Αφηρημένο

Η υποξία και η φλεγμονή είναι αυστηρά διασυνδέονται τόσο σύμφωνη με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Πολυάριθμες αναφορές τονίζουν το ρόλο των καρκινικών κυττάρων στη σύνθεση προ-φλεγμονωδών μορίων και δείχνουν ότι η υποξία μπορεί να διαμορφώνει μια σειρά από αυτά τα γονίδια που συμβάλλουν ουσιαστικά στην αύξηση της επιθετικότητας του καρκίνου. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη σημασία του φαινοτύπου του όγκου σε αυτή τη διαδικασία. Η παρούσα μελέτη διερευνά το πώς τα διαφορετικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης και την επιθετικότητα, του όγκου του προστάτη κυτταρικών γραμμών αντίκτυπο στην υποξική αναδιαμόρφωση των προ-φλεγμονωδών γονιδιακή έκφραση και κακοήθεια. Πραγματοποιήσαμε μελέτες μας σε τρεις κυτταρικές γραμμές με την αύξηση μεταστατικό δυναμικό: το καλά διαφοροποιημένο ανδρογονοεξαρτώμενων LNCaP και το λιγότερο διαφοροποιημένη και ανδρογόνα-ανεξάρτητους DU145 και PC3. Αναλύσαμε την επίδραση ότι υποξική θεραπεία έχει στη διαμόρφωση προ-φλεγμονωδών γονιδιακής έκφρασης και αξιολόγησε τα ισόμορφα HIF ρόλος και NF-kB play στη διατήρηση αυτής της διαδικασίας. DU145 και τα κύτταρα PC3 αποδεικνύεται υψηλότερη νορμοξικές έκφρασης και μια πιο ολοκληρωμένη υποξική διέγερση του προ-φλεγμονωδών μορίων σε σύγκριση με την καλά διαφοροποιημένο LNCaP κυτταρική γραμμή. Ο ρόλος των HIF1α και NF-kB, ο πλοίαρχος ρυθμιστές της υποξίας και της φλεγμονής, αντίστοιχα, στη διατήρηση της υποξική προ-φλεγμονώδη φαινότυπο ήταν διαφορετική ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου. NF-kB παρατηρήθηκε να παίξει ένα κύριο ρόλο στην DU145 και PC3 κύτταρα στα οποία η θεραπεία με τον αναστολέα παρθενολίδη NF-kB ήταν σε θέση να αντισταθμίσει τόσο την υποξική προ-φλεγμονώδη μετατόπιση και ενεργοποίηση HIF1α αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP. τονίζουν τα δεδομένα μας ότι φαινοτύπου των κυττάρων του προστάτη όγκου συμβάλλει σε διαφορετικό βαθμό και με διαφορετικούς μηχανισμούς για την υποξική προ-φλεγμονώδη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου

Παράθεση:. Ραβέννα L, Principessa L, Verdina Α, Salvatori L, Russo MA, Petrangeli Ε (2014) Ξεχωριστά φαινότυποι των Ανθρωπίνων κύτταρα καρκίνου προστάτη Συνεργάτης με διαφορετικά προσαρμογή στην υποξία και προ-φλεγμονωδών γονιδιακής έκφρασης. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10.1371 /journal.pone.0096250

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Σεπ, 2013? Αποδεκτές: 4 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2014

Copyright: © 2014 Ραβέννα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης και Έρευνας (MIUR, COFIN 2006062242). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη εμφανίζει μια ετερογενή πληθυσμό κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βλαστικών κυττάρων σπάνια μορφή καρκίνου (CSC) και προγονικών κυττάρων πολυδύναμα (Ps) ενσωματωμένα σε μια μάζα των κυτταρικών τύπων σε διάφορους βαθμούς διαφοροποίησης. Η σχετική αφθονία της CSC + Ps και η διαφοροποίηση των χύμα κυττάρων συσχετίζονται με κακοήθεια του όγκου [1], [2]. Ωστόσο, λίγα στοιχεία είναι διαθέσιμα σχετικά με τις επιπτώσεις του φαινοτύπου των χύμα καρκινικών κυττάρων στην προσαρμογή στην πίεση του περιβάλλοντος και ιδιαίτερα στην υποξία. Η υποξία είναι μια μείωση του φυσιολογικού επιπέδου τάση οξυγόνου ιστού που μπορεί να εμφανιστούν σε ασθένειες του ανθρώπου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η υποξία προωθεί μια πιο επιθετική μεταστατικό φαινότυπο σε ανθρώπινους καρκίνους όπως του μαστού [3], γλοιοβλάστωμα [4], του θυρεοειδούς [5], του παχέος εντέρου [6], παγκρεατικό [7], και ιδίως όγκους του προστάτη [8] – [10] η οποία συνδέεται με κακή πρόγνωση. Υποξία παράγοντες που διεγείρονται (HIFs) αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της μεταγραφικής απόκρισης σε υποξικό στρες [11]. Είναι ετεροδιμερή που σχηματίζονται από ένα O

