκινώματος και κύτταρα γλοιοβλαστώματος Α172. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η χειραγώγηση του NRF2 μπορεί να βελτιώσει την ευαισθησία ΡΒΑ PDT σε πολλαπλά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) Η ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να φαιοφορβιδίου ένα-Based φωτοδυναμική θεραπεία ενισχύεται από

NRF2

κατασιγάσει. PLoS ONE 9 (9): e107158. doi: 10.1371 /journal.pone.0107158

Επιμέλεια: Μιχαήλ Hamblin, MGH, MMS, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Μαΐου, 2014? Αποδεκτές: 6 του Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Σεπτεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ και μελλοντικό σχεδιασμό (NRF-2013R1A2A2A01015497). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT) έχει αναδειχθεί ως ένα αποτελεσματικό θεραπεία για αρκετούς στερεούς όγκους [1] – [3]. PDT απαιτεί τρία στοιχεία: i) έναν φωτοευαισθητοποιητή που μπορεί να στοχεύονται επιλεκτικά σε ιστούς όγκων, ii) ένα κατάλληλο πηγή φωτός που εκπέμπει χαμηλής ενέργειας και το φως του ιστού-διεισδυτική, και iii) το μοριακό οξυγόνο [4]. Το πρώτο βήμα της PDT είναι η ενεργοποίηση ενός φωτοευαισθητοποιητή από το φως. Όταν το ενεργοποιημένο φωτοευαισθητοποιητή σε διεγερμένη κατάσταση της δηλώσεις στην βασική του κατάσταση, μεταφέρει την ενέργειά του σε οξυγόνο και δημιουργεί μονήρες οξυγόνο (

1Ο

2), μια ιδιαίτερα αντιδραστική και βραχύβια αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), όπως ένας τύπος αντίδραση II. Ταυτόχρονα, το ενεργοποιημένο φωτοευαισθητοποιητή μπορεί να αντιδράσει απευθείας με κυτταρικά συστατικά και τις μεταφορές ένα άτομο υδρογόνου σχηματίζουν ρίζες, οι οποίες τελικά παράγει προϊόντα οξείδωσης μέσω της αντίδρασης με οξυγόνο (αντίδραση τύπου Ι) [5]. Μονήρες οξυγόνο και ROS είναι ιδιαίτερα οξειδωτικές μόρια? Ως εκ τούτου, PDT επεξεργασμένα κύτταρα υφίστανται κυτταρικό θάνατο μέσω τόσο νέκρωση και απόπτωση [6]. Εκτός από την άμεση επίδραση του στα κύτταρα του όγκου, PDT επηρεάζει μικροπεριβάλλον του όγκου καταστρέφοντας μικροαγγείωση του και με την ενίσχυση των φλεγμονωδών αποκρίσεων και ογκο-ειδικές ανοσοαποκρίσεις [4], [7], [8].

φαιοφορβίδιο α (ΡΒΑ) είναι ένα προϊόν της διάσπασης της χλωροφύλλης, το οποίο απομονώνεται από μεταξοσκώληκα περιττώματα [9] και την κινεζική φαρμακευτικό φυτό

Scutellaria barbarta

[10]. ΔΔΕ απορροφά το φως σε μεγαλύτερα μήκη κύματος από την πρώτη γενιά φωτοευαισθητοποιητή photofrin. Το μέγιστο μήκος κύματος ΡΒΑ 666 nm, ενώ εκείνο του photofrin είναι 630 nm [11]. Επειδή η διείσδυση του ιστού ενισχύεται από μεγαλύτερα μήκη κύματος, Pba έχει θεωρηθεί ως ένα φωτοευαισθητοποιητή για την θεραπευτική αγωγή μεγάλους όγκους στην περιτοναϊκή κοιλότητα [12]. Παρόμοια με Photofrin, Pba προκαλεί απόπτωση και νέκρωση σε παγκρεατικό καρκίνωμα, λευχαιμία, και τα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [13] – [15]. Σε κύτταρα καρκινώματος της μήτρας, ο υποκείμενος μηχανισμός της απόπτωσης είναι Pba συσσώρευση στα μιτοχόνδρια, το οποίο οδηγεί στην παραγωγή των ROS και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [16], [17]. Ομοίως, Pba προκαλεί μιτοχόνδρια εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα καρκινώματος του μαστού MCF-7 [18]. Αρκετές

in vivo

μελέτες σε ζώα έχουν υποστηρίξει την αποτελεσματικότητα των ΡΒΑ PDT στην πρόληψη ογκογένεση. Για παράδειγμα, ένα λιποσωμικό παρασκεύασμα ΡΒΑ-PDT καθυστέρηση ανάπτυξης όγκου σε ξενομόσχευμα ΗΤ29 καρκινώματος του κόλου [19]. Η ενδοφλέβια χορήγηση 0,3 mg /kg ακολουθούμενη από Pba ακτινοβολία φωτός ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν ένα ανθρώπινο ηπάτωμα ξενομοσχεύματος [11].

