Αφηρημένο

Ιστορικό

ιστόνης δεακετυλάσης αναστολείς (HDACis) εκ νέου εκφράζουν σιγήσει ογκοκατασταλτικών γονιδίων και επί του παρόντος στο στάδιο των κλινικών δοκιμών. Αν και έχουν γίνει HDACis γνωστό ότι επάγει την έκφραση του γονιδίου, ένας ίσος αριθμός γονιδίων τα μειωτικά κατά HDAC αναστολή. Ο μηχανισμός πίσω από αυτή την αρνητική ρύθμιση παραμένει ασαφής. Εδώ έχουμε παράσχει αποδεικτικά στοιχεία ότι τα διάφορα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από την αναστολή HDAC και παρέχει ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει τον παράγοντα μεταγραφής E2F1 στη διαδικασία.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εφαρμόζοντας Ανάλυση Λειτουργικής σχολιασμού (AFA ) για τα δεδομένα μικροσυστοιχιών των καρκινικών κυττάρων του προστάτη αντιμετωπίζεται με HDACis, βρήκαμε μια σειρά από γονίδια της απόκρισης βλάβες στο DNA και τις οδούς αποκατάστασης που ρυθμίζεται προς τα κάτω από HDACis. AFA αποκάλυψε εμπλουτισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA της οδού BRCA1, καθώς και γονίδια που ρυθμίζονται από τον παράγοντα μεταγραφής E2F1. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα έδειξαν μια μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA και αυξημένη ευαισθητοποίηση σε χημικής ποιότητας και ραδιο-παράγοντες βλάβης του DNA μετά την αναστολή HDAC. Πρόσληψη των βασικών πρωτεϊνών επισκευής ΥΕ στην περιοχή της βλάβης του DNA, καθώς και την ικανότητα επιδιόρθωσης HR τέθηκε σε κίνδυνο κατά την αγωγή HDACi. Με βάση τα δεδομένα μας AFA, υποθέσαμε ότι οι E2F μεταγραφικοί παράγοντες μπορεί να παίζουν ένα ρόλο στην αρνητική ρύθμιση του κλειδιού γονιδίων επιδιόρθωσης κατόπιν αναστολή HDAC σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. ανάλυσης chip και δοκιμασίες λουσιφεράσης αποκαλύπτουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των βασικών γονιδίων επιδιόρθωσης επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση μειωμένη πρόσληψη του μεταγραφικού παράγοντα E2F1 και όχι μέσα από την ενεργό καταστολή από καταπιεστικά E2Fs.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η μελέτη μας δείχνει ότι αρκετά γονίδια στο μονοπάτι επιδιόρθωσης του DNA επηρεάζεται κατά HDAC αναστολή. Αρνητική ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης είναι λόγω της μείωσης στο ποσό και υποστηρικτής πρόσληψη του μεταγραφικού παράγοντα E2F1. Επειδή η αναστολή HDAC επηρεάζει αρκετές οδούς που θα μπορούσαν δυνητικά να έχει αντίκτυπο στην επιδιόρθωση του DNA, σε κίνδυνο την επιδιόρθωση του DNA μετά την αναστολή HDAC θα μπορούσε επίσης να αποδοθεί σε διάφορες άλλες οδούς εκτός από αυτές διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ωστόσο, η μελέτη μας δεν παρέχουν γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό που διέπει την αρνητική ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA ΥΕ μετά την αναστολή HDAC, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε λογική χρήση των HDACis στις κλινικές

Παράθεση:. Kachhap SK, Rosmus Ν, Collis SJ , Kortenhorst MSQ, Wissing MD, Hedayati M, et al. (2010) Ελάττωση των γονιδίων επιδιόρθωσης ομόλογου ανασυνδυασμού του DNA από HDAC αναστολή στον καρκίνο του προστάτη διαμεσολαβείται από τη μεταγραφή Factor E2F1. PLoS ONE 5 (6): e11208. doi: 10.1371 /journal.pone.0011208

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 17 του Μάρ 2010? Αποδεκτές: 25η Μαΐου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2010

Copyright: © 2010 Kachhap et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από το Flight Attendant Ιατρικό Ινστιτούτο Έρευνας, David Koch Ταμείου που παρέχονται από το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη, του προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου Grant, εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας Grant P50-58236 και AEGON. MDW υποστηρίζεται από το Δρ Saal Ίδρυμα van Zwanenberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων πιστεύεται ότι προκαλούνται από τις δύο ρυθμιστές χρωματίνης που τροποποιούν Ν-τερματικό ουρές των ιστονών και DNA μεθυλίωση ένζυμα που μεθυλιώσει συστάδες CpG στις περιοχές υποκινητή των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων [1], [2 ], [3]. Τα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζουν την επιγενετική μηχανήματα να φιμώσουν όγκου και τη μεταστατική καταστολείς να αποκτήσουν επιλεκτική ανάπτυξη και επεμβατική ιδιότητες [4], [5], [6]. Η τάξη HDAC Ι και τα ένζυμα κατηγορίας II σχηματίζουν σύμπλοκα με συν-καταστολείς όπως NuRD και τα σύμπλοκα SMRT /NCoR [7]. Τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA), προσλαμβάνουν διαφορετικές HDACs συνδέονται με αυτά τα μεγάλα συγκροτήματα πολυ-πρωτεΐνη συν-καταστολέα να σιγήσει ογκοκατασταλτικών γονιδίων και αυτό χρησιμεύει ως ένα σκεπτικό για τη χρήση των HDACis τη θεραπεία του καρκίνου [8], [9] .