2 ευαίσθητο υπομονάδα α και μία συστατικώς εκφράζεται β υπομονάδα (HIF1β). Τρεις ισομορφές του επαγώγιμου HIFα είναι παρούσες στα θηλαστικά. HIF1α και HIF2α είναι τα καλύτερα χαρακτηρισμένα και δομικά παρόμοια ισόμορφα [12]. HIF3α είναι η σχετική πιο μακρινή ένα με πολλές παραλλαγές ματίσματος [13]. Με την παρουσία του οξυγόνου, HIF1α υφίσταται αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Υπό υποξικές συνθήκες, συσσωρεύεται στους πυρήνες των κυττάρων, σχηματίζει ετεροδιμερή με HIF1β και δεσμεύει στοιχεία απόκρισης υποξίας στο γονίδιο στόχο τόπους. Επίσης HIF2α και HIF3α παρούσα σταθεροποίησης υποξική και δεσμευτική για HIF1β αν και με διαφορετική κινητική. Τόσο HIF2α και HIF3α εμφανίζονται εκφράζεται σε ένα κύτταρο-ειδικό τρόπο και να παίξει μη περιττή ρόλους στην προσαρμογή στην υποξία και σε υποξικά ανάπτυξη και την εξέλιξη [14] του όγκου, [15]. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι η φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει περαιτέρω οδηγεί σε ανάπτυξη του καρκίνου στον προστάτη [16], [17]. Φλεγμονώδης απόκριση γονίδιο εξαρτάται από διάφορους παράγοντες μεταγραφής, μεταξύ των οποίων NF-kB παίζει ένα κεντρικό ρόλο. Η κλασική μορφή της NF-kB είναι η ετεροδιμερές p50 /p65. Μετά την ενεργοποίηση, NF-kB διμερή μετατοπίζονται μέσα στον πυρήνα όπου μπορούν να υποστούν φωσφορυλίωση, γονίδια-στόχους συνδέονται και να διεγείρουν τη μεταγραφή [18]. Ένα cross-talk μεταξύ του NF-kB και τα μονοπάτια HIF έχει τεκμηριωθεί εκτενώς [19] – [21]. Πράγματι, η υπομονάδες ρ50 ΝΡ-κΒ και ρ65 αλληλεπιδρούν άμεσα με την συναινετική θέση ΝΡ-κΒ επί του υποκινητή HIF1α και συμβάλλουν στην βασικά επίπεδα HIF1α mRNA και πρωτεΐνης σε ορισμένα μοντέλα [22], [23]. Από την άλλη πλευρά, η υποξία φαίνεται να ενεργοποιεί NF-kB εξαρτώμενη μεταγραφή γονιδίου [24]. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί που συνδέουν την υποξία σε φλεγμονή και φλεγμονή εξέλιξης του όγκου εξακολουθούν να παραμένουν ασαφείς. Πρόσφατες εκθέσεις κατέδειξαν το ρόλο των υποξικών κυττάρων όγκου στη σύνθεση των φλεγμονωδών σχετίζονται μόρια στο μητρικό [3], γλοιοβλάστωμα [4], του θυρεοειδούς [25] και του προστάτη [26] κακοήθη εξέλιξη του καρκίνου. Επιπλέον, αποδεικνύεται ότι μια συντονισμένη πορεία, περιλαμβανομένων φλεγμονωδών και επανορθωτικής μόρια είναι παρόν στον ιστό του όγκου σε απουσία ανιχνεύσιμου λευκοκυττάρων διηθήματος (CD45 +) και είναι επάνω-ρυθμιζόμενη σε μετασχηματισμένα κύτταρα.

Η παρούσα μελέτη διεξήχθη προκειμένου να αναλυθεί η σχετική σημασία των οδών HIF και NF-kB στην διαμόρφωση της υποξικής φλεγμονωδών γονιδιακής έκφρασης σε μοντέλα προστάτη κύτταρο που δείχνει διακριτές φαινοτύπους με την αύξηση της διαφοροποίησης. Αποσαφήνιση τη συγκεκριμένη συμμετοχή των δύο αυτών περιόδων εντός του όγκου ετερογενών κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν χρήσιμες πτώση-out για την κλινική έρευνα και τη θεραπεία [27]. Για το σκοπό αυτό, εκτελέσαμε πειράματα μας στην καλά διαφοροποιημένο, ανδρογόνο-εξαρτώμενη LNCaP και στις λιγότερο διαφοροποιημένα, ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές DU145 και PC3 προστάτη όγκου με χαμηλή, μέτρια και υψηλού μεταστατικού δυναμικού, αντίστοιχα [28] – [32] . Πήραμε υπόψη ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσοαπόκριση που εμπλέκονται σε μεγάλο βαθμό στην πρόοδο του όγκου του προστάτη που παρουσιάστηκαν ρυθμίζεται αυξητικά στον ιστό του όγκου [26], [33]. Αυτά περιλαμβάνουν: τον υποδοχέα ζημιά για τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (RAGE) και τον υποδοχέα πουρίνης (P2X7R), τον παράγοντα αγγειακής επιδερμικού αυξητικού Α (VEGF) που συμμετέχουν στην αγγειογένεση των όγκων, η επαγώγιμη ένζυμα Ciclo-οξυγενάσης-2 (COX2) αρμόδια για τις προσταγλανδίνες σύνθεση, η οξεία φάση πρωτεΐνη πεντραξίνη 3 (ΡΤΧ3) και ο υποδοχέας χημειοκίνης CXC 4 (CXCR4) του στρωματικών κυττάρων που προέρχονται από παράγοντα, ρυθμιστή της μεταστατικής ανάπτυξης και του σχηματισμού μετάστασης. Επιπλέον, αναλύσαμε τα επίπεδα της αίμης-οξυγενάσης-1 (HO1), το περιοριστικό ρυθμού ένζυμο στην αποικοδόμηση αίμης, ως ένα πρωτότυπο των αντι-φλεγμονωδών ρυθμιστής [34], [35]. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του NF-kB στον υποξία οδηγείται διαμόρφωση των αναλύθηκαν προ-φλεγμονωδών γονιδίων, μελετήσαμε τα αποτελέσματα του αναστολέα παρθενολίδη ΝΡ-κΒ. Η συμβολή των HIF1α και η συνδυασμένη δράση του NF-kB και HIF1α αναλύθηκαν στα κύτταρα DU145 ανδρογόνα-ανεξάρτητους σταθερά νοκ ντάουν για HIF1α.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια κυττάρων

