Αφηρημένο

Ιστορικό

όζοι του θυρεοειδούς είναι συχνές, και περίπου 5% αυτών των όζων είναι κακοήθεις. Πλειοτροπίνη (ΡΤΝ) είναι ένας δέσμευσης ηπαρίνης του αυξητικού παράγοντα που υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους. Η έκφραση της ΡΤΝ στο θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς (PTC) είναι άγνωστη

Τρόπος και Ευρήματα

74 άτομα (ηλικίας 47 ± 12 y, 15 άνδρες) που είχαν θυρεοειδεκτομή με ιστολογική διάγνωση:. 79 καλοήθη οζίδια και 23 PTCs (10 κλασικά, 6 ψηλό κυττάρων, 6 θυλακιώδες παραλλαγή και 1 απροσδιόριστο). Με λεπτή βελόνα αναρρόφησης λήφθηκαν (FNA) δείγματα

ex vivo

από χειρουργικά με εκτομή ιστού και προσδιορίστηκαν για PTN και θυρεοσφαιρίνης (Tg). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε σε τομές ιστών. Σε δείγματα FNA, συγκέντρωση ΡΤΝ κανονικοποιείται στη Tg ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PTC σε σχέση με καλοήθη οζίδια (16 ± 6 έναντι 0,3 ± 0,1 ng /mg, ρ & lt? 0.001). Σε θυλακιώδη παραλλαγή της PTC (n = 6), η αναλογία ΡΤΝ /Tg ήταν επίσης υψηλότερη από καλοήθη οζίδια (1.3 ± 0.6 έναντι 0.3 ± 0.1 ng /mg,

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα). IHC έδειξε κυτταροπλασματική εντόπιση της PTN στα κύτταρα PTC.

Συμπέρασμα

ex vivo δείγματα

FNA, η ΡΤΝ σε αναλογία θυρεοσφαιρίνης ήταν υψηλότερη σε PTCs, συμπεριλαμβανομένων των ωοθυλακίων παραλλαγή PTC, από ό, τι σε καλοήθεις όζους του θυρεοειδούς. Τα ευρήματα εγείρουν την πιθανότητα ότι η μέτρηση της ΡΤΝ αναλογία Tg για να μπορούν να παρέχουν χρήσιμες διαγνωστικές ή /και προγνωστικές πληροφορίες κατά την αξιολόγηση των όζων του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Jee YH, Sadowski SM, Celi FS, Xi L, Raffeld Μ, Σακούλες DB, et al. (2016) Η αυξημένη πλειοτροπίνη Συγκεντρώσεις σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. PLoS ONE 11 (2): e0149383. doi: 10.1371 /journal.pone.0149383

Επιμέλεια: Soheil Σ Dadras, Πανεπιστήμιο του Κονέκτικατ Κέντρο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 6 Αύγ 2015? Δεκτές: 1 Φλεβάρη 2016? Δημοσιεύθηκε: 25 Φεβρουαρίου, 2016

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:.. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από το εντός των τειχών Ερευνητικά Προγράμματα της Eunice Kennedy Shriver Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού και Ανθρώπινης Ανάπτυξης (NICHD), το Εθνικό Ινστιτούτο διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα (ΝΙϋϋΚ), το Κέντρο για την Έρευνα του Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI), και την Κλινική κέντρο των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. YHJ και JB είναι συν-εφευρέτες σε μια αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας που κατατίθεται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, που καλύπτει τη μέτρηση των ΜίάΚίηβ και πλειοτροπίνη σε δείγματα FNA (αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ Νο 61 /728.624 που κατατέθηκε στις 20 Νοεμβρίου 2012. HHS Παραπομπή:. E-016-2013 /0-ΗΠΑ-01 σε δοκιμασία για τη μέτρηση ΜίάΚίηβ ή πλειοτροπίνης επίπεδο για τη διάγνωση μιας ανάπτυξης Εισηγμένων εφευρέτες: Baron και Jee). Συγγραφείς δεν έχουν άλλες σχετικές δηλώσεις που αφορούν την απασχόληση, την παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή τροποποιημένα προϊόντα. Αυτό δεν μετέβαλε την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Σε αντίθετη περίπτωση, οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων που θα μπορούσε να εκληφθεί ως ζημιώσει την αμεροληψία της έρευνας που αναφέρθηκαν.