Η δραστικότητα τόσο κατηγορίας Ι και κατηγορίας HDACs II αναστέλλεται από λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου (φαινυλοβουτυρικό, βαλπροϊκό οξύ (VPA)) και υδροξαμικά οξέα (Vorinostat, Τριχοστατίνη Α), ενώ βενζαμιδίων (MS-275) φαίνεται να είναι συγκεκριμένα στην κατηγορία Ι HDACs [8]. Αντιστρόφως, HDACs κατηγορίας III, οι sirtuins, δεν αναστέλλονται από κανένα από αυτούς τους παράγοντες [10]. Πρόσφατα, Vorinostat έχει εγκριθεί από το FDA για τη θεραπεία δερματικών κυττάρων Τ λεμφώματος. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι η θεραπεία του προστάτη με HDACis ή αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης DNA ανακουφίζει από την καταπίεση, προκαλώντας επανέκφραση του σιγήσει καταστολείς των όγκων οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση και την απόπτωση [11], [12], [13]. Ο συνδυασμός της HDACis με άλλους παράγοντες έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική για μια ευρεία ποικιλία καρκίνων. Αν και έχουν HDACis είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα πάνω ενός αριθμού γονιδίων, παραδόξως ένας ίσος αριθμός γονιδίων καταστέλλονται κατά HDAC αναστολή [14], [15], [16]. Καταστολή των γονιδίων κατά την αναστολή HDAC μπορεί να είναι το αποτέλεσμα των έμμεσων δράσεων του καταστολείς που ενεργοποιούνται και προκαλούν καταστολή σε HDAC παθητικό τρόπο, ή καταστολή θα μπορούσε να επιτευχθεί με ενεργό πρόσληψη των HDAC στους υποψηφίους των επιλεγμένων γονιδίων [17]. Μονοπάτια που ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά την αναστολή HDAC δημιουργήσετε ρυθμίσεις για μεθόδους θεραπείας που είναι αναποτελεσματικά στην παρουσία τους. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι HDACis όπως φαινύλιο βουτυρικό, VPA, MS-275 και SAHA μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία ακτινοβολία των καρκινικών κυττάρων [18], [19], [20], [21]. Μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω ορισμένων γονιδίων που εμπλέκονται στην ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) και μη ομόλογου άκρου ενώνει έχουν (NHEJ) οδούς επιδιόρθωσης του DNA έχουν ενοχοποιηθεί [18], [19], [20], [22].

διπλό διαλείμματα κλώνου (DSBs) μπορεί να προκληθεί με ενδογενή παράγοντες όπως αντιδραστικά είδη οξυγόνου και το άγχος αντιγραφή από στασιμότητα περόνες αντιγραφής, ή μπορεί να προκληθεί από εξωγενείς παράγοντες όπως ιοντίζουσα ακτινοβολία [23]. Είναι όλο και περισσότερο εμφανές ότι η βλάβη του DNA γίνεται αισθητή από σύμπλοκα πρωτεΐνης, που οροθετείται αισθητήρες βλάβη του DNA, η οποία με τη σειρά της διεγείρει έναν καταρράκτη μεταγωγής σήματος που προσλαμβάνουν πρωτεΐνες μεσολαβητής και τελεστή προς τις προσβεβλημένες περιοχές, οδηγώντας στην επιδιόρθωση του DNA [24]. Ανάλογα με την έκταση της βλάβης, περαιτέρω μεταγωγή σήματος προειδοποιεί το κύτταρο είτε καθυστερούν τον κυτταρικό κύκλο μέσω του σημείου ελέγχου ενεργοποίησης για τις διαδικασίες επισκευής για να ολοκληρωθεί, ή υφίστανται απόπτωση [24]. Κάθε είδος της βλάβης του DNA ανιχνεύεται και να επισκευαστεί από διακριτά μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA. Το συγκρότημα MRN, που αποτελείται από σύμπλοκο μεσολαβητή MRE11-Rad50-NBS1, ανιχνεύει DSBs και στρατολογεί ΑΤΜ, ένα ΡΙ3Κ-όπως κινάση, στον τόπο του DSBs [25]. ATM ενεργοποιείται μετά την πρόσληψη σε ϋδΒδ και φωσφορυλιώνει μεταγενέστερος υποστρώματα, να κινήσει τη διαδικασία μεταγωγής σήματος [26].

ATM και των σχετικών κινασών, ATR και DNAPK, φωσφορυλιώνει μια παραλλαγή της ιστόνης γ-H2AX σε ser-139 που φορτώνει σε περιοχές της DSBs και καλύπτει μεγαβάσεων πλαισιώνουν τις DSBs? Το παρόν αποτελεί τη προκαλείται από την ακτινοβολία εστίες. Η φωσφορυλιωμένη γ-Η2ΑΧ προσλαμβάνει αρκετές πρωτεΐνες μεσολαβητής [27]. Μεταξύ αυτών των μεσολαβητών είναι το συγκρότημα επιτήρησης που σχετίζονται BRCA1 και 53BP1. Το καταρράκτη μεταγωγής σήματος ενισχύεται περαιτέρω από κινάσες σημείου ελέγχου μετατροπέα, CHK1 και CHK2, τα οποία ενεργοποιούνται κατά την φωσφορυλίωση από ΑΤΜ και ATR. ATM και ATR μαζί με CHK1 /κινάσες φωσφορυλιώνουν CHK2 έναν αριθμό υποστρωμάτων τελεστών που περιλαμβάνουν BRCA1, Rad51, ρ53, και Mdm2 [28]. Η φωσφορυλίωση της ρ53 οδηγεί στην σταθεροποίηση του, προκαλώντας μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της επαγωγής της ρ21, ή σε περίπτωση μεγαλύτερης βλάβης του DNA, την απόπτωση. Οι αδιέξοδο πιρούνια αντιγραφής που οφείλονται σε βλάβες στο DNA και το άγχος αναπαραγωγή, ανιχνεύονται από PCNA σχετίζονται Rad9-Rad1-Hus1 ή το 911 συγκρότημα, του οποίου η πρόσληψη στο αδιέξοδο ιστοσελίδα διαμεσολαβείται από πρωτεΐνη αντιγραφής Α και ATR. Οι τελικές πρωτεΐνες-τελεστές που επισκευάσει το κατεστραμμένο DNA ενεργοποιείται και προσλαμβάνονται από τα προαναφερθέντα κινάσες και πρωτεΐνες μεσολαβητής στη θέση της βλάβης και επισκευής ακολουθεί.