Ανθρώπινα προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές LNCaP, DU145 και PC3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. LNCaP αναπτύχθηκαν σε μέσο ΚΡΜ1-1640, DU145 και PC3 σε μέσο D-ΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ν /ν αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (HyClone Thermo Scientific) και 100 U /ml πενικιλίνη + 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Πουρομυκίνη dihydrocloride (Sigma-Aldrich) 2 μg /ml ήταν πάντα προστέθηκε στο μέσο του HIF1α κλώνων knockdown. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες ορθοξικές (95% αέρα και 5% CO

2) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C. Για τα πειράματα σε συνθήκες υποξίας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα σε πλήρες μέσο ανάπτυξης σε πυκνότητα ανάλογα με τη διάρκεια της θεραπείας να φθάσουν συρροής όταν διεξήχθη η ανάλυση. Την ημέρα του πειράματος, το μέσο αντικαταστάθηκε με προετοιμασμένων μέσο και κυτταρικές καλλιέργειες υποξικές υποβλήθηκαν σε υποξία σε σφραγισμένο modular θάλαμο επώασης (Μπίλαπς-Rothenberg) ξεπλένεται με 1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C. Παρθενολίδη (Sigma-Aldrich) θεραπείες διεξήχθησαν σε μια συγκέντρωση 5 μΜ για το χρόνο που υποδεικνύεται, προηγείται πάντα μια προ-θεραπεία 2 ώρες σε φυσιολογική οξυγόνωση.

εκχύλιση πρωτεϊνών και δοκιμασία κηλίδος Western

Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με κιτ πυρηνικό εκχύλισμα (Active Motif). Συνολικά 5-20 μg πρωτεΐνες αναλύθηκαν επί πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου Tris-HCl και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο διφθοριούχο (Invitrogen). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε PBS-άπαχο γάλα 5% (Bio-Rad Laboratories) για 1 ώρα, ανιχνεύθηκαν με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοσύμπλοκα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ χημειοφωταύγειας (EuroClone). Ψηφιακές εικόνες των προκυπτόντων ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με το πακέτο λογισμικού Ποσότητα One (Bio-Rad Laboratories) και εκφράζεται ως αυθαίρετες πυκνομετρικές μονάδες

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα:. Ποντικού αντι-HIF1α (1:500 , BD Bioscience)? αντι-HIF2α και αντι-Ρ50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals)? αντι-HIF3α (1:1000, Aviva Βιολογικά Συστήματα)? ποντίκι αντι-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology)? αντι-φωσφο ΝΡ-κΒ ρ65 κουνελιού (Ser 276) (1:1000, Cell Signaling)? ποντικού αντι β-ακτίνης (1:10000, Sigma Aldrich)? υπεροξειδάση κρένου συζευγμένη αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού (1:2000, Bio-Rad Laboratories).

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο

ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Ολικό RNA εξήχθη από το αντιδραστήριο ΤπζοΙ και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας Superscript II αντίστροφη μεταγραφάση και τυχαίους εκκινητές (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική RT-PCR έγινε με το ΑΒΙ Prism 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Life Technologies). TaqMan Gene Expression κιτ δοκιμασίας χρησιμοποιήθηκαν για HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, ΡΤΧ3, CXCR4, HO1 και 18S rRNA (Life Technologies) με τους όρους προεπιλογή ποδηλασίας του κατασκευαστή. Το επίπεδο του mRNA του κάθε γονιδίου ποσοτικά με τη χρήση ενός κατάλληλου πρότυπη καμπύλη και ομαλοποιήθηκε ως προς τα rRNA 18S γονίδιο καθαριότητας.

Σταθερό γονιδιακής σίγασης

ακολουθία υπόθαλψη Αποστολή shRNA Βακτηριακές γλυκερόλη Χρηματιστήριο επαληθεύεται shRNA φακοϊού πλασμίδιο φορείς ( κλώνος αριθμούς TRCN0000003810 και TCRN0000010819) που εκφράζουν μικρή RNA φουρκέτας (shRNA) με στόχο HIF1α (HIF1α shRNA) και τα μη στόχευση αρνητικό πλασμίδια ελέγχου shRNA (NTshRNA) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Βακτηριακές καλλιέργειες ενισχύθηκαν και τα πλασμίδια shRNA καθαρίστηκε (PureLink, Invitrogen) και επιμολύνθηκε σε κύτταρα DU145. Σταθερές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα με διάμετρο 6 cm. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 4 μg πλασμιδίου σε ένα μέσο χωρίς αντιβιοτικά. Έξι ώρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με ένα πρότυπο μέσο και, 24 ώρες μετά την έναρξη της διαμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε διαφορετικές αραιώσεις. Μετά από άλλες 24 ώρες, το επιλεκτικό αντιβιοτικό υδροχλωρική πουρομυκίνη προστέθηκε στην τελική συγκέντρωση 2 μg /ml. Δέκα αποικίες επιλέγονται για κάθε φορέα πλασμιδίου ενισχύθηκαν και εξετάστηκαν για έκφραση HIF1α mRNA. Αποικίες με μειωμένο επίπεδο HIF1α mRNA (~ 20% του μέσου βάρους αξίας) για φίμωση πλασμιδίου φορείς και σε επίπεδο mRNA συγκρίσιμο με βάρος κύτταρα για NTshRNA πλασμιδιακού φορέα ελέγχθηκαν για την πυρηνική πρωτεΐνη HIF1α με κηλίδα western, μετά από 4 ώρες υποξική διέγερση. Για να μειωθεί η μεταβλητότητα των υποξικών απόκρισης, εκτελέσαμε πειράματα μας σε τρεις διαφορετικές knockdown κλώνων και παρουσιάζουμε τη μέση ± SE των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από κάθε κλώνο. Για τον έλεγχο, χρησιμοποιήθηκε ένα μείγμα από τρία μη στόχευσης φορείς πλασμιδίου επιμολυσμένων κλώνων. NTshRNA DU145 και WT κύτταρα δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα νορμοξικές και υποξικές επίπεδα όλων των παραμέτρων που αναλύθηκαν. Ως εκ τούτου, έχουμε αναφέρει ως «βάρος» στην μέση τιμή ± SE των δεδομένων που λαμβάνονται τόσο από κ.β. και NTshRNA DU145 κύτταρα.

