Abstract

BBF2H7 αποτελεί ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) -resident διαμεμβρανική βασικού φερμουάρ λευκίνης (bZIP) παράγοντας μεταγραφής που διασπάται στη διαμεμβρανική περιοχή από ρυθμιζόμενες intramembrane πρωτεόλυση σε απόκριση σε ER στρες. Το διασπασμένο κυτταροπλασματική Ν-άκρο περιέχει ενεργοποίησης μεταγραφής και πεδία bZIP μετατοπίζεται στον πυρήνα για την προώθηση της έκφρασης των γονιδίων στόχων. Σε χονδροκύτταρα, η σχάση του αυλού Ο-τέρμα είναι εξωκυτταρικά εκκριθεί και διευκολύνει τον πολλαπλασιασμό των γειτονικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του Hedgehog σηματοδότησης. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι

Bbf2h7

επίπεδα έκφρασης αυξήθηκαν σημαντικά κατά 1,070 έως 2,567-φορές σε αρκετούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων γλοιοβλαστώματος σε σύγκριση με εκείνες στις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς, με τη χρήση της βάσης δεδομένων ONCOMINE Cancer προφίλ. Σε ορισμένες εξαρτώμενη από συνδέτη καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων Hedgehog κύτταρα γλοιοβλαστώματος U251MG, ο BBF2H7 Ο-άκρο εκκρίθηκε από τα κύτταρα στο μέσο καλλιέργειας και προωθείται πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του Hedgehog σηματοδότησης. Νοκ ντάουν του

Bbf2h7

έκφραση κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων U251MG με ρύθμιση προς τα κάτω Hedgehog σηματοδότησης. Η διαταραχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και σηματοδότησης Hedgehog ανακτήθηκαν με την προσθήκη BBF2H7 C-τελικό άκρο στο μέσο καλλιέργειας του

Bbf2h7

-knockdown U251MG κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η εκκρινόμενη αυλού BBF2H7 C-άκρο εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων εξαρτώμενη από συνδετήρα Hedgehog μέσω της ενεργοποίησης του Hedgehog σηματοδότησης. Έτσι, η BBF2H7 Ο-άκρο μπορεί να είναι ένας νέος στόχος για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων

Παράθεση:. Iwamoto Η, Matsuhisa Κ, Saito Α, Kanemoto S, Asada R, Hino Κ, et al. (2015) Προώθηση του καρκίνου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από διασπαστεί και να Έκκριση αυλού Τομείς της ER στρες αισθητηρίου BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10.1371 /journal.pone.0125982