Γονίδια των οδών επιδιόρθωσης DNA ρυθμίζονται στενά τόσο σε μεταγραφικό και δημοσιεύσετε μεταγραφικό επίπεδο. Στο μεταγραφικό επίπεδο, οι E2F μεταγραφικοί παράγοντες είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση πρωτεΐνες επισκευής. Υπάρχουν εννέα γνωστά E2F μεταγραφικών παραγόντων που μπορούν να χωριστούν σε μεταγραφικούς ενεργοποιητές (E2F1, E2F2, E2F3a) και καταστολείς (E2F4-8)? E2F3b Έχει υποτεθεί ότι λειτουργεί ως καταστολέας [29]. E2F1 και E2F4 έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της CHK1, BRCA1 και γονίδια RAD51 [30], [31], [32].

Πρόσφατα, αναφέρθηκε μία νέα «πολλαπλού βρόχου, διπλό κύβος» cDNA σχεδιασμός μικροσυστοιχιών, να αναλύσει αναστολέα HDAC που επάγεται αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση σε όλη ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών προστάτη [16]. Εφαρμόζοντας Ανάλυση Λειτουργικής σχολιασμού (AFA) σχετικά με τα δεδομένα που από το παραπάνω πείραμα μικροσυστοιχιών βρήκαμε ότι τα διάφορα γονίδια της επισκευής ΥΕ και DNA μονοπάτι απάντηση βλάβη μειωτικά κατά αναστολή HDAC. Στην έκθεση αυτή, δείχνουμε μεταγραφική αρνητική ρύθμιση αρκετών γονιδίων ανταπόκρισης βλάβη του DNA στα κύτταρα του προστάτη μετά την αναστολή HDAC, παρέχουν λειτουργική αποδείξεις για την εμπλοκή της οδού επιδιόρθωσης HR σε μειωμένη επιδιόρθωση του DNA, και να παρέχουν ένα ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα E2F1 στην αρνητική ρύθμιση του DNA γονίδια απάντηση ζημιά.

Αποτελέσματα

AFA αποκαλύπτει HDACis ρυθμίζει προς τα κάτω αρκετά γονίδια της βλάβης του DNA και μονοπάτι απόκρισης σε προστάτη

AFA διεξήχθη σε πρόσφατα δημοσιευμένο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών μας δύο κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU-145) που έλαβαν θεραπεία με vorinostat (παλαιότερα γνωστή ως SAHA) και VPA [16]. Η ανάλυση αποκάλυψε προς τα κάτω ρύθμιση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται με την απάντηση βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση (Πίνακας 1). ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών απεκάλυψε αρκετά γονίδια που σχετίζονται με το E2F1 και οδοί BRCA1 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και με τα δύο HDACis περισσότερο από 1,3 φορές σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές του προστάτη (Σχ. 1α). Πολλά από αυτά τα μειωτικά γονίδια εμπλέκονται στην οδό επιδιόρθωσης του DNA HR. Παραδόξως, οι σχετικές μονοπατιού NHEJ γονίδια, ειδικά DNAPK και Ku, δεν επηρεάστηκαν σε συστοιχίες μας. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι RAD51 ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά την επεξεργασία αναστολέα HDAC σε μία ποικιλία κυτταρικών σειρών [18], [19], [20]. δεδομένα μικροσυστοιχιών μας αποκάλυψαν ότι εκτός Rad51 και συναφή γονίδια, μια ευρεία ποικιλία των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση βλάβης DNA και επιδιόρθωση μονοπάτι όπως BRCA1, Chk1, Τορο ΙΙα, Hus1, και Bubr1, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την κατεργασία αναστολέα HDAC (Σχ. 1β) .

α) DU145 και PC3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δύο διαφορετικά HDACis (vorinostat (SAHA, 1 μΜ), και VPA (βαλπροϊκό οξύ, 1 mM) για τις περιόδους επώασης (2 ημέρες και 4 ημέρες). AFA αποκαλύπτει κατάντη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται με βλάβες στο DNA και την αντίδραση (βλέπε πίνακα 1). αποτελέσματα AFA για την αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών δείχνουν τα BRCA 1 και E2F δίκτυα αλληλεπιδρούν επηρεάζονται από την αναστολή HDAC. κωδικός χρώμα αντιπροσωπεύει το 10

-n το

ρ-

τιμές που λαμβάνονται από τη δοκιμή rank-sum Wilcoxon. β) τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA μειωτικά ≥1.3 φορές τόσο PC3 και DU-145 κύτταρα κατά την αγωγή τόσο με VPA και vorinostat. γ) Επικύρωση της AFA έγινε από την ανάλυση Q-PCR σε ένα υποσύνολο των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά 1,5 θεραπεία mM VPA. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως φορές μεταβολής πάνω από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

Η

Για να κατανοήσουμε τη συνέπεια προς τα κάτω ρύθμιση και να αποκτήσουν περισσότερες γνώσεις σχετικά με τον μηχανισμό πίσω από την προς τα κάτω ρύθμιση, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω ανάλυση με τη χρήση δύο κυττάρων του προστάτη γραμμές (DU-145 και LNCaP) με τη χρήση του VPA αναστολέα HDAC. Για την επικύρωση δεδομένων μικροσυστοιχιών μας, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση Q-PCR σε ένα υποσύνολο των γονιδίων επιδιόρθωσης. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι όλα τα γονίδια που ελέγχθηκαν κατιούσα ρύθμιση και στις δύο κυτταρικές σειρές, εκτός Hus1 οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω μόνο σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 1γ). BRCA1, Rad51 και Chk1 είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από τον παράγοντα μεταγραφής E2F [30], [31]. Δεδομένου ότι η AFA αποκάλυψε εμπλουτισμού για προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων στόχων E2F1, συμπεριλαμβανομένης της ίδιας E2F1, ερευνήσαμε το επίπεδο μεταγραφής τόσο του ενεργοποιητή (E2F1) και κατασταλτική E2F (E2F4 και 6) παράγοντες μεταγραφής. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι E2F1 ήταν σημαντικά κατιούσα ρύθμιση και στις δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με VPA, ενώ οι E2Fs καταστολέα δεν επηρεάστηκαν σε καμία από τις γραμμές κυττάρων κατά την κατεργασία VPA (Σχ. 1γ).

