Αφηρημένο

Το στοιχείο καταστολέα φίμωση μεταγραφικού παράγοντα (REST) ​​είναι μια συντεταγμένη μεταγραφικά και επιγενετικές ρυθμιστή που λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων ή ογκογονιδίου ανάλογα με κυτταρική έννοια, καθώς και μια κολοβωμένη παραλλαγή ματίσματος REST4 έχει συνδεθεί με διάφορους τύπους καρκίνου. Πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση του εναλλακτικού ματίσματος (AS) του

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

από ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA και ενίσχυση PCR του cDNA από διάφορους ιστούς και κυτταρικές σειρές με ειδικούς εκκινητές. Εντοπίσαμε 8 καινοτόμος εναλλακτική εξώνια συμπεριλαμβανομένου ενός εναλλακτικού τελευταίο εξόνιο που διπλασιάζει το

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονίδιο όριο, μαζί με πολλές τοποθεσίες 5 ‘/3’ συναρμογής και καταλήγει στα συστατικά εξώνια. Με το συνδυασμό των διαφόρων μοντέλων ματίσματος (π.χ. παράκαμψη εξωνίου και εναλλακτική χρήση της πρώτης και της τελευταίας εξόνια) που είναι προγνωστικά αλλαγμένη δραστικότητα REST, τουλάχιστον 45 παραλλαγές εναλλακτικού ματίσματος του κωδικοποίησης και μη-κωδικοποίησης mRNA εκφράστηκαν σε ένα είδος και κύτταρο -τύπου /ιστού-ειδικό τρόπο, με τις ατομικές διαφορές. Με την εξέταση του ρεπερτορίου του

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA ματίσματος σε 27 ασθενείς με νεφρική, ηπατική και τον καρκίνο του πνεύμονα, διαπιστώσαμε ότι όλοι οι ασθενείς χωρίς καμία εξαίρεση έδειξαν διαφορική έκφραση των διαφόρων

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

ματίσματος παραλλαγές μεταξύ των αξιόπιστων όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, με εντυπωσιακό τύπου κυττάρου /ιστού και τις ατομικές διαφορές. Επιπλέον, αποκάλυψε ότι το εξόνιο 3 παράκαμψη, η οποία δεν προκαλεί μετατόπιση πλαισίου, αλλά η απώλεια του ενός τομέα απαραίτητη για πυρηνική μετατόπιση, επηρεάστηκε από πιογλιταζόνη, ένας εξαιρετικά εκλεκτικός ενεργοποιητής του ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα (ΡΡΑΡγ) που συμβάλλει στην κυτταρική διαφοροποίηση και ογκογένεση εκτός από μεταβολικές δράσεις της. Κατά συνέπεια, η μελέτη αυτή δείχνει μια εκτεταμένη AS των

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA το οποίο επαναπροσδιορίζει

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονίδιο όριο και η δομή, μαζί με ένα γενικό αλλά διαφορική σχέση μεταξύ

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

προ- ματίσματος mRNA και διάφορους τύπους καρκίνου. Τα ευρήματα αυτά διευρύνει την κατανόηση του συγκροτήματος, το πλαίσιο-εξαρτώμενη ρύθμιση του

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονιδιακή έκφραση και λειτουργία και παρέχουν στους δυνητικούς βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων για καρκίνο

Παράθεση:. Chen GL, Miller GM ( 2013) Εκτεταμένες εναλλακτικό μάτισμα του καταστολέα Στοιχείο κατασιγάσει του μεταγραφικού παράγοντα συνδέεται με τον καρκίνο. PLoS ONE 8 (4): e62217. doi: 10.1371 /journal.pone.0062217

Επιμέλεια: Emanuele Buratti, Διεθνές Κέντρο Γενετικής Μηχανικής και Βιοτεχνολογίας, Ιταλία

Ελήφθη: 14 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 18 του Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Απρίλη του 2013

Copyright: © 2013 Chen, Miller. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί DA025697 (GMM), DA030177 (GMM), και OD11103 (NEPRC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το εναλλακτικό μάτισμα (AS), μια διαδικασία για να διαφορικά σύνδεσμο εξώνια σε ένα ενιαίο πρόδρομο mRNA (pre-mRNA) για την παραγωγή δύο ή περισσότερα διαφορετικά ώριμο mRNA, είναι μια σημαντική συμβολή στο μεταγραφικό και την πολυμορφία proteome, με & gt? το 90% των ανθρώπινων γονιδίων που υποβάλλονται σε AS σε ένα ιστών και αναπτυξιακό στάδιο-ειδικό τρόπο [1], [2]. Αναγνωρίζεται πλέον ότι η σύζευξη μεταξύ μεταγραφή και το μάτισμα είναι ζωτικής σημασίας για Δεδομένου ότι ο κανονισμός [3], [4], και ότι οι συνδέσεις εξονίου-ιντρονίου ή θέσεις ματίσματος (SS) καθορίζονται από επιγενετικές τροποποιήσεις που εξαρτώνται από την κυτταρική πλαίσιο [4], [ ,,,0],5]. Κατά συνέπεια, επιγενετικές τροποποιήσεις επηρεάζουν όχι μόνο μεταγραφής, αλλά και την συν-μεταγραφική μάτισμα [6], [7]. Επιγενετική ρύθμιση της προ-mRNA ματίσματος, σύμφωνα με τη χωροχρονική επιλογή των SS, δείχνουν ότι η πολλαπλή συνομιλίες με τις περιβαλλοντικές νύξεις να συμβάλει στην προσαρμοστικές αντιδράσεις και την παθοφυσιολογία της νόσου. Πράγματι, όπως διαμορφώνεται από το κιρκαδικό ρολόι, ψυχολογικό στρες, και πολλές ορμόνες και χημικά [8] – [10], ενώ εκτιμάται ότι 15-60% των ανθρώπινων γενετικών ασθενειών, που κυμαίνονται από νευρολογικές να ογκογόνα και μεταβολικές διαταραχές, περιλαμβάνουν μεταλλάξεις ματίσματος [2], [11] – [14]