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Ιταλία

Ελήφθη: 15 του Δεκεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 27 του Μάρτη του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 Iwamoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Takeda Science, το Ιατρικό Ίδρυμα Yasuda, το Ίδρυμα Nakajima, το Τόκιο Ιδρύματος Βιοχημικής Ερευνών, Ίδρυμα Kobayashi Διεθνής Υποτροφία, Nagase Ίδρυμα Επιστημών Τεχνολογίας , το Ίδρυμα Mitsubishi, SEI Ίδρυμα Ομίλου Εταιρική Κοινωνική Ευθύνη και η Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης KAKENHI (25/677, 25251014, 25650069, 25861324, 24300135, 26460099). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) είναι το κεντρικό κυτταρική οργανίδιο υπεύθυνη για τη σύνθεση, την αναδίπλωση και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών που προορίζονται για την εκκριτική οδό. Διάφορα παθοφυσιολογικές καταστάσεις, όπως η καταστροφή ER ασβέστιο, το οξειδωτικό στρες, υπογλυκαιμία, η έκφραση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών και υποξία, παρεμβαίνει με την σωστή αναδίπλωση των πρωτεϊνών, και κακώς αναδιπλωμένο ή ξεδιπλωμένο πρωτεΐνες συσσωρεύονται στον αυλό ER. Οι συνθήκες αυτές, που ονομάζονται συλλογικά ER στρες, έχουν τη δυνατότητα να προκαλέσουν κυτταρική βλάβη. Η ER ανταποκρίνεται σε αυτές τις διαταραχές με την ενεργοποίηση ενός ολοκληρωμένου μονοπατιού μεταγωγής σήματος που ονομάζεται εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνης (UPR) [1,2]. Η ενεργοποίηση του UPR οδηγεί σε παροδικές μεταφραστικής εξασθένισης, ώστε να μειωθούν οι απαιτήσεις από τον ER, μεταγραφική επαγωγή των γονιδίων που κωδικοποιούν ER-κάτοικος συνοδοί για τη διευκόλυνση της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών, και ER-συνδέονται υποβάθμιση (ERAD) για να υποβαθμίσει τις ξετυλίγεται πρωτεΐνες που έχουν συσσωρευτεί στην ER. Σε κύτταρα θηλαστικών, υπάρχουν τρεις καθιερωμένες μετατροπείς στρες ER: δίκλωνο RNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση που μοιάζει ενδοπλασματικού δικτύου κινάσης (PERK), ινοσιτόλη-απαιτώντας ένζυμο-1 (IRE1), και ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK φωσφορυλιώνει άμεσα την α-υπομονάδα του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης (eIF2α), που οδηγεί σε μια δραματική μείωση στη σύνθεση κυτταρικής πρωτεΐνης [6]. Αντίθετα, και παραδόξως, φωσφορυλίωση eIF2α ρυθμίζει προς τα πάνω και την έκφραση της ATF4 [1]. ATF4 διαενεργοποιεί την έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Ο /ΕΒΡ-ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP), πρωτεΐνες προ-επιβίωσης, όπως ER chaperones, και αντι-οξειδωτικό στρες πρωτεΐνες [7]. IRE1 επεξεργάζεται μη συρραμμένο μορφές

X-box-δέσμευσης πρωτεΐνης-1

(

Xbp1

) mRNA για να δημιουργήσει ματισμένες μορφές του mRNA [4,8]. πρωτεΐνες XBP1 που προέρχονται από τις συνδεδεμένες μορφές του

Xbp1

mRNA επάγουν την έκφραση του ER-κάτοικος chaperones και ERAD-σχετικά μόρια. ATF6 διασπάται σε διαμεμβρανική περιοχή του από το site-1 και -2 πρωτεάσες (S1P και S2P, αντίστοιχα) σε απάντηση ER στρες [5,8]. Η σχάση ATF6 Ν-άκρο μετατοπίζεται στον πυρήνα και επάγει την έκφραση του ER-κάτοικος chaperones να διευκολύνουν την πτύχωση της πρωτεΐνης.

Εκτός από τους τρεις κανονικές μορφοτροπείς ER στρες, υπάρχουν νέα τύποι μετατροπέων ER στρες που μοιράζονται τομείς της υψηλής ομοιότητας αλληλουχίας με ATF6. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής έχουν ενεργοποίησης της μεταγραφής και βασικό φερμουάρ λευκίνης (bZIP) τομείς στο Ν-τελικό άκρο τους και περιλαμβάνουν BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /LZIP /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] και CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. Ένα από τα μέλη της οικογένειας ΟΑΣΗΣ, BBF2H7, εκφράζεται κατά προτίμηση στα χονδροκύτταρα [15,16]. BBF2H7 διασπάται στο διαμεμβρανικό τομέα με ρυθμιζόμενη πρωτεόλυση intramembrane (RIP) ως απάντηση στην ER στρες. Το διασπασμένο κυτταροπλασματική Ν-άκρο που περιέχει τα πεδία ενεργοποίησης και bZIP μεταγραφή μετατοπίζεται στον πυρήνα για την προώθηση της έκφρασης των γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων

Sec23a

[15]. Σε αντίθεση, το διασπασμένο Οτέρμα είναι εξωκυτταρικά εκκριθεί άμεσα και συνδέεται τόσο με την ινδική hedgehog (Ihh) και του υποδοχέα του, το Patched-1 (Ptch1), ακολουθούμενη από ενεργοποίηση του Hedgehog (Hh) σηματοδότησης [16]. Η οδός διαμεσολαβείται από την BBF2H7 Ο-άκρο παίζει ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων στις αναπτυσσόμενες χόνδρου. Οι λειτουργίες τόσο του Ν- και Ο-άκρο είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του χόνδρου του ποντικιού.

σηματοδότηση Hh απαιτείται για την διαφοροποίηση των κυττάρων και το σχηματισμό οργάνων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης [17]. Στον ενήλικα, σηματοδότηση Hh παραμένει ενεργή σε ορισμένα όργανα, όπου εμπλέκεται στη ρύθμιση της συντήρησης και του πολλαπλασιασμού των αρχέγονων κυττάρων. Στα θηλαστικά, η οδός σηματοδότησης Hh εκκινεί με τρία προσδέματα Hh (Sonic hedgehog [Shh], Desert hedgehog [Dhh] και Ihh) [18]. συνδετήρες Hh δεσμεύονται με τον διαμεμβρανικό υποδοχέα Hh, Ptch1. Εν απουσία συνδετήρων Hh, Ptch1 αναστέλλει την λειτουργία της πρωτεΐνης διαμεμβράνης, smoothened (SMO), το οποίο ενεργοποιεί γλοίωμα σχετιζόμενη ογκογονίδιο 1 (Gli1) [19,20]. Μόλις συνδέτες Hh δεσμεύονται με Ptch1, Smo απελευθερώνεται από την αναστολή και προωθεί την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Gli1. Ενεργοποιείται Gli1 εκκινεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων Hh, όπως

Gli1

,

Forkhead L1 κουτί

(

Foxl1

),

Ptch1

,

κυκλίνης D1

και

η κυκλίνη Ε1

[21].

σηματοδότηση Hh συμμετέχει επίσης στην προώθηση του καρκίνου. Οι ασθενείς με σύνδρομο Gorlin (ή σύνδρομο σπίλου βασικών κυττάρων) έχουν κληρονομήσει αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο Ptch1, οδηγώντας σε ουσιαστικά δραστική σηματοδότηση Hh σε απουσία συνδετήρων Hh [22]. Αυτοί οι ασθενείς έχουν μια υψηλή συχνότητα εμφάνισης καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων (BCCs), έναν όγκο του δέρματος των κερατινοκυττάρων, εκτός από την μυελοβλαστώματα και ραβδομυοσαρκώματα. Σχεδόν όλες οι περιπτώσεις σποραδικής BCC που προκαλείται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μέσω της απώλειας της ετεροζυγωτίας Ptch1 ή /και αδρανοποίηση ή μεταλλάξεις ενεργοποίησης σε Smo, η οποία μειώνει την αναστολή της από Ptch1. Επιπλέον, πολλά από συνδετήρα εξαρτώμενων καρκίνων Hh που περιλαμβάνουν υπερέκφραση της συνδετών Hh έχουν ταυτοποιηθεί τα τελευταία χρόνια, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, του παγκρέατος, του μαστού και του προστάτη [23,24]. Σε όλες τις περιπτώσεις, αυτοί οι καρκίνοι ανταποκρίνονται σε συνδέτες Hh με αυτοκρινή τρόπο. Hh συνδέτες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα δρουν επί των κυττάρων που εκκρίνουν (ή γειτονικά καρκινικών κυττάρων) για να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και /ή την επιβίωση, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη του όγκου. Ως εκ τούτου, οι ειδικοί αναστολείς σηματοδότησης Hh μπορούν να χρησιμεύσουν ως αντικαρκινικών παραγόντων. Ωστόσο, παραμένει ασαφές το πώς συνδέτες Hh, υποδοχέα τους Ptch1 και ο μεταγενέστερος σηματοδότησης ρυθμίζονται σε καρκινικά κύτταρα.