προς τα κάτω ρύθμιση του DNA των γονιδίων επιδιόρθωσης με αναστολή HDAC οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων του προστάτη σε παράγοντες βλάβης του DNA

Προηγούμενες αναφορές από την ομάδα μας και άλλοι έχουν αποδείξει ότι HDACis όπως VPA μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [11], [16]. HDACis έχουν επίσης γνωστό ότι δρα ως ραδιοευαισθητοποιητές [18], [19], [20]. Υποθέσαμε ότι προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA μετά την αναστολή HDAC θα οδηγούσε σε αυξημένη ευαισθησία σε διάφορες επιβλαβείς παράγοντες του DNA. DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες κλωνογονική επιβίωση μετά από αγωγή με ένα συνδυασμό HDACis και διαφορετικούς παράγοντες που επάγουν DSBs όπως η ακτινοβολία, η σισπλατίνη και υδροξυουρία. Ένα κλωνογονική δοκιμασία ραδιοευαισθησία διεξήχθη με αυξανόμενες δόσεις του VPA με την παρουσία ενός αυξανόμενου δοσολογία της ακτινοβολίας. Όπως ήταν αναμενόμενο, VPA έκανε ραδιοευαισθητοποιεί DU-145 κύτταρα, και υπήρχε μια αύξηση στην ευαισθησία με αυξανόμενες δοσολογίες (Εικ. 2α). Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι ένα ελάττωμα στο ομόλογο ανασυνδυασμό μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στο προφίλ ευαισθησία φαρμάκου, καθιστώντας τα BRCA1 ελλειμματικά καρκίνοι του μαστού ευαίσθητα σε μιτομυκίνη C, σισπλατίνη, ετοποσίδη και άλλα φάρμακα που παράγουν δίκλωνο βλάβες [33]. Υποστηρίξαμε ότι αυτό μπορεί να ισχύει για HDACi επεξεργασμένα κύτταρα του προστάτη, όπου υπάρχει μια μείωση στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται μονοπάτι BRCA1. Δοκιμασίες κλωνογονικότητας εκτελείται μετά την αγωγή του DU-145 κύτταρα με μόνη ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη και υδροξυουρία VPA, αποκάλυψε ότι σε σύγκριση με ένα μόνο παράγοντα, ο συνδυασμός του VPA είτε με υδροξυουρία ή σισπλατίνη μειώθηκε σημαντικά κλωνογονιδιακή επιβίωση (Σχ. 2β και γ) .

α) κλωνογονική δοκιμασία διεξάγεται σε DU-145 μετά από αγωγή με διαφορετικές δόσεις του VPA για 48 ώρες πριν από την ακτινοβόληση με διαφορετικές δόσεις ακτινοβολίας. Κορυφαία πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτική κλωνογονικού πλάκες με 0Gy και 4 Gy γράφημα ακτινοβολία κάτω απεικονίζει κλάσμα επιβίωσης μετά από τις θεραπείες VPA και ακτινοβολία. μπάρα σφάλματος αντιπροσωπεύει την τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. β) κλωνογονική δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 1,5 mM VPA και σισπλατίνη (100 ηΜ και 250 ηΜ) για 48 ώρες. μπαρ λάθους αντιπροσωπεύει την τυπική απόκλιση. γ) κλωνογονική δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 1,5 mM VPA και υδροξυουρία (0.5 mM και 1 mM) για 48 ώρες. μπάρα σφάλματος αντιπροσωπεύει την τυπική απόκλιση.

Η

HDAC αναστολή με VPA οδηγεί σε μείωση στις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA της οδού απόκρισης HR και βλάβη του DNA

ευαισθησία στις διάφορες παράγοντες βλάβης του DNA μετά την αναστολή HDAC θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα μειωμένη ή subnormal ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA στα επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με την ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA κατά την HDAC αναστολή. Ραδιοευαισθητοποίηση HDACis έχει συνδεθεί με μία μείωση στην έκφραση του γονιδίου Rad51 σε PCa [20]. Για πρώτη δοκιμή αν VPA προκαλεί μια μείωση στο διπλό σπάσιμο κλώνου ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA των κυττάρων προστάτη πραγματοποιήσαμε μια ουδέτερη κομήτη δοκιμασία για την αξιολόγηση ως προς την ικανότητά επιδιόρθωση του DNA καρκινικών κυττάρων προστάτη κατά την HDAC αναστολή [34], [35]. Κάτω από τις πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν, δεν βρήκαμε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά στην ουρά στιγμή της ΕΣΕΣ επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου χωρίς ακτινοβολία. Ωστόσο, με την απουσία των κυττάρων θεραπεία VPA εκτέθηκαν σε 4 Gy ακτινοβολίας ήταν σε θέση να επισκευάσει τις περισσότερες των κατεστραμμένων DNA τους εντός 4 ωρών. Ωστόσο μετά την θεραπεία VPA δύο κυτταρικές σειρές προστάτη έδειξε σημαντικά υψηλότερες στιγμές ουρά 4 ώρες μετά την έκθεση σε 4 Gy ακτινοβολίας που υποδηλώνει μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA (Σχ. 3α). Για να προσδιορίσετε αν η επισκευή DSB είναι σε κίνδυνο μετά την αναστολή HDAC, χρησιμοποιήσαμε H2AX κάθαρση εστίες ως δείκτη της αποτελεσματικής επισκευής DSB. DU-145 και LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με VPA και ακτινοβολήθηκε με 2 Gy, 4 Gy, και 6 Gys της ακτινοβολίας. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν μετά από 4 ώρες από την επισκευή και ανιχνεύθηκαν με Ser