Το στοιχείο καταστολέα φίμωση παράγοντα μεταγραφής (το υπόλοιπο, επίσης γνωστή ως ΕΣΠΑ για τον παράγοντα σίγηση νευρώνα περιοριστικά), που αρχικά αναγνωρίστηκε ως καταστολέας νευρωνικών γονιδίων σε μη. νευρωνικά κύτταρα [15], [16], αναγνωρίζεται πλέον ως συντεταγμένη μεταγραφικά και επιγενετικές ρυθμιστή που ενορχηστρώνει την κυτταρική επιγονιδίωμα στις δύο νευρώνων και μη νευρωνικών κυττάρων [17]. ΥΠΟΛΟΙΠΟ δεσμεύεται με διανέμονται ευρέως γονιδιωματικές ρυθμιστικές αλληλουχίες, συμπεριλαμβανομένου του καταστολέα στοιχείο-1 (RE1) με μια δέσμευσης DNA τομέα (DBD) η οποία περιλαμβάνει 8 δακτύλου ψευδαργύρου μοτίβα (ZFMs), ενώ η επίδρασή της επί της έκφρασης γονιδίου διαμεσολαβείται από δύο ανεξάρτητους τομείς καταστολή ( RD1 και RD2), η οποία προσλαμβάνει άμεσα ή έμμεσα πολλές μεταγραφικές και επιγενετικές συμπαράγοντες. Εν συντομία, το Ν-τερματικό RD1 στρατολογεί mSin3, ένα ικρίωμα για αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs), ενώ οι Ο-τερματικό εταίρους RD2 με το υπόλοιπο συν-καταστολέα (CoREST), η οποία επιστρατεύει επιπλέον HDACs, πρωτεΐνη δέσμευσης μεθυλο-CpG 2 (MeCP2), ιστόνη H3K4 διμεθυλάση λυσίνη (LSD1) και μεθυλτρανσφεράσες H3K9 (G9a), καθώς και μια συνιστώσα της χρωματίνης SWI /SNF αναδιαμόρφωση συγκρότημα-Brg1. Με την πρόσληψη πολλών συμπαράγοντες για τη στόχευση του γονιδίου τόπους, ΥΠΟΛΟΙΠΟ προωθεί δυναμικά, το πλαίσιο που εξαρτάται από την οργάνωση της χρωματίνης και την καταστολή /ενεργοποίηση των χιλιάδων γονιδίων που εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ογκογένεσης, για το οποίο λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων ή ένα ογκογονίδιο ανάλογα με το κυτταρικό περιβάλλον [ ,,,0],18], [19]. Οι διαφορετικές, μεταβλητής συναρτήσει του ΥΠΟΛΟΙΠΟ καθορίζεται από πολλαπλούς μηχανισμούς που περιλαμβάνουν αποικοδόμηση του πρωτεασώματος, πυρηνική μετατόπιση και pre-mRNA splicing [20] – [23], καθώς και η διαμόρφωση από μη-κωδικοποίησης RNAs (ncRNAs) και συγγένεια δέσμευσης ΥΠΟΛΟΙΠΟ σε διάφορες RE1 και μη-RE1 περιοχές [24], [25].

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

υφίστανται τη με ένα περιορισμένο αριθμό συναρμογής των παραλλαγών που έχουν αναφερθεί, εκ των οποίων ένα C-τελικό κουτσουρεμένο παραλλαγή REST4, το οποίο περιέχει RD1 και ZFMs 1-5, έχει τεκμηριωθεί καλά [20], [21]. Ως κυρίαρχο αρνητικό, REST4 συνδέεται με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC), νευροβλάστωμα και του καρκίνου του μαστού [26] – [28], και συμβάλλει στον προγραμματισμό πρόωρης ζωής της απόκρισης στρες, η νευροπροστασία και ορμονική ρύθμιση της γλουταμίνης synthethase [ ,,,0],29] – [31]. Άλλες δύο παραλλαγές ματίσματος, REST1 το οποίο περιέχει RD1 και ZFMs 1-4 [16], και REST-5FΔ με διαγραφή της ZFM-5 [27], έχουν επίσης τεκμηριωθεί. Αξιοσημείωτα, REST4 με ZFM-5 μεταφέρεται προς τον πυρήνα ενώ REST1 χωρίς ZFM-5 δεν είναι [32], και αργότερα έδειξε ότι ZFM-5 είναι απαραίτητη για την πυρηνική στόχευση του ΥΠΟΛΟΙΠΟ [33].

σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση των AS του

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA και εξετάστηκε η σχέση της με τον καρκίνο. Έχουμε αποδείξει ότι: 1)

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

υφίσταται εκτεταμένο AS σε ένα γονίδιο όριο πλέον διπλασιαστεί από ένα μυθιστόρημα τελευταίο εξόνιο (Ε

5), με τα πολυάριθμα κωδικοποίησης και μη-κωδικοποίησης mRNA που σχηματίζεται με το είδος και τύπου κυττάρου /ιστού-ειδική έκφραση? 2) πολυάριθμες

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές ματίσματος, οι οποίες προκαλούνται από διάφορα σχέδια ματίσματος (π.χ. εξόνιο παράκαμψη και εναλλακτική χρήση της πρώτης και της τελευταίας εξόνια) προγνωστικά αλλαγμένη δραστικότητα ανάπαυσης, γενικά αλλά διαφορικά συνδέεται με διάφορους τύπους καρκίνου ? και 3) εξόνιο 3 (Ε