Όπως προαναφέρθηκε, η BBF2H7 C-τελικό άκρο ενεργοποιεί σηματοδότηση Hh με απευθείας σύνδεση με τόσο συνδέτη HH και Ptch1, η οποία προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, το

Bbf2h7

γονίδιο εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως εταίρος του

συγχωνεύονται σε σάρκωμα

(

FUS

) σε ένα χιμαιρικό γονίδιο βρέθηκε σε χαμηλού βαθμού fibromyxoid σάρκωμα (LGFMS) [25]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι HH και Hh γονιδίων-στόχων υπερεκφράζεται σε LGFMS ασθενείς [25,26]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι BBF2H7 μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην εξάπλωση των εξαρτώμενη από συνδετήρα καρκινικά κύτταρα Hh. Εδώ, βρήκαμε ότι η σχάση BBF2H7 Ο-άκρο εκκρίνεται από ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων και προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του σηματοδότηση Hh.

Υλικά και Μέθοδοι

σύνολα δεδομένων ONCOMINE μικροσυστοιχιών για

Bbf2h7

έκφραση

μικροσυστοιχιών σύνολα δεδομένων για το γλοιοβλάστωμα (ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas-γλοιοβλάστωμα ερυθήματος και του εγκεφάλου χαμηλότερη ποιότητα Γλοίωμα αντιγραφής του DNA Αριθμός Data, 2013), πορογενές διηθητικό καρκίνωμα του μαστού (ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas-διηθητικό καρκίνωμα του μαστού Gene Expression Data, 2011), του τραχήλου της μήτρας πλακώδες καρκίνωμα [27], αδενοκαρκίνωμα του προστάτη [28], αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου [29], αδενοκαρκίνωμα στομάχου (ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas-στομάχι αδενοκαρκίνωμα DNA Copy Number Data, 2013), και του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα (ο καρκίνος Genome Atlas-αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος DNA Copy Number Data, 2013) έχουν πρόσβαση με τη χρήση της βάσης δεδομένων ONCOMINE Καρκίνου Profiling (έκδοση 4.4.4.4, www.oncomine.org) να διερευνήσει

Bbf2h7

έκφραση σε διάφορους καρκίνους.

καλλιέργειας κυττάρων

ΗΕΚ293Τ (προέρχεται από ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά? American Type Culture Collection [ATCC]),

Bbf2h7

– /- ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF, τα οποία προέρχονται από το

Bbf2h7

– /- ποντίκια χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [15 ]), MCF7 (προέρχεται από ανθρώπινο καρκίνο του μαστού? ATCC) και HeLa (προερχόμενα από ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας? κύτταρα ATCC) αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Life Technologies) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS). LNCap (που προέρχονται από ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη? ATCC) κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute μέσο-1640 (Life Technologies) που περιείχε 10% FBS. U251MG (που προέρχονται από ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα? JCRB τράπεζα κυττάρων) και LS174T (που προέρχονται από ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου? ATCC) κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (DS Pharma) που περιέχει 10% FBS. Για να μετριαστεί ER στρες, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4-φαινυλοβουτυρικό (4-ΡΒΑ? WAKO), ένα χημικό chaperone. Για να προκληθεί ER στρες, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ θαψιγαργίνη. (TG? WAKO), ενός αναστολέα της ER Ca

2 + -ΑΤΡάσης

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA απομονώθηκε με την μέθοδο γουανιδίνης φαινόλης χρησιμοποιώντας ISOGEN (ΝΙΡΡΟΝ GENE) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κλάσματα 1 μg καθαρισμένου RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA πρώτου κλώνου σε όγκο 20 μΙ αντίδραση χρησιμοποιώντας 200 U Moloney ιού λευχαιμίας ποντικού αντίστροφης μεταγραφάσης (Life Technologies) [30]. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα σύνολα εναρκτήρα σε συνολικό όγκο 20 μΐ που αποτελείται από 1 μΙ cDNA, 0.5 μΜ του κάθε εκκινητή, 0.2 mM dNTPs, 1 U DNA πολυμεράση (Agilent), και ρυθμιστικό διάλυμα PCR (Agilent). Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής:

Gli1

εμπρός, 5′-GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 ‘?