139 φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ αντισώματα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η αύξηση του Η2ΑΧ εστίες βρέθηκε σε κύτταρα προστάτη σε επεξεργασία με VPA, υποδεικνύοντας μία μείωση στην ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA (Σχ. 3β). Σε κίνδυνο την επιδιόρθωση του DNA μπορεί να είναι το αποτέλεσμα της μείωσης των συνολικών ποσών των πρωτεϊνών επισκευή και /ή μια μείωση στον εντοπισμό ή την πρόσληψη των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης για την τοποθεσία που υπέστη ζημία. Για να δοκιμαστούν αυτές οι πιθανότητες, ερευνήσαμε πρώτα τα επίπεδα των πρωτεϊνών επισκευής που αποδείχθηκαν ότι downmodulated σε μικροσυστοιχία σύνολο δεδομένων μας μετά τη θεραπεία VPA. Πολλά από αυτά τα γονίδια, όπως Rad51, BRCA1 και Chk1, επάγονται μετά βλάβη του DNA [24]. Για να διερευνηθεί εάν αυτές οι πρωτεΐνες παραμένουν μειωτικά κατά HDAC αναστολή ακόμα και μετά από βλάβη στο DNA, εκτελέσαμε ανάλυση μας με την απουσία και παρουσία της ακτινοβολίας. Μία αύξηση στην συνολική Η3 ακετυλίωση σε κύτταρα DU-145 και LNCaP έδειξε ότι το VPA προκαλεί μια αποτελεσματική παγκόσμια αναστολή HDAC σε δοσολογία που χρησιμοποιείται για τα πειράματα (Σχ. 4α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αύξηση της συγκέντρωσης του VPA προκαλεί μείωση του BRCA1 και Rad51 και στα δύο κύτταρα DU-145 και LNCaP, ενώ άλλες πρωτεΐνες επισκευής όπως DNAPK και NBS1 παραμένουν ανεπηρέαστες (Εικ. 4β και γ). επίπεδα πρωτεΐνης BRCA1 δεν είναι σταθερή στο κύτταρο, και κορυφές σε διαφορετικά χρονικά σημεία, ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου. Για να κατανοήσουμε όταν BRCA 1 προς τα κάτω σε VPA επεξεργασμένα κύτταρα, λύματα συλλέχθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο μετά τη θεραπεία. BRCA1 βρέθηκε να μειώνει το συντομότερο 18 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 4γ), υποδεικνύοντας μία ταχεία απόκριση μετά από HDAC αναστολή. Η ακτινοβόληση των κυττάρων προστάτη, μετά τη θεραπεία με VPA, απέδειξαν ορισμένες πρωτεΐνες απόκριση βλάβης του DNA και επιδιόρθωση όπως ATR και NBS1 παρέμεινε ανεπηρέαστη, ενώ DNAPK προκλήθηκε κατά την κατεργασία VPA παρουσία ακτινοβολίας (Σχ. 5α). RAD51, BRCA1 και CHK1 βρέθηκαν να παραμείνει μειωτικά ακόμη και μετά την ακτινοβόληση σε VPA επεξεργασμένα κύτταρα. BRCA1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη, η οποία διανέμει στο κυτταρόπλασμα υπό ορισμένες προϋποθέσεις. Για να εξακριβωθεί ότι η θεραπεία με VPA αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω του BRCA1 στον πυρηνικό διαμέρισμα, DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με VPA και ακτινοβολημένα 48 ώρες μετά την αγωγή με 4 Gy ακτινοβολίας. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από αυτά τα κύτταρα ανοσοιχνηθετούνται για BRCA1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5β, VPA κατεργασμένα κύτταρα έχουν μια προς τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης BRCA1, ακόμη και μετά την ακτινοβόληση.

α) Ουδέτερη κομήτη δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε επεξεργασία με 1.5 mM VPA για 48 ώρες και ακτινοβολήθηκε με 6 Gy ακτινοβολία γ- ακολουθείται από ένα διάστημα επισκευής 4 ώρες. Μη-ακτινοβολημένα κύτταρα (0Gy) με και χωρίς θεραπεία VPA δεν έδειξε καμία σημαντική διαφορά στο κομήτη στιγμές ουρά. Το γράφημα απεικονίζει μέση ουρά ροπή 50 κύτταρα bar σφάλματος υποδεικνύει αξία SD τριών πειραμάτων. Συγκρίσεις έχουν πραγματοποιηθεί με τη χρήση t-test του φοιτητή. β) ανοσοφθορισμού δείχνει Η2ΑΧ Ser

139 χρώση σε DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 1,5 mM VPA για 48 ώρες και ακτινοβολήθηκε με ακτινοβολία 4Gy ακολουθούμενη από χρόνος επισκευής 4 ώρες. Το γράφημα δείχνει την ποσοτικοποίηση των H2AX εστίες σε έλεγχο (μπλε στήλη) και επεξεργάστηκε (κόκκινη στήλη) DU-145 και LNCaP κύτταρα. μπάρα σφάλματος αντιπροσωπεύει την τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

α) στύπωμα Western που δείχνει την ακετυλίωση της πρωτεΐνης ιστόνης Η3 σε DU-145 κύτταρα μετά από αγωγή με διαφορετικές δόσεις του VPA για 48 ώρες. β) DNAPK και τα επίπεδα πρωτεΐνης NBS1 σε VPA αγωγή DU-145 κύτταρα για 48 ώρες. γ) κηλίδα Western που δείχνει RAD51 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης BRCA1 εις LNCaP και DU-145 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με κυμαινόμενες δοσολογία του VPA για 48 ώρες. Blot στα δεξιά δείχνει DU-145 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 1,5 mM VPA για διάφορα χρονικά σημεία ανιχνεύτηκαν για πρωτεΐνη BRCA1.

Η

α) PCA κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με 1,5 mM VPA για 48 ώρες, ακτινοβολούνται με διαφορετικές δόσεις ακτινοβολία, ανιχνεύτηκαν για διάφορες πρωτεΐνες επισκευή με western αποτύπωση. Μη ακτινοβολημένα (κύτταρα 0Gy) συμπεριλήφθηκαν επίσης. β) Σύνολο και πυρηνικό εκχύλισμα του VPA (1.5 mM για 48 ώρες) αντιμετωπίζονται DU-145 κύτταρα με και χωρίς ακτινοβολία ερωτάται για την πρωτεΐνη BRCA1. Μη ακτινοβολημένα (κύτταρα 0Gy) συμπεριλήφθηκαν επίσης. γ) Top πίνακα δείχνει το επίπεδο της πρωτεΐνης TOPO ΙΙα σε πυρηνικό εκχύλισμα από DU-145 κύτταρα κατά την αγωγή VPA. Κάτω πάνελ είναι μια γέλη αγαρόζης που δείχνει δραστικότητα ΤΟΡΟ ΙΙα υπό τις ίδιες εκχυλίσματα, η λωρίδα 4 είναι ένας αρνητικός έλεγχος.

Η

Τα αποτελέσματά μας είχαν δείξει αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων μεταγραφής ΤΟΡΟ ΙΙα κατά την κατεργασία με VPA. ΤΟΡΟ ΙΙα επιλύει catenated DNA προκαλώντας μια παροδική DSB και επακόλουθη ανασύνδεση [36]. ΤΟΡΟ ΙΙα έχει εμπλακεί σε μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της αντιγραφής του DNA, την μεταγραφή και χρωμόσωμα διαχωρισμού [37]. Αναμέναμε προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτείνης ΤΟΡΟ ΙΙα μετά HDAC αναστολή. Προς έκπληξή μας, βρήκαμε ΤΟΡΟ ΙΙα πρωτεΐνη υπερεκφράζεται κατά την κατεργασία VPA στις δύο κυτταρικές σειρές προστάτη (Σχ. 5γ και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνηθεί κατά πόσο αυτό οδηγεί σε αύξηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης ΤΟΡΟ ΙΙα, χρησιμοποιήσαμε πυρηνικό εκχύλισμα από VPA αγωγή DU-145 κύτταρα για να μετρηθεί δραστικότητα decatenation του ΤΟΡΟ ΙΙα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5c, VPA κατεργασμένα κύτταρα decatenated κινητοπλάστη DNA πιο αποτελεσματικά από ό, τι τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Αυτό υποδηλώνει ότι, αν και ΤΟΡΟ ΙΙα ρυθμίζεται προς τα κάτω σε επίπεδο μεταγραφής κατόπιν της αναστολής HDAC, υπάρχει μία ρύθμιση μετα-μεταφραστική όπου η πρωτεΐνη σταθεροποιείται κατόπιν HDAC αναστολή.

Πρόσληψη βασικών πρωτεϊνών επιδιόρθωσης HR DNA επηρεάζεται κατά HDAC αναστολή ηγετική σε μείωση HR επιδιόρθωση του DNA

χωρικής και χρονικής πρόσληψη πρωτεϊνών διαμεσολαβητή και επιδιόρθωση του DNA με την επαγόμενη ακτινοβολία εστίες είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική επιδιόρθωση του DNA να συμβεί [24]. Ερευνήσαμε αν μια μείωση στην απόκριση πρωτεΐνες και την επισκευή βλάβης του DNA μετά την αναστολή HDAC οδήγησε επίσης σε μια μείωση στην πρόσληψη των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA με την τοποθεσία που υπέστη ζημία. VPA αγωγή DU-145 και LNCaP κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 4 Gy ακτινοβολίας και στη συνέχεια καθορίζεται μετά από τέσσερις ώρες από την επισκευή.

ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε για BRCA1 και RAD51 μαζί με φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες Η2ΑΧ. Υπήρξε μια αξιοσημείωτη μείωση στην χρώση για BRCA1 και RAD51 εστιών κατά την κατεργασία VPA? κύτταρα ελέγχου από την άλλη πλευρά έδειξε διακριτά BRCA1 και RAD51 εστίες που colocalized με φωσφορυλιωμένο Η2ΑΧ (Σχ. 6α και β). Η χρώση και ο εντοπισμός του NBS1, ωστόσο, παρέμεινε αναλλοίωτη μετά από θεραπεία VPA (Σχ. 6α). Εμείς ποσοτικά τον αριθμό των γονιδίων BRCA1 και RAD51 εστίες μετρώντας τους σε κύτταρα που έχουν περισσότερα από είκοσι εστίες Η2ΑΧ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C, διαπιστώσαμε ότι υπήρχε μια σημαντική μείωση στον αριθμό των εστιών επισκευής για τις δύο από τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης κατά την κατεργασία VPA. Τόσο LNCaP και DU-145 κύτταρα έδειξαν στικτή κυτταροπλασματική χρώση τόσο για RAD51 και BRCA1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, εκτός από τα κάτω ρύθμιση, υπάρχει μια εξασθενημένη πρόσληψη των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης για το κατεστραμμένο χώρου μετά HDAC αναστολή.

α) ανάλυση ανοσοφθορισμού των DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 1,5 mM VPA για 48 ώρες και ακτινοβολήθηκε με 4Gy της ακτινοβολίας ερωτάται για το BRCA 1 (κόκκινο) και NBS1 (πράσινο). Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Κυτταροπλασματική BRCA1 (βέλος) φαίνεται στο VPA επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν μειωμένη πρόσληψη BRCA1 σε VPA επεξεργασμένα κύτταρα. β) ανάλυση ανοσοφθορισμού των κυττάρων LNCaP σε επεξεργασία με 1.5 mM VPA για 48 ώρες και ακτινοβολήθηκε με 4Gy ακτινοβολίας ανιχνεύθηκαν για Η2ΑΧ Ser

139 (κόκκινο) και RAD51 (πράσινο). Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Κύτταρα που έχουν & gt? 25 H2AX Ser

139foci αναλύθηκαν. Κυτταροπλασματική RAD51 (βέλος) φαίνεται στο VPA επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν μειωμένη πρόσληψη BRCA1 σε VPA επεξεργασμένα κύτταρα. γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός του αριθμού των γονιδίων BRCA1 και RAD51 εστίες colocalizing με Η2ΑΧ Ser

139 εστίες στα κύτταρα DU-145 και LNCaP μετά από θεραπεία με 1,5 mM VPA και ακτινοβόληση με 4Gy ακτινοβολίας. Ένα σύνολο 100 κυττάρων που έχουν & gt? 25 H2AX Ser

139foci μετρήθηκαν. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τη μέση τιμή. δ) ανάλυση FACS που απεικονίζει μία δοκιμασία επιδιόρθωσης HR χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα πλασμίδιο αναφοράς σε κύτταρα LNCaP μετά από θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις του VPA.

Η

Είτε αυτό οδηγεί σε μείωση της επισκευής HR ήταν η επόμενη ερώτηση ερευνήσαμε. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση που βασίζεται πλασμίδιο να σκοράρει για την αποδοτικότητα HR στα κύτταρα LNCaP. Δημιουργήσαμε ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή ανασυνδυασμό EGFP μέσω κλωνοποίησης ενός EGFP χωρίς προαγωγέα ανοδικά του φορέα pEGFPN1. Μία θέση Bcl Ι κατασκευάστηκε σε αυτό το γονίδιο για την επαγωγή DSBs. Το γονίδιο EGFP μπροστά από τον υποκινητή CMV μεταλλάχθηκε, με συνέπεια ότι η λειτουργικότητα της EGFP θα αποκατασταθεί μόνον όταν υπάρχει αποτελεσματική επισκευή HR. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6d, υπήρξε μια σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων HR καλά LNCaP κατά την κατεργασία VPA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς τη συμμετοχή της οδού HR στα κύτταρα του προστάτη μετά την αναστολή HDAC.

E2F1 εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση των βασικών πρωτεϊνών επισκευής μετά την αναστολή HDAC

Από τα στοιχεία μας αποδεικνύεται μεταγραφική αρνητική ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης κατόπιν αναστολή HDAC, διερευνήσαμε την ιστόνης Η3 κατάσταση ακετυλίωση υποκινητών ενός υποσυνόλου μειωτικά γονιδίων χρησιμοποιώντας δοκιμασίες chip. Περιέργως, τα αποτελέσματά μας έδειξε μία μείωση των Η3 κατάσταση ακετυλιώσεως των εγγύς περιοχών υποκινητή όλων των γονιδίων διερευνήθηκαν (Σχ. 7α). Μια μείωση στην ακετυλίωση των περιοχών προαγωγού συνοδεύεται επίσης από μια αύξηση στη σύνδεση μεταγραφικών πρωτεϊνών καταστολέα στους προαγωγούς [7]. Να διερευνήσει τους παράγοντες μεταγραφής που μπορεί να επιφέρει η μεταγραφή καταστολή των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA μετά την αναστολή HDAC, εστιάσαμε την προσοχή μας στις E2F μεταγραφικών παραγόντων. BRCA1 και Rad51 έχουν δύο E2F θέση δέσμευσης στην περιοχή του εγγύς υποκινητή [31]. Τόσο BRCA1 και Rad51 καταπιέζονται κάτω από συνθήκες υποξίας από την πρόσληψη καταστολείς /ρ130 μεταγραφή E2F4. Υπό υποξικές συνθήκες, E2F1 και E2F4 δεσμεύουν ταυτόχρονα τον προωθητή Brca1 σε δύο γειτονικές θέσεις E2F να επιφέρουν μεταγραφική καταστολή της έκφρασης του γονιδίου BRCA1 [30], [31]. Ομοίως, Chk1 και BubR1 έχουν θέσεις δέσμευσης μεταγραφή για μεταγραφικούς παράγοντες E2F και προκαλείται από E2F1 [32], [38].

α) ανάλυση τσιπ VPA (1.5 mM για 48 ώρες) αντιμετωπίζονται DU-145 κύτταρα για ακετυλιωμένη κατάσταση της ιστόνης Η3 στους υποκινητές των γονιδίων επιδιόρθωσης. Το διάγραμμα μπαρ είναι ένα ανάγνωση πυκνότητας της γέλης αγαρόζης παρουσιάζεται ομαλοποιηθεί στις εισόδους. β) Activator και καταστολέα E2F επίπεδα της πρωτεΐνης στο VPA (1.5 mM για 48 ώρες) επεξεργασμένων κυττάρων επίπεδα LNCaP και DU-145 cells.E2F παρέμεινε μειωτικά κατά την θεραπεία VPA, ακόμη και μετά την ακτινοβόληση με 4Gy ακτινοβολία, όπως φαίνεται στο DU-145 κύτταρα, μη-εκπέμπον (0Gy ) κύτταρα χρησίμευσαν ως ένας έλεγχος ακτινοβολία. γ) δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή σε DU-145 και LNCaP κύτταρα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις VPA, χρησιμοποιώντας περιοχές εγγύς υποκινητή, καλύπτοντας E2F περιοχές μειωτικά γονιδίων επιδιόρθωσης δεσμευτική. δ) ανάλυση ChIP για E2F πληρότητα στις περιοχές υποκινητή των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω. ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι E2Fs (1, 4, και 6) σε VPA (1.5 mM για 48 ώρες) αγωγή και τον έλεγχο των κυττάρων DU-145. Το διάγραμμα μπάρα αντιπροσωπεύει πυκνομετρικές μετρήσεις ρυθμίζεται σύμφωνα με τις αντίστοιχες εισόδους.

Η

Από E2F1 μεταγραφής ρυθμίζεται προς τα κάτω από HDACis, υποθέσαμε ότι η αναστολή HDAC μπορεί να αυξήσει τη σύνδεση των κατασταλτικών E2Fs να ρυθμίζεται προς τα κάτω υποκινητές γονιδίων επισκευής, και ως εκ τούτου να οδηγήσει σε ενεργή καταστολή των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA. Ερευνήσαμε πρώτα επίπεδα της πρωτεΐνης τόσο του ενεργοποιητή και κατασταλτική E2Fs μετά τη θεραπεία με VPA τόσο LNCaP και DU-145 κύτταρα. Σύμφωνα με τα επίπεδα μεταγραφής, το επίπεδο της πρωτεΐνης E2F1 ήταν μειωτικά κατά την αγωγή VPA, ενώ τα κατασταλτικά E2Fs (E2F4 και 6) δεν άλλαξε. E2F1 παρέμεινε μειωτικά ακόμη και μετά την επαγωγή της βλάβης του DNA με ακτινοβολία (Εικ. 7b). Έτσι, υπάρχει μια διαφορική απόκριση του ενεργοποιητή και κατασταλτικών E2Fs στην αναστολή HDAC. Υπάρχουν αναφορές που δείχνουν μια αύξηση στην μεταγραφική δραστικότητα E2F1 διάρκεια νευρωνική απόπτωση κατά HDAC αναστολή [39]. Αυτό θα μπορούσε να είναι ιστός που εξαρτάται, ως μεσολάβηση vorinostat αποτελέσματα αναστολή HDAC σε μειορύθμιση των συγγενικών E2F γονιδίων σε πολλαπλό μυέλωμα [40]. Περαιτέρω, η σύνδεση του E2F1 με τον προαγωγέα ΑΡΧΗ δείχθηκε να μειωθεί από τον αναστολέα HDAC τριχοστατίνη Α [41]. Παρά το γεγονός ότι βρήκαμε επίπεδα πρωτεΐνης E2F1 μειωτικά κατά αναστολή HDAC, υπήρχε μια πιθανότητα ότι η δραστικότητα του υπόλοιπου πισίνα του E2F1 αυξήθηκε μετά HDAC αναστολή. Για να διερευνήσουν αυτό, κλωνοποιημένα εγγύς περιοχές του BRCA1, Rad51, και Chk1, το οποίο περιλαμβάνει τις θέσεις πρόσδεσης E2F, στο βασικό φορέα αναφοράς λουσιφεράσης pGL3. VPA αγωγή DU-145 και LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με το ρεπόρτερ υποκινητή κατασκευάσματα μαζί με φορέα αναφοράς λουσιφεράσης Renilla. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. Τα δεδομένα μας αποκάλυψε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω όλων των υποκινητών γονιδίων κατά την κατεργασία VPA, με τον υποκινητή BRCA1 είναι το πιο επηρεάζεται, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 7c). Είτε αυτό συνεπάγεται μειωμένη δέσμευση του E2F1 ή αυξημένη πρόσδεση των κατασταλτικών E2F4 ή E2F6 στα μειωτικά υποκινητές γονιδίων ήταν η επόμενη ερώτηση που απευθύνεται. Εκκινητές για αναλύσεις ChIP σχεδιάστηκαν για να πλαισιώσει τις θέσεις E2F στο εγγύς υποστηρικτές του BRCA1, Rad51, Chk1 και Bubr1 γονίδια. Χρωματίνης από VPA επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ανοσοκατακρημνίσθηκε με αντισώματα έναντι E2F1, E2F4 και E2F6. PCR ενίσχυση του καταβυθισμένου χρωματίνης DNA αποκάλυψε κατάληψη προαγωγέα από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής. Επιβεβαιώνοντας την προηγούμενη έκθεση, βρήκαμε ταυτόχρονη κατάληψη του E2F1 και E2F4 σε φορείς του γονιδίου BRCA1 και Rad51 και βρήκε ένα παρόμοιο πρότυπο για τον υποκινητή Bubr1. Υπό πειραματικές συνθήκες μας, δεν βρήκαμε καμία σύνδεση με οποιαδήποτε από τους αναδόχους διερευνηθεί E2F6. Ενώ E2F1 συνδέονται ισχυρώς προς περιοχές υποκινητή σε μη επεξεργασμένους μάρτυρες, υπήρξε μια σημαντική μείωση των προσλήψεων E2F1 κατόπιν αναστολή HDAC (Εικ. 7d). Σε αντίθεση με την υπόθεση μας, διαπιστώσαμε ότι η αρνητική ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης δεν είναι, ως αποτέλεσμα της δραστικής καταστολής από καταπιεστικά E2Fs, αλλά μια συνολική μείωση στην πρόσληψη του ενεργοποιητή E2F1 με τους αναδόχους.

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη, ορισμένες οδούς επιδιόρθωσης του DNA είναι αδρανοποιημένο, ως αποτέλεσμα του οποίου, η PCA αποκτά γενωμική αστάθεια. Αυτό αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο επίπεδο της ενδογενούς βλάβης του DNA σε κύτταρα του προστάτη από τα φυσιολογικά κύτταρα [42], [43]. Για τη συνέχιση της επιβίωσης των κυττάρων, οι άλλες οδοί απάντηση βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση που προκαλείται και συντηρείται.