3) παρακάμπτοντας, η οποία δεν προκαλεί μετατόπιση πλαισίου, αλλά η απώλεια του ZFM-5 απαραίτητη για την πυρηνική μετατόπιση, επηρεάζεται σημαντικά από την πιογλιταζόνη, ένα ιδιαίτερα εκλεκτικό αγωνιστή για PPARγ που ρυθμίζει την κυτταρική διαφοροποίηση και ογκογένεση εκτός της μεταβολικές δράσεις. Τα ευρήματα αυτά διευρύνει την κατανόηση της πολυπλοκότητας του

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονιδιακής ρύθμισης και λειτουργίας, και παρέχει στους δυνητικούς βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων για καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η χρήση ανθρώπινων ιστών εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review Χάρβαρντ, και τα συναφή έργα, για τα οποία υποβλήθηκαν σε ευθανασία μακάκοι και τα ποντίκια είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και χρήση για Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ. Το πρόγραμμα διαχείρισης των ζώων Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ είναι διαπιστευμένο από την Αμερικανική Ένωση για την Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) και πληροί Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας πρότυπα, όπως ορίζεται στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (DHHS Publication Νο ( ΝΙΗ) 85-23 Αναθεωρημένο 1985). Το ίδρυμα δέχεται επίσης ως υποχρεωτική την πολιτική της PHS με ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων από awardee Θεσμών και ΝΙΗ Αρχές για την αξιοποίηση και τη φροντίδα των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται στις δοκιμές, Έρευνας και Εκπαίδευσης.

Ζώα (μακάκοι και ποντίκια) που συμμετέχουν σε αυτή τη μελέτη ήταν φροντίζονται σύμφωνα με το National Institutes of Health, Υπουργείο Γεωργίας των ΗΠΑ, και το Harvard Medical School κατευθυντήριες γραμμές για την έρευνα σε ζώα. Μακάκοι ήταν μονής στεγάζονται και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να μειώσουν τη δυσφορία και την παροχή εμπλουτισμού ευκαιρίες (π.χ. ποικίλλει συμπληρώματα διατροφής, αναζήτηση τροφής και μεθόδους σίτισης έργο προσανατολισμό, και την αλληλεπίδραση με τους φροντιστές και ερευνητικό προσωπικό). Συγκεκριμένα, μακάκοι είχαν τραφεί δύο φορές την ημέρα (AM και PM) με ένα ισορροπημένο εμπορικά διαθέσιμο Παλαιό Κόσμο Προκαθήμενος διατροφής (π.χ. Harlan Teklad 8714 Πίθηκος διατροφή). Φρούτα ή /και λαχανικά συμπληρώματα δόθηκαν σε όλα τα ζώα καθημερινά, και πόσιμο νερό παρεσχέθη κατά βούληση με αυτόματες lixits νερό ή πλαστικά μπουκάλια νερού. Δείγματα ιστού συλλέχθηκαν από πέντε μακάκους που είχε χρησιμοποιηθεί σε άλλα πειράματα κατά τον χρόνο της νεκροψίας τους. Οι μακάκοι είχαν ευθανασία εξής να αναισθητοποιούνται με κεταμίνη HCl με ενδοφλέβια πεντοβαρβιτάλη υπερβολική δόση, και αφαίμαξη. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εισπνοή αερίου διοξειδίου του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Ανθρώπινα και ζωικούς ιστούς

Τα δείγματα cDNA που προέρχεται από ενήλικα φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς (νεφρό, ήπαρ, πνεύμονα, υπόφυση, ιππόκαμπο, την αμυγδαλή και της γέφυρας, 1 για το καθένα) αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο BioChain®, Inc (Newark, CA). 27 ζεύγη όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς με διάγνωση κλινικώς με τους νεφρούς, το ήπαρ και πνεύμονα (9 ζεύγη για το καθένα) ελήφθησαν από το Cancer UMass Κέντρο Tissue Bank (5 ζεύγη για κάθε καρκίνο ιστού σε RNAlater) και το Ινστιτούτο BioChain® Inc (4 ζεύγη για κάθε καρκίνο, όπως το συνολικό RNA). Η δημογραφική πληροφορίες των ασθενών φαίνονται συνοπτικά στον Πίνακα 1. Τα ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs), τα οποία καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [34], ευγενικά προικισμένος από τον Dr. Fred Wang στο Brigham & amp? Νοσοκομείο Γυναικών. Συλλέξαμε επίσης ιστούς από πιθήκους ρέζους και τα ποντίκια υποβάλλονται σε ευθανασία για άλλα έργα.

Η

Οι κυτταρικές σειρές και φαρμακευτική αγωγή

Ένα σύνολο από 18 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινα (ΗΕΚ293, ΗΕΚ293Τ, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, Α549, MCF7, Κ562, SK-Ν-ΜΟ, HeLa, Raji, ΤΕ671, Jurkat, Sup-Τ1 και πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPS)), μη ανθρώπινα πρωτεύοντα (COS-7) και τρωκτικά (RN46A και PC12) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Εκτός από RN46A και iPS, όλοι οι άλλοι 16 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). κύτταρα RN46A ευγενικά από τον Dr. Scott Whittemore [35], ενώ τα κύτταρα iPS προήλθαν από το Δρ Stephen J. Haggarty [36]. Για να εξεταστεί η επίδραση της πιογλιταζόνης στο

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

pre-mRNA ματίσματος, ο NCCIT, ΗΕΚ293Τ και HepG2 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με 10 μΜ της πιογλιταζόνης (Sigma-Aldrich) ή μια αντίστοιχη συγκέντρωση του διαλύτη (0,04% DMSO ), και τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Οι αγωγές εκτελέστηκαν εις διπλούν σε 3 ανεξάρτητες περιπτώσεις.

απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Trizol® (Invitrogen). Ένα κλάσμα του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen), ενώ ένα άλλο δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με τη χρήση ενός αγκυρωμένο ολιγο-άΤ (αλληλουχία άγκυρας δίνονται στον Πίνακα 2). Συντίθεται cDNA διαλύθηκε σε 50 ng /μl για χρήση.

