Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος της Βορείου Αμερικής άνδρες. θεραπεία στέρηση ανδρογόνου (ADT) επιτείνει την διείσδυση ανοσοκυττάρων εντός του προστάτη. Ωστόσο, οι ανοσοκατασταλτικές μονοπάτια ρυθμίζονται από ανδρογόνα σε PCa δεν είναι καλά χαρακτηρισμένες. Η αργινάση 2 (ARG2) έκφραση από κύτταρα προστάτη οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση του όγκου-ειδικά Τ κύτταρα. Η υπόθεσή μας ήταν ότι τα ανδρογόνα μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των ARG2 από τα κύτταρα του προστάτη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι τόσο ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 εκφράζονται από ορμόνη-ευαίσθητα (ΕΣ ) και ορμονοάντοχου (HR) PCa κυτταρικές σειρές, με τα κύτταρα LNCaP που έχουν την υψηλότερη δραστικότητα αργινάσης. Σε δείγματα ιστού του προστάτη, ARG2 ήταν περισσότερο εκφράζεται σε κανονικά και μη-κακοήθεις ιστούς του προστάτη σε σύγκριση με ιστούς όγκου. Μετά ανδρογόνων διέγερση των κυττάρων LNCaP με 10 ηΜ R1881, τόσο ΠΑΡΑΜ1 και ARG2 υπερεκφράστηκαν. Η ρύθμιση της αργινάσης έκφρασης μετά ανδρογόνου διέγερση ήταν εξαρτημένη από τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), όπως μια θεραπεία siRNA που στοχεύει τον AR ανέστειλε τόσο ΠΑΡΑΜ1 και ARG2 υπερέκφραση. Αυτή η παρατήρηση συσχετίστηκε

in vivo

σε ασθενείς με ανοσοϊστοχημεία. Ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ADT πριν από την επέμβαση είχαν χαμηλότερη έκφραση ARG2 στις δύο μη-κακοήθεις και κακοήθεις ιστούς. Επιπλέον, ARG1 και ARG2 ήταν ενζυμικά ενεργή και μειωμένη έκφραση τους με siRNA είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη συνολική δραστηριότητα αργινάσης και η L-αργινίνη μεταβολισμό. Η μειωμένη έκφραση ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 μεταφραστεί, επίσης, με την αύξηση μειωμένη LNCaP κύτταρα των κυττάρων και αυξημένη ενεργοποίηση των PBMC μετά από έκθεση σε κύτταρα LNCaP ρυθμισμένα μέσα. Τέλος, βρήκαμε ότι η ιντερλευκίνη-8 (IL-8) επίσης ρυθμίζεται αυξητικά εξής ανδρογόνων διέγερση και ότι αύξησε άμεσα την έκφραση του ARG1 και ARG2 απουσία ανδρογόνων.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

τα στοιχεία μας παρέχει η πρώτη λεπτομερής

in vitro

και

in vivo

λογαριασμό ενός ανδρογόνου ρυθμιζόμενη ανοσοκατασταλτικές μονοπάτι στο ανθρώπινο προστάτη μέσω της έκφρασης ARG1, ARG2 και IL-8.

Παράθεση: Gannon PO, Godin-Ethier J, Hassler Μ, Delvoye Ν, Aversa Μ, Poisson AO, et al. (2010) ανδρογόνα ρυθμισμένη έκφραση της αργινάσης 1, αργινάση 2 και ιντερλευκίνη-8 στο ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10.1371 /journal.pone.0012107

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Μαρτίου 2010? Αποδεκτές: 6, Ιουλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2010

Copyright: © 2010 Gannon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση της έρευνας Sanofi Aventis (FS), από μια καναδική βραβείο έρευνας ουρο-Ογκολογική Ομάδα /AstraZeneca (FS) και με επιχορήγηση από τον προστάτη Ίδρυμα έρευνας για τον Καρκίνο του Καναδά (RL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, την ανταλλαγή δεδομένων, την απόφαση να δημοσιεύσει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Επιπλέον, F.S. κατέχει το Πανεπιστήμιο του Μόντρεαλ πρόεδρος στον καρκίνο του προστάτη. R.L. υποστηρίζεται από μια υποτροφία από το Fonds de recherche en Santé du Québec (FRSQ). P.O.G. είναι αποδέκτης ενός Ph.D. studentship από την FRSQ και έλαβε πρόσθετη στήριξη από το Institut du καρκίνου de Montréal /CANDEREL υποτροφία και από το Μοριακής Βιολογίας πρόγραμμα του Πανεπιστημίου του Μόντρεαλ

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια ερευνητική Sanofi Aventis επιχορήγησης (FS) και από μια καναδική βραβείο έρευνας ουρο-Ογκολογική Ομάδα /AstraZeneca (FS). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος και η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου θανάτων που σχετίζονται για την αμερικανική άνδρες της Βόρειας [1]. οργανογένεση και την καρκινογένεση του προστάτη που βασίζονται στην παρουσία των ανδρογόνων [2]. Ως εκ τούτου, η πιο κοινή μορφή θεραπείας για τους άνδρες με προχωρημένο στάδιο ή υποτροπιάζοντα PCA είναι η θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT). ADT οδηγεί στην απόπτωση των κυττάρων του προστάτη ορμόνη επιθηλιακών ευαίσθητα [3]. Δυστυχώς, μέσα σε ένα έως πέντε έτη μετά από ADT έναρξη, οι περισσότεροι ασθενείς αναπτύσσουν ορμονοάντοχο προστάτη (HRPC), του οποίου η επεξεργασία παραμένει παρηγορητική [4]. Νέα μορφές θεραπείας, όπως η ανοσοθεραπεία, προσπάθεια να αντιμετωπίσει αυτά τα μεταγενέστερα στάδια του προστάτη. Ωστόσο, οι τρέχουσες ανοσοθεραπείες έναντι προστάτη έχουν οδηγήσει σε περιορισμένη επιτυχία στις κλινικές ρυθμίσεις. Μια λεπτομερής κατανόηση του όγκου ανοσολογικών μικροπεριβάλλον σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη θα πρέπει να παρέχουν νέες ιδέες για το πώς να βελτιώσουν την τρέχουσα πρωτόκολλα του ανοσοποιητικού που βασίζεται.

Πρόσφατα στοιχεία αποδεικνύουν ότι τα διάφορα ανοσοκατασταλτικά μηχανισμοί βρίσκονται εντός του προστάτη και μπορεί να εμποδίσει την αντι- ογκική ανοσοαπόκριση στο πλαίσιο μιας ανοσοθεραπείας (που επισκοπείται στο [5]). Η αργινάση 2 (ARG2) εκφράζεται σε ανθρώπινο προστάτη [6] και η αναστολή της, ταυτόχρονα με iNOS, αυξάνει την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (TILs) [7]. Ενώ οι ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες του arginases μέσω του μεταβολισμού της L-αργινίνης είναι καλά τεκμηριωμένα (που επισκοπείται στο [8]), η ρύθμιση της έκφρασης ανθρώπινης αργινάσης, ωστόσο, είναι σήμερα απροσδιόριστος.

Τα ανδρογόνα είναι γνωστό ότι έχουν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες , η οποία απεικονίζεται από την ενδο-προστατικής φλεγμονής μετά ADT [9], [10]. Η γονιδιακή έκφραση αναλύσεις και ποντικού μελέτες δείχνουν ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν την έκφραση ARG2 και άλλα ένζυμα της οδού πολυαμίνης [11], [12], [13]. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη τις θεμελιώδεις ρόλους των ανδρογόνων στην καρκινογένεση προστάτη και στην γλυπτική του μικροπεριβάλλοντος του προστάτη του, αξιολογήσαμε εάν τα ανδρογόνα μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των arginases από κύτταρα προστάτη

in vitro

και

in vivo

.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι κυτταρικές σειρές προστάτη εκφράζουν και λειτουργικά ενεργό ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2. Είναι ενδιαφέρον, ορμόνη ευαίσθητη (ΕΣ) και ορμονοάντοχο (HR) σε ιστούς που εκφράζονται λιγότερο ARG2 από τους μη-κακοήθεις ιστούς. Στην κυτταρική σειρά LNCaP ΕΣ, ανδρογόνο διέγερση οδήγησε στην αυξημένη έκφραση τόσο ARG1 και ARG2 σε ένα υποδοχέα ανδρογόνου (AR) εξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η έκφραση ρυθμίζεται από ανδρογόνο παρατηρήθηκε επίσης στον πρωτογενή όγκο των ασθενών που έλαβαν ADT-οποίοι εξέφρασαν λιγότερο ARG2 σε αμφότερες τις μη-κακοήθεις ιστούς πλησίον του όγκου και καρκινικών ιστών σύγκριση με ασθενείς ελέγχου. Τέλος, ανακαλύψαμε ότι η IL-8 επίσης ρυθμίζεται από ανδρογόνα υπό τον έλεγχο του AR, και συμμετείχε στη ρύθμιση της ΠΑΡΑΜ1 και της έκφρασης ARG2. Συνολικά, τα δεδομένα μας παρέχει η πρώτη λεπτομερής

in vitro

και

in vivo

λογαριασμό ενός ανδρογόνο ρυθμίζονται ανοσοκατασταλτικά μονοπάτι στο ανθρώπινο προστάτη.

Αποτελέσματα

ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 έκφραση σε προστάτη

Πρέπει πρώτα αξιολογούνται arginases έκφραση από κυτταρικές σειρές προστάτη και κλινικά δείγματα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι κυτταρικές σειρές προστάτη εκφράζουν και ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2. Η γονιδιακή έκφραση αναλύσεις qPCR έδειξε ότι

ARG1

mRNA ήταν πιο άφθονο στην κυτταρική γραμμή 22Rv1 (Σχήμα 1Α), ενώ ARG1 πρωτεΐνη ήταν ελαφρώς πιο εξέφρασαν οι δύο κυτταρικές σειρές HR PCa (Du145 και PC3) σε σχέση με το LNCaP κύτταρα (Εικόνα 1Β, κάτω πλαίσιο). έκφραση της πρωτεΐνης ARG1 δεν συσχετίζονται με την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης υποδηλώνει μια πιθανή μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Όσο για την έκφραση ARG2, η LNCaP κυτταρική σειρά εξέφραζαν τα υψηλότερα επίπεδα

ARG2

mRNA (Εικόνα 1Α). Χαμηλή

ARG2

έκφραση του mRNA ανιχνεύθηκε σε δύο HR κυτταρικές σειρές DU145 και PC3 σε σύγκριση με τις δύο κυτταρικές σειρές του ΕΣ του προστάτη. ARG2 πρωτεΐνη αφθονία συσχετίζεται με την qPCR καταλήγει με LNCaP κύτταρα που εκφράζουν σημαντικά περισσότερο ARG2 από τις άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1Β, κάτω πλαίσιο). Επιπλέον, τα κύτταρα LNCaP είχε το υψηλότερο αργινάσης δραστηριότητα που υποδηλώνει ότι η ARG2 είναι το κυρίαρχο ένζυμο σε σχέση με αργινάσης δραστηριότητα των κυττάρων του προστάτη (Σχήμα 1Β, πάνω πίνακα).

κυτταρικές σειρές προστάτη (LNCaP, 22Rv1, DU145 και PC3) διατηρήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS. Α) Η γονιδιακή έκφραση του

ARG1

(αριστερό πάνελ) και

ARG2

(δεξιά πλευρά). Μέση σχετική έκφραση (n = 3) με το πρότυπο σφάλμα του μέσου (ράβδοι σφάλματος). Β) Top πίνακα: αργινάση δραστηριότητα των κυτταρικών σειρών προστάτη ποσοτικά σε mU /mg πρωτεϊνών. Κάτω πίνακα: κηλίδα Western των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2. Ran υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. Γ) αντιπροσωπευτική εικόνα της χρώσης ανοσοϊστοχημεία της έκφρασης ARG2 στον προστατικό ιστό. Σημειώστε ότι η έκφραση του ARG2 περιορίστηκε στα επιθηλιακά κύτταρα χωρίς χρώση στρωματικά. Δ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης ARG2 με ανοσοϊστοχημεία σε δείγματα προστάτη. * Στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση ARG2 ανάμεσα στο ΡΙΝ και HR ιστούς (ρ = 0,033, Mann-U). ** Στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση ARG2 μεταξύ ιστών όγκου και φυσιολογικών ιστών (ρ & lt? 0.001, Mann-U), μη-κακοήθεις ιστούς πλησίον του όγκου (ρ & lt? 0,01, Mann-U) και ιστών ΡΙΝ (ρ & lt? 0.001, Mann- U).

η

η έκφραση της πρωτεΐνης ARG2 αξιολογήθηκε σε κλινικά δείγματα με ανοσοϊστοχημεία σε τρεις διαφορετικούς ιστούς μικρο-συστοιχίες (TMAs) που συγκεντρώνει δείγματα προστάτη από μια ομάδα των 99 ασθενών προστάτη και 50 φυσιολογικού προστάτη που λαμβάνεται από αυτοψίες. Εμείς δεν αξιολογούν την έκφραση της πρωτεΐνης ARG1 όπως, στα χέρια μας, τα αντισώματα αντι-ARG1 δοκιμάστηκαν δεν ήταν κατάλληλες για ανοσοϊστοχημεία σε αρχειοθετημένα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση ARG2 περιορίστηκε στο επιθήλιο του προστάτη και απούσα από το στρώμα (Σχήμα 1 C). ARG2 ήταν στατιστικά σημαντικά λιγότερο εκφράζεται σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με την κανονική (ρ & lt? 0.001, Mann-U), για μη-κακοήθεις κανονικό γειτονικό (ρ & lt? 0,01, Mann-U) και του προστάτη ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) ιστούς (ρ & lt? 0.001 , Mann-U) (Σχήμα 1 D). ιστούς ΥΕ εξέφρασε επίσης λιγότερο ARG2, αν και μόνο διαφέρει σημαντικά από ιστούς PIN (p = 0,033, Mann-U). Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ARG2 εντός των κανονικών παρακείμενων και καρκινικών ιστών (Πίνακας S1). Τέλος, θα αξιολογηθεί αν η έκφραση ARG2 συσχετίζεται με κλινικο-παθολογικές παραμέτρους όπως Gleason Score, προεγχειρητική ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) και βιοχημική υποτροπή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση ARG2 εντός της κανονικής γειτονικό ιστό αντιστρόφως ανάλογη με φλύκταινα σπερματικό εισβολή (πίνακας S1). Συνολικά, αυτά τα

in vitro

και

in vivo

δεδομένα καταδεικνύουν τη διαφορική έκφραση των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 μεταξύ των διαφόρων σταδίων της εξέλιξης προστάτη, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ΥΕ.

ανδρογόνα οργανωμένη έκφραση των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2

Η διαφορική έκφραση των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 μεταξύ των κυτταρικών σειρών του ΕΣ και HR προστάτη μας οδήγησε να διερευνήσει τις ρυθμιστικές ρόλους των ανδρογόνων στο αργινάσης έκφρασης. Για να γίνει αυτό, θα αξιολογηθούν arginases γονιδίου και την έκφραση της πρωτεΐνης μετά από ανδρογόνων διέγερση.

ARG1

έκφραση mRNA δεν ήταν στατιστικά σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω είτε LNCaP ή 22RV1 κυτταρικές γραμμές εξής R1881 διέγερση (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, σε κύτταρα LNCaP,

ARG2

έκφραση mRNA αυξήθηκε στις 48 ώρες (ρ = 0,002, Mann-U) και στις 72 ώρες (ρ = 0,016, Mann-U) μετά τη διέγερση R1881 (αριστερό πάνελ, Σχήμα 2Β). Η υπερέκφραση του

ARG2

στο 22RV1 δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,248, Mann-U) (δεξί πάνελ, Σχήμα 2Β). Στην πραγματικότητα,

ARG2

έκφραση συσχετίζεται με την υψηλότερη ευαισθησία ανδρογόνων των LNCaP κυττάρων σε σύγκριση με 22RV1 (Σχήμα S1A). Ως εκ τούτου, τα κύτταρα LNCaP χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Επιβεβαιωτικός τα δεδομένα PCR, κηλίδες Western από κύτταρα LNCaP έδειξε ότι η διέγερση R1881 αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ARG2 (Σχήμα 2C). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην

ARG1

έκφραση mRNA σε κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με R1881, η έκφραση της πρωτεΐνης ARG1 ήταν σημαντικά αυξημένη. Εμείς δεν παρατηρήσαμε οποιεσδήποτε αυξήσεις στην ΠΑΡΑΜ1 ή πρωτεΐνη ARG2 έκφραση σε DU145 και PC3 διεγείρονται με 10 ηΜ R1881 (Σχήμα S1B).

ΑΒ) κύτταρα LNCaP (αριστερά πάνελ) και 22RV1 (δεξιά πάνελ) διεγείρονται πάνω μία περίοδος 72 ώρες με 10 ηΜ R1881 μετά από μια περίοδο 72 ωρών επώαση σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα μέσα και την έκφραση του γονιδίου του α)

ARG1

και Β)

ARG2

αναλύθηκαν με qPCR. Ελέγχου (ανοιχτό γκρι μπάρες) και R1881-διεγείρονται (μαύρες μπάρες). * Στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05, Mann-U). Μέση σχετική έκφραση (n = 4) με τυπικό σφάλμα (ράβδοι σφάλματος). Γ) Η αυξημένη πρωτεΐνη έκφραση τόσο ARG1 και ARG2 εξής R1881 διέγερση με κηλίδα Western. LNCaP κύτταρα διεγέρθηκαν με 10 ηΜ R1881 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. PSA χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Αντιπροσωπευτικά πείραμα, (η = 6). Δ) Η αναστολή της δραστηριότητας AR με βικαλουταμίδη (Casodex). LNCaP κύτταρα διεγέρθηκαν με R1881 για 72 ώρες όπως περιγράφεται προηγουμένως με την παρουσία αυξανόμενων δόσεων βικαλουταμίδης (0, 10, 20 και 40 μΜ). ARG1 και ARG2 επίπεδα έκφρασης αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 3). Σημειώστε την επίδραση αγωνιστή βικαλουταμίδης απουσία R1881 απεικονίζεται από μία αυξημένη έκφραση του PSA και ARG2. Ε) Η αναστολή της έκφρασης AR με siRNA. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. AR, τα επίπεδα ΠΑΡΑΜ1 και έκφραση ARG2 αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 4). ΣΤ) Η δράση της αργινάσης προσδιορίζεται ποσοτικά σε mU /mg πρωτεϊνών. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με siCTRL (ανοιχτό γκρι στήλες) ή Siar (μαύρες ράβδοι) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με R1881 για 72 ώρες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αντιπροσωπευτικό πείραμα, (n = 3).

Η

Η AR εμπλέκεται στην ΠΑΡΑΜ1 και την έκφραση ARG2

Όπως τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν την έκφραση αργινάσης, αξιολογήσαμε τη συμβολή του AR . Εμείς ανέστειλαν δραστικότητα AR με το μη-στεροειδή αντι-ανδρογόνα βικαλουταμίδη (Casodex) (Σχήμα 2D). Σημειώσαμε μια μειωμένη έκφραση ARG1 με την υψηλότερη συγκέντρωση (40 μΜ) βικαλουταμίδης εξής R1881 διέγερση. Η πρόκληση των ανδρογόνων ARG2 δεν έχει αποκλειστεί, ακόμα και στην υψηλότερη συγκέντρωση της βικαλουταμίδης. Όπως τεκμηριώνεται προηγουμένως [14], παρατηρήσαμε ότι η βικαλουταμίδη είχε AR-αγωνιστή δραστικότητα σε κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται απουσία των ανδρογόνων. Υπήρχε μια R1881-ανεξάρτητη επαγωγή της PSA και έκφραση ARG2 σε κύτταρα LNCaP διεγείρονται με 20 μΜ και 40 μΜ βικαλουταμίδης απουσία ανδρογόνων. Σε αυτή την ίδια συνθήκη, βικαλουταμίδη προκάλεσε μία μείωση στην έκφραση ARG1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση ARG1 μπορεί να είναι πιο ευαίσθητοι στην αναστολή AR από ARG2, του οποίου η έκφραση επάγεται από την αγνωστικιστής επίδραση του αναστολέα AR.

Αποφασίσαμε να αναστέλλει περαιτέρω την AR μπλοκάροντας την έκφραση AR σε κύτταρα LNCaP με τη χρήση siRNA. Η παρουσία του siRNA κατά της AR οδήγησε σε σημαντική αναστολή της έκφρασης AR και σε μειωμένη έκφραση του PSA εξής R1881 διέγερση (Σχήμα 2Ε). Τόσο η ARG1 και επαγωγή ARG2 ακόλουθα R1881 διέγερση ανεστάλησαν από την θεραπευτική αγωγή siRNA, το οποίο μεταφράζεται σε απουσία ενός προς τα άνω ρύθμιση σε αργινάσης δραστηριότητα (Σχήμα 2F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η AR ρυθμίζει την έκφραση των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2

in vitro

και ότι ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 έχουν διαφορετική ευαισθησία στην αναστολή AR.

Μειωμένη έκφραση ARG2 σε ασθενείς προστάτη μετά από ADT

με βάση μας

in vitro

δεδομένων, υποθέσαμε ότι τα ανδρογόνα μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης ARG2 σε ασθενείς του προστάτη, καθώς και. Παρατηρήσαμε ότι, σε σύγκριση με τον έλεγχο ασθενών με καρκίνο (χειρουργική μόνο), ADT-αγωγή ασθενείς (ADT πριν τη χειρουργική επέμβαση) είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση ARG2 σε αμφότερες τις μη-κακοήθεις ιστούς πλησίον του όγκου (46,4 vs 23,5 σχετικές μονάδες? Ρ & lt? 0.001 , Mann-U) και οι ιστοί του όγκου (41,7 vs 31,5 σχετικές μονάδες? ρ & lt? 0,01, Mann-U) (Σχήμα 3Α). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η στέρηση ανδρογόνου

in vitro

θα μπορούσε να μειωθεί ARG2, αλλά όχι ARG1 πρωτεϊνική έκφραση, σε LNCaP και 22RV1 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν για επτά ημέρες σε απουσία ανδρογόνων (Σχήμα 3Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν την έκφραση των ARG2

in vivo

σε ασθενείς ΣΕΣΣ ως ADT μειώνει την έκφραση ARG2.

Α) Ανάλυση της έκφρασης ARG2 ανδρογόνων-ρυθμίζονται σε ασθενείς προστάτη με ανοσοϊστοχημεία . ασθενείς της ομάδας ελέγχου (ανοιχτό γκρι μπάρες, n = 40) και οι ασθενείς ADT-αγωγή (μαύρες μπάρες, n = 35). Β) μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ARG2 απουσία ανδρογόνων

in vitro

προσδιορίστηκε με στύπωμα Western. Ran υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. κυτταρικές γραμμές PCa (LNCaP, 22Rv1, DU145 και PC3) διατηρήθηκαν σε RPMI 10% FBS ή σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα για 7 ημέρες (η = 3). Σημειώστε ότι η έκφραση ARG1 δεν ποικίλλουν, αλλά ότι ARG2 μειώθηκε στα κύτταρα LNCaP και 22Rv1 απουσία ανδρογόνων.

Η

ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 είναι μεταβολικά ενεργό

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 εκφράζεται από κύτταρα LNCaP ήταν μεταβολικά δραστική, θα ανέστειλε την έκφραση είτε ΠΑΡΑΜ1 ή ARG2 με siRNA. Σε σύγκριση με ένα siCTRL, τόσο siRNA αναστέλλει σημαντικά ΠΑΡΑΜ1 ή έκφραση ARG2 (Σχήμα 4Α). Αναστολή είτε ΠΑΡΑΜ1 ή ARG2 οδήγησε σε μειωμένη ενζυματική δραστηριότητα αργινάσης (Σχήμα 4Β). Με HPLC, μπορούμε στη συνέχεια προσδιορίζεται η επίπτωση της αναστολής της ARG1 και έκφραση ARG2 επί του μεταβολισμού της L-αργινίνης από κύτταρα LNCaP. Η απουσία είτε ΠΑΡΑΜ1 ή ARG2 οδήγησε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις L-αργινίνης στο ρυθμισμένο μέσο που υποδηλώνει χαμηλότερο μεταβολισμό της L-αργινίνης από κύτταρα LNCaP (Σχήμα 4C). Επιπλέον, σημειώνεται ότι R1881 διέγερση οδήγησε σε μειωμένη συγκέντρωση του εξωκυπαρικού L-αργινίνη, το οποίο επιβεβαιώνει τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν αυξημένη έκφραση αργινάσης εξής ανδρογόνου διέγερση. Αξιολογήσαμε την έκφραση της συνθάσης νιτρικού οξειδίου (NOS), γνωστή επίσης και να μεταβολίζουν η L-αργινίνη. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε την έκφραση της iNOS ή nNOS (πρωτεΐνη), καθώς και καμία παραγωγή του ΝΟ (λειτουργία) στο μοντέλο μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με siCTRL ή κοκτέιλ των τριών siRNA κατά της ΠΑΡΑΜ1 ή ARG2. Μετά τη διαμόλυνση (24 ώρες), τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα συμπληρωμένο μέσο ορό για 72 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 72 ώρες με 10 ηΜ R1881. Α) αναστολή siRNA της έκφρασης ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 αξιολογήθηκε από Western Blot. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 4). Β) Μειωμένη αργινάσης δραστηριότητα μετά την επιμόλυνση με siARG1 ή siARG2 στα κύτταρα LNCaP. Το αντίστοιχο στύπωμα Western φαίνεται στον κάτω πίνακα. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 3). Γ) Μειωμένη μεταβολισμό της L-αργινίνης σε απουσία αργινάσης έκφρασης. Ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με siCTRL, siARG1 ή siARG2 αναλύθηκαν με HPLC για συγκέντρωση L-αργινίνης. Τα ρυθμισμένα μέσα αναλύθηκαν με HPLC ήταν από τα κύτταρα LNCaP που παρουσιάζονται στην Εικόνα 4Α. * Στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05, Mann-U). Δ) μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP με την απουσία της αργινάσης έκφρασης. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με καταμέτρηση κυττάρων 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. * Στατιστικά σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05, Mann-U), (n = 3). Ε) Η αναστολή των αιτίων της έκφρασης ARG2 αυξημένο πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των PBMC. PBMCs από κανονικούς δότες ενεργοποιήθηκαν με αντι-CD3 (ΟΚΤ3, 1 μg /ml) με ή χωρίς IL-2 παρουσία φρέσκου μέσου ή προσαρμοσμένο μέσο από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα είτε με έλεγχο, siCTRL, siARG1 ή siARG2 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. PBMCs ελέγχου επωάστηκαν με ισοτυπικό έλεγχο IgG (1 μg /ml) και με PBS αντί του IL-2. Αριστερό πλαίσιο: πολλαπλασιασμός PBMC προσδιορίστηκε ποσοτικά με ενσωμάτωση BrdU ακόλουθες 120 ώρες ΟΚΤ3 και IL-2 διέγερση. Η μέση απορρόφηση (n = 4) παρουσιάζεται με τυπικό σφάλμα (ράβδοι σφάλματος). Δεξιό πλαίσιο: PBMC έκκριση της ΙΡΝ-γ ποσοτικοποιήθηκε με ELISA. Ίδιο πείραμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αλλά τα PBMCs ενεργοποιήθηκαν για 24 ώρες χωρίς IL-2. Αντιπροσωπευτικά έκφραση δείχνεται (η = 4) με το πρότυπο σφάλμα του μέσου (ράβδοι σφάλματος).

Η

Καθώς οι arginases εμπλέκονται στην οδό σύνθεσης πολυαμίνης είναι αναγκαία για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αξιολογήσαμε την επίδραση του ARG1 και ARG2 στην ανάπτυξη των κυττάρων. Παρατηρήσαμε ότι η αναστολή της είτε ΠΑΡΑΜ1 ή έκφραση ARG2 οδήγησε σε χαμηλότερο πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP διατηρήθηκε σε πλήρες μέσο (ρ = 0,02 και ρ = 0,01, αντίστοιχα για siARG1 και siARG2) (Σχήμα 4D). Επιπλέον, προκειμένου να μελετήσει κατά πόσον ARG1 και την έκφραση ARG2 από τα κύτταρα LNCaP επηρεαστεί ενδεχόμενη ανοσοκατασταλτική δράση τους, PBMCs από υγιείς δότες ενεργοποιήθηκαν με την παρουσία ρυθμισμένων μέσων από LNCaP + siCTRL ή LNCaP + siARG1 ή LNCaP + siARG2. Η αναστολή της είτε ARG1 ή ARG2 μεταφραστεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό PBMC όπως ποσοτικοποιείται με BrdU ενσωμάτωση (Σχήμα 4Ε, αριστερό πάνελ). Αυτή η αυξημένη πολλαπλασιασμός συνδέθηκε με μια αυξημένη έκκριση IFN-γ από ΜΚΠΑ όπως μετράται με ELISA (Σχήμα 4Ε, δεξιό πλαίσιο). Καμία σημαντική μεταβολές στην έκκριση της IL-2 ή IL-10 παρατηρήθηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Τέλος, αξιολογήσαμε κατά πόσο η έκφραση ARG2 συσχετίζεται με το ανοσοποιητικό κυτταρικό διήθημα του πρωτογενούς όγκου που δημοσιεύθηκε πρόσφατα [10]. Σημειώσαμε ότι η έκφραση ARG2 είχε αντιστρόφως συσχετίζεται με την διείσδυση των λεμφοκυττάρων Τ και των μακροφάγων εντός του προστάτη (Πίνακας S2). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ARG1 και ARG2 εκφράζεται από κύτταρα LNCaP είναι ενζυμικά ενεργή και να συμμετέχει σε σημαντικές φυσιολογικές διεργασίες, όπως κυτταρικό πολλαπλασιασμό και που προέρχονται από όγκους ανοσοκαταστολή.

IL-8 επαγωγή ARG1 και έκφραση ARG2

Όπως arginases είναι καλά τεκμηριωμένες να συμμετάσχουν στην γλυπτική του όγκου ανοσολογικής μικροπεριβάλλον [15] και ότι οι κυτοκίνες είναι γνωστό ότι επάγουν αργινάσης έκφραση σε μοντέλα ποντικών [16], αξιολογήσαμε εάν κυτοκίνες θα μπορούσαν επίσης να ρυθμίσουν την έκφραση αργινάσης στην ανθρώπινη PCa . Το προφίλ έκφρασης κυτοκίνης των κυττάρων LNCaP διεγείρεται με 10 ηΜ R1881 ήταν ποιοτικά αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία συστοιχία κυτοκίνης Proteome Profiler (R &? D Systems) (σχήμα 5Α). Τα δεδομένα που απεικονίζονται πρωτεομική ότι οι R1881-διεγερμένα LNCaP κύτταρα είχαν αυξημένη έκφραση της IL-8 και Serpin Ε1 (Σχήμα S2A). Ερευνήσαμε περαιτέρω το ρόλο της IL-8 σε αργινάσης έκφραση IL-8 έχει πρόσφατα συνδεθεί με την έκφραση των γονιδίων ανδρογόνο ρυθμίζεται με προστάτη [17]. Μπορούμε έτσι ποσοτικά το αυξημένη έκφραση της IL-8 σε κύτταρα LNCaP ακόλουθη έκφραση R1881 (Σχήμα 5Β). Αυτή η επαγωγή IL-8 ήταν εξαρτημένη από τον AR όπως η αναστολή της έκφρασης AR με siRNA εμπόδισε IL-8 έκκριση ανδρογόνων εξής διέγερση (Σχήμα 5C). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το εάν η αναστολή της IL-8 θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση ΠΑΡΑΜ1 και ARG2 εξής R1881 διέγερση. Χρησιμοποιώντας ένα siRNA έναντι IL-8, θα μπορούσαμε να ελαττώσει σημαντικά έκκρισης IL-8 (Σχήμα 5D). Αυτή η μειωμένη παραγωγή IL-8 συσχετίστηκε με μείωση του ARG1 και ARG2 24 ώρες μετά R1881 διέγερση (Σχήμα 5Ε). Η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με SIIL-8 μεταφράζεται επίσης σε μείωση της αργινάσης δραστηριότητα (Σχήμα S2B). Τέλος, διεγερμένα κύτταρα LNCaP ανδρογόνα στερηθεί με αυξανόμενη συγκέντρωση του εξωγενούς IL-8 για 72 ώρες και παρακολουθήθηκε η έκφραση της ARG1 και ARG2. Με ανάλυση κηλίδος Western, παρατηρήσαμε ότι τόσο 50 ng /ml και 100 ng /ml IL-8 που προκαλείται από την έκφραση του ARG1 και ARG2 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου LNCaP (Σχήμα 5F). Η μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης ΠΑΡΑΜ1 και ARG2 με 250 ng /ml IL-8 συσχετίστηκε με IL-8 προκαλούμενη κυτταρική τοξικότητα. Παρατηρήσαμε επίσης επαγωγή του

ARG2

, αλλά όχι

ARG1

, γονιδιακή έκφραση μετά από διέγερση 24 ώρες (Σχήμα S2C). Τέλος, όπως ήταν στο παρελθόν αναφερθεί ότι το κόκκινο της φαινόλης μπορεί να ενεργοποιήσει το AR [18], μπορούμε διεγερμένα επίσης LNCaP κύτταρα με IL-8 σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI media. Αυτά τα πειράματα ελέγχου έδειξαν ότι η IL-8-εξαρτώμενη επαγωγή ARG1 και ARG2 θα μπορούσε να συμβεί σε περίπτωση απουσίας του ερυθρού της φαινόλης (Σχήμα S2D). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν την έκφραση της IL-8, η οποία από μόνη της μπορεί να προκαλέσει την έκφραση και των δύο ARG1 και ARG2.

Αξιολόγηση του προφίλ έκφρασης κυτοκίνης των κυττάρων LNCaP εξής R1881 διέγερση. Α) Ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα LNCaP διεγείρεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως αναλύθηκαν με Proteome Profiler ™ (R &? D Systems). Β) Ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα LNCaP διεγείρεται την πάροδο του χρόνου είτε με έλεγχο αιθανόλη (ανοιχτό γκρι ράβδοι) και R1881 (μαύρες ράβδοι) αναλύθηκαν για την παραγωγή της IL-8 με ELISA. Το αντιπροσωπευτικό πείραμα έδειξε διεξήχθη με τον ίδιο ρυθμισμένων μέσων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση Proteome Profiler σε 5α, (n = 3). Γ) Ποσοτικοποίηση της έκκρισης IL-8 από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με Σιάρ και διεγείρονται με R1881 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 3). Δ) Ποσοτικοποίηση της έκκρισης IL-8 από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με SIIL-8 και διεγείρονται με R1881 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 3). Για 5β και 5γ, δεν υπήρχε έκκρισης IL-8 ανιχνεύεται με την απουσία του R1881 διέγερση. Ε) Έκφραση ARG1 και ARG2 σε κύτταρα LNCaP μετά από επιμόλυνση του SIIL-8 και R1881 διέγερση για 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, (n = 3). ΣΤ) LNCaP κύτταρα απλώθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα συμπληρωμένο μέσο ορό για 72 ώρες και για 24 ώρες σε RPMI ελεύθερο ορού. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 72 ώρες με 10 ηΜ R1881 ή με 50, 100 ή 250 ng /ml IL-8 σε RPMI ελεύθερο ορού. ARG1 και ARG2 επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. Αντιπροσωπευτικά πείραμα, (η = 3). Σημειώστε την επαγωγή τόσο ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 στα 50 και 100 ng /ml συγκέντρωση IL-8 απουσία R1881.

Η

Συζήτηση

Μια πιο λεπτομερής κατανόηση της ανοσολογικής προστάτη μηχανισμοί μικροπεριβάλλον μπορεί να βελτιώσει την κλινική αποτελεσματικότητα της τρέχουσας ανοσοθεραπειών κατά PCa. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι ADT οδηγεί σε δραστικές αλλαγές στον προστάτη ανοσολογικές μικροπεριβάλλον [9], [10]. Η οδός αργινάσης συμμετέχει στην ανάπτυξη ενός ανοσοκατασταλτικού κατάσταση εντός του πρωτογενούς όγκου των ασθενών προστάτη [7]. Ωστόσο, η ρύθμιση της αργινάσης έκφρασης από τα κύτταρα του προστάτη παραμένει απροσδιόριστη.

Στην έκθεση αυτή, παρατηρήσαμε ότι τα ανδρογόνα που προκαλείται από την έκφραση τόσο ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 σε κυτταρικές σειρές του ΕΣ του προστάτη. Η AR είχε εμπλακεί σε αυτόν τον κανονισμό και ως βικαλουταμίδη και Σιάρ επιμόλυνση εμπόδισε ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 υπερέκφραση παρακάτω R1881 διέγερση. Αντίστοιχα, στέρησης ανδρογόνων και ADT μειωμένη έκφραση ARG2

in vitro

και στον πρωτογενή όγκο των ασθενών προστάτη, αντίστοιχα. LNCaP κύτταρα εξέφρασαν ενζυματικά λειτουργική ΠΑΡΑΜ1 και ARG2 το οποίο, αφού ανεστάλη η έκφραση της πρωτεΐνης τους, προκάλεσε μία μείωση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ανοσοκατασταλτική δυναμικό τους. Τέλος, δείξαμε ότι η IL-8 επίσης ρυθμίζεται από R1881 και θα μπορούσε να τονώσει την έκφραση των ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 ανεξάρτητα από ανδρογόνα. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας παρέχουν την πρώτη μηχανιστική απόδειξη μιας ανδρογόνων με γνώμονα την ανοσοκατασταλτική μονοπάτι στο προστάτη μέσω της έκφρασης ARG1, ARG2 και IL-8 από τα κύτταρα του προστάτη.

Έχουμε αποδείξει ότι τα κύτταρα του προστάτη εκφράζουν και ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2. ARG2 ήταν κυρίως εκφράζεται από κυτταρικές σειρές του ΕΣ του προστάτη και από μη-κακοήθεις ιστούς του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα δημοσιευμένα δεδομένα που περιγράφουν μία χαμηλότερη έκφραση ARG2 σε ανδρογόνο αναίσθητη κυτταρικές γραμμές (DU145 και PC3) PCa και στον όγκο και HR ιστούς των ασθενών προστάτη [6], [19]. Ωστόσο, με τις γνώσεις μας, είμαστε η πρώτη ομάδα για να μελετήσει την έκφραση της ARG1 από τα κύτταρα του προστάτη και προσδιορίζουν μηχανιστική συνέπειες που οδηγούν στην επαγωγή των ανδρογόνων-ρυθμίζεται του. Παρόμοια με ΠΑΡΑΜ2, η αναστολή της έκφρασης ARG1 οδήγησε σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, μειωμένη L-αργινίνη μεταβολισμό και τη μείωση των ανοσοκατασταλτικών δυναμικό τους. Με βάση την έκφραση της πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β, κάτω πάνελ) και σχετικά με τη δραστηριότητα αργινάσης κυττάρων προστάτη (Σχήμα 1Β, άνω πλαίσιο), τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι ARG2 μπορεί παρ ‘όλα αυτά έχει ένα πιο σημαντικό ρόλο σε σχέση ARG1 στην αργινάσης πιθανή δραστικότητα των κυττάρων προστάτη [20].

Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ΠΑΡΑΜ1 και ΠΑΡΑΜ2 ήταν διαφορετικά ρυθμίζεται από ανδρογόνα. Σε αντίθεση με το γονίδιο ARG2 και την έκφραση της πρωτεΐνης, που αποδεικνύεται σαφώς ότι η έκφραση του γονιδίου και της πρωτεΐνης του ARG1 δεν συσχετίζονται. Αυτό υποδηλώνει ότι τα ανδρογόνα μπορεί να επηρεάσει μία μετα-μεταγραφική ρύθμιση ARG1 όπως προηγουμένως αναφέρθηκε στο Xenopus [21] και σε μοντέλα ζύμη [22]. Δεδομένου ότι η έκφραση ARG2 εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, αξιολογήσαμε εάν κυτταρικό πολλαπλασιασμό ανεξάρτητο των ανδρογόνων θα μπορούσε να προκαλέσει την έκφραση ARG2 στα κύτταρα LNCaP. Σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού με EGF αντί του R1881, δεν επαγωγή ARG2 παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, αν και οι δύο που προκαλείται από R1881, τα μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν σε ARG1 και την έκφραση ARG2 διαφέρουν για τα δύο ένζυμα και πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω.

Η επίπτωση μιας ανδρογόνων-ρυθμιζόμενη έκφραση ARG1 και ARG2 στην καρκινογένεση του προστάτη απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Η αργινάση έκφραση και η σύνθεση πολυαμίνης είναι αυξημένα στο PCa [23], [24] και συνδέονται με το βαθμό του όγκου [25]. Ένα υψηλό αργινάσης δραστικότητα συσχετίζεται με αυξημένο πολλαπλασιασμό του καρκίνου του μαστού [26], καρκίνος του παχέος εντέρου [27] και νεφρικών κυττάρων γραμμές [28]. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι όγκου ή HR ιστοί εκφράζουν λιγότερο ARG2 από τους μη-κακοήθεις ιστούς. Είναι πιθανό ότι τα καρκινικά κύτταρα δεν αποκτούν την έκφραση αυτών των ενζύμων ως ένα μέσο για την περαιτέρω αξιοποίηση ενδεχόμενη ανοσοκατασταλτική δράση τους, μια πτυχή που σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου. Στην πραγματικότητα, δεδομένου ότι ο προστάτης είναι το όργανο με την υψηλότερη παραγωγή πολυαμίνης, αργινάση έκφραση από κύτταρα του προστάτη μπορεί να προηγείται της ανάπτυξης του καρκίνου, καθώς η παραγωγή πολυαμίνης είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη. Έτσι, το πλεονέκτημα ανοσοκατασταλτικά που έχει αποκτηθεί από τα κύτταρα του προστάτη μπορεί να είναι δευτερεύουσα σε πολλαπλασιαστική ρόλο που διαδραματίζουν οι arginases. Από τα δεδομένα μας και των άλλων, υποθέτουμε ότι αργινάσης μπορεί να εμπλέκεται στις προηγούμενες ορμόνη ευαίσθητα στάδια της καρκινογένεσης του προστάτη μέσω της προώθησης του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη μιας ανδρογονο-ρυθμιζόμενη ανοσοκατασταλτικές περιβάλλον.

Τέλος, παρατηρήθηκε ότι η IL-8 ρυθμίζεται αυξητικά εξής ανδρογόνων διέγερση και θα μπορούσε να επάγει την έκφραση του ARG1 και ARG2. IL-8 διαμεσολαβεί τα αποτελέσματά της μέσω της ενεργοποίησης δύο υψηλής συγγένειας G-πρωτεΐνη υποδοχείς, CXCR1 και CXCR2 [29], τα οποία εκφράζονται από τα κύτταρα LNCaP [30], [31]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η έκφραση του ARG1 και ARG2 εξής IL-8 διέγερση δεν ήταν τόσο σημαντική όσο με R1881 διέγερση υποδηλώνοντας ότι άλλες οδοί ανδρογόνο ρυθμιζόμενες θα μπορούσαν να συμμετέχουν.