Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ. Θάνατος από προστάτη προκύπτει κυρίως από μετάσταση. Μιτογόνο-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης κινάσης 4 (MAP2K4) υπερεκφράζεται σε επεμβατική αλλοιώσεις PCA σε ανθρώπους, και μπορεί να ανασταλεί από μικρά θεραπευτικά μόριο που επιδεικνύουν ευνοϊκή δραστικότητα σε μελέτες φάσης ΙΙ. Ωστόσο, ο ρόλος MAP2K4 στη ρύθμιση μεταστατική συμπεριφορά είναι αμφιλεγόμενο και άγνωστο. Να ερευνήσει, έχουμε μηχανικής ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη που υπερεκφράζουν είτε άγριου τύπου ή συστατική ενεργό MAP2K4. Ορθοτοπική εμφύτευση σε ποντίκια απέδειξαν MAP2K4 αυξάνει το σχηματισμό των μακρινών μεταστάσεων. Συστατική ενεργός MAP2K4, αν και όχι άγριου τύπου, αυξάνει το μέγεθος του όγκου και κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο αίμα και στο μυελό των οστών. Συμπληρωματικές

in vitro μελέτες

θεσπιστούν σταθεροί MAP2K4 υπερέκφραση προωθεί την κυτταρική εισβολή, αλλά δεν επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη ή μετανάστευση. MAP2K4 υπερέκφραση αυξάνει την έκφραση της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 27 (HSP27) πρωτεΐνη και πρωτεάση παραγωγής, με το μεγαλύτερο αποτέλεσμα επί μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 2 (ΜΜΡ-2), και τα δύο

in vitro

και σε δείγματα όγκων ποντικού. Περαιτέρω, MAP2K4 μεσολάβηση αυξήσεις στην κυτταρική εισβολή εξαρτώνται από πρωτεΐνη θερμικού σοκ 27 (HSP27) και ΜΜΡ-2, αλλά όχι κατά την άμεση κατάντη στόχοι, ρ38 ΜΑΡΚ ή JNK MAP2K4 του. Έχουμε αποδείξει ότι MAP2K4 αυξάνει την ανθρώπινη μετάσταση του προστάτη, και η παρατεταμένη διάρκεια της έκφρασης προκαλεί μακροπρόθεσμες αλλαγές στο κελί μονοπάτια που οδηγούν στην ανεξαρτησία από p38 ΜΑΡΚ και JNK σηματοδότησης. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν μια μηχανιστική εξήγηση για ανθρώπινες μελέτες που συνδέουν αυξήσεις HSP27 και ΜΜΡ-2 σε εξέλιξη σε μεταστατική νόσο. MAP2K4 επικυρώνεται ως ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο για την αναστολή της ανθρώπινης μετάσταση προστάτη

Παράθεση:. Pavese JM, Ogden IM, Voll ΕΑ, Huang Χ, Xu L, Γιοβάνοβιτς Β, et al. (2014) Μιτογόνο-Activated Protein κινάση 4 (MAP2K4) προωθεί τα ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη μετάσταση. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10.1371 /journal.pone.0102289

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 1 Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 17 Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Pavese et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) για να RCB, CA122985 και προστάτη SPORE CA90386, και να JMP, ΝΙΗ Τ32 AG000260 «Drug Discovery Κατάρτιση σε ηλικία που σχετίζονται με διαταραχές», και από τον Walter S. και Lucienne Driskill Μεταπτυχιακών πρόγραμμα στις Επιστήμες ζωής στο Πανεπιστήμιο Northwestern. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες Ηνωμένες Πολιτείες, και η δεύτερη πιο κοινή μορφή του θανάτου από καρκίνο [1]. Ενώ πάνω από το 90% των ατόμων με εντοπισμένο προστάτη δεν θα πεθάνουν από τη νόσο τους, εκείνοι με μεταστατική νόσο έχουν ένα τερματικό διάγνωση και η συντριπτική πλειοψηφία θα πεθάνουν από προστάτη [2]. Η κατανόηση του πώς ρυθμίζεται η μεταστατική εξάπλωση του ανθρώπινου προστάτη είναι ζωτικής βιολογικής σημασίας. Αυτή η γνώση θα μας επιτρέψει να εντοπιστούν ασθενείς που βρίσκονται σε κίνδυνο και, συνεπώς, στην ανάγκη παρέμβασης, και θα αποτελέσει τη βάση για την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπευτικών στρατηγικών.

Μιτογόνο-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση κινάση 4 (MAP2K4, επίσης γνωστή ως ΜΚΚ4, ΜΕΚ4, ή SEK1) είναι μια πρωτεϊνική κινάση διπλής ειδικότητας που φωσφορυλιώνει σερίνη και θρεονίνη, καθώς και κατάλοιπα τυροσίνης. MAP2K4 είναι ένα μέλος της ενεργοποιημένης με μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδοτώντας και τυπικά ενεργοποιεί δύο κατάντη στόχοι, ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ p38) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) [3]. Ο ρόλος των MAP2K4 στην ανθρώπινη εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, καθώς και η ανάπτυξη της μετάστασης ειδικότερα, είναι αμφιλεγόμενη. MAP2K4 βρίσκεται στο 17ρ11.2 χρωμοσωμικό τμήμα, το οποίο μπορεί να χαθεί σε ποσοστό περίπου 7-10% σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους, ιδιαίτερα καρκίνους ωοθηκών και του μαστού [4], [5] Για το λόγο αυτό, αρχικά υποτίθεται ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό. Σε ένα μοντέλο αρουραίου PCa, χρησιμοποιώντας κύτταρα που στερούνται ένα χρωμοσωμικό τμήμα που περιέχει MAP2K4, ειδική αποκατάσταση του MAP2K4 πρωτεΐνης μειώνεται PCa μετάσταση στον πνεύμονα εξής πλευρό ένεση των κυττάρων αυτών [6]. Σε αυτό το μοντέλο, η αυξημένη MAP2K4 επίσης καθυστερεί την ανάπτυξη των μεταστατικών κυττάρων που φθάνουν σε πνεύμονες, πιθανόν να οφείλεται σε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου [7].

Ωστόσο, άλλες μελέτες δείχνουν ότι MAP2K4 προσδίδει μια προ-μεταστατικό φαινότυπο, και την υποστήριξη η ιδέα ότι θα αυξήσει τη μετάσταση. MAP2K4 ενεργοποιεί p38 ΜΑΡΚ, η οποία οδηγεί πολλά βήματα της μεταστατικής καταρράκτη, συμπεριλαμβανομένης της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), την κυτταρική εισβολή και τη μεταστατική αποικισμός (που επισκοπείται στο [8]). έκφραση MAP2K4 αυξάνεται σε υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (HGPIN) βλάβες τόσο στο μοντέλο TRAMP ποντικού που βασίζεται αυθόρμητων προστάτη, καθώς επίσης και σε ανθρώπινα δείγματα [9]. Επίσης, η έκφραση MAP2K4 είναι αυξημένη στις αρχές επεμβατική, δηλαδή, η PCA, οι βλάβες σε ανθρώπους, και η αυξημένη έκφραση MAP2K4 συσχετίζεται σημαντικά με την υψηλότερη παθολογική στάδιο [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αυτές τις μελέτες και άλλων, τα επίπεδα της MAP2K4 στη συνέχεια μειώθηκε σε μετάσταση προχωρημένο στάδιο, υποδεικνύοντας ότι αύξηση MAP2K4 είναι κρίσιμη για την πρόωρη βήματα της μεταστατικής καταρράκτη [10]. Αυτή η επιρροή όσον αφορά την πρόωρη βήματα επιβεβαιώνεται στο

in vitro

μελέτες. Χρησιμοποιώντας αρκετές διαφορετικές ανθρώπινες φυσιολογικές και προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές και παροδική έκφραση μηχανικής MAP2K4, η ομάδα μας έδειξε ότι MAP2K4 αυξάνει κύτταρο εισβολή, μια κρίσιμη ένδειξη της μεταστατική εξέλιξη

in vitro

[11]. Εντοπίσαμε επίσης MAP2K4 ως ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο των μικρών αναστολέων ένωσης. Συγκεκριμένα, αποδείξαμε ότι MAP2K4 ήταν ο θεραπευτικός στόχος του μικρού ένωσης, 4 ‘, 5,7-τριυδροξυισοφλαβόνη (genistein), για τα αποτελέσματά της επάνω αναστολή εισβολή [11], [12], και ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει την ανθρώπινη μετάσταση PCA σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού [13]. Μέσα από μια σειρά σχετικών μελετών, εντοπίσαμε το μονοπάτι, αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (TGF) β → MAP2K4 → p38 πρωτεΐνης ΜΑΡΚ → θερμικού σοκ 27 (HSP27) → μήτρα τύπου μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ-2) → ανθρώπινη εισβολή των κυττάρων του προστάτη, και ότι αυτό αναστέλλεται από γενιστεΐνη [11] – [16]. Δείξαμε επίσης ότι οι μελλοντικοί χορήγηση genistein σε ανθρώπους με εντοπισμένη προστάτη μειώνει την έκφραση ΜΜΡ-2 σε ιστό προστάτη [11]. Χρησιμοποιώντας

in vivo

ζωικά μοντέλα, αλλοιωμένη έκφραση MAP2K4 μπορεί να αλλάξει μετάσταση σε άλλα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους. Ιδιαιτέρως, άλλες ομάδες έχουν δείξει MAP2K4 knockdown μειώνει την ανάπτυξη μεταστατικού όγκου σε μοντέλα ποντικών του μαστού και καρκίνου του παγκρέατος [17], [18].

Δεδομένου αλλαγμένη έκφραση MAP2K4 και προγνωστική σημασία για τον άνθρωπο, του

in vitro

αποτελέσματα επί των ανθρώπινων κυττάρων του προστάτη και ποικίλες απαντήσεις σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικές κυτταρικές γραμμές αρουραίου και, είναι σημαντικό να καθοριστεί ειδικά ρόλο MAP2K4 στη ρύθμιση της μεταστατικής συμπεριφοράς των ανθρωπίνων προστάτη. Παρά το γεγονός ότι MAP2K4 είναι ένας θεραπευτικός στόχος της genistein, genistein ασκεί πολλές διαφορετικές επιδράσεις. Ως εκ τούτου, παρά την αναστολή genistein των ανθρωπίνων μετάσταση προστάτη, ο ρόλος των MAP2K4 στη ρύθμιση του σχηματισμού μετάστασης δεν μπορεί να προσδιοριστεί από αυτά τα ευρήματα. Η αβεβαιότητα του ρόλου MAP2K4 να ρυθμίζει την ανθρώπινη μετάσταση καρκίνου του προστάτη αυξάνεται περαιτέρω με μελέτες σε διάφορους διαφορετικούς τύπους καρκίνου που στηρίζουν είτε έναν καταστολέα μετάστασης [6], [7], [19] – [21], ή διεγερτική ρόλο [9], [11], [17], [18]. Είναι σημαντικό, κανένας δεν έχει εξεταστεί ο ρόλος MAP2K4 στη ρύθμιση μεταστατική συμπεριφορά του ανθρώπινου προστάτη.

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποδείξει πολλές νέες διαπιστώσεις. Κατ ‘αρχάς, MAP2K4 αυξημένη ανθρώπινη μετάσταση του προστάτη. MAP2K4 αυξημένη ανάπτυξη όγκου

in vivo

, αλλά όχι

in vitro

. Κάτω από την πίεση της χρόνιας έκφρασης, η οποία μιμείται την κλινική κατάσταση, MAP2K4 οδήγησε σε μια επανα-καλωδίωση οδών σηματοδότησης κυττάρου. Αυτό οδήγησε σε μια παράκαμψη της άμεσης πρωτεϊνών κατάντη σηματοδότησης, p38 MAPK και JNK. Εντοπίσαμε ένα μοναδικό μηχανισμό αποζημίωσης σύμφωνα με την οποία MAP2K4 οδήγησε σε μια ρύθμιση προς τα επάνω στην έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης HSP27. Αυτό με τη σειρά του οδήγησε σε υψηλότερα απόλυτα επίπεδα φωσφορυλιωμένη HSP27, και αυξήσεις στην κατάντη ΜΜΡ-2. Το μεταστατικό φαινότυπο MAP2K4 καθοδηγείται δείχθηκε να εξαρτάται από HSP27 και καθοδικός τελεστής του, ΜΜΡ-2. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι MAP2K4 είναι μια σημαντική κινητήρια δύναμη της ανθρώπινης μετάσταση προστάτη, και με αυτόν τον τρόπο να επικυρώσει ως θεραπευτικός στόχος για την αναστολή του προστάτη μετάσταση. Παρέχουν επίσης μια μηχανιστική εξήγηση για τις κλινικές μελέτες που συνδέουν αυξήσεις MAP2K4, HSP27 και έκφραση της ΜΜΡ-2 για τη μελλοντική ανάπτυξη της μετάστασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο Northwestern (PHS Διασφάλισης # A3283-01). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Κυτταροκαλλιέργεια και διαμόλυνση

PC3-M και LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 2 mM L -γλουταμίνη, 10 mM ρυθμιστικού HEPES, 50units /ml πενικιλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Life Technologies) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% διοξειδίου του άνθρακα. 1542CPTX κύτταρα διατηρήθηκαν σε κερατινοκυττάρων SFM μέσα συμπληρωμένα με 2 mM L-γλουταμίνη, 10 mM HEPES ρυθμιστικό, 50units /ml πενικιλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 5 ng /ml EGF Human Recombinant, 50 μg /ml εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς (Life Technologies) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% διοξειδίου του άνθρακα.

MAP2K4 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση PC3-M, LNCaP, ή κύτταρα 1542CPTX, η προέλευση των οποίων περιγράφηκε προηγουμένως [22], με Αντιδραστήριο TransIT-LT1 Επιμόλυνσης (Mirus Bio LLC), και το πλασμίδιο DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες επιλογής G418, μεμονωμένες αποικίες συλλέχθηκαν και επεκτάθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [23]. Σε υποδεικνύεται πειράματα, προκύπτουσα επιμέρους κλωνικές κυτταρικές σειρές επιπροσθέτως επιμολύνθηκαν, όπως παραπάνω, με πλασμίδιο έκφρασης GFP, που επιλέγονται σύμφωνα με βλαστισιδίνη συνθήκες ανάπτυξης, και στη συνέχεια καθαρίζεται χρησιμοποιώντας στείρα διαλογή κυττάρων με βάση την κατάσταση GFP. Οι κυτταρικές γραμμές επικυρωμένο σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφονται στο American Type Culture Collection (ATCC) Technical Bulletin Νο 8, Cell Συστάσεις Γραμμή δοκιμή επαλήθευσης [24]. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα από χαμηλή διέλευση (δηλαδή, & lt? 15 περάσματα) χρησιμοποιήθηκαν κατεψυγμένα αποθέματα και ήταν αναπληρώνονται μετά από 20 περάσματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν ρουτίνας μικροσκοπική εξέταση για να επιβεβαιωθεί ομοιόμορφη και τυποποιημένη κυτταρική αρχιτεκτονική και καμία μικροβιακή μόλυνση, και τα κύτταρα ελέγχθηκαν και βρέθηκαν αρνητικά για λοίμωξη από μυκόπλασμα.

Για νοκ ντάουν πειράματα, Dharmacon ON-Targetplus SMARTpool siRNA που στοχεύει MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00-0005), ή μη-στόχευση siRNA (D-001810-10-05) μετασκευάστηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Dharmafect Duo (Τ-2010, όλα από την Thermo Scientific), μαζί με ρΟΜν-β-γαλακτοσιδάσης (Agilent Technologies), και χρησιμοποιηθεί μετά από 48 ώρες, όπως περιγράφεται από εμάς [11]

Τα αντιδραστήρια και πλασμίδια

ήσαν αγοράσει:. αντισώματα, SEK1 /ΜΚΚ4 (# 9152), φωσφο-p38 ΜΑΡΚ (Τ180 /Y182) (# 4631), p38 ΜΑΡΚ (# 9212), φωσφο-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), φωσφο-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) , και GAPDH (# 2118), όλα από την Cell Signaling Technology, και υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού, από GE Healthcare Biosciences? πλασμίδια, άγριου τύπου και συστατική ενεργό MAP2K4 (# 14615 και # 14813? Addgene) και GFP (ζωντανά χρώματα ροϋΝΑ 6.2 /Ν-EmGFP-GW /ΤΟΡΟ, Invitrogen)? χημικοί αναστολείς, αναστολείς ρ38 ΜΑΡΚ, SB203580 (Sigma-Aldrich) και συνδέονται αρνητικό έλεγχο, SB202474, και JNK Inhibitor II (SP600125) και αρνητικού ελέγχου JNK Inhibitor II (N

1-μεθυλο-1,9-pyrazoloanthrone), όλα από EMD Millipore.

μοντέλο ποντικού για τα Ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη μετάσταση

τα κύτταρα εμφυτεύθηκαν και μακρινή μετάσταση ποσοτικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς, με τροποποιήσεις [13], [25]. Εν συντομία, 2.5 χ 10

5 κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε κοιλιακό προστάτη του c αθυμικών ποντικών ηλικίας 6-8 εβδομάδων αρσενικά Balb /, Fed Harlan Teklad 2016S τροφή και νερό

κατά βούληση

, και στεγάζεται σε ένα φράγμα εγκατάσταση με 12 ώρες φωτός σκούρο κύκλους /. Μετά από 6 εβδομάδες, ο ιστός του όγκου καταψύχθηκαν, οι πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν /ενσωματωμένα σε παραφίνη φορμαλίνη, και το αίμα και το μυελό των οστών καλλιεργήθηκαν σε πλήρες RPMI 1640 με G418 για 10 ημέρες, και η παρουσία του CTCs καταγράφονται.

με 45 micron βήμα-τμήματα, παρακείμενα 4-micron τομές πνευμονικού ιστού ανοσοχρώστηκαν για GFP και με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Μεταστάσεις βαθμολογήθηκαν, με τυφλό τρόπο, όπως ομάδες ≥5 GFP θετικών κυττάρων.

τηλέφωνα εισβολή Αναλύσεις

Η εισβολή των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται από εμάς, με τροποποιήσεις [26]. Μετά την προσθήκη 1 × 10

5 κύτταρα, σε RPMI 1640 με 0.1% BSA, στο BD Biocoat Αυξητικό Παράγοντα Μειωμένη θαλάμους Matrigel με 8 μm μεμβράνες, τα κύτταρα εισέβαλαν για 24 ώρες προς τον κατώτερο θάλαμο, που περιέχει ελεύθερο ορού ΝΙΗ 3Τ3 ρυθμισμένα μέσα . Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 ξεχωριστές φορές, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 3. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ αναστολέα 48 ώρες πριν από, και κατά τη διάρκεια εισβολής.

εισβάλλοντα κύτταρα, δηλαδή, για την κάτω μεμβράνη, καθορίστηκαν μεθανόλη, κρυσταλλικό ιώδες βάφονται, και απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν υπό οπτικό μικροσκόπιο. Σε παράλληλα φρεάτια, τα κύτταρα στην κορυφή της μεμβράνης δεν απομακρύνθηκαν, επιτρέποντας την επιβεβαίωση από ίσο αριθμό συνολικών κυττάρων φορτωθεί. Για τα πειράματα siRNA, κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το

In Situ

β-Γαλακτοσιδάσης Χρώση Kit (Agilent Technologies), που ακολουθείται από απεικόνιση και καταμέτρηση εισέβαλαν και μη εισέβαλαν β-gal θετικά κύτταρα ανά φρεάτιο.

κυττάρων η μετανάστευση Αναλύσεις

Κινητά μετανάστευση μετρήθηκε όπως περιγράφεται από εμάς, με τροποποιήσεις [26]. Κάθε BD Falcon καλά, με 8 μm μεμβράνες, φορτώθηκε με 2,5 × 10

4 κύτταρα, και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 8 ώρες προς ρυθμισμένα μέσα στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, όπως παραπάνω. Οι αναλύσεις διεξήχθησαν 3 ξεχωριστές φορές, κάθε φορά σε επαναλήψεις Ν = 3.

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης Polymerase Chain

Αντίδραση

ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (qRT /PCR) διεξήχθη όπως περιγράφεται από εμάς [27]. Εν συντομία, RNA απομονώθηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen) για κύτταρα και με ΤπζοΙ (Invitrogen) που ακολουθείται από RNeasy Mini Kit καθαρισμού για ιστό όγκου, cDNA συντίθεται χρησιμοποιώντας TaqMan Reverse Transcription Αντιδραστήρια και qPCR εκτελούνται χρησιμοποιώντας TaqMan καθολική PCR Master Mix και εκκινητή ζεύγη καθετήρα σε 7500 ΑΒΙ Real Time PCR System (όλα από την Life Technologies). Primer ανιχνευτές ήταν: GAPDH (Hs99999905_m1), ΜΜΡ-2 (HS00234422_m1), ΜΜΡ-9 (Hs00234579_m1), ΜΜΡ-10 (Hs00233987_m1), ΜΜΡ-13 (Hs00233992_m1). Τουλάχιστον δύο ξεχωριστές δοκιμασίες διεξήχθησαν, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 2, προκύπτουσα μέση κύκλοι κατώφλι κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH, και η σχετική έκφραση του γονιδίου που υπολογίζεται από την 2

-ΔΔCt μέθοδο [28].

Κυττάρων δοκιμασία ανάπτυξης

Πέντε δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου ημέρες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από εμάς [23]. Εν συντομία, μετά από πέντε ημέρες μη συρρεόντων εκθετική ανάπτυξη σε πλάκες των 96, dimethylthiazoldiphenytetrazolium βρωμιούχο (ΜΤΤ) προστέθηκε, και OD

540 προσδιορίστηκε. Οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές, κάθε φορά σε επαναλήψεις Ν = 3.

Soft Δοκιμασία Ανάπτυξης Agar

Σε ένα 6 μορφή πλάκας καλά, 1 × 10

4 κύτταρα /0,5 ml 0,3% DNA άγαρ βάση βαθμός (Sigma Aldrich) επιστρώθηκαν σε 1 ml 0.5% agar, όλα φτιαγμένα με και τελικά ολοκληρώνεται με 0,5 ml RPMI 1640 μέσα κυτταρικής καλλιέργειας. Μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες χρώθηκαν κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Οι αναλύσεις διεξήχθησαν τρεις φορές, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 2.

Western Blots

στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως από εμάς [15]. Οι συγκεντρώσεις αντισωμάτων ήταν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η στατιστική ανάλυση

Ομάδες θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές, αν p-value t-test δύο όψεων του Student ήταν ≤0.05.

Αποτελέσματα

Αυξήσεις MAP2K4 Ανθρωπίνων Καρκίνος του προστάτη Μετάσταση

Εμείς μηχανικής σταθερή έκφραση του άγριου τύπου MAP2K4 (WT-MAP2K4), συστατική ενεργό MAP2K4 (CA-MAP2K4), ή κενό φορέα, για τους ελέγχους (VC), σε κύτταρα PC3-M. Το κατασκεύασμα CA-MAP2K4 έχει σημειακές μεταλλάξεις Ser220Glu και Thr224Glu στο μοτίβο ενεργοποίηση της [29]. Όπως προσδιορίζεται με στύπωμα Western, Σχήμα 1Α, CA-MAP2K4 και WT-MAP2K4 κυτταρικές σειρές εκφράζουν MAP2K4 2,9 και 4,3 φορές υψηλότερα επίπεδα κατά μέσο όρο, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το μέσο όρο των κυτταρικών σειρών VC. Κάθε άτομο CA-ή κυτταρική σειρά WT-MAP2K4 εκφράζει επίπεδα ≥2.6 φορές υψηλότερη. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι είναι δυνατό να κατασκευαστούν MAP2K4 κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν.

Α) έκφραση της πρωτεΐνης MAP2K4 στην παραλλαγή κυτταρικές γραμμές MAP2K4. Η έκφραση της πρωτεΐνης MAP2K4 μετρήθηκε σε άγριου τύπου, WT1, Wt2, και ιδιοσυστατική ενεργό, CA1, CA2, CA3, MAP2K4 υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές, και τον έλεγχο των φορέων, VC1, VC2, κυτταρικές σειρές με κηλίδα Western. Μια αντιπροσωπευτική κηλίδα Western απεικονίζεται, με ποσοτικοποίηση των επιπέδων MAP2K4 /GAPDH, κανονικοποιημένη σε κύτταρα VC1, που δείχνεται πάνω από κάθε λωρίδα. Β) Εισβολή της παραλλαγής κυτταρικές σειρές MAP2K4. Boyden θάλαμο Matrigel προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής διεξήχθησαν, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα είναι από 5 ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 3. Τα δεδομένα από τον αντίστοιχο άγριου τύπου, συστατική δραστική και έλεγχος φορέα κυτταρικές γραμμές συνενώθηκαν για να δώσουν μια μέση διαβάζεται για WT-MAP2K4, CA-MAP2K4 και VC κύτταρα, αντίστοιχα . Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM εκατοστιαία αναλογία των κυττάρων VC. C-Ε) Η επίδραση της έκφρασης MAP2K4 κατά την μεταστατική εξάπλωση και την ανάπτυξη του όγκου. Ίσοι αριθμοί ποντικών ορθοτοπικά εμφυτεύθηκαν με VC1 ή VC2 κύτταρα (σχηματίζοντας την ομάδα VC), WT1 ή τα κύτταρα Wt2 (WT κοόρτη), ή με CA1, CA2 ή κύτταρα CA3 (CA κοόρτη). Στο (C) το προκύπτον αριθμός των μακρινών μετάσταση εκφράζεται ως η μέση ± SEM ποσοστό των ποντικών VC, με (Ε) ο αριθμός των ποντικών αναπτυσσόμενων κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων απεικονίζεται, και (F) όγκου του όγκου απεικονίζεται γραφικά ως οι μέσοι ± SEM ποσοστό των ποντικών VC. Μία αντιπροσωπευτική εικόνα μιας διακριτής μετάστασης φαίνεται στο (D). * Υποδηλώνει p ≤ 0,05 μεταξύ VC και μια πειραματική ομάδα.

Η

Για να αξιολογηθεί η λειτουργική συνάφεια των MAP2K4 υπερέκφραση, εκτιμήσαμε την ικανότητα των κυτταρικών γραμμών να εισβάλει σε μια δοκιμασία θάλαμο Matrigel Boyden, Σχήμα 1Β. Η υπερέκφραση του MAP2K4 αυξήθηκε σημαντικά εισβολή σε μια μέση τιμή 328% για κυτταρικές γραμμές WT-MAP2K4 και 490% για τις κυτταρικές σειρές CA-MAP2K4, σε σύγκριση με κυτταρικές γραμμές VC. Για τις μεμονωμένες κυτταρικές σειρές, δηλαδή, δύο από τις δύο WT-MAP2K4 και τρία από τα τρία CA-MAP2K4, τα επίπεδα εισβολή ήταν στατιστικώς σημαντικές, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παράλληλα με μηχανική MAP2K4 υπερεκφράζουν κυτταρικές γραμμές, έχουμε μηχανικής και μια σειρά σταθερών MAP2K4 knockdown κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς μικρή φουρκέτα shRNA φορείς έκφρασης, και επιβεβαίωσε knockdown ήταν ειδική για MAP2K4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, κατά τη δοκιμή της λειτουργίας αυτών των κυτταρικών γραμμών σε προσδιορισμούς εισβολής, δεν παρατηρήσαμε μια συνεπή φαινότυπο. Συγκεκριμένα, οι μισές από τις κλωνικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μειωμένο εισβολή, ενώ το ήμισυ δεν έδειξε μεταβολή. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνες με ένα όριο έκφρασης που απαιτείται για τις επιπτώσεις από MAP2K4 κατά την ρύθμιση της εισβολής. Λόγω της έλλειψης συνεπούς φαινοτύπου με νοκ ντάουν της MAP2K4, έχουμε επιλέξει να μην ακολουθήσει αυτή περαιτέρω. Σε αντίθεση, με MAP2K4 υπερέκφραση ευρήματά μας καταδεικνύουν σαφώς μια συνεπή φαινότυπος αυξημένης εισβολής και είναι συνεπείς με τις παρατηρήσεις σε ανθρώπους, όπου η αυξημένη έκφραση MAP2K4 συμβαίνει σε επεμβατικές βλάβες στον προστάτη.

Για να προσδιοριστεί εάν η αυξημένη έκφραση MAP2K4 αυξάνει μεταστατικό δυναμικό, εξετάσαμε την επίδραση της MAP2K4 κατά την ανάπτυξη του όγκου και τον σχηματισμό μετάστασης

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού της ανθρώπινης μετάστασης προστάτη που αναπτύχθηκε ειδικά από εμάς για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων αυτών [13], [25]. Αυτό το μοντέλο είναι αποκρίνεται σε αντι-κινητικότητας θεραπευτικών παραγόντων καθώς και για μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν τη μεταστατική εξέλιξη. Σε αυτό το μοντέλο, τα ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη εμφυτεύονται απευθείας εντός του προστάτη, που επιτρέπει την μέτρηση των πρωτογενών μέγεθος του όγκου, τα κύτταρα προστάτη που εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος, όπως κατά τη μεταφορά κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΜΑ), τα κύτταρα του προστάτη στο μυελό των οστών, και των μακρινών πνεύμονα μετάσταση. Μετάσταση στους πνεύμονες είναι ένα πρωταρχικό χαρακτηριστικό τελικό σημείο αυτού του μοντέλου, που επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση των επιμέρους μεταστατικού καταθέσεων, και ως εκ τούτου μια ακριβή μέτρηση της ικανότητας των πρωτογενών κυττάρων προς μετάσταση από όργανο προέλευσής τους, μιμούμενοι την κατάσταση σε ανθρώπους.

Τρεις ομάδες ποντικών εμφυτεύθηκαν είτε με κύτταρα VC (όπου ίσο αριθμό ποντικών εμφυτεύθηκαν είτε με VC1 ή VC2 κύτταρα), κύτταρα WT-MAP2K4 (ίσους αριθμούς μεταμοσχευθεί κύτταρα WT1 ή Wt2), ή με CA-MAP2K4 κύτταρα (ίσους αριθμούς εμφυτεύεται είτε με CA1, CA2 ή κύτταρα CA3), αποδίδοντας 21, 26 και 28 ποντίκια βιώσιμα ποντίκια μετά από χειρουργική επέμβαση στην VC, WT-MAP2K4 και CA-MAP2K4 ομάδες, αντίστοιχα. Έξι εβδομάδες μετά την επέμβαση, μέγεθος πρωτογενούς όγκου, μετάσταση, και CTCs μετρήθηκαν σε κάθε ποντικό. Αυξημένη έκφραση, είτε WT-MAP2K4 ή CA-MAP2K4 αυξήθηκε σημαντικά μακρινή μετάσταση από 16,2 και 17,4 φορές, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα ποντίκια VC, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ WT-MAP2K4 και ποντίκια CA-MAP2K4, σχήμα 1Γ. Μία αντιπροσωπευτική εικόνα μιας διακριτής μετάστασης φαίνεται στο Σχ 1D. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν αυξημένη αυξήσεις MAP2K4 ανθρώπινο προστάτη μετάσταση. Είναι ενδιαφέρον, ΚΜΑ παρατηρήθηκαν μόνο σε ποντίκια CA-MAP2K4, ανιχνεύτηκαν στο αίμα του 11% (3/28) και του μυελού των οστών του 7% (2/28), σχήμα 1Ε, και αποδεικνύουν ότι ΚΜΑ είναι σχετικά σπάνια σε MAP2K4- οδηγείται μετάσταση.

Παρά WT-MAP2K4 ποντικούς που δεικνύουν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με μετάσταση VC, το μέγεθος του πρωτογενούς όγκου σε WT-MAP2K4 ποντικών ήταν κατά μέσο όρο 24% μικρότερο, αν και όχι στατιστικά σημαντική, Σχ 1F. Καθώς η αύξηση του μεγέθους του όγκου σε-και-του-η ίδια μπορεί να επηρεάσει την μεταστατική εξάπλωση, αυτό δείχνει MAP2K4 έχει μια κύρια επίδραση επί της ρύθμισης της μεταστατικής συμπεριφοράς. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι όγκοι των ποντικών CA-MAP2K4 αυξήθηκε σημαντικά κατά 2,04 και 2,67 φορές, σε σύγκριση με VC και WT-MAP2K4 ποντικούς, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, άγριου τύπου MAP2K4 δεν αυξάνει την ανάπτυξη του όγκου, αλλά συστατική ενεργό MAP2K4 κάνει.

MAP2K4 μεταβάλλει την παραγωγή πρωτεάσης, αλλά δεν τα κινητά μετανάστευση ή την ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

Η

Έχοντας δείξει ότι MAP2K4 αυξάνει μετάσταση, επιδιώξαμε να εμβαθύνουμε την κατανόησή μας των υποκείμενων μηχανισμών. Χρόνιες έκφραση MAP2K4 αυξημένη κυτταρική εισβολή (Εικόνα 1Β), και την κυτταρική εισβολή είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της μεταστατικής συμπεριφοράς. Είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσον η αυξημένη κυτταρική εισβολή στο MAP2K4 κύτταρα που υπερεκφράζουν εξαρτιόταν από MAP2K4 με να χτυπήσει κάτω MAP2K4 με siRNA. Στο Σχήμα 2Α, για κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές, επετεύχθη knockdown του 21-55%. Είμαστε δίπλα απέδειξε ότι MAP2K4 νοκ ντάουν αντιστραφεί σημαντικά τον αυξημένο φαινότυπο εισβολής παρατηρείται τόσο WT-MAP2K4 και τα κύτταρα CA-MAP2K4, σχήμα 2Β. Ως εκ τούτου, η κυτταρική εισβολή εξακολουθεί να εξαρτάται από τη συνέχιση της έκφρασης MAP2K4.

Οι μελέτες διεξήχθησαν σε παραλλαγή κυτταρικές σειρές MAP2K4. Α) Νοκ ντάουν της MAP2K4 πρωτεΐνης με siRNA. Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων με siRNA που στοχεύει MAP2K4 (siMAP2K4) ή μη-στόχευσης ελέγχου (SICON), η έκφραση MAP2K4 μετρήθηκε με κηλίδα Western. Ποσοστό knockdown υποδηλώνεται πάνω από την κηλίδα. Β) Επίδραση των MAP2K4 νοκ ντάουν στην κυτταρική εισβολή. MAP2K4 κυτταρικές γραμμές παραλλαγής υποβλήθηκαν σε θεραπεία με siRNA, όπως υποδεικνύεται, και η κυτταρική εισβολή μετριέται και απεικονίζεται όπως στο Σχ 1. Τα δεδομένα είναι από τέσσερα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 2, και εκφράζονται ως το ποσοστό της εισβολής κυττάρων. Γ) Επιδράσεις στην κυτταρική μετανάστευση. μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Δεδομένα από επιμέρους τύπους κλώνων σε συνδυασμό, είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 3, και εκφράζονται ως το ποσοστό των μεταναστευόντων κυττάρων, κανονικοποιημένη για VC. Δ) έκφραση μεταγραφή ΜΜΡ. Τα επίπεδα ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-10 και ΜΜΡ-13 επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν με qRT /PCR, κανονικοποιημένη σε GAPDH, και εκφράζεται ως το ποσοστό του VC. Τα δεδομένα είναι από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 2. Ε) Η ανάπτυξη των κυττάρων. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, αφέθηκε να αναπτυχθεί για 5 ημέρες, ΜΤΤ προστέθηκε, και προσδιορίστηκε η οπτική πυκνότητα. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε Ν = 3. σχηματισμός F) αποικίας. σχηματισμός αποικιών μετά από 14 ημέρες προσδιορίστηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε Ν = 2, και εκφράζεται ως η επί τοις εκατό του VC. Οι τιμές σε όλα τα γραφήματα είναι ο μέσος όρος ± SEM. * Υποδηλώνει p ≤ 0,05 μεταξύ των υποδεικνύεται ομάδων.

Η

Δεδομένου ότι ο αναγνωρισμένος ρόλος των κυττάρων εισβολής στη μεταστατική εξέλιξη, εξετάσαμε περαιτέρω τις μηχανιστικές βάσεις της επίδρασης MAP2K4 του κατά την κυτταρική εισβολή. Κυτταρική εισβολή οδηγείται κυρίως από τη μετανάστευση των κυττάρων σε συνδυασμό με πρωτεάση πέψη. Ούτε WT-MAP2K4 ούτε CA-MAP2K4 υπερέκφραση αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων σε ένα χωρίς επικάλυψη δοκιμασία θαλάμου Boyden, σχήμα 2C. Επιπλέον, παρατηρήσαμε καμία σταθερή επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση μετράται με τη δοκιμασία κινητικότητος μονού κυττάρου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εξετάσαμε επίδραση MAP2K4 του κατά την έκφραση πρωτεάσης. Επειδή υπάρχει ένα ευρύ φάσμα των γνωστών πρωτεασών, πραγματοποιήσαμε την πρώτη οθόνη για το σχετικό πρωτεάσες. Έχουμε προηγουμένως συσταθεί genistein συνδέεται με και αναστέλλει MAP2K4 κινάση, αναστέλλοντας έτσι την ανθρώπινη κυτταρική εισβολή προστάτη [11]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της αγωγής γενιστεΐνης σε φυσικά κύτταρα PC3-M χρησιμοποιώντας την εξωκυτταρική μήτρα και Adhesion Μόρια RT

2 σύστημα Array Profiler PCR, η οποία προφίλ 84 ανθρώπινων γονιδίων που ρυθμίζουν κυττάρου-κυττάρου και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας (Σχήμα S1). Οι ακόλουθες πρωτεάσες ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω κατά τουλάχιστον 2-φορές με genistein: ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-10 και ΜΜΡ-13, και επιβεβαιώθηκαν με ειδική γονιδιακή qRT /PCR (Σχήμα S1). Με βάση αυτά τα ευρήματα, εξετάσαμε την έκφραση αυτών των τριών πρωτεασών στο πλαίσιο της MAP2K4 υπερέκφραση. Επιπλέον, όπως ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι στενά συνδεδεμένα ζελατινάσες, συχνά συν-ρυθμίζονται, και επηρεάζει ως genistein ΜΜΡ-9 είναι μερικές κυτταρικές γραμμές, αν και επεισοδιακά και σε ένα μικρό βαθμό, πραγματοποιήσαμε πρόσθετη μετρούμενη ΜΜΡ-9 [30]. Μέτρηση των επιπέδων μεταγραφής από qRT /PCR αποκάλυψε ότι η ΜΜΡ-2 αυξήθηκε σημαντικά με μία μέση τιμή & gt? 15 φορές σε σύγκριση με VC, και στις δύο κύτταρα WT-MAP2K4 και CA-MAP2K4. ΜΜΡ-9 αύξησε σημαντικά την 2-φορές, αλλά μόνο σε κύτταρα WT-MAP2K4. ΜΜΡ-10 και ΜΜΡ-13 δεν επηρεάστηκαν. Ως εκ τούτου, MAP2K4 μεσολάβηση αυξήσεις στην εισβολή δεν οφείλονται σε αλλαγές στην κυτταρική μετανάστευση, αλλά συνδέονται με μεταβολές στην έκφραση πρωτεάσης, ΜΜΡ-2 ειδικότερα. Αυτό είναι κλινικά σημαντική, όπως ΜΜΡ-2 μπορεί να υποβαθμίσει το κολλαγόνο IV, ένα σημαντικό συστατικό του προστατικού ιστού, και έχει συσχετιστεί με κακή πρόγνωση, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης της μετάστασης (αναθεωρούνται στο [31]).

Στη συνέχεια ερευνήσαμε η αύξηση του μεγέθους του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς CA-MAP2K4, σχήμα 1Ε, για να καθοριστεί αν η ανάπτυξη μεταβάλλεται

in vitro

, Σχήμα 2Ε-F. Σε πέντε ημέρες

in vitro

δοκιμασία ΜΤΤ, υπάρχουν διαφορές στην ανάπτυξη των κυττάρων μεταξύ των ομάδων παρατηρήθηκαν, σχήμα 2Ε. Σε μία δοκιμασία 14 ημερών μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας, κύτταρα CA-MAP2K4 αυξήθηκε ελαφρώς βραδύτερα από τα κύτταρα VC και WT-MAP2K4, αλλά αυτή η αλλαγή δεν ήταν σημαντική, Σχ 2F. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι κάτω από το

in vitro

συνθήκες ανάπτυξης, ούτε WT-MAP2K4 ούτε CA-MAP2K4 επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων.

MAP2K4 υπερέκφραση μεταβάλλει ειδικά φωσφορυλίωση HSP27 και η συνολική έκφραση της πρωτεΐνης

τα παραπάνω ευρήματα δείχνουν ότι MAP2K4 αυξάνει σχετικά ειδικά ΜΜΡ-2. Παροδική τροποποίηση του MAP2K4 ρυθμίζει ΜΜΡ-2 και κυττάρων εισβολής με φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ [12]. Εκτός από την ρ38 ΜΑΡΚ, MAP2K4 μπορεί επίσης είτε ενεργοποιούν JNK, ή αμφότερες τις πρωτεΐνες, εξαρτάται από το πρότυπο σύστημα [32]. JNK συνήθως συνδέεται με αλλαγές στην πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε απάντηση στο στρες σε ανθρώπινο προστάτη [33] – [35], αλλά επίσης και με τις αλλαγές στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [36], [37]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η χρόνια έκφραση MAP2K4 θα αυξήσει ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ και /ή JNK. Δοκιμάσαμε αυτή τη θεωρία με την εξέταση φωσφο-p38 ΜΑΡΚ, -JNK1 και -JNK2 επίπεδα με Western blot στον MAP2K4 πάνω από κυτταρικές σειρές που εκφράζουν, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα φωσφοπρωτεΐνη. Ωστόσο, τα ευρήματα μας δεν υποστηρίζουν την υπόθεσή μας, όπως η υπερέκφραση του MAP2K4 δεν αυξήθηκε ούτε φωσφο- ή συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης είτε p38 ΜΑΡΚ ή JNK, Εικόνα S2.

Τα ευρήματά μας υποστήριξε την υπόθεση ότι κάτω από συνθήκες παρατεταμένης MAP2K4 υπερέκφραση, όπως συμβαίνει στην κλινική σενάριο, αντισταθμιστικές μονοπάτια μπορεί να παρακάμπτει τους στόχους αμέσως κατάντη του MAP2K4, αφήνοντας έτσι τους σε ένα ανενεργό κατάσταση. HSP27, ένας μεταγενέστερος του p38 ΜΑΡΚ, αυξάνει τόσο την ΜΜΡ-2 έκφρασης και κύτταρο εισβολή στο ανθρώπινο PCa, υπό συνθήκες παροδικής επιμόλυνσης [12], [15]. Ως εκ τούτου, εξέτασε την κατάσταση της HSP27, Σχήμα 3Α-Β. Συνολικά επίπεδα τόσο φωσφο- και συνολική HSP27, σε σύγκριση με GAPDH, αυξήθηκαν. Φωσφο- και συνολική HSP27 αυξήθηκε κατά 3,4 (σημαντικά) και 2.7 (μόνο μια τάση? 2 όψεων p-value = 0,065), αντιστοίχως, για τα κύτταρα WT-MAP2K4, και οι δύο σημαντικά από 3,1 και 3,0-φορές για κύτταρα CA-MAP2K4 . Η /συνολική αύξηση αναλογίας HSP27 φωσφο-HSP27 ήταν μικρή, και σημαντικές μόνο για τα κύτταρα WT-MAP2K4. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν MAP2K4 οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα ολικής και φωσφο-HSP27 πρωτεΐνη. Δεν υπήρχαν διαφορές στην γονιδιακή έκφραση HSP27 μεταξύ MAP2K4 υπερεκφράζουν και κυττάρων VC, Σχήμα 3C, που δείχνει ότι οι διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης προήλθε από αλλοιώσεις στη μετάφραση ή /και την υποβάθμιση των πρωτεϊνών. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα ευρήματα καθορίζουν ότι η χρόνια MAP2K4 υπερέκφραση οδηγεί σε αυξημένη έκφραση HSP27 πρωτεΐνης, ενώ παρακάμπτοντας την ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ και ΙΝΚ.

Η έκφραση της ολικής και φωσφορυλιωμένες μορφές των πρωτεϊνών HSP27 αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western στην υποδεικνύεται κυτταρικές σειρές, AB. Τα δεδομένα από τρεις χωριστές κηλίδες απεικονίζονται γραφικά INB, ως μέση τιμή ± SEM. C), τα επίπεδα μεταγραφής HSP27 μετρήθηκαν με qRT /PCR, κανονικοποιημένη σε GAPDH, και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM ποσοστό VC.