Η

PCR ενίσχυση και DNA αλληλουχίας

Ένα πρωτόκολλο PCR touchdown χρησιμοποιήθηκε για τα δύο πρότυπα και ένθετα PCRs και ενισχύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler (ΕΕΕ) σε συνολικό όγκο 20 μΐ που περιέχει 1 μΙ πρότυπο (50 ng /μl cDNA για πρότυπο ή 1

st στάδιο PCR, και 1:20 αραιωμένο προϊόν του 1

st στάδιο PCR για 2

ου βήμα της ένθετης PCR), 10 pmoles του κάθε εκκινητή (Πίνακας 2), και 10 μλ GoTaq® Πράσινη Master Mix (Promega). Το πρώτο βήμα της nested PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του cDNA από αγκυροβολημένη ολιγο-άΤ ως μήτρα και ολιγο-dT άγκυρα σε συνδυασμό με Ε

1AF

2, Ε

1Bf

2 και Ε

1cF

2, όπως τα σύνολα αστάρι. Για ενήλικες φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς χωρίς cDNA από αγκυροβολημένα ολιγο-dT διαθέσιμη, η άγκυρα ολιγο-dT αντικαταστάθηκε από Ε

4R

3 και Ε

5R

2 (εκτός Ε

4R

1 και Ε

5R

1, αντίστοιχα). Εκκινητές για ρέζους μακάκους και τα τρωκτικά είχαν τροποποιηθεί, εάν είναι απαραίτητο. συνθήκες ενίσχυση περιελάμβανε ένα αρχικό 2,5 λεπτά μετουσίωση στους 95 ° C, που ακολουθείται από 28 (για 1

st βήμα του ένθετη PCR) ή 40 (για το πρότυπο ή 2

ος βήμα του ένθετη PCR) κύκλοι των 30 s μετουσίωση σε 95 ° C, 30 s ανόπτησης (θερμοκρασία ξεκινώντας από 61 ° C και μειώθηκε κατά 0,5 ° C /κύκλο για τις αρχικές 12 κύκλους, τότε καθορίζεται σε 55 ° C), και 60~180 s επέκταση στους 72 ° C, με ένα τελικό επέκταση 5 λεπτών στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% και αμπλικόνια διακριτών μεγέθους αποκόπηκαν, καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν. της αλληλουχίας του DNA πραγματοποιήθηκε όπως εμπορική υπηρεσία από τη Λειτουργική Biosciences Inc (Madison, WI). PCR προϊόντα με τα δεδομένα αλληλούχισης κακή ποιότητα κλωνοποιήθηκαν σε φορέα Αν ρΘΕΜ®-Τ (Promega) για περαιτέρω ανάλυση αλληλουχίας.

5 ‘/3’ Ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (RACE)

Ολικό RNA που παράγεται από ΗΕΚ293, ΗΕΚ293Τ, HepG2 και SH-SY5Y χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση της RACE 5 ‘και 3’, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν από δύο εμπορικά κιτ, το 5 ‘/3’ Kit RACE (2

ης γενιάς) από τη Roche ( Indianapolis, ΙΝ) και GeneRacer® από την Invitrogen, τα οποία διαφέρουν σε στρατηγικές για την 5 ‘RACE. Για 5 ‘RACE με κιτ GeneRacer®, ένας RNA ολίγο κατ’ αρχάς συνδέθηκε προς RNA, που ακολουθείται από σύνθεση cDNA με χρησιμοποίηση ολίγο-άΤ και ένθετες PCR χρησιμοποιώντας

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-ειδικές αντίστροφοι εκκινητές (π.χ. Ε

4R

1 και Ε

4R

2) σε συνδυασμό με μια GeneRacer® έναυσμα 5 ‘(ομόλογο στο RNA ολιγο). Για 5 ‘RACE με κιτ της Roche, cDNA συντέθηκε για πρώτη φορά από ολικό RNA χρησιμοποιώντας ένα

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-ειδικές αντίστροφο εκκινητή (π.χ. Ε

4R

2, έξω), ακολουθούμενη από ουράς με dATP και terminale τρανσφεράσης και την επακόλουθη φωλιασμένη PCR με τη χρήση στάσιμων ολιγο-dT ή άγκυρα αστάρι σε συνδυασμό με ένα

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-ειδικό αντίστροφο εκκινητή (π.χ. Ε

4R

1, μέσα). Για την εκτέλεση 3 ‘RACE, cDNA συνετέθη από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας αγκυροβολημένη Oligo-άΤ, ακολουθούμενη από ένθετη PCR χρησιμοποιώντας

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-ειδικές εκκινητές εμπρός (π.χ. Ε

1AF

1 και Ε

1AF

2) σε συνδυασμό με τον εκκινητή άγκυρα.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

χρησιμοποιώντας εκκινητές που παρατίθενται στον πίνακα 2, αναπτύξαμε SYBR Green Ι και /ή ο υβριδισμός Probe qRT-PCR για συγκεκριμένες συνδέσεις εξονίου-εξονίου και το εξόνιο 2 (Ε

2, πιθανώς αντιπροσωπεύει συνολική έκφραση της κωδικοποίησης mRNAs, ανεξάρτητα από το πρώτο και το τελευταίο εξόνια), καθώς επίσης και το γονίδιο housekeeping

GAPDH

. Οι δοκιμασίες qRT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως σε ένα σύστημα Roche LightCycler 2.0 [37], με τον κύκλο κατωφλίου (Ct) τιμές που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της αλλαγής έκφραση μεταξύ αντιστοιχισμένων ιστοί ή τα κύτταρα από το 2

-ΔΔCt προσέγγιση [ ,,,0],38]. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν εις διπλούν. Για E

1α /E

4 διασταύρωση που εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στις περισσότερες περιπτώσεις, μόνο δοκιμασία SYBR Green I είναι διαθέσιμο και οι τιμές Ct είναι πιθανό διαταράσσεται από διμερές εκκινητή που σχηματίζεται από υπερβολική υπόλοιπα εκκινητών, έτσι ώστε να εκτελούνται qRT -PCR, χρησιμοποιώντας το προϊόν του 1

st στάδιο της PCR ως εκμαγείο. Λόγω του υψηλού ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ των άκρων 3 ‘του Ε

2 και Ε

3, ειδική δοκιμασία qRT-PCR για το Ε

2 /E

4 διασταύρωση δεν ήταν εφικτός.