Η στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα είναι απεικονίζεται. Οι τιμές σε γραφήματα ράβδων δίνεται ως μέσο ± SE. Η στατιστική σημαντικότητα για ενιαία συγκρίσεις των κανονικά κατανεμημένων δεδομένων προσδιορίστηκε με δοκιμασία t του Student ή με Mann-Whitney test Rank Sum για δεδομένα κανονικά δεν διανέμεται. Όλα τα στατιστικά στοιχεία αναλύθηκαν με το πρόγραμμα PRISM. P-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές (* /° /# P & lt? 0,05, ** /οο /## P & lt? 0,01, *** /οοο /### P & lt? 0.001).

Αποτελέσματα

πρωτεΐνη πυρηνική μετατόπιση και η μεταγραφή του mRNA της HIF1α HIF2α και HIF3α σε υποξικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη LNCaP, DU145 και PC3

η πυρηνική μετατόπιση είναι ένα μέτρο της ενεργοποίησης των ισομορφών HIF. Ως εκ τούτου, χαρακτηριζόμενη από το προφίλ πυρηνική έκφραση του HIF1α, HIF2α και HIF3α στις κυτταρικές γραμμές του προστάτη LNCaP όγκου, DU145 και PC3 μετά από στέρηση οξυγόνου (Σχήμα 1Α). Σε νορμοξικά ελέγχου, HIF1α πρωτεΐνη ήταν μη ανιχνεύσιμη ή παρόν σε πολύ χαμηλό επίπεδο. Ένα% οξυγόνου αυξήθηκε πυρηνική μετατόπιση της σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν με παρόμοιες κινητικές. Πυρηνική συσσώρευση άρχισε νωρίς μετά την στέρηση οξυγόνου (1 ώρα), κορυφώθηκε μετά από 4 ώρες και υποχώρησε κοντά στο επίπεδο βάσης από 48 ώρες. HIF2α ήταν παρούσα στον πυρήνα σε όλα τα μοντέλα των κυττάρων και στη φυσιολογική οξυγόνωση και την ποσότητα της δεν φάνηκε διαμορφωμένο σημαντικά σε κανένα από τα μελετήθηκαν μοντέλων. Μια πρωτεΐνη 72 kDa πυρηνική HIF3α ήταν ανιχνεύσιμη μόνο στα ορθοξικές DU145 κύτταρα όπου μια καθυστερημένη επαγωγή παρατηρήθηκε επίσης αρχίζουν μετά από 24 ώρες διέγερσης. Η πυκνομετρική ανάλυση αποδεικνύεται μέγιστη αύξηση της τάξης του 2,8 ± 0,8 σε σύγκριση με πτυχώσεις νορμοξικό κύτταρα μετά από την απόσυρση του οξυγόνου 48 ώρες και βραδεία μείωση σε τιμές ακόμη υψηλότερα από εκείνα των ελέγχων μετά από 72 ώρες υποξία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κυττάρων εκτέθηκαν έως 1% O

2 από 1 έως 48-72 ώρες, ανάλογα με τον πειραματικό σχεδιασμό ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Μια έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε σε πυρηνικά εκχυλίσματα με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα για κάθε γονίδιο σε κάθε μελετηθεί κυτταρικές γραμμές δείχνεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. προσδιορισμοί Β mRNA διεξήχθησαν με πραγματικού χρόνου PCR, κανονικοποιημένη με τις οικοκυρική 18S rRNA γονιδίου και εκφράζεται ως επαγωγή πτυχής σε σχέση με νορμοξικές ελέγχους (που ορίστηκε σε 1). Μέσες τιμές ± SE.

Η

Τα αποτελέσματα της υποξίας στα επίπεδα HIF1α, HIF2α και HIF3α mRNA στα σπούδασε μοντέλα κυττάρων που απεικονίζεται στο Σχήμα 1Β. HIF1α mRNA εκφράστηκε σε όλα τα μη διεγερμένα κύτταρα. Στο περιβάλλον υποξίας, επίπεδο HIF1α mRNA παρέμεινε αμετάβλητο επί 4 ώρες και στη συνέχεια απότομα μειώθηκε σε 40-50% της αξίας βάσης και παρέμεινε σταθερά χαμηλή έως 48 θεραπεία h. Επίσης HIF2α mRNA εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές νορμοξικές και έδειξε μία αργά και ελαφρά αύξηση μόνο στο ανδρογόνο-εξαρτώμενη LNCaP μετά από στέρηση 24 και 48 ώρες οξυγόνο. HIF3α mRNA ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε DU145. Σε αυτό το μοντέλο των κυττάρων, υποξία καθορίζεται mRNA πάνω ρύθμιση που προηγήθηκε της αύξησης της πυρηνικής πρωτεΐνης, αρχίζοντας μετά από 4 ώρες και την επίτευξη διέγερσης κορυφή μετά από 48 ώρες (10,8 ± 1,5 φορές επαγωγής).

Συνολικά, τονίζουν τα δεδομένα μας ότι η ισομορφή HIF1α, από τα τρία που αναλύθηκαν, είναι ο κύριος παίκτης στην απόκριση στην υποξία, ανεξάρτητα του φαινοτύπου των κυττάρων. ενεργοποίηση HIF3α είναι ειδικό κύτταρο και δεν φαίνεται να σχετίζονται με τον καρκίνο των κυττάρων επιθετικότητα.

υποξία ενεργοποιεί το μονοπάτι ΝΡ-κΒ σε DU145 και PC3 αλλά όχι σε ανδρογονο-εξαρτώμενη κύτταρα LNCaP

αξιολόγησε την επίδραση της υποξίας στην κατάσταση NF-kB με ανάλυση κηλίδος western, ποσοτικοποίηση της ποσότητας ρ50 και ρ65 υπομονάδες της πυρηνικής σε πειράματα χρονικής πορείας της στέρησης οξυγόνου. Basal NF-kB ενεργοποίηση παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Πυρηνική μετατόπιση των δύο ρ50 και ρ65 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με νορμοξικές κύτταρα σε PC3 (1-4 h) και DU145 (2-4 ώρες), ενώ στέρηση οξυγόνου απέτυχε να ρυθμίζει σημαντικά πυρηνικά θέματα NF-kB σε κύτταρα LNCaP μέσα στο ίδιο χρονικό διάστημα βαθμονόμησης (Σχήμα 2).

κυττάρων εκτέθηκαν σε 1% O

2 από 0,5 έως 24 ώρες ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Μετά χρόνους που αναφέρονται, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και η πυρηνική περιεχόμενο του ρ50 και ρ65 ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα για κάθε γονίδιο σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν φαίνεται. Η μέση πυκνομετρία του NF-kB ρ50 και ρ65 σε σχέση με την β-ακτίνη ± SE αποδεικνύεται επίσης και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες. * Κύτταρα Υποξική

vs κύτταρα ελέγχου

ορθοξικές.

Η

Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι η υποξία έχει διαφορετικό αντίκτυπο στις NF-kB οδού σύμφωνα με φαινότυπο των κυττάρων του όγκου.

Υποξική αυξορρύθμιση της φλεγμονώδους σχετίζονται φαινοτύπου σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

στη συνέχεια μελετήθηκε ο ρόλος της υποξίας στην ρύθμιση της σύνθεσης των προ-φλεγμονωδών μορίων στις περιγραφόμενες κυτταρικές γραμμές όγκου του προστάτη. Για το σκοπό αυτό, έχουμε επιλέξει έναν αριθμό αντιπροσωπευτικών μελών των οικογενειών γονιδίων που εμπλέκονται στη φλεγμονή και στην επιδιόρθωση των ιστών υπερεκφράζεται σε όγκο του προστάτη ή της μετάστασης και την έκφραση τους σε χρονική πορεία της οξείας (2 και 4 h) και χρόνια (24, 48, 72 ώρες) υποξική διέγερση μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR.

παρατηρήθηκαν Ποιοτική και ποσοτική διαφορές στο επίπεδο βάσης και στην υποξική διέγερση των επιλεγμένων μορίων σύμφωνα με το φαινότυπο των κυττάρων και μεταστατικό δυναμικό.

κύτταρα LNCaP ήταν τα λιγότερο δραστήρια παραγωγοί των μορίων που μελετήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση. Δεν ανιχνεύθηκαν μεταγραφές για ΡΤΧ3 και COX2 και όλα τα άλλα γονίδια, εκτός από CXCR4, ήταν σημαντικά λιγότερο μεταγράφηκε σε σύγκριση με DU145 και PC3 κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα (Πίνακας 1).

Η

υποξία ήταν σε θέση να επάγουν VEGF, RAGE, CXCR4 και HO1 αλλά όχι P2X7R μεταγραφή του mRNA. αύξηση mRNA RAGE περιορίστηκε σε οξεία διέγερση (4 ώρες), ενώ η μεταγραφή του mRNA των άλλων γονιδίων έφθασε στο υψηλότερο σημείο μετά από 24 ώρες στέρηση οξυγόνου και μειώθηκε κατά 72 h (Σχήμα 3Α).

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1% O

2 από 2 έως 72 ώρες. επίπεδα mRNA για τον VEGF, RAGE, P2X7R, ΡΤΧ3, COX2, CXCR4 και HO1 αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR και ομαλοποιείται στο γονίδιο 18S rRNA οικοκυρικής. Διαγράμματα δείχνουν την αναλογία μεταξύ της έκφρασης κύτταρα επεξεργασμένα υποξίας σε σχέση με νορμοξικές κύτταρα ελέγχου (που ορίζεται στο 1). Μέσες τιμές ± SE. * Κύτταρα Υποξική

vs κύτταρα ελέγχου

ορθοξικές.

Η

DU145 και τα κύτταρα PC3 εξέφρασαν μεγαλύτερο αριθμό των επιλεγμένων φλεγμονής που σχετίζονται με τα γονίδια που απορυθμίζεται σε υποξία με μια πιο ολοκληρωμένη και επίμονη αντίδραση σε πιο επιθετικά κύτταρα PC3. Ειδικότερα, DU145 αποδεικνύεται βασική μεταγραφές για όλους τους μελετήθηκαν μόρια εκτός για P2X7R. Σε υποξία, ΡΤΧ3 mRNA έδειξε μια πρώιμη και χρονικά περιορισμένη αύξηση, ενώ η μεταγραφή του VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 και HO1 κορυφώθηκε μετά από 24 ώρες διέγερσης και μειώθηκε κατά 72 ώρες (Εικόνα 3Β). PC3 κύτταρα εξέφρασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα mRNA βασικά όλων των αναλύθηκαν προ-φλεγμονώδη μόρια. Επίσης σε αυτή την κυτταρική γραμμή ΡΤΧ3 και RAGE ήταν μέγιστη επαγόμενη από οξεία υποξία μετά από 2 και 4 ώρες διέγερση, αντιστοίχως. Διαφορετικές προς τα άλλα μοντέλα κυττάρων, την υποξική αύξηση της έκφρασης του VEGF, P2X7R, COX2, CXCR4 και HO1 ήταν ακόμα στο αποκορύφωμά της μετά από 48-72 ώρες στέρησης οξυγόνου (Εικόνα 3C).

Συλλογικά, τα παραπάνω αποτελέσματα τονίζουν ότι η έκφραση και η υποξική προς τα πάνω ρύθμιση μορίων που συμμετέχουν συνήθως σε φλεγμονή και μετάσταση σε όγκο του προστάτη μπορεί σε μεγάλο βαθμό ποικίλλουν ανάλογα με το φαινότυπο του κυττάρου.

NF-kB αναστολέα παρθενολίδη εξουδετερώνει την επαγόμενη από υποξία προ-φλεγμονώδη φαινότυπο σε DU145 και PC3 αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP και επάγει μεταγραφή HO1 σε όλα τα μοντέλα των κυττάρων

Η παρατήρηση ότι η υποξία έχει μια διαφορετική επίδραση στην ενεργοποίηση του NF-kB, ανάλογα με το φαινότυπο κυτταρικής γραμμής μας ώθησε να ερευνηθεί ο ρόλος του NF-kB σε η υποξική αυξορρύθμιση της φλεγμονώδους σχετίζονται φαινότυπο σε όλα τα κύτταρα του προστάτη με τη χρήση του φυσικού αναστολέα παρθενολίδη ΝΡ-κΒ. Στα Σχήματα 4Α, 4Β και 4C τα αποτελέσματα της 5 μΜ παρθενολίδη για την έκφραση της υποξίας διαμορφωμένου προ-φλεγμονωδών γονιδίων σε LNCaP, DU145 και PC3 κύτταρα αντίστοιχα απεικονίζονται, τόσο σε υποξικές και νορμοξικές συνθήκες. Για κάθε γονίδιο, παρουσιάζουμε τα δεδομένα που ελήφθησαν στο χρονικό σημείο κατά το οποίο ασκείται υποξία μέγιστη αύξηση της στην μεταγραφή, όπως φαίνεται στα Σχήματα 3Α, 3Β και 3C. Παρθενολίδη παρεμπόδισαν σημαντικά την επαγόμενη από υποξία προς τα πάνω ρύθμιση των περισσοτέρων από αυτά τα γονίδια σε DU145 και σε κύτταρα PC3 με εξαίρεση P2X7R και CXCR4 στα κύτταρα PC3. Αντίθετα, το φάρμακο δεν έδειξε καμία σημαντική επίδραση στην έκφραση των επαγόμενων υποξίας μόρια σε λιγότερο επιθετική κύτταρα LNCaP.

LNCaP (Α), PC3 (Β), DU145 κύτταρα (C) κρατήθηκαν στο νορμοξία και εκτέθηκαν σε 1% O

2 παρουσία και απουσία 5 μΜ παρθενολίδη. επίπεδα mRNA για τον VEGF, RAGE, P2X7R, ΡΤΧ3, COX2, CXCR4 και HO1 αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, κανονικοποιημένη με τις οικοκυρική 18S rRNA γονιδίου και εκφράζεται ως επαγωγή πτυχής σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα νορμοξικό (που ορίζεται στο 1). Για κάθε γονίδιο παρουσιάζουμε την επίδραση των παρθενολίδη στα χρονικά σημεία όπου υποξία εξασκείται μέγιστη αύξηση σε σχέση με την μεταγραφή του. * Υποξική κύτταρα επεξεργασμένα parthenolide

vs κύτταρα

υποξική. C: ορθοξικές ελέγχου χωρίς θεραπεία κύτταρα. P: κύτταρα ορθοξικές παρθενολίδη θεραπεία. Η: υποξικά κύτταρα. HP:. Αντιμετωπίζονται parthenolide υποξικά κύτταρα

Η

Η δράση της parthenolide στη διαμόρφωση της HO1, ένα ένζυμο κλειδί στην αντιμετώπιση της φλεγμονώδους βλάβης, ήταν εντελώς διαφορετική (Σχήμα 5). Parthenolide ήταν σε θέση να πρώιμα και ισχυρά προκαλέσουν HO1 σε όλες τις ορθοξικές και υποξικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη με ένα μέγιστο αποτέλεσμα μετά από 4 ώρες διέγερση. Αυτή η επίδραση μειώνεται σταδιακά, αλλά ήταν ακόμη παρούσα μετά από θεραπεία 24 ώρες σε LNCaP και DU145 και μετά από 48 ώρες στα κύτταρα PC3. Σε αυτά τα χρονικά σημεία η επίδραση της παρθενολίδη και υποξία στην έκφραση HO1 ήταν προσθετικό.

LNCaP, PC3 και DU145 κύτταρα διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και εκτέθηκαν σε 1% O

2 παρουσία και απουσία 5 μΜ παρθενολίδη. επίπεδα mRNA για HO1 αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, κανονικοποιημένη με τις οικοκυρική 18S rRNA γονιδίου και εκφράζεται ως επαγωγή πτυχής σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα νορμοξικό (που ορίζεται στο 1). Δείχνουμε την επίδραση της παρθενολίδη μετά από 4 ώρες θεραπεία όταν το φάρμακο μέγιστο υπερέκφραση HO1 σε νορμοξικά καλλιέργειες και μετά από 24 ώρες (LNCaP, DU145) και 48 ώρες (PC3) διέγερση όταν υποξία εξασκείται μέγιστη αύξηση σε σχέση με την μεταγραφή του. Μέσες τιμές ± SE. * Normoxic και υποξικά κύτταρα επεξεργασμένα parthenolide

vs κύτταρα ελέγχου

ορθοξικές. C: ορθοξικές ελέγχου χωρίς θεραπεία κύτταρα. P: κύτταρα ορθοξικές παρθενολίδη θεραπεία. Η: υποξικά κύτταρα. HP: parthenolide αντιμετωπίζονται υποξικά κύτταρα

Η

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η NF-kB διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη μετατόπιση της πιο επιθετική DU145 και PC3, αλλά όχι LNCaP υποξικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη προς μια προ-φλεγμονώδη, πιο κακοήθεις. φαινότυπο. Επιπλέον, σε όλες τις κυτταρικές σειρές, NF-kB φαίνεται να εμπλέκεται σε μια υποξία-ανεξάρτητη αναστολή της αντι-φλεγμονώδη γονίδιο HO1.

παρθενολίδη επηρεάζει HIF1α και HIF3α υποξία ενεργοποίηση εξαρτώμενων σε DU145 και κυτταρικές σειρές PC3

Ο έλεγχος της ενεργοποίησης HIFs και ιδιαίτερα των HIF1α από NF-kB είναι ένα θέμα συζήτησης. Ελέγξαμε εάν parthenolide είχε καμία επίπτωση στην πυρηνική συσσώρευση HIF1α μετά από 4 ώρες υποξική διέγερση που προκαλείται από το υψηλότερο επίπεδο πυρηνικής μετατόπισης σε πειραματικές συνθήκες μας. Το Σχήμα 6Α δείχνει ότι ο αναστολέας παρθενολίδη NF-kB μειώθηκε σημαντικά πυρηνική συσσώρευση HIF1α πρωτεΐνης σε DU145 και PC3 κυττάρων (-30%, Ρ & lt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον, HIF1α πυρηνικό επίπεδο δεν επηρεάστηκε από NF-kB αναστολή μόνο σε κύτταρα LNCaP που δεν δείχνουν σημαντική ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ σε υποξία.

Α LNCaP, DU145 και PC3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και εκτέθηκαν σε 1% O

2 για 4 ώρες υπό την παρουσία και απουσία 5 μΜ παρθενολίδη. περιεχόμενο HIF1α μετρήθηκε στο πυρηνικό κλάσμα με ανάλυση ανοσοστυπώματος. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Για κάθε γονίδιο αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται. Η μέση πυκνομετρία HIF1α σχέση προς β-ακτίνη αποδεικνύεται επίσης και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες. κύτταρα DU145 Β επωάστηκαν υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 48 ώρες υπό την παρουσία και απουσία 5 μΜ παρθενολίδη. περιεχόμενο HIF3α μετρήθηκε στο πυρηνικό κλάσμα με ανάλυση ανοσοστυπώματος. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Για κάθε γονίδιο αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται. Η μέση πυκνομετρία HIF3α σχέση προς β-ακτίνη αποδεικνύεται επίσης και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες. Μέσες τιμές ± SE. C: ορθοξικές ελέγχου χωρίς θεραπεία κύτταρα. P: κύτταρα ορθοξικές παρθενολίδη θεραπεία. Η: υποξικά κύτταρα. HP: parthenolide αντιμετωπίζονται υποξικά κύτταρα. * Υποξική κύτταρα επεξεργασμένα parthenolide

vs

υποξικά κύτταρα.

Η

Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1Α, ρύθμιση HIF3α ήταν κυττάρων συγκεκριμένες και η έκφρασή της ήταν περιορισμένη σε DU145 κύτταρα από τα μοντέλα όγκων του προστάτη που εξετάστηκαν. Ερευνήσαμε αν ΝΡ-κΒ έπαιξε ρόλο και στην υποξία-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των HIF3α και παρατηρήσαμε ότι παρθενολίδη μειώθηκε σημαντικά HIF3α πυρηνικό επίπεδο μετά από 48 ώρες υποξική διέγερση (-65%, Ρ & lt? 0,01). (Σχήμα 6Β)

Συνολικά, τα στοιχεία αυτά υπογραμμίζουν ότι parthenolide μπορεί να επηρεάσει υποξικό ενεργοποίηση HIF1α μόνο στα καρκινικά κύτταρα, όπου NF-kB ανταποκρίνεται στην στέρηση του οξυγόνου. Μία ανασταλτική επίδραση του παρθενολίδη παρατηρείται επίσης σε HIF3α.

Ο ρόλος της HIF1α στην αναδιαμόρφωση του προ-φλεγμονωδών φαινότυπο σε κύτταρα DU145. Συνδυασμένη δράση των HIF1α νοκ ντάουν και parthenolide

Σε αντίθεση με LNCaP, σε λιγότερο διαφοροποιημένη DU145 και PC3 κύτταρα, NF-kB μονοπάτι συμμετείχε ενεργά στην αναδιαμόρφωση της προ-φλεγμονώδη φαινότυπο υπό υποξία. Για να ορίσετε τη συμβολή της HIF1α σε αυτή τη διαδικασία, έχουμε δημιουργήσει σταθερές HIF1α νοκ ντάουν κλώνους (HIF1α shRNA) από τα κύτταρα DU145. Το Σχήμα 7Α δείχνει το επίπεδο της πρωτεΐνης πυρηνικής HIF1α σε βάρος, σε κύτταρα επιμολυσμένα διάνυσμα NTshRNA και σε ένα αντιπροσωπευτικό HIF1α shRNA επιμολυσμένα κλώνος από τα τρία που επιλέγεται για τα πειράματα, μετά από 4 ώρες στέρηση οξυγόνου. Το πολύ χαμηλό επίπεδο πυρηνικής πρωτεΐνης σε κύτταρα knockdown HIF1α προέρχεται από 87% ± 1 μέση σταγόνα HIF1α mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όσον αφορά τα κύτταρα άγριου τύπου, χαρακτηρίσαμε NTshRNA και HIF1α shRNA κλώνων σε νορμοξία και υποξία για το mRNA και το επίπεδο πυρηνικής πρωτεΐνης HIF2α και HIF3α και για το καθεστώς ΝΡ-κΒ. κύτταρα knockdown HIF1α επιβεβαίωσε HIF2α απάθεια σε υποξικές θεραπεία σε πειραματικές συνθήκες μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τόσο mRNA HIF3α και πρωτεΐνης που προκαλείται από παρατεταμένη υποξία σε πολύ μικρότερο βαθμό από ό, τι σε wt κύτταρα (Σχήματα 7Β, 7C). Επιπλέον, παρθενολίδη δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα των HIF3α πυρηνικής πρωτεΐνης μετά από 48 ώρες υποξική διέγερση (Σχήμα 7C). Επίσης, σε HIF1α κύτταρα knockdown υποξία ενισχυμένη της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, όπως φαίνεται από την αυξημένη πυρηνικό επίπεδο του ρ50 και ρ65 σε 1% οξυγόνο (Σχήμα 7D), ακόμη και αν ο χρόνος ενεργοποίησης ήταν μικρότερη από ό, τι σε wt κύτταρα.

άγριου τύπου, NTshRNA και HIF1α shRNA επιμολυσμένα DU145 κύτταρα διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και κάτω από υποξία (1% O

2) επί 4 ώρες. περιεχόμενο HIF1α μετρήθηκε στο πυρηνικό κλάσμα με ανάλυση ανοσοστυπώματος. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C: ορθοξικές ελέγχου χωρίς θεραπεία κύτταρα. Η: υποξικά κύτταρα. Β άγριου τύπου και HIF1α shRNA κύτταρα διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και υπό υποξία για 24, 48 και 72 ώρες. επίπεδο του mRNA για HIF3α αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και ομαλοποιείται στο γονίδιο 18S rRNA οικοκυρικής. Το γράφημα δείχνει την αναλογία μεταξύ της έκφρασης σε κύτταρα επεξεργασμένα υποξία σε σχέση με καλλιέργειες κυττάρων νορμοξικό ελέγχου (που ορίζεται στο 1). Μέσες τιμές ± SE. τύπος C Άγρια και HIF1α shRNA κύτταρα διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και υπό υποξία για 48 ώρες υπό την παρουσία και απουσία 5 μΜ παρθενολίδη. Το περιεχόμενο της πυρηνικής πρωτεΐνης HIF3α ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα ανάλυση. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C: ορθοξικές ελέγχου χωρίς θεραπεία κύτταρα. P: κύτταρα ορθοξικές παρθενολίδη θεραπεία. Η: υποξικά κύτταρα. HP: parthenolide αντιμετωπίζονται υποξικά κύτταρα. κύτταρα D HIF1α shRNA διατηρήθηκαν σε φυσιολογική οξυγόνωση και υπό υποξία για 1, 2 και 4 ώρες. Η πυρηνική περιεχόμενο του ρ50 και ρ65 ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα ανάλυση. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η πυκνομετρική ανάλυση των ρ50 και ρ65 σε σχέση με την β-ακτίνη εκφράστηκε ως αυθαίρετες μονάδες και παρουσιάζεται ως φορές επαγωγής σε σχέση με καλλιέργειες κυττάρων νορμοξικό ελέγχου (που ορίζεται στο 1). Μέσες τιμές ± SE. * Κύτταρα Υποξική HIF1α shRNA

vs

HIF1α shRNA ορθοξικές ελέγχου.

Η

Στη συνέχεια μέτρησαν την έκφραση των επιλεγμένων φλεγμονωδών γονιδίων που σχετίζονται σε πειράματα χρονικής πορείας της οξείας (2, 4 h ) και χρόνιες (24, 48, 72 ώρες) υποξική διέγερση εν απουσία και παρουσία 5 μΜ παρθενολίδη. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα NTshRNA δεν διέφερε σημαντικά από τα κύτταρα wt σε όλες τις αναλύθηκαν παραμέτρους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, έχουμε συγκεντρωτικά τα δεδομένα που λαμβάνονται τόσο στο βάρος και στα κύτταρα NTshRNA DU145. Τα αποτελέσματα στα κύτταρα HIF1α shRNA ήταν αρκετά διαφορετική. Συγκρίναμε τις τιμές τους με εκείνες που ελήφθησαν σε βάρος κύτταρα με εκφράζουν τα επίπεδα του mRNA του κάθε γονιδίου σε κύτταρα HIF1α shRNA ως φορές επαγωγής σε σχέση με τη μέση νορμοξικό επίπεδο που παρατηρήθηκε σε κύτταρα που κ.β. ορίστηκε στο 1. Το σχήμα 8Α συνοψίζει τα ευρήματά μας για VEGF, RAGE, η γονιδιακή έκφραση ΡΤΧ3, COX2 και CXCR4 στα χρονικά σημεία όπου υποξία εξασκείται μέγιστη αύξηση της στην μεταγραφή (2 ώρες για ΡΤΧ3, 48 h για VEGF, COX2 και CXCR4). Normoxic VEGF και ΡΤΧ3 RNA τιμές ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα knockdown κ.β. κύτταρα, επιβεβαιώνοντας ένα ρόλο για HIF1α σε βασική έκφραση τους. Υποξία ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά VEGF, COX2 και την έκφραση CXCR4 σε επίπεδα συγκρίσιμα με εκείνα που παρατηρήθηκαν σε βάρος κύτταρα.