Εισαγωγή

όζοι του θυρεοειδούς συμβαίνουν συχνά στο γενικό πληθυσμό, με επιπολασμό της περίπου 3-7% για ψηλαφητή μάζα [1, 2]. Περίπου 5% των όζων θυρεοειδούς είναι κακοήθη [3] και ο πιο κοινός τύπος είναι ιστολογική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς (PTC) [1]. Δύο μεγάλες προκλήσεις που αντιμετωπίζει τους κλινικούς γιατρούς είναι να διακρίνει κακοήθεις από καλοήθεις όζους και να εντοπιστούν οι κακοήθειες του θυρεοειδούς που είναι επιθετικοί [1]. Λεπτή βελόνα (FNA) κυτταρολογική εξέταση αποτελεί τον πρωταρχικό στόχο προεγχειρητική διαγνωστικό εργαλείο για την αξιολόγηση των θυρεοειδικών όζων [4], αλλά είναι ασαφές σε ποσοστό έως 30% των ασθενών [5]. Ειδικότερα, θυλακιώδη παραλλαγή PTC είναι δύσκολο να διακριθεί από καλοήθεις βλάβες του ωοθυλακίου με κυτταρολογική εξέταση [6, 7].

πλειοτροπίνη (PTN) και ΜίάΚίηβ (MDK) σχετίζονται πολυπεπτίδιο δέσμευσης ηπαρίνης αυξητικούς παράγοντες [8, 9] . ΡΤΝ και MDK υπερεκφράζονται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, όπου πιστεύεται ότι προάγουν την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη του όγκου [10, 11].

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η συγκέντρωση του MDK στα δείγματα FNA είναι αυξημένη σε σύγκριση με PTCs καλοήθη οζίδια [12]. Στη μελέτη αυτή, η συγκέντρωση MDK ομαλοποιήθηκε με την συγκέντρωση θυρεοσφαιρίνη (Tg), η οποία προσαρμόζεται για το περιεχόμενο του ιστού και επίσης ενισχυμένη το διαχωρισμό μεταξύ καλοηθών και κακοηθών δειγμάτων λόγω των χαμηλότερων συγκεντρώσεων Tg σε κακοήθεις όζους. Ωστόσο, ούτε η συγκέντρωση MDK ούτε η αναλογία MDK /Tg ανυψώθηκε στην θυλακιώδη παραλλαγή της PTC υποομάδας [12], περιορίζοντας την πιθανή διαγνωστική αξία αυτής της προσέγγισης.

ΡΤΝ προηγουμένως αναφέρθηκε ότι υπερεκφράζεται σε μυελώδη θυρεοειδή καρκίνος [13], αλλά η έκφραση της ΡΤΝ σε PTCs δεν έχει διερευνηθεί. Υποθέσαμε ότι η συγκέντρωση PTN και η αναλογία συγκέντρωσης ΡΤΝ /Tg είναι υψηλότερες σε PTCs από ό, τι σε καλοήθεις όζους.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα και δείγμα συλλογής

Εβδομήντα τέσσερα ενήλικα άτομα (ηλικίας 47 ± 12 y, 15 άνδρες) με όζους του θυρεοειδούς που υποβλήθηκαν σε θυρεοειδεκτομή στα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) Κέντρο Κλινικής συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. πρωτόκολλα μελέτης εγκρίθηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Διαβήτη και του πεπτικού και Νεφρική Νόσο επιτροπής αναθεώρησης Θεσμικά, και όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν στη μελέτη. Μετά το θυρεοειδή αποκόπηκε, επιλεγμένα οζίδια με τις γύρω ιστοί διχοτομείται για τις δημόσιες συμβάσεις και, στη συνέχεια,

ex vivo

FNA εκτελέστηκε περνώντας μια βελόνα 25-gauge στα οζίδια. Η βελόνα πέρασε 10 έως 20 φορές. Δεν εφαρμόστηκε αναρρόφηση. Ο ιστός εντός της βελόνης πλύθηκε με 0,5 ml PBS που περιέχει 1% BSA. Τα δείγματα δειγματίστηκε και φυλάχθηκε αμέσως στους -80 C έως τον ποσοτικό προσδιορισμό. Πολλαπλές

ex vivo δείγματα

FNA (μέση τιμή, 3.0 δείγματα) ελήφθησαν ανά όζος. Αρχικά επιχείρησε να μετρήσει ΡΤΝ σε

in vivo

δείγματα έκπλυσης FNA, αφού τα περιεχόμενα της βελόνας είχαν εκδιωχθεί για κυτταρολογική εξέταση, αλλά συχνά βρίσκεται ανιχνεύσιμο συγκεντρώσεις ΡΤΝ, υποδεικνύοντας ανεπαρκή ιστός που απομένει μέσα στη βελόνα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Ένα σύνολο 103 οζίδια περιλήφθηκαν στο δείγμα. Από αυτά, 62 δείγματα όζου προηγουμένως αναλύθηκαν για συγκέντρωση MDK και περιλαμβάνονται στην προηγούμενη έκθεση [12].