Βιοπληροφορική και ανάλυση δεδομένων

Πρόβλεψη του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) των συγκεκριμένων

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος StarORF (https://star.mit.edu/orf /runapp.html), και επιγενετικές πληροφορίες στο

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

τόπου ανακτήθηκε από το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Συγκρίσεις qRT-PCR αναλύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των ειδικών κόμβων εξονίου-εξονίου μεταξύ ζεύγη ιστών ή κυττάρων πραγματοποιήθηκαν από το 2

-ΔΔCt προσέγγιση με τη χρήση κατάλληλων αναφοράς και δύο φορές αλλαγή θεωρήθηκε ως σημαντική.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση E

2 /E

3 υπερπηδήσει εκφράζονται σε είδη-εξαρτώμενο τρόπο

Πραγματοποιήσαμε πρότυπο και ένθετη PCR με δείγματα cDNA που προέρχεται από πολλές ανθρώπινους ιστούς (ήπατος, νεφρού, πνεύμονα, υπόφυση, ιππόκαμπο, αμυγδαλή και της γέφυρας) και κυτταρικές γραμμές (ΗΕΚ293, ΗΕΚ293Τ, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, Α549, MCF7 και iPS). Χρησιμοποιώντας ένα αντίστροφο έναυσμα E

4R

1 στόχευση του εγγύς εξόνιο 4 (Ε

4) σε συνδυασμό με την προς τα εμπρός εναρκτήρες E

1AF

1 και Ε

2F

1 στόχευση εξόνια 1α (Ε

1α) και 2 (Ε

2) (Εικόνα 1Α και στον πίνακα 2), αντίστοιχα, εντοπίσαμε αρκετές

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές ματίσματος με E

2 ή /και Ε

3 παραλείπεται (Εικόνα 1Β και 1Γ). Η παραλλαγή με Ε

2 παραλείπεται εκφράζεται άφθονα σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές και ιστούς εκτός αμυγδαλή, ενώ οι παραλλαγές με E

3 μόνες τους ή συν Ε

2 αναπηδούσας εκφράστηκαν σε χαμηλά επίπεδα σε ένα υποσύνολο των ιστών και κυτταρικές σειρές. Αξίζει να σημειωθεί ότι, E

2 /E

3 παρακάμπτοντας κατά κύριο λόγο σχετίζεται με E

1α, αλλά σπάνια με E

1β και Ε

1γ (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, το Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας παρατηρήθηκε σε άλλες 7 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και τα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) (Σχήμα S1).

(Α) Απεικόνιση της σχολιασμένα

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

εξώνια και τις θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση των em> ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές ματίσματος

2 /E

3 παράκαμψη σε ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές με ένθετη PCR με συγκεκριμένα σύνολα εκκινητή. E

2 /E

3 παρακάμπτοντας συνήθως συνδέεται με την Ε

1α, αλλά σπάνια συνδέονται με την Ε

1β και Ε

1γ. χρωματογραφήματα (C) Trace για τις διασταυρώσεις εξόνιο-εξόνιο που εμπλέκονται στην Ε

2 /E

3 πήδημα. (Δ) Ανίχνευση της Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας σε ιστούς και κυτταρικές σειρές από μη ανθρώπινα πρωτεύοντα και τρωκτικά με ένθετη PCR. Από τα πολυάριθμα ρέζους ιστούς, E

2 παρακάμπτοντας μόνη παρατηρήθηκε μόνο σε amygdale (α) και επίφυση (β).

Η

Δοκιμάσαμε αν Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας εκφράζεται σε μη ανθρώπινο πρωτεύον και τρωκτικού ιστούς και κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, παρακάμπτοντας του Ε

2 μόνο παρατηρήθηκε μόνο σε αμυγδαλή και κωνοειδή από 17 ιστούς που λαμβάνονται από 1 ρέζους μακάκους, ενώ παρακάμπτοντας τόσο Ε

2 και Ε

3 παρατηρήθηκε μόνο σε μακάκος PBMCs και τα κύτταρα COS-7 (που προέρχεται από νεφρού αφρικανικού πράσινου πιθήκου)? Ωστόσο, παρακάμπτοντας του Ε

μόνος 3 παρατηρήθηκε στους περισσότερους ιστούς μακάκος και COS-7 κυτταρική γραμμή. Στα τρωκτικά, παρακάμπτοντας του Ε

2 (μόνο και συν Ε

3) παρατηρήθηκε σε RN46A αλλά όχι τα κύτταρα PC12, ενώ παρακάμπτοντας Ε

2 μόνο παρατηρήθηκε στον ιππόκαμπο από 2 από τους 4 ποντικούς που ελέγχθηκαν, προτείνοντας μια ενδο-ατομική διαφορά. Ομοίως, ατομική διαφορά στο

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA ματίσματος παρατηρήθηκε επίσης στη γέφυρα και ραφής από 4 μακάκους (Εικόνα S2).