Gli1

αντιστραφεί, 5′-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 ‘?

Foxl1

προς τα εμπρός, 5′-ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 ‘?

Foxl1

αντιστραφεί, 5′-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 ‘?

Xbp1

προς τα εμπρός, 5′-ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 ‘?

Xbp1

αντιστραφεί, 5′-GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 ‘?

β-ακτίνης

προς τα εμπρός, 5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 ‘?

β-ακτίνης

αντιστραφεί, 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 ‘. παράμετροι του κύκλου PCR ήταν 20 s στους 94 ° C, 20 s στους 58 ° C και 25 s στους 72 ° C για 18-33 κύκλους (

Gli1

, 33?

Foxl1

, 31 ?

Xbp1

, 25?

β-ακτίνης

, 18) που ακολουθείται από 72 ° C για 5 λεπτά. Δείγματα (5 μΐ) από κάθε μίγμα αντίδρασης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4.8%. Η πυκνότητα του κάθε μπάντα ποσοτικά με τη χρήση Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).

Για να αναλύσουμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Light Cycler 480 System II (Roche) και Light Cycler SYBR Green Ι Μεταπτυχιακό (Roche). Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ΚΑΠΑ SYBR FAST Kit qPCR Βελτιστοποιημένη για Light Cycler 480 (ΚΑΠΑ). Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση του ενδογενούς

mRNA β-ακτίνης και εκφράστηκαν ως σχετικές αυξήσεις ή μειώσεις στην έκφραση σε σύγκριση με τους μάρτυρες.

κηλίδωση Western

πρωτεΐνες εξάγεται από κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης (1% Triton Χ-100, 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM HEPES, 500 mM σακχαρόζη, και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [MBL Διεθνές]). Οι συγκεντρώσεις πρωτείνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης Pierce BCA (Thermo). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 12% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad). Για ανοσοστύπωση, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα και αραιώσεις: πολύκλωνο αντι-BBF2H7 Ο-άκρο κουνελιού (Abcam? 1: 1000), αντι-BBF2H7 Ν-άκρο πολυκλωνικού ποντικού (το παραγόμενο αντίσωμα [15]? 1: 1000), μονοκλωνικό ποντικού αντι-β-ακτίνης (Sigma? 1: 3000), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ιντερλευκίνης 6 (IL-6) (Abcam? 1: 250), συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση IgG αντι-κουνελιού (Sigma? 1: 3000), και αλκαλική φωσφατάση-συζευγμένη αντι-ποντικού IgG (Enzo? 1: 3000). Σημασμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας νιτρο-μπλε χλωριούχο τετραζόλιο (WAKO) και 5-βρωμο-4-χλωρο-3′-indolylphosphatase π-τολουϊδίνη άλας (Roche).

Ανοσοκαταβύθιση

Για την ανίχνευση BBF2H7 C-τελικό άκρο στο μέσο καλλιέργειας, υπερκείμενα καλλιέργειας επωάστηκαν με αντι-BBF2H7 Ν-άκρο, αντι-BBF2H7 C-τελικό άκρο, ή αντι-IL-6 αντισώματα για όλη τη νύχτα. Τα δείγματα στη συνέχεια καταβυθίστηκαν με σφαιρίδια πρωτεΐνης G αγαρόζης (Life Technologies), που ακολουθείται από κηλίδωση Western. IL-6 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Ανοσοϊστοχημεία