πλειοτροπίνη Sandwich ELISA Δοκιμασία

Ένα σάντουιτς ΡΤΝ ELISA αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας (βλ S1 Μέθοδος για λεπτομέρειες δοκιμασίας). Το CV ενδο-δοκιμασίας ήταν 6.9% για την υψηλή συγκέντρωση (1,3 ng /mL) και 9% για χαμηλή συγκέντρωση (0,2 ng /mL). Το CV δια-δοκιμασίας ήταν 8.8% στα 0.2 ng /mL και 12.3% σε 0,6 ng /mL. Το όριο ανίχνευσης ήταν 10 pg /mL. Δεν υπήρξε καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με έως 50 ng /mL της MDK (S1 Α Σχήμα). Οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ σε PBS που περιέχει 1% BSA παρέμειναν σταθερές σε πλαστικό αλλά όχι γυάλινους σωλήνες επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και με επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης (S2 Εικ). Η δοκιμασία έδειξε καλή παραλληλισμού (S3 Εικ).

ΜίάΚίηβ Sandwich ELISA Δοκιμασία

MDK σάντουιτς ELISA διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (Biovendor, Τσεχία) με τροποποιήσεις [12]. CV Εντός της δοκιμασίας ήταν 3.4% σε υψηλή συγκέντρωση (0,7 ng /mL) και 5,2% σε χαμηλή συγκέντρωση (0,25 ng /mL). CV δια-δοκιμασίας ήταν 12,3% σε χαμηλή συγκέντρωση. Το όριο ανίχνευσης ήταν 0.009 ng /mL. Δεν υπήρξε καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με έως 50 ng /mL της ΡΤΝ (S1B σχήμα).

θυρεοσφαιρίνης Δοκιμασία

50 μL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει θυρεοειδικού ιστού από μια βελόνα FNA αραιώνεται 10 φορές σε φυσιολογικό ορό και η συγκέντρωση του Tg μετρήθηκε με χημειοφωταύγειας ανοσομετρική δοκιμασία (IMMULITE 2000XPi, Siemens, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

ανάλυση μετάλλαξη BRAF

DNA εκχυλίζεται με ημιαυτόματο ρομποτική συσκευή Qiacube (Qiagen, Valencia, CA) χρησιμοποιώντας είτε το QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) από 17 δείγματα FNA έκπλυσης και 6 δείγματα κατεψυγμένου ιστού, ή του QIAamp DNA Kit Tissue FFPE (Qiagen) για παραφίνη -embedded τομές ιστών, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

BRAF

T1799A (V600E) μεταλλάξεων ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανίχνευσης μετάλλαξης PrimePCR ddPCR (Bio-Rad, Hercules, CA) σε BIO-RAD QX200 σταγονιδίων ψηφιακό σύστημα PCR (ddPCR). Κάθε αντίδραση περιελάμβανε 10 μλ 2x ddPCR Supermix για ανιχνευτές (δεν dUTP), 1 μl του

BRAF

V600E αστάρι /μείγμα ιχνηλατών (FAM), 1 μl του BRAF άγριου τύπου αστάρι /μείγμα ιχνηλατών (HEX), και 40-100 ng γενωμικού DNA. Η παρουσία της μετάλλαξης και η κλασματική αφθονία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου προσδιορίστηκε με QuantaSoft v.1.7 (Bio-Rad).