Ανακάλυψη ενός νέου τελευταίο εξόνιο που διπλασιάζει τα ανθρώπινα

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονίδιο όριο

Πραγματοποιήσαμε RACE για τον προσδιορισμό των ‘και 3’ άκρα 5 του ανθρώπινου

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

mRNA. Απροσδόκητα, έχουμε εντοπίσει ένα νέο πολυαδενυλιωμένο εξόνιο (Ε

5) που εντοπίζει ~ 30 kb κατάντη του Ε

4 και επικαλύπτει μερικώς σε αντίθετη κατεύθυνση με το εξόνιο 5 του μονοξειδίου του αζώτου που συνδέονται-1 (

NOA1

) γονίδιο (Σχήμα 2Α), το οποίο κωδικοποιεί ένα ΟΤΡάσης απαραίτητη για τη σύνθεση μιτοχονδριακών πρωτεϊνών [39]. Με ένθετη PCRs χρησιμοποιώντας ένα Ε

5-ειδικό αντίστροφο εκκινητή (Ε

5R

1) σε συνδυασμό με Ε

1AF

1 και Ε

2F

1, αντίστοιχα, εμείς βρέθηκε ότι Ε

5 συμπερίληψη, περιστασιακά σε συνδυασμό με E

2 /E

3 πηδώντας, εκφράζεται στους περισσότερους ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β, 2C και το σχήμα S1). Όπως E

2 /E

3 παρακάμπτοντας, E

5 ένταξη συνδέεται κυρίως με E

1α, αλλά σπάνια με E

1β και Ε

1γ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εμείς δεν βρήκε παραλλαγές που περιέχουν και Ε

4 και Ε

5, γεγονός που υποδηλώνει ότι E

4 και Ε

5 αλληλοαναιρούνται και ότι E

4, όπως η περίπτωση για το E

2 και Ε

3, μπορεί να παραλειφθεί εντελώς. Κατά συνέπεια, το μυθιστόρημα τελευταίο εξόνιο E

5 δίκλινα η ανθρώπινη

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονίδιο όριο από ~ 28 kb σε ~59 kb (Σχήμα 3Α). E

5 ένταξη δεν παρατηρήθηκε στα μη ανθρώπινα πρωτεύοντα θηλαστικά και τρωκτικά.

(Α) Ακολουθία του Ε

5 και μερική (81-bp) της με το

NOA1

γονιδίου σε αντίθετη κατεύθυνση. (Β) Ανίχνευση Ε

5 συμπερίληψη σε ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές με ένθετη PCR. (C) χρωματογραφήματα Trace για τις διασταυρώσεις της Ε

5 με E

1α, E

2 και Ε

3. Σημειώστε ότι το 3 ‘άκρα της Ε

2 και Ε

3 μετοχικού ταυτότητα υψηλή ακολουθία.

Η

(Α) κατονομάζεται

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

εξώνια και τους 5′ /3 «SS ή άκρα. Η UCSC γονίδια πίστα χρησιμοποιήθηκε για την ανακεφαλαίωση του χρωμοσωμική θέση του

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

γονιδιακό τόπο, ενώ η αλληλουχία γονιδιώματος NG_029447 χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά για να διευκρινιστούν οι ακριβείς θέσεις των εξώνια. Σημαντικές περιοχές της πρωτεΐνης ανάπαυσης (NP_005603) έχουν απεικονίζεται παράλληλα προς την αντίστοιχη κωδικοποιητική περιοχή, έτσι ώστε να προβλέψει συνέπειες των AS του

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

pre-mRNA σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Οι συστατικές και εναλλακτικές εξώνια, καθώς επίσης και τα 5 ‘/3’ SS ή άκρα, είναι χρωματικά κωδικοποιημένα, όπως αναφέρεται. Σημειώστε ότι: 1) εξώνιο Ν στο Σχήμα 1 μετονομάζεται σε Ν

3γ εδώ? 2) E

2k είναι μια επέκταση της Ε

2α χωρίς μάτισμα? και 3) E

5 και N4b στην πραγματικότητα δεν παρουσιάζονται σε NG_029447. (Β) Πρότυπα

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA ματίσματος και παραλλαγές που προκύπτουν mRNA. Υποθετική παραλλαγές κωδικοποίησης είναι χρωματική κωδικοποίηση (όχι μπλε-αλλαγή αμινοξέων που προβλέπεται? Κόκκινο-κομμένη πρωτεΐνη) ή σκιασμένα (απώλεια ZFM-5). (Γ) Πρόβλεψη των Ο-τερματικών πρωτεΐνες κολοβωμένη ανάπαυσης για συγκεκριμένες παραλλαγές mRNA. Οι διασταυρώσεις εξόνιο-εξόνιο και πρόωρο κωδικόνια λήξης υπογράμμισε.

Η

Εκτεταμένη AS των

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA

Με την εξέταση προαναφερθείσες πρωτευόντων ιστούς και κυτταρικές σειρές , καθώς και ζεύγη όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ασθενείς με καρκίνο που αναφέρονται παρακάτω, έχουμε αποκαλύψει ένα εκτεταμένο AS του

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, εκτός Ε

5 και η προηγουμένως αναφερθεί εξόνιο Ν (τώρα μετονομάστηκε σε N

3γ), εντοπίσαμε άλλες 7 καινοτόμος εναλλακτική εξώνια (N

1, N

2α, Ν

2β, Ν

3α, Ν

3β, Ν

4α και Ν

4β), μαζί με πολυάριθμους 5 ‘/3’ SS και καταλήγει στα συστατικά εξώνια E

2 και Ε

4. Ανεξάρτητα από το 5 ‘/3’ άκρα σε Ε

2 και Ε

4, τουλάχιστον 45 παραλλαγές (S1-S45) σχηματίζονται από διάφορα σχέδια ματίσματος συμπεριλαμβανομένων εξωνίου πηδώντας, εναλλακτικά 5 ‘/3’ SS, η αμοιβαία αποκλεισμού και εναλλακτική χρήση του πρώτου και του τελευταίου εξώνια (Σχήμα 3Β). Οι αλληλουχίες των νέων παραλλαγών έχουν κατατεθεί σε GenBank με αύξοντες αριθμοί ένταξη JX896957-JX896993 και KC117262-KC117266.