δείγματα όγκου συλλέχθηκαν κατά την διάρκεια χειρουργικής επέμβασης του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Hiroshima, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Οι τομές σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη στους -20 ° C και στη συνέχεια σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού παραφορμαλδεΰδης 4%. Για ανοσοχρώση BBF2H7 C-τελικό άκρο, χρησιμοποιήσαμε ένα αντι-BBF2H7 καρβοξυτελικό άκρο αντισώματος σαν το πρωτογενές αντίσωμα και Dako Envision Kit (Agilent) για την ανίχνευση σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όλες οι διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με την Επιτροπή Δεοντολογίας για την Human Genome Research του Πανεπιστημίου της Χιροσίμα.

πλασμίδια και επιμόλυνση

Ανθρώπινο BBF2H7 πλήρους μήκους, Ν- και C-τελικό άκρο cDNA που ελήφθησαν από blunt- άκρων των προϊόντων PCR που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1-520, 1 – 377 και 431 – 520 (αριθμός πρόσβασης Genbank, NP_919047.2) με ένα ΒίΡ (δεσμευτική πρωτεΐνη ανοσοσφαιρίνης) πεπτίδιο σήματος αλληλουχία (αμινοξέα 1-16, αριθμός πρόσβασης Genbank , NP_005338.1) στο Ν-άκρο. Η BBF2H7 πλήρους μήκους, Ν- και C-τελικό άκρο cDNAs κλωνοποιήθηκαν εντός pcDNA3.1 (+) φορέα. κύτταρα ΗΕΚ293Τ και

Bbf2h7

– /-. Οι MEF διαμολύνθηκαν με κάθε πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

Οι βιολογικές δοκιμασίες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

U251MG κύτταρα (1 χ 10

5), απλώθηκαν σε 6-cm πιάτα, καλλιεργήθηκε στους 37 ° C για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο ή

Bbf2h7

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για

Bbf2h7

knockdown, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες αλληλουχίες: 5′-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 ‘(siBBF2H7-1) και 5′-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3’ (siBBF2H7-2). κύτταρα U251MG επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν στα δεικνυόμενα ημέρες μετά την επιμόλυνση. siRNAs αγοράστηκαν από Bioneer (Daejeon, Νότια Κορέα).

Επιπλέον, μετά από επιμόλυνση με ομελέτα ή

Bbf2h7

siRNAs,

Bbf2h7

-knockdown U251MG κύτταρα εκτέθηκαν σε ρυθμισμένο μέσο συλλέγονται από κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα (Mock) ή BBF2H7 Ο-άκρο (C-Sup.), ή στο C-Sup. στην οποία BBF2H7 Ο-άκρο με αποτέλεσμα να πέσουν κάτω με ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-BBF2H7 Ο-άκρο (C-Sup. + Ab.). Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν στα δεικνυόμενα ημέρες μετά την επιμόλυνση. Για τη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε επίσης ένα κιτ μέτρησης κυττάρων (WST-8 δοκιμασία, Dojindo) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Για να επιβεβαιωθεί η ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh με BBF2H7 C-τελικό άκρο, τα κύτταρα U251MG υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένη Shh (R Σχ 3Ε-3Η). Όπως ήταν αναμενόμενο, η εξάντληση των BBF2H7 C-άκρο από το C-Sup. προκάλεσε σημαντική μείωση στην έκφραση των γονιδίων στόχων Hh και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επιπλέον, η θεραπεία με κυκλοπαμίνη (CPN) [32], ένας ανταγωνιστής ΠΕΑ που αναστέλλει ΠΕΑ και κατάντη σηματοδότησης του Hh, ακυρώνονται τα αποτελέσματα της C-Sup. για την επαγωγή των γονιδίων στόχων Hh όπως

Gli1

και

Foxl1

(Σχ 3Ε και 3F). Επιπλέον, η προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από C-