πλειοτροπίνη Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη, και κομμένα σε τμήματα 5-μm πάχους που αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Για ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές τοποθετήθηκαν σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα στους 120 ° C χρησιμοποιώντας μια κουζίνα pressuer για 10 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό με 1.5% φυσιολογικό ορό κουνελιού σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20 (TBST) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα πλακίδια επωάστηκαν με κατσίκα πολυκλωνικό αντίσωμα που εγείρεται κατά της ανθρώπινης ΡΤΝ (Cat # AF-252-ΡΒ, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) σε 1: 250 αραίωση σε 1.5% ορού σε TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C και έπειτα οπτικοποιούνται με ένα βιοτινυλιωμένο αντι-κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα IgG (1: 200) χρησιμοποιώντας το Vectastain ABC (αίγας IgG, PK- 6105) και κιτ DAB (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) και βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Η παράλειψη του πρωτογενούς αντιορού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και διαφάνειες εμβρύου ποντικού χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος (S5 Εικ). Διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή ScanScope XT ψηφιακή διαφάνεια και να προβληθούν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δείγματα FNA από κάθε οζίδιο κατά μέσο όρο σε ληφθεί μια ενιαία μέση τιμή. Μετά από λογαριθμική μετατροπή, η συγκέντρωση ΡΤΝ, συγκέντρωση Tg και αναλογία ΡΤΝ /Tg συγκρίθηκαν μεταξύ των ιστολογικών ομάδων με t-τεστ και ANOVA με post-hoc Bonferroni διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις. Η σχέση μεταξύ της PTN και Tg αξιολογήθηκε μετά από μετασχηματισμό log από το γενικό γραμμικό μοντέλο με αριθμό οζίδιο ως συμμεταβλητή. Η σχέση μεταξύ της PTN /Tg και MDK /Tg αξιολογήθηκε από Pearson παλινδρόμησης μετά από μετασχηματισμό log. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS, έκδοση 12 (IBM, NY).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των θεμάτων και των όζων

Ένα σύνολο των 103 κονδύλων από 74 άτομα (ηλικίας 47 ± 12 y, 15 άνδρες) μελετήθηκαν με

ex vivo

FNA κατά τη στιγμή της σύναψης συμβάσεων, αμέσως μετά τη θυρεοειδεκτομή. Η ιστολογική εξέταση έδειξε 23 οζίδια με PTC (10 κλασικά, 6 ψηλό κυττάρων, παραλλαγή 6 ωοθυλακίων, και 1 απροσδιόριστο), 1 οζίδιο με μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς και 79 καλοήθεις όζους (72 αδενωματώδης οζίδια, 4 αδενώματα των ωοθυλακίων και 3 υπερπλασίας οζίδια). Τα χαρακτηριστικά των οζιδίων με PTC παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Σύλλογος ΡΤΝ και Tg συγκεντρώσεις στα δείγματα FNA

Οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ συσχετίστηκαν θετικά με τις συγκεντρώσεις Tg στα δείγματα έκπλυσης FNA από καλοήθη οζίδια (ανάλυση περιλαμβάνονται όλα τα επιμέρους περάσματα, R

2 = 0.04,

P

& lt? 0.001, S4 σχήμα). Δεδομένου ότι αυτή η συσχέτιση πιθανό συνέβη διότι τόσο ΡΤΝ και συγκεντρώσεις Tg στο υγρό έκπλυσης εξαρτώνται από την ποσότητα του θυρεοειδούς ιστού που υπάρχει στο δείγμα, τα επίπεδα ΡΤΝ κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα Tg ως ΡΤΝ /Tg, ng /mg, για τη διόρθωση για την ποσότητα του θυρεοειδικού ιστού.

συγκεντρώσεις PTN και αναλογία ΡΤΝ /Tg σε ex vivo δείγματα FNA

οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ στο PTC ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι σε καλοήθεις όζους (0,1 ± 0,01 vs 0,05 ± 0,01 ng /mL, μέση τιμή ± SEM, σ & lt? 0.001). Οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ στο υποσύνολο των ωοθυλακίων παραλλαγή του καρκίνου του θηλώδους θυρεοειδούς (FVPTC) ήταν επίσης υψηλότερες από ό, τι σε καλοήθεις όζους (0,12 ± 0,03 έναντι 0,05 ± 0,01 ng /ml, p & lt? 0.001, Σχήμα 1Α)

ελήφθησαν δείγματα. από

ex vivo

αναρρόφηση με λεπτή βελόνα? ΡΤΝ και Tg μετρήθηκαν με ανοσοδοκιμασία. Οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ (μέση ± SEM) ήταν υψηλότερες σε PTC (συμπεριλαμβανομένων όλων των υποτύπων) και στο υποσύνολο των θυλακιώδους παραλλαγής PTC (FVPTC) σε σχέση με καλοήθη οζίδια (Α). Ομοίως, ΡΤΝ /Tg ήταν μεγαλύτερη σε PTC (συμπεριλαμβανομένων όλων των υποτύπων) και στο υποσύνολο των FVPTC ό, τι στην καλοήθη οζίδια (Β). Οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ κλασικό, παραλλαγή ψηλός κυττάρων, και FVPTC (C). ΡΤΝ /Tg τάση (

P

= NS) να είναι χαμηλότερη σε FVPTC από ό, τι σε άλλους υπότυπους (D). Scatterplot δείχνουν τιμές ΡΤΝ /Tg όλων των όζων. Κλειστά σύμβολα, PTC? ανοικτά σύμβολα, καλοήθη οζίδια (Ε). Οι τιμές μικρότερες από 0.001 εμφανίζεται ως ίση με 0.001.