29 από τις παραλλαγές ματίσματος 45 περιλαμβάνει την πλήρη ή μερική παράκαμψη της Ε

2, όπου η μετάφραση μυημένους, όπως ώστε να μπορούν να λειτουργούν ως ncRNAs λόγω έλλειψης της θέσης έναρξης της μετάφρασης (TSS), εκτός του ότι διάφορες παραλλαγές (S16, S19 και S28) των οποίων TSS διατηρήθηκε είναι προβλεπτικά της Ν-τερματικής κολοβωμένης πρωτεΐνης ισομορφών ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ. Ομοίως, μερική ή πλήρη παράκαμψη του Ε

4, η οποία συχνά συνοδεύεται από Ε

2 παρακάμπτοντας ή /και Ε

5 ένταξη, παράγει πολλές ncRNAs ή κωδικοποίησης mRNAs πρόβλεψης της περικομμένη ισομορφές της πρωτεΐνης REST. Σε αντίθεση, παρακάμπτοντας του 84-bp E

3 (S4 και S34) δεν προκαλεί μετατόπιση πλαισίου, αλλά η απώλεια του ZFM-5. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι παραλλαγές με ανέπαφο Ε

2 (ή συν Ε

3) που ακολουθείται από εναλλακτικά εξόνια (αλλά όχι Ε

4) προβλέπεται ότι κωδικοποιεί C-τελικό κουτσουρεμένο πρωτεΐνες ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ, εκ των οποίων 8 παραλλαγών με Ε

3 κωδικοποιούν REST4 (S3 και S12) ή πρωτεΐνες με RD1 και ZFMs 1-5 REST4-όπως (S2, S21, S31, S33, S39 και S41), ενώ άλλα 4 παραλλαγές (S34, S39-S41) με Ε

3 παραλείπεται κωδικοποιούν REST1 με RD1 και ZFMs 1-4 (Σχήμα 3C)

οι περισσότερες από τις παραλλαγές ματίσματος 45 εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε ένα τύπο κυττάρου /ιστού-ειδικό τρόπο.? Ωστόσο, τουλάχιστον μία παραλλαγή παρατηρήθηκε σε όλες τις δοκιμασμένες ιστούς και κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1, 2 και Σχήμα S3).

Σύνδεσμος μεταξύ

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

pre-mRNA splicing και του καρκίνου

Συγκρίναμε την έκφραση συγκεκριμένων προτύπων ματίσματος και παραλλαγές μεταξύ αντιστοιχισμένων όγκου (Τ) και γειτονικό φυσιολογικό (Ν) ιστών από 27 ασθενείς με νεφρική (Ki), ήπαρ (Li) και πνεύμονα (Lu) καρκίνων (9 ζεύγη για κάθε καρκίνο, Πίνακας 1) από ένθετη PCR και qRT-PCR δοκιμασίες, με επίκεντρο την Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας και εναλλακτική χρήση του πρώτου και του τελευταίου εξώνια. Οι δοκιμασίες qRT-PCR σχεδιάστηκαν στόχευση συγκεκριμένων συνδέσεων εξονίου-εξονίου (Σχήμα 4Α), και οι μεταβολές έκφραση ειδικών μάτισμα μεταξύ Τ και Ν δείχνεται στο πτυχώσεις (Τ υπεράνω Ν) για κάθε υποκείμενο (Σχήμα 4Β). Με την εξαίρεση της Ε

1α /E

3 και Ε

1α /E

4 που αντιπροσωπεύουν S5 και S6 παραλλαγές, αντίστοιχα, οι διασταυρώσεις εξόνιο-εξόνιο δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως μια ενιαία συγκεκριμένη παραλλαγή ματίσματος , το οποίο όμως μπορεί να ανιχνευθεί με ένθετη PCRs (Σχήμα 4C). Ως εκ τούτου, ελήφθησαν υπόψη τόσο qRT-PCR και ένθετη PCR δοκιμασίες για τη σύγκριση των

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

προ-mRNA προφίλ μάτισμα μεταξύ των αξιόπιστων ιστών Τ και Ν. Ενώ η μεγάλη έκφραση της Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας και Ε

5 ένταξη στο ανθρώπινο περαιτέρω επικυρωθεί, διαπιστώσαμε ότι όλοι οι 27 ασθενείς, χωρίς εξαίρεση έδειξαν διαφορική έκφραση των πολυάριθμων

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές ματίσματος που προκαλείται από συγκεκριμένα μοτίβα μάτισμα μεταξύ ζευγών Τ και Ν ιστούς, με ένα εντυπωσιακό τύπου ιστού και των ατομικών διαφορά.

(Α) Στρατηγική για τον σχεδιασμό ποσοτικού προσδιορισμού qRT-PCR για συγκεκριμένες συνδέσεις εξονίου-εξονίου. (Β) αλλαγές Έκφραση (Τ πάνω από Ν, σε φορές) των συγκεκριμένων κόμβων εξόνιο-εξόνιο αναλύθηκαν με τη δοκιμασία qRT-PCR? (Γ) έκφραση των συγκεκριμένων

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

παραλλαγές ματίσματος ανιχνεύονται από ένθετη PCR. Η προς τα εμπρός και να αντιστρέψει τα εναύσματα που υποδεικνύεται από δεξιά και αριστερά βέλη, αντίστοιχα. Paired t και Ν ιστοί συλλέχθηκαν από 27 ασθενείς με νεφρική (Ki), ήπαρ (Li) και πνεύμονα (Lu), και η βασική διάγνωση φαίνεται στον Πίνακα 1 δόθηκε εν συντομία ως αρχική 3 γράμματα του για κάθε ασθενή. αλλαγές έκφρασης (Τ πάνω από Ν, σε φορές) των συγκεκριμένων παραλλαγών ή ματίσματος (π.χ. διασταυρώσεις εξόνιο-εξόνιο) προσδιορίστηκαν από qRT-PCR και υπολογίζεται από το 2

-ΔΔCt προσέγγιση χρησιμοποιώντας Ε

2 ως αναφορά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος ± SEM. δοκιμασία qRT-PCR δεν είναι εφικτή για το E

3 παρακάμπτοντας μόνο (δηλαδή Ε

2 /E

4 διασταύρωση), αλλά εμφανείς αλλαγές μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ Τ και Ν ιστούς για τα περισσότερα θέματα με ένθετη PCR χρησιμοποιώντας το E

2F

1 /E

4R

1 σετ εκκινητών.