Ένας παράγοντας που καθορίζει την αποτελεσματικότητα της PDT είναι η έκφραση της ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα ( ABC) μεταφορείς στον ιστό στόχο. Αυτές οι μεταφορείς ελέγχουν την ενδοκυτταρική συσσώρευση των ξένων χημικών ουσιών από την ενεργό μεταφορά τους έξω από το κύτταρο [20]. Η πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού (BCRP ή ABCG2) είναι ένα μεταφορέα ABC που ταυτοποιήθηκε αρχικά σε δοξορουβικίνη ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του μαστού [21]. Η υπερέκφραση της BCRP σε όγκους προσδίδει αντίσταση στη χημειοθεραπεία [22]. Εκτός από τα φάρμακα κατά του καρκίνου, BCRP έχει δειχθεί ότι μεταφέρει φωτοευαισθητοποιητών πορφυρίνης τύπου. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα ΗΕΚ υπερεκφράζουν BCRP ήταν ανθεκτικά σε ΡΒΑ επαγόμενη κυτταροτοξικότητα [23]. Ταυτόχρονα,

BCRP

-knockout ποντίκια ήταν ιδιαίτερα επιρρεπή σε διατροφικές ΡΒΑ που προκαλείται από φωτοτοξικότητα του δέρματος [24].

Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-E2 που σχετίζονται με συντελεστή 2 (NRF2) είναι ένα μέλος της cap’n’collar οικογένειας των βασικών παραγόντων φερμουάρ λευκίνης (CNC-bZIP) μεταγραφής [25]. δραστηριότητα NRF2 ρυθμίζεται κυρίως από την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Kelch-όπως ECH-πρωτεΐνης που συνδέεται 1 (KEAP1) [26], [27]. Μέσω της σύνδεσης με τον τομέα Neh2 της NRF2, KEAP1 μεσολαβεί ubiquitinylation και την επακόλουθη υποβάθμιση του πρωτεασώματος της NRF2. Κάτω από συνθήκες οξειδωτικής και ηλεκτρονιόφιλης στρες, NRF2 ελευθερώνεται από KEAP1 και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα, με αποτέλεσμα την μεταγραφή των πολλαπλών γονιδίων στόχων που κωδικοποιούν ένζυμα αποτοξίνωσης, αντιοξειδωτικό, πρωτεΐνες στρες-απόκρισης, και οι μεταφορείς ναρκωτικών [28] – [30] . Επειδή τα γονίδια στόχους της έχουν κυτταροπροστατευτικά αποτελέσματα, NRF2 θεωρείται ως ένα κρίσιμο παράγοντα στον αμυντικό σύστημα έναντι του οξειδωτικού στρες και ηλεκτρονιόφιλες [31]. Συνεπώς, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η γενετική διαγραφή του

Nrf2

σχετίζεται με αυξημένη ευαισθησία σε βλάβη ιστού και τη ζημία που προκύπτει από το περιβάλλον και την ενδογενή στρες [28], [31], [32]. Από την άλλη πλευρά, η αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα εκμεταλλεύονται το σύστημα NRF2 για επιβίωση με την προσαρμογή στο στρες μικροπεριβάλλον του όγκου [33]. σηματοδότηση NRF2 ιδιοσυστατικά ενεργοποιείται σε διάφορους τύπους όγκων και καλλιεργήθηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές, η οποία συνδέεται με αυξημένη ανάπτυξη του όγκου και την αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Στα καρκινικά κύτταρα, NRF2 σηματοδότηση ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά από έκθεση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, η οποία προσδίδει επίκτητη αντοχή στην χημειοθεραπεία [34] – [36]. Ομοίως, PDT με υπερικίνηε σε κύτταρα ανθρώπινης κύστης καρκίνωμα οδήγησε σε αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης πυρηνικής NRF2 και αίμη οξυγενάσης-1 (ΗΟ-1) διαμέσου ρ38

ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ οδών [37]. Η επεξεργασία των κυττάρων HepG2 με ένα μη-τοξική συγκέντρωση ΡΒΑ ακολουθούμενη από ενεργοποίηση φωτογραφία για 90 λεπτά είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση του BCRP και οξυγονάσης αίμης-1 (ΗΟ-1) σε ένα NRF2-εξαρτώμενο τρόπο [38].

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε NRF2 ως νέων μοριακών καθοριστικός παράγοντας της αποτελεσματικότητας PDT. Επειδή NRF2 ρυθμίζει την έκφραση των ROS-εξουδετέρωση εξαρτήματα και διάφορα φάρμακα μεταφορείς, υποθέσαμε ότι ο χειρισμός της έκφρασης NRF2 θα ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της PDT. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, καθιερώσαμε σταθερές

NRF2

-knockdown κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ανθρώπινο καρκίνωμα μαστού MDA-MB-231 κύτταρα και τα κύτταρα ΗΤ29 καρκινώματος του παχέος εντέρου, και μετρήθηκε η ευαισθησία PDT. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

NRF2

νοκ ντάουν ενισχύει PDT-κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την αύξηση της παραγωγής των ROS. Ως υποκείμενο μηχανισμό, η έκφραση BCRP καταστάλθηκε από

NRF2

νοκ ντάουν, οδηγώντας σε αυξημένη κυτταρική συσσώρευση ΡΒΑ και την αυξημένη παραγωγή μονήρους οξυγόνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

Pba ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). NRF2 αντίσωμα ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Αντισώματα που αναγνωρίζουν AKR1C1 και BCRP αγοράστηκαν από Abnova (Taipei City, Ταϊβάν) και Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), αντίστοιχα. αντισώματα PRDX3 και β-τουμπουλίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), και πουρομυκίνη ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ, USA). 5 (6) -καρβοξυ-2 ‘, διοξική (DCFDA), trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο, και MitoGreen 7’-διχλωρο αγοράστηκαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Το σύστημα λεντοϊού που περιέχει ένα προ-σχεδιασμένο ανθρώπινη

NRF2

shRNA και μη ειδικά κωδικοποιημένα RNA (scRNA) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ο καρκίνος του μαστού ανθρώπινων κυττάρων σειρά MDA-MB-231 και MCF-7, του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά καρκίνου ΗΤ29 και HCT116, και Α498 ανθρώπινο νεφρικό καρκίνωμα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Το Α172 ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την κορεατική Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (Σεούλ, Νότια Κορέα). MDA-MB-231, MCF7, Α498, Α172, και HCT116 διατηρήθηκαν σε μέσο που περιέχει κατά Dulbecco Modified Eagle Medium και θρεπτικό μίγμα F-12 (Hyclone, Utah, USA) σε αναλογία 1:01 συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (Hyclone) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (WelGene Inc., Νταεγκού, Νότια Κορέα). ΗΤ29 διατηρήθηκε σε RPMI-1640 (Hyclone) με 10% FBS και πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Παραγωγή λεντοϊού σωματιδίων που περιέχουν

NRF2

πλασμίδιο έκφρασης shRNA

λεντοϊών σωματίδια με shRNA παρήχθησαν σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ μετά την επιμόλυνση των κυττάρων με

NRF2

πλασμίδιο έκφρασης shRNA και το μείγμα συσκευασιών (Sigma-Aldrich), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Εν συντομία, τα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ σπάρθηκαν σε πλάκες 60 mm σε πυκνότητα 7 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με OptiMEM (Life Technologies) και στη συνέχεια, 1,5 μg pLKO.1-NRF2 shRNA, το οποίο περιέχει το ανθρώπινο

NRF2

-ειδικές shRNA (5′-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3 ‘), και το μίγμα συσκευασία επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Το πλασμίδιο pLKO.1-scRNA χρησιμοποιήθηκε ως μη ειδικό RNA ελέγχου. Την δεύτερη ημέρα, μετά την απομάκρυνση του συμπλόκου επιμόλυνση, το πλήρες μέσο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μέσα που περιέχουν λεντοϊού σωματίδια συλλέχθηκαν μετά από 4 ημέρες.

Σύσταση

NRF

νοκ ντάουν κυτταρική σειρά

MDA-MB-231 κύτταρα σε πλάκα 6 φρεατίων επωάστηκαν με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν είτε scRNA ή πλασμίδιο έκφρασης NRF2 shRNA. Μετά από 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα ανακτήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο και την πουρομυκίνη (1 μg /ml) επιλογή ακολουθήθηκε για μέχρι 4 εβδομάδες. Η

NRF2

νοκ ντάουν ΗΤ29 κυτταρική σειρά καθιερώθηκε ως έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [39].

Παροδική νοκ ντάουν της NRF2

MCF-7, HCT116, Α172 και Α498 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για όλη τη νύχτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα επωάστηκαν με χοληστερίνη για 15 λεπτά και στη συνέχεια, το σωματίδιο που περιέχει λεντοϊού scRNA ή shNRF2 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 48 ώρες επώαση, ιικών μέσων που περιέχει σωματίδια απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα ανακτήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για μία νύκτα.

PDT και ΜΤΤ ανάλυση

MDA-MB-231 και ΗΤ29 σπάρθηκαν σε ένα πυκνότητα 7 χ 10

3 κύτταρα πλάκες /φρεάτιο σε 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 20 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Pba (0-2,5 μg /ml) για 6 ώρες και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0,3 (ΗΤ29) ή 0,6 J /cm

2 (MDA-MB-231) λέιζερ απουσία ΡΒΑ. Για την ακτινοβολία λέιζερ, η 670 nm LED Υβριδικό σύστημα Lamp (Quantum Spectra ζωή, Barneveld, WI) χρησιμοποιήθηκε. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν σε πλήρες μέσο για 18 ώρες και επωάστηκαν με ΜΤΤ για 4 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του διαλύματος ΜΤΤ, 100 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας Spectro αστέρων Nano αναγνώστη μικροπλάκας (BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany).

η κυτταροτοξικότητα μέτρηση

η κυτταροτοξικότητα με PDT εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα δοκιμασίας CytoTox-Fluor (Promega, Madison, WI, USA). Μετά PDT, τα κύτταρα διατηρήθηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια 50 μΙ δις-AAF-R110 υπόστρωμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Υποστρώματος που περιέχει διάλυμα επωάστηκε για άλλες 2 ώρες με τροχιακή ανακίνηση στους 37 ° C. Εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) σε 485 nm Ex /520 nm Em.

Σύνολο εκχύλισης RNA και σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση

Σύνολο RNAs απομονώθηκαν από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Life Technologies). Για τη σύνθεση του cDNA, αντίστροφη μεταγραφάση (RT) αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με επώαση 200 ng ολικού RNA με ένα μίγμα αντιδράσεως που περιέχει 0.5 μg /μΙ oligo dT

12-18 και 200 ​​U /μl ιό λευχαιμίας ποντικού Moloney RT (Life Technologies). Για την ανάλυση σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), Roche LightCycler (Mannheim, Germany) χρησιμοποιήθηκε με την Takara SYBR σύστημα Πρόμιγμα ExTaq (Otsu, Ιαπωνία). Οι εκκινητές συντέθηκαν με Bioneer (Daejeon, Νότια Κορέα) και τις αλληλουχίες εκκινητή για τα ανθρώπινα γονίδια είναι:

NRF2

, 5′-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 ‘και 5′-CATGCACGTGAGTGCTCT-3’?

ΗΟ-1,

5′-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 ‘και 5′-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3’? aldo-κετο αναγωγάσης 1C1 (

AKR1C1),

5′-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 ‘και 5′-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3’? NAD (P) κινόνης οξειδοαναγωγάση-1 (

NQO1

), 5′- CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 ‘και 5′-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3’? οι καταλυτικές υπομονάδες του γ-γλουταμικού κυστεΐνη λιγάση (

GCLC

), 5′-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 ‘και 5′-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3’? εποξείδιο υδρολάσης-1 (

EPHX1

), 5′-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 ‘και 5′-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3’? υπεροξειδική δισμουτάση 1 (

SOD1

), 5′-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 ‘και 5′-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3’?

SOD2

, 5′-AACCTCACATCAACGCGCAGAT-3 ‘και 5′-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3’? καταλάση (

CAT

), 5′-GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 ‘και 5′-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3’? peroxiredoxin 3 (

PRDX3

), 5′-GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 ‘και 5′-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3’?

PRDX5

, 5′-GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 ‘και 5′-ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3’? γλουταθειόνης υπεροξειδάσης 1 (

GPX1

), 5′-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 ‘και 5′-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3’?

GPx4

, 5′-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 ‘και 5′-GCCACACACTTGTGGAGCTA-3’? ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (

GSR

), 5′-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 ‘και 5′-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3’? γλουταρεντοξίνη 2 (

GLRX2

), 5′-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 ‘και 5′-CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3’. θειορεδοξίνης-2 (

TXN2

), 5′-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 ‘και 5′-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3’? πρωτεΐνης αντοχής στον καρκίνο του μαστού (

BCRP /ABCG2

), 5′-CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 ‘και 5′-TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3’? πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης 1 (

MDR1 /ABCB1

), 5′-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 ‘και 5′-TCTTCACCTGGCTCAGT-3’? πολυφαρμακευτική αντίσταση που σχετίζεται με πρωτεΐνη 1 (

MRP1 /ABCC1

), 5′-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 ‘και 5′-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3’?

MRP2 /ABCC2,

5′-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 ‘και 5′-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3’?

MRP3 /ABCC3,

5′-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 ‘και 5′-GCTGGCCATGATGACCACAA-3’?

MRP4 /ABCC4

, 5′-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 ‘και 5′-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3’?

MRP5 /ABCC5,

5′-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 ‘και 5′-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3’?

MRP6 /ABCC6,

5′-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 ‘και 5′-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3’? οργανικό κατιόν μεταφορέας νέες 1 (

OCTN1?

SLC22A4), 5′-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 ‘και 5′-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3’?

OCTN2

(

SLC22A5

), 5′-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 ‘και 5′-GGTCATCCACAGCATTATGG-3’? πολυφαρμάκου και εξώθηση τοξίνη μεταφορέα 2 (

MATE2

?

SLC47A2

), 5′-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 ‘και 5′-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3′? φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης-1 (HPRT1), 5’-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 ‘και 5′-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3’.

Μέτρηση του μονήρους οξυγόνου

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα γυάλινο κάλυμμα πιάτο (SPL βιοεπιστημών, Gyeonggi-do, Νότια Κορέα) και καλλιεργήθηκαν για μια νύχτα. Μετά την ακτινοβόληση ΡΒΑ λέιζερ, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 50 μΜ trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο (Life Technologies) για 30 λεπτά. Για την χρώση των πυρήνων, Hoechst 33342 (H342) προστέθηκε στα παραπάνω πιάτα και επωάστηκαν για 10 λεπτά. Πράσινο φθορισμό από μονήρες οξυγόνο ανιχνεύθηκε αμέσως χρησιμοποιώντας ένα LSM 710 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany) και εντάσεις ποσοτικά με τη χρήση ενός λογισμικού ZEN2011 (Carl Zeiss).

Μέτρηση των ενδοκυττάριων ROS

επίπεδα Cellular ROS εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κελί διαπερατό φθορογόνο ανιχνευτή, καρβοξυ-H

2DCFDA. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο πυθμένα γυάλινο κάλυμμα (SPL επιστήμη Life) και περαιτέρω επωάστηκαν για όλη τη νύχτα. Μετά την θεραπεία με λέιζερ ΡΒΑ, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 30 μΜ του καρβοξυ-H

2DCFDA για 30 λεπτά στους 37 ° C. Για την πυρήνες χρώση, H342 επωάστηκε για 10 λεπτά. Στη συνέχεια ελήφθησαν συνεστιακή εικόνες και πράσινη φθορίζουσα εντάσεις ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο και ZEN2011 λογισμικό LSM 710

Μέτρηση ΡΒΑ συσσώρευσης

ΡΒΑ ένα φθορογόνο ουσία.? Ως εκ τούτου, το επίπεδο της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης ΡΒΑ προσδιορίσθηκε με μέτρηση κόκκινου φθορισμού στο κύτταρο. MDA-MB-231 και ΗΤ29 σε γυάλινα πλακίδια κάλυψης επωάστηκαν με Pba για 6 ώρες. Στη συνέχεια, Pba απομακρύνθηκε και PBS πλύσεις ακολούθησαν. Εντάσεις ΡΒΑ κόκκινου φθορισμού ποσοτικά συνεστιακή εικόνες χρησιμοποιώντας ZEN2011 λογισμικού. Ως εναλλακτικό τρόπο για την ποσοτικοποίηση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Βϋ Biosciences) και επωάζονται με Pba για 6 ώρες. Μετά την πλύση των κυττάρων, Pba ερυθρό φθορισμός ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός απεικονιστού CellInsight Personal Κυττάρων (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και οι εντάσεις ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό CellInsight (Thermo Fisher Scientific).

Φθορομετρικής προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής Pba

κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν με Pba για 6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση χρησιμοποιώντας 1% SDS μετά PBS πλύση. DMSO προστέθηκε σε λύματα κυττάρων για να διαλυθεί κυτταρική ένταση Pba και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax M5 στο 415 nm Εχ /673 nm Em.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris [ρΗ 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, και 1% phenoxypolyethoxylethanol εννεανυλο 40) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich). Για εκχύλιση πρωτεϊνών BCRP, 0,1% SDS προστέθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 12% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Whatman, Dassel, Germany). Στη συνέχεια, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% αποβουτυρωμένο γάλα ή 3% αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα και επωάστηκαν με αντισώματα. Οι εικόνες χημειοφωταύγειας συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Fujifilm ΣΕΝ-4000 mini σύστημα απεικόνισης (Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία) και εντάσεις ποσοτικά με αντίστοιχο λογισμικό.

κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα NRFi-MDA σπάρθηκαν σε 60 cm

2 πιάτα σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Μετά την ακτινοβόληση ΡΒΑ λέιζερ, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, 2 × 10

5 κύτταρα μεταφέρθηκαν σε 1.5 ml σωλήνα για φυγοκέντρηση στις 8000

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, 5 μΐ συζευγμένου φθοριόχρωμα αννεξίνης V (BioLegend, San Diego, CA, USA) και 10 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, BioLegend) διάλυμα προστέθηκαν σε κάθε σωληνάριο και επωάζεται με ήπια περιδίνηση. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και στη συνέχεια, 400 μΐ αννεξίνης V ρυθμιστικό σύνδεσης (BioLegend) προστέθηκε σε κάθε σωλήνα. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Becton-Dickinson FACS Canto (Sanjosé, CA, USA) με και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό FACSDiva (BD).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με ένα Student paired t-test που ακολουθείται ή μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (one-way ANOVA) που ακολουθείται από τη δοκιμασία Student Newman-Keuls για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism (La Jolla CA, USA).

Αποτελέσματα

Pba κυτταροτοξικότητα ενισχύεται από

NRF2

νοκ ντάουν σε MDA-MB-231 κυττάρων καρκίνου του μαστού

για να διερευνηθεί η συμμετοχή των NRF2 στην αποτελεσματικότητα των ΡΒΑ PDT για καρκίνο του μαστού, ιδρύσαμε ένα

NRF2

-knockdown κυτταρική σειρά καρκινώματος του μαστού σε MDA- ΜΒ-231 κύτταρα. Σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν μη ειδικά κωδικοποιημένα RNA (sc-MDA) ή

NRF2

-ειδικό shRNA (NRF2i-MDA) επιτεύχθηκαν από την επιλογή πουρομυκίνης για 4 εβδομάδες. Τα επίπεδα έκφρασης του NRF2 και γονιδίων-στόχων της αξιολογήθηκαν σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. κύτταρα NRF2i-MDA παρουσίασαν μείωση κατά 85% στο

NRF2

mRNA και σημαντικές μειώσεις στην έκφραση της NRF2 στόχων

AKR1C1

και

ΗΟ-1

(Εικ. 1Α). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι οι πρωτεΐνες επίπεδα NRF2 και AKR1C είναι ουσιαστικά μειωμένη σε knockdown κυττάρων (Εικ. 1Β). Αυτές επιβεβαιώνουν την επιτυχή αναστολή της NRF2 σηματοδότησης στην έδρα σταθερή κυτταρική σειρά. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την ευαισθησία του

NRF2

-knockdown MDA-MB-231 κυττάρων στο Pba και ο συνδυασμός λέιζερ θεραπεία. Χωρίς ακτινοβολία λέιζερ, η επώαση του SC-MDA και τα κύτταρα NRF2i-MDA με Pba (0,025 έως 2,5 μg /ml, 24 h) δεν επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ. 1 C). Παρομοίως, η ακτινοβολία λέιζερ χωρίς Pba επώαση δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ. 1D). Για να αξιολογηθεί η ευαισθησία PDT, τα κύτταρα ακτινοβολούνται με μία 0,6-J /cm

2 λέιζερ μετά από επώαση με Pba και ΜΤΤ ανάλυση εκτελέσθηκε ακολουθώντας 18 ανάκτηση h. Αρχικά, PDT αποτέλεσμα αξιολογήθηκε με ποικίλες χρόνους επώασης ΡΒΑ. Η επώαση ΡΒΑ (0.125 μg /mL) για 2, 6, και 18 ώρες έδειξε παρόμοια κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα ελέγχου sc (Σχ. 1Ε). Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, το 6 h-επώασης ΡΒΑ διατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη.

(Α) τα επίπεδα μεταγραφής του

NRF2

,

AKR1C1

, και

HO-1

μετρήθηκαν στον έλεγχο (sc-MDA) και

NRF2

-knockdown κύτταρα (NRF2i-MDA) χρησιμοποιώντας σχετική ποσοτικοποίηση των PCR πραγματικού χρόνου. HPRT1 χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου καθαριότητας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν αναλογίες σε σχέση με το SC-MDA και αναφέρονται ως μέσος όρος ± τυπικές αποκλίσεις (SDS) 3 πειραμάτων. επίπεδα (Β) Protein του NRF2 και AKR1C1 προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western στον έλεγχο sc και κύτταρα NRF2i-MDA. (C) Τα κύτταρα SC-MDA και NRF2i-MDA επωάστηκαν με Pba (0-2,5 μg /mL) για 6 ώρες, και τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ μετά από ανάκτηση 18 h. (D) Κύτταρα δέχθηκαν ακτινοβολία από ένα λέιζερ απουσία ΡΒΑ, και τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ μετά από ανάκτηση 18 h. (Ε) Η SC-MDA επωάστηκε με Pba για 2, 6, ή 18 ώρες και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε μετά την ακτινοβολία λέιζερ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ποσοστά σε σχέση με την ομάδα του οχήματος για κάθε κυτταρική σειρά και αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD από 8 φρεάτια.

Η

ανάλυση ΜΤΤ, τα κύτταρα NRF2-MDA ήταν σχετικά πιο ευαίσθητα σε Pba -με βάση PDT: βιώσιμος αριθμός κυττάρων μετά από PDT ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα NRF2i-MDA από ότι στα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Α).. Ομοίως, όταν τα νεκρά δραστικότητα πεπτιδάσης προέρχεται από κύτταρα μετρήθηκε στο μέσο χρησιμοποιώντας ένα υπόστρωμα CytoTox

NRF2

knockdown κυττάρων έδειξε ένα σημαντικά υψηλή κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο sc (Εικ. 2Β).

( Α) Ο έλεγχος sc και τα κύτταρα NRF2i-MDA ήταν προ-επωάστηκαν με Pba (0-2,5 μg /mL) για 6 ώρες και στη συνέχεια ακτινοβολούνται από 0,6 J /cm

2 laser. Στη συνέχεια, η ανάλυση ΜΤΤ διεξήχθη μετά από ανάκτηση 18 h. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ποσοστά σε σχέση με την ομάδα του οχήματος για κάθε κυτταρική σειρά και αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD από 8 φρεάτια.

AP & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο sc-MDA σε κάθε συγκέντρωση ΡΒΑ. (Β) PDT επαγόμενη κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με μέτρηση νεκρός δραστικότητα πρωτεάσης κύτταρο σε ένα κύτταρο καλλιεργημένο μέσο. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Pba (0,125 και 0,25 μg /mL) για 6 ώρες που ακολουθείται από ακτινοβολία λέιζερ, και επωάστηκαν για 18 ώρες. Νεκρά παράγωγη κυτταρική δραστικότητα πρωτεάσης προσδιορίσθηκε με τη χρήση φθορογόνου υποστρώματος AAF-R110. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν σχετική κυτταροτοξικότητα σε σχέση με την ομάδα του οχήματος για κάθε κυτταρική σειρά και αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD από 8 φρεάτια.

AP & lt? 0,05 σε σύγκριση με κάθε έλεγχο sc-MDA. κυτομετρική ανάλυση (C) Η ροή των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα NRF2i-MDA μετά τη θεραπεία με λέιζερ ΡΒΑ. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙ και αννεξίνης V, και αξιολογήθηκαν κυτταρικών πληθυσμών. (Δ) Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει πληθυσμού κυττάρων σε αννεξίνη V (AV) + /ΡΙ +, AV + /ΡΙ-, ή από τον μέσο /ΡΙ + φάσης από τρία ξεχωριστά πειράματα.

AP & lt? 0,05 σε σύγκριση με την χωρίς έλεγχο λέιζερ. κύτταρα (Ε) NRF2i-MDA συν-επωάστηκαν με Z-VAD-FMK (10 μΜ) ή necrostatin (NEC-1, 50 μΜ) και Pba (0.125 μg /mL) για 6 ώρες? τότε, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και ακτινοβολούνται με ένα λέιζερ. Μετά από 18 ώρες επώαση, τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία. Τα δεδομένα είναι ποσοστά σε σχέση με το μάρτυρα (χωρίς PDT και όχημα θεραπεία) και αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD από 8 φρεάτια.

AP & lt?. 0.05, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

PDT προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω αποπτωτικών και νεκρωτικές οδών [6], [40]. Στη συνέχεια, προκειμένου να προσδιοριστεί ο μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που εμπλέκονται στην PDT θεραπεία με

NRF2

knockdown κυττάρων καρκίνου του μαστού, ανάλυση FACS με Annexin V και διπλή χρώση ΡΙ διεξήχθη. κύτταρα NRF2i-MDA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PDT? αμέσως μετά, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V (πρώιμος δείκτης απόπτωσης) και ΡΙ (αργά απόπτωση και νέκρωση δείκτη). Μετά την επεξεργασία συνδυασμός ΡΒΑ λέιζερ, ο πληθυσμός πλειοψηφία των κυττάρων μετατοπίζεται προς τα αποπτωτικά-νεκρωτική φάση (Σχ. 2C). Ποσοτικοποίηση των πειραματικών επαναλήψεων έδειξε ότι 16,7% των κυττάρων ήταν στην πρώιμη αποπτωτική φάσης (αννεξίνης V + /ΡΙ-) και 61,3% των κυττάρων ήταν στα τέλη της δεκαετίας αποπτωτικών /νεκρωτικών φάση (αννεξίνης V + /ΡΙ +). Μόνο το 15,7% των κυττάρων ήταν στην μη-αποπτωτικά και μη νεκρωτική φάση (Σχ. 2D). Αυτά δείχνουν σαφώς ότι PDT επάγει κυτταρικό θάνατο που περιλαμβάνει τη διαδικασία της απόπτωσης και νέκρωσης. Ως επιβεβαίωση, όταν τα κύτταρα συν-επωάστηκαν με ένα κασπάσης παν-αναστολέα Ζ-VAD-FMK (10 μΜ) και PDT (ΡΒΑ 0.125 μg /mL) ποσοστό του αριθμού βιώσιμων κυττάρων αυξήθηκε από 63% σε 80,1% (Σχ. 2Ε ). Επιπλέον, η επώαση με necrostatin (50 μΜ), ένας ισχυρός αναστολέας του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου νεκρωτικό, αυξημένο αριθμό βιώσιμων κυττάρων σε 78,2%. Στο σύνολό τους, ελήφθησαν τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το

NRF2

κύτταρα knockdown ευαισθητοποιημένα καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 σε ΡΒΑ βασίζονται PDT, με αποτέλεσμα ενισχυμένη κυτταρικό θάνατο.

PDT διεγείρεται παραγωγή ROS είναι αυξημένη σε

NRF2

νοκ ντάουν κύτταρα MDA

δελτία συνδυασμό ΡΒΑ λέιζερ θεραπεία μονήρες οξυγόνο μέσα στο κύτταρο, και η προκύπτουσα ROS είναι μια σημαντική συμβολή στην κυτταροτοξικότητα PDT [5]. Ως εκ τούτου, παρακολουθείται PDT προερχόμενο μονήρες επιπέδων οξυγόνου σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα προ-θεραπεία με Pba (2,5 μg /mL για 6 ώρες) ακτινοβολούνται με μία /cm

2 λέιζερ 0,6-J, και τα επίπεδα του μονήρους οξυγόνου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο, μια φθορίζουσα χρωστική, η οποία είναι ειδική για μονήρες οξυγόνο. Σε σύγκριση με τη θεραπεία με Pba μόνο ή λέιζερ ακτινοβολία μόνο, το trans-1- (2’methoxyvinyl) μέθοδος που βασίζεται πυρένιο έδειξε ότι ο συνδυασμός ΡΒΑ λέιζερ ομάδα εμφανίζει μια ενισχυμένη σήμα φθορισμού εντός του κυττάρου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), επιβεβαιώνοντας την αύξηση της μονήρες οξυγόνο κατά την PDT. Στην αρχική μας εκτίμηση, η επώαση του trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο για 5 λεπτά, 30 λεπτά και 50 λεπτά έδειξαν παρόμοια αύξηση των επιπέδων μονήρους οξυγόνου προερχόμενων φθορογόνο ένταση πυρένιο (Σχ. 3Α). Αυτό επιβεβαιώνει ότι μονήρες οξυγόνο που προέρχεται φθορισμού πυρένιο μπορεί να είναι αξιόπιστα ανιχνεύσιμη κατά τη διάρκεια αυτών των επωάσεων φορές? Ως εκ τούτου, ένα ομοεστιακό προσδιορισμός έγινε μετά από 30 λεπτά επώασης του trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο στη μελέτη μας. Η συγκριτική μέτρηση του μονήρους οξυγόνου έδειξαν ότι το

NRF2

-knockdown MDA-MB-231 κύτταρα παράγουν υψηλότερα επίπεδα μονήρους οξυγόνου από τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3Β). Τα σήματα φθορισμού διανεμήθηκαν εντός του κυτταροπλάσματος, καθώς και τον πυρήνα, και η συνολική ένταση φθορισμού ήταν 1.5 φορές υψηλότερη στα knockdown κυττάρων από ότι στα κύτταρα ελέγχου. Κατά συνέπεια, το συνολικό επίπεδο των ROS, το οποίο παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας DCFDA, ουσιαστικά αυξημένα μετά από αγωγή με το συνδυασμό ΡΒΑ λέιζερ στις δύο κυτταρικές σειρές? Ωστόσο, η αύξηση ήταν μεγαλύτερη στα κύτταρα NRF2i-MDA. Συγκεκριμένα, μετά από θεραπεία με 2,5 μg /mL Pba και ακτινοβολία λέιζερ, η αύξηση των ROS ήταν 4,6 φορές υψηλότερη στο

NRF2

-knockdown κυτταρική σειρά από ό, τι στην κυτταρική γραμμή ελέγχου (Σχ. 3C). Ομοίως, μετά την επεξεργασία με τη χαμηλή συγκέντρωση ΡΒΑ (0.125 μg /mL) και ακτινοβολία λέιζερ, η αύξηση των ROS ήταν 3,5 φορές υψηλότερη σε κύτταρα NRF2i-MDA (Σχ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αύξηση στο μονήρες οξυγόνο και ROS αυξάνει την ευαισθησία του

NRF2

-knockdown κύτταρα καρκίνου του μαστού σε PDT.

(Α) Η Επιτροπή Εποπτείας κύτταρα ελέγχου επωάστηκαν με Pba για 6 ώρες και ακτινοβοληθεί με 0,6 J /cm

2 laser. Αμέσως μετά PDT, ένα ευαίσθητο trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο μονήρες οξυγόνο προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 5, 30, ή 50 λεπτά παρουσία του trans-1- (2’methoxyvinyl) πυρένιο. Στη συνέχεια ομοεστιακό παρατήρηση εκτελέστηκε για να ανιχνεύσει φθορισμογόνων σχηματισμού της χρωστικής, το οποίο σχηματίζεται από την αντίδραση με μονήρες οξυγόνο.