Η

Οι συγκεντρώσεις Tg ήταν χαμηλότερες σε PTC από ό, τι σε καλοήθεις όζους (112 ± 30 έναντι 926 ± 88 μg /mL,

P

& lt ? 0.001). Στην υποομάδα FVPTC, συγκεντρώσεις Tg επίσης έτειναν να είναι χαμηλότερες σε σχέση με καλοήθη οζίδια, αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (203 ± 80 έναντι 926 ± 88 μg /mL ng /mL,

P

= NS). Η αναλογία του ΡΤΝ να Tg (ng /mg) ήταν υψηλότερη σε σχέση με το PTC καλοήθη οζίδια (16 ± 6 έναντι 0,3 ± 0,1 ng /mg,

P

& lt? 0.001, Εικόνα 1Β και 1 Ε), καθώς επίσης και σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με το FVPTC καλοήθη οζίδια (1.3 ± 0.6 έναντι 0.3 ± 0.1 vs ng /mg,

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 1Β). ΡΤΝ /Tg επίσης αυξημένα στο ένα οζίδιο που περιέχει μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς (2,9 ng /mg).

Μεταξύ PTCs, δεν υπήρχε διαφορά στις συγκεντρώσεις ΡΤΝ μεταξύ κλασικό, παραλλαγή ψηλός κυττάρων και FVPTCs (0,09 ± 0,02, 0.12 ± 0.03 και 0.12 ± 0.03 ng /mL, αντίστοιχα,

P

= NS) (Εικ 1C). Ωστόσο, FVPTC είχαν τα χαμηλότερα τις αναλογίες ΡΤΝ /Tg (24,5 ± 11,7, 42,1 ± 23,3 και 1,3 ± 0,6 ng /mg, αντίστοιχα,

P

= 0,06) (Σχήμα 1D).

10 καλοήθη οζίδια με την υψηλότερη αναλογία ΡΤΝ /Tg, 2 εμφανίστηκαν σε ασθενείς με Graves ‘νόσο (2 από 2 άτομα με του Graves ασθένεια), 1 σε ένα υποκείμενο με θυλακιώδες αδένωμα (1 από 4 άτομα με θυλακιώδες αδένωμα), 1 σε έναν ασθενή με χρόνια λεμφοκυτταρική θυρεοειδίτιδα (1 από 3 άτομα με χρόνια λεμφοκυτταρική θυρεοειδίτιδα), 1 σε ένα καλοήθη οζίδιο δίπλα στο PTC και 5 σε καλοήθεις όζους χωρίς άλλα σημαντικά ιστολογικά ευρήματα.

Η αναλογία ΡΤΝ /Tg δεν είχε καμία συσχέτιση με το μέγεθος του όζου ή την παρουσία του λεμφικού μετάσταση στους λεμφαδένες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

σύνδεσης μεταξύ της PTN /Tg και MDK /Tg και διμεταβλητή ανάλυση

Τόσο MDK /Tg και ΡΤΝ /Tg μετρήθηκαν σε 22 PTCs και 77 καλοήθη οζίδια. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της PTN /Tg και MDK /Tg μεταξύ καλοήθη οζίδια. Ωστόσο, υπήρξε μια θετική συσχέτιση μεταξύ MDK /Tg και ΡΤΝ /Tg μεταξύ PTCs (R

2 = 0,44,

P

= 0,001) (Εικόνα 2Α).

Σύνδεσης μεταξύ ΡΤΝ /Tg και MDK /Tg αναλογίες μεταξύ όλων των PTC οζίδια που μελετήθηκαν (Α). ΡΤΝ /Tg και MDK /Tg σχετίστηκαν θετικά (R

2 = 0,44,

P

= 0,001). Διμεταβλητή ανάλυση της PTN /Tg και αναλογίες MDK /Tg (Β). Όλα PTCs είχε MDK /Tg μεγαλύτερη από 0,2 ng /mL (οριζόντια διακεκομμένη γραμμή) και ΡΤΝ /Tg μεγαλύτερη από 0,13 ng /mL (κάθετη διακεκομμένη γραμμή). Οι τιμές μικρότερες από 0.001 εμφανίζεται ως ίση με 0.001. Κλειστούς κύκλους, PTC? ανοικτοί κύκλοι, καλοήθη οζίδια.

Η

Ένα διμεταβλητή απεικόνιση όλων των οζιδίων με τόσο PTN /Tg και MDK /Tg μετριέται αποκάλυψε ότι όλες οι PTCs είχε MDK /Tg μεγαλύτερη από 0,2 ng /mL και ΡΤΝ /Tg μεγαλύτερη από 0. 13 ng /mL (Σχήμα 2Β). Από τις 35 οζίδια που πληρούν και τα δύο αυτά κριτήρια, 23 ήταν κακοήθεις (100% των PTC) και 12 ήταν καλοήθεις (15% των καλοήθων όζων), αποδίδοντας μια ευαισθησία 100% και ειδικότητα 85%.

σύνδεσης μεταξύ ΡΤΝ λόγου /Tg και μετάλλαξη BRAF

μεταξύ 23 PTC οζίδια, 16 είχαν την

BRAF

μετάλλαξη V600E. Ο λόγος ΡΤΝ /Tg έτεινε να είναι υψηλότερη σε

BRAF

-θετικό από ό, τι στο

BRAF

-αρνητικοί οζίδια, αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (21,5 ± 7,9 έναντι 1,8 ± 0,8,

P

= 0,095).

Επιβεβαίωση της έκφρασης ΡΤΝ χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία

η ανοσοϊστοχημική χρώση τομών ιστού αποκάλυψε ότι ΡΤΝ ανοσοχρώση ήταν πιο έντονη σε αυτές νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς εντός των PTCs από ό, τι στην τα κοντινά φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς. (Σχήμα 3Α-3C). Μερικά διάσπαρτα στρωματικά κύτταρα στην παρακείμενη συνδετικού ιστού έδειξε επίσης ανοσοϊστοχημική χρώση. Μέσα σε επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς, η χρώση ΡΤΝ ήταν κυρίως κυτταροπλασματική και περιπυρηνικών (Σχήμα 3C).

Α) Οι ιστολογικές τομές που περιέχουν ψηλό παραλλαγή κυττάρων PTC ανοσοχρωματίστηκαν για ΡΤΝ (καφέ χρώμα) και αντίθετα με hematolxylin (μοβ χρώμα). Ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν πιο έντονη στα νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς εντός των PTCs (κλειστά βέλη) από ό, τι στο κοντινό κανονική επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς (ανοικτά βέλη). Μερικά στρωματικά κύτταρα στην παρακείμενη συνδετικού ιστού έδειξε επίσης ανοσοϊστοχημική χρώση. Β) Μεγαλύτερη μεγέθυνση του PTC και φυσιολογικό ιστό από το ίδιο τμήμα όπως στο πάνελ Α C) Ανοσοϊστοχημική στράγγισμα του κλασικού PTC που δείχνει περιπυρηνική τοποθεσία των ΡΤΝ (βέλη). Μέγεθος μπαρ, 100 μm.

Η

Συζήτηση

Βρήκαμε ότι η ΡΤΝ ήταν μετρήσιμη σε δείγματα FNA λαμβάνονται

ex vivo

από δείγματα θυρεοειδεκτομή και ότι οι συγκεντρώσεις ΡΤΝ ήταν υψηλότερες στην PTC σε σχέση με καλοήθη οζίδια. Ομοίως, ο λόγος ΡΤΝ /Tg ήταν μεγαλύτερη στην PTC σε σχέση με καλοήθη οζίδια. Αρχικά επέλεξε να χρησιμοποιήσει Tg ως μέτρο της περιεκτικότητας των ιστών. Ωστόσο, βρήκαμε ότι το επίπεδο της Tg σε δείγματα από PTC ήταν χαμηλότερη από ό, τι σε δείγματα από καλοήθεις όζους, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση Tg μπορεί να είναι χαμηλότερη σε κακοήθη κύτταρα, σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη [14], και ως εκ τούτου Tg δεν μπορεί απλά να είναι μια μέτρο του περιεχομένου ιστού. Ωστόσο, από μια ρεαλιστική σκοπιά, η επίδραση αυτή είναι τυχαίο, διότι ομαλοποίηση της ΡΤΝ να Tg ενισχυθεί το διαχωρισμό μεταξύ καλοηθών και κακοηθών δείγματα.

έκφραση ΡΤΝ από PTCs επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Οι ανοσοϊστοχημικές ευρήματα υποδεικνύουν ότι ΡΤΝ υπερεκφράζεται από τα νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα του θυρεοειδούς τους, κυρίως σε ένα περιπυρηνική και κυτταροπλασματική εντόπιση όπως αναφέρεται σε άλλους ιστούς [15-16]. Ωστόσο, η χρώση για ΡΤΝ παρατηρήθηκε επίσης στα γειτονικά στρωματικά κύτταρα αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα άλλα κύτταρα θα μπορούσαν επίσης να συμβάλει στην αυξημένη ΡΤΝ μετρήθηκαν με ELISA σε PTC.

Το εύρημα ότι ΡΤΝ είναι αυξημένη σε PTC υποδηλώνει ότι ΡΤΝ υπερέκφραση μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του PTCs, η οποία έχει επίσης προταθεί για άλλους καρκίνους, όπως των ωοθηκών [17], παγκρεατικό [18], γλοιοβλάστωμα [19], του καρκίνου του προστάτη [20] και του καρκίνου του μαστού [21]. Για παράδειγμα, σε ένα μοντέλο καρκίνου του μαστού, ΡΤΝ υπερέκφραση διεγείρονται αναδιαμόρφωση του μικροπεριβάλλοντος, αγγειογένεση όγκου, και την ταχεία ανάπτυξη του όγκου [22]. Ωστόσο, στη μελέτη μας, εμείς δεν παρατηρούμε τη σύνδεση μεταξύ της αναλογίας PTN /Tg και το μέγεθος των όζων ή την παρουσία μεταστάσεων λεμφαδένων. Επίσης, δεν κατάφερε να βρει τον σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αναλογίας PTN /Tg και η παρουσία της μετάλλαξης BRAF V600E. Ωστόσο, το μέγεθος του δείγματος της μελέτης μας είναι ανεπαρκής για να αποκλείσει οριστικά ενώσεις με επιθετικότητα της νόσου ή γενετικής αιτιολογίας.

προηγουμένως βρεθεί ότι η συγκέντρωση του MDK, αυξητικός παράγοντας δέσμευσης ηπαρίνης που σχετίζονται με ΡΤΝ, ήταν υψηλότερη στις PTC σε σχέση με καλοήθη οζίδια [12]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι MDK /Tg και ΡΤΝ /Tg σχετίστηκαν θετικά στην PTCs. Ωστόσο, μια σημαντική διαφορά είναι ότι, σε FVPTC, η ΡΤΝ /Tg ανυψώθηκε ενώ το MDK /Tg έδειξαν τιμές επικαλυπτόμενα εκείνα της καλοήθους όζους. Αυτό το εύρημα έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι FVPTC είναι συχνά δύσκολο να διακριθεί από καλοήθεις βλάβες του ωοθυλακίου με κυτταρολογική εξέταση, που συχνά απαιτεί ιστολογική αξιολόγηση [7].

Ένα διμεταβλητή απεικόνιση της PTN /Tg και MDK /Tg έδειξε ισχυρή ομαδοποίηση των PTC δείγματα, έτσι ώστε όλες οι κακοήθειες είχαν MDK /Tg μεγαλύτερη από 0,2 ng /mg και ΡΤΝ /Tg μεγαλύτερη από 0,13 ng /mg. Μόνο το 15% των καλοήθων όζων ικανοποιημένοι και τα δύο αυτά κριτήρια (Σχήμα 2Β). Η παρατήρηση ότι η αναλογία PTN /Tg και ο λόγος MDK /Tg είναι αυξημένα σε PTC σε σύγκριση με καλοήθη οζίδια αυξάνει την πιθανότητα ότι η μέτρηση της ΡΤΝ, MDK, και Tg στον θυρεοειδή δείγματα FNA μπορεί να παράσχει χρήσιμες συμπληρωματική διαγνωστικές πληροφορίες για κυτταρολογική εξέταση, όπως έχει αποδείχθηκε από την RNA προφίλ [23], ανάλυση μεταλλάξεων [24] και άλλες μοριακές προσεγγίσεις [25]. Ωστόσο, για να δημιουργήσει μια κλινικά χρήσιμη προσέγγιση, υπάρχουν σημαντικές προκλήσεις που θα πρέπει να ξεπεραστούν, πολλά από τα οποία αντανακλούν τους περιορισμούς στην παρούσα μελέτη. Κατ ‘αρχάς, για τη μέτρηση της ΡΤΝ στο FNA έκπλυσης, αρκεί θυρεοειδικού ιστού πρέπει να είναι παρόντες. Έτσι, ένα ειδικό πέρασμα FNA, ξεχωριστή από εκείνες που απαιτούνται για κυτταρολογική εξέταση, μπορεί να απαιτείται για να ληφθεί επαρκής ιστός όπως γίνεται με το εμπορικά διαθέσιμο τεστ ταξινομητής γονιδιακή έκφραση [23]. Εναλλακτικές πιθανές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν την ανάπτυξη μιας πιο ευαίσθητη δοκιμασία ΡΤΝ ή το πλύσιμο του αποβάλλονται βελόνα με ένα μικρότερο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος και διεξαγωγή της δοκιμασίας χωρίς αραίωση. Δεύτερον, η παρούσα μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας δείγματα FNA λαμβάνονται

ex vivo

μετά από θυρεοειδεκτομή. Είτε παρόμοια δεδομένα θα πρέπει να τηρούνται με

in vivo

, διαδερμική παρακέντηση δειγματοληψίας είναι άγνωστη. Εμείς δεν ασχολήθηκε με αυτό το θέμα, λόγω της μη διαθεσιμότητας του αφιέρωσε

in vivo

δείγματα FNA σε αυτή την ερευνητική μελέτη. Τρίτον, η προσέγγισή μας μπορεί να μην είναι χρήσιμη σε ασθενείς με νόσο του Graves ή χρόνια λεμφοκυτταρική θυρεοειδίτιδα? παρατηρήσαμε αυξημένη αναλογίες ΡΤΝ /Tg σε καλοήθεις όζους στο θυρεοειδή αδένα επηρεάζεται από αυτά τα αυτοάνοσα νοσήματα. Τέταρτον, η προσαρμογή των ευρημάτων αυτών σε επικουρική διαγνωστικό τεστ κλινικής θα απαιτούσε σημαντικά μεγαλύτερη μελέτη για να προσδιοριστεί η ευαισθησία και η εξειδίκευση σε άτομα με απροσδιόριστο κυτταρολογία. Η τρέχουσα πιλοτική μελέτη καταδεικνύει μια νέα παρατήρηση της αυξημένης ΡΤΝ /Tg σε όλους τους τύπους των PTC, αλλά δεν είχε σχεδιαστεί για να επικυρώσει αυστηρά μια διαγνωστική εξέταση. Η μελέτη μας έχει σχεδιαστεί για μια απόδειξη της έννοιας και χρησιμοποιείται

ex vivo

FNA υλικά. Ως εκ τούτου, η ανάλυση ROC δεν εκτελείται.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι οι συγκεντρώσεις PTN και η αναλογία /Tg ΡΤΝ στο

ex vivo δείγματα

FNA διακρίνει PTC από καλοήθεις βλάβες, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι αυτή η στρατηγική μπορεί να έχει συμπληρωματική διαγνωστική χρησιμότητα για τη συμπλήρωση της κυτταρολογίας και άλλες υπάρχουσες μοριακές μεθόδους. Ωστόσο, πρόσθετες μεγαλύτερες μελέτες θα χρειαστούν για την επικύρωση αυτής της προσέγγισης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ.

Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α. ΡΤΝ διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με MDK. Συμπληρωματικό σχήμα 1Β. MDK διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με ΡΤΝ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0149383.s001

(DOCX)

S2 Εικ.

Συμπληρωματικό Σχήμα 2Α. Σταθερότητα στο γυαλί vs πλαστικό σωλήνα. Συμπληρωματικό Σχήμα 2Β. Σταθερότητα σε θερμοκρασία δωματίου και κατά τη διάρκεια της κατάψυξης και απόψυξης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0149383.s002

(DOCX)

S3 Εικ. Συμπληρωματικό Σχήμα 3.

Παραλληλισμός της ΡΤΝ ELISA μεταξύ της πρότυπης καμπύλης και σειριακά αραιωμένα δείγματα έκπλυσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0149383.s003

(DOCX)

S4 Εικ. Συμπληρωματικό Σχήμα 4.

συγκεντρώσεις ΡΤΝ συσχετίστηκαν θετικά με τις συγκεντρώσεις Tg στα δείγματα έκπλυσης FNA από καλοήθη οζίδια (ανάλυση περιλαμβάνονται όλα τα επιμέρους περάσματα, R

2 = 0,04, P & lt? 0.001)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0149383.s004

(DOCX)

S5 Εικ. Συμπληρωματικό Σχήμα 5.

Θετικός και αρνητικός μάρτυρας IHC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0149383.s005

(DOCX)

Μέθοδος S1. Συμπληρωματικό Μέθοδος

Δοκιμασία ELISA πλειοτροπίνη Σάντουιτς

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0149383.s006

(DOCX)