Η

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β και 4Γ, παραλλαγές με E

2 /E

3 παραλείπεται εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ ζεύγη ιστών Τ και Ν για τους περισσότερους ασθενείς. Παραλλαγές χρησιμοποιώντας Ε

4 ως το τελευταίο εξόνιο, S6 (δύο Ε

2 και Ε

3 παραλείπεται) έδειξε εντυπωσιακά διαφορικής έκφρασης για όλους τους ασθενείς, εκτός από Lu # 4 και 7. Ειδικότερα, 7, 5 και 1 ασθενείς με νεφρική, ηπατική και καρκίνο του πνεύμονα, αντίστοιχα, έδειξαν αυξημένη έκφραση S6, ενώ 2, 4 και 6 ασθενείς με νεφρική, ηπατική και καρκίνο του πνεύμονα, αντίστοιχα, παρουσίασαν μειωμένη έκφραση S6. Αν και δοκιμασία qRT-PCR για Ε

3 παρακάμπτοντας μόνο (δηλαδή Ε

2 /E

4 διασταύρωση) δεν είναι εφικτή, ένθετα PCR με E

2F

1 /E

4R

1 έδειξε προφανώς διαφορική έκφραση S4 μεταξύ ζευγών Τ και Ν για ένα τμήμα των ασθενών. Εν τω μεταξύ, η διαφορική έκφραση της Ε

2-παραλειφθεί παραλλαγές S5 και S15 μεταξύ των αξιόπιστων Τ και Β από ορισμένους ασθενείς φάνηκε από qRT-PCR και ένθετη PCR, αντίστοιχα. Επιπλέον, κάποιες άλλες παραλλαγές (π.χ. S14, S16 και S17) με Ε

1β ως το πρώτο εξόνιο και Ε

2 μερικώς αναπηδούσας εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ των αξιόπιστων T και N για λίγες ασθενείς. Για παράδειγμα, S14 και S16 παρατηρήθηκαν μόνο στα Τ ιστούς του 4 ασθενείς (Ki # 5, 6 για S14 και Ki # 4, Lu # 9 για την S16, αντίστοιχα). Ομοίως, από τις παραλλαγές χρησιμοποιώντας Ε

5 ως το τελευταίο εξόνιο, S34 (Ε

3 παραλείπεται), S35 (Ε

2 παραλείπεται) και S38 (αμφότερα Ε

2 και Ε

3 παραλείπονται ) έδειξε προφανώς διαφορική έκφραση μεταξύ των αξιόπιστων T και N όπως υποδεικνύεται από ένθετη PCR με E

1AF

1 /E

5R

1 και Ε

2F

1 /E

5R

1. Κατά συνέπεια, E

2 /E

3 (κυρίως Ε

3) παρακάμπτοντας είναι γενικά αλλά διαφορικά που συνδέονται με διαφορετικούς τύπους καρκίνου με εντυπωσιακό τύπου κυττάρου /ιστού και τις ατομικές διαφορές.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4C, με την εξαίρεση των 3 ασθενείς (Li # 5, 6 και 6 Lu #) χωρίς ανιχνεύσιμη έκφραση της Ε

5 ένταξη, όλες οι άλλες ασθενείς έδειξαν διαφορική έκφραση της Ε

5-συμπεριλαμβάνονται παραλλαγές μεταξύ ζευγών Τ και Ν ιστούς. Ιδιαίτερα, η έκφραση των S33 /S39, χωρίς Ε

2 /E

3 παρακάμπτοντας αποκτήθηκε και χάνεται στα Τ ιστούς των 6 (Ki # 2, 9, Λι # 1, 3, 7 και Lu # 3) και 4 (Ki # 1, 4, 7, 8 και Lu # 1) ασθενείς, αντίστοιχα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ένθετα PCR με E

2F

1 /E

5R

1 έδειξε ότι όλοι οι 9 ασθενείς με καρκίνο του νεφρού εξέφρασε E

5 στο Ν ιστούς τους, εκ των οποίων 3 (Ki # 1, 7, 8) έχασε Ε

5 έκφραση στους ιστούς τους Τ. Αντίθετα, όλοι οι 9 ασθενείς με καρκίνο του ήπατος δεν έδειξε E

5 έκφραση σε Ν ιστούς τους, και από αυτούς, 4 (Li # 1, 2, 3, 7) κέρδισε Ε

5 έκφραση στους ιστούς τους Τ. Η διαφορική έκφραση της Ε

5-συμπεριλαμβάνονται παραλλαγές μεταξύ ζευγαρωμένα Τ και Ν ιστούς φαίνεται από ένθετη PCR υποστηρίχθηκε με δοκιμασία qRT-PCR του Ε

3 /E

5 διασταύρωση (Σχήμα 4Β).

Επιπλέον, η παραλλαγή S18 το οποίο χρησιμοποιεί E

1γ ως το πρώτο εξόνιο είχε εκφράζονται διαφορικά μεταξύ ζευγών Τ και Ν ιστών για τα περισσότερα (22/27) των ασθενών, με 12 και 10 ασθενείς που δείχνουν αυξημένη και μειωμένη έκφραση, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β και 4C). Εν τω μεταξύ, δοκιμασία qRT-PCR έδειξε ότι οι παραλλαγές S1 και S11 που χρησιμοποιούν E

1α και Ε

1β ως το πρώτο εξόνιο, αντίστοιχα, έδειξαν μεγαλύτερη από 2 φορές αλλαγές έκφραση μεταξύ ζευγών Τ και Ν ιστούς για ορισμένους ασθενείς (Σχήμα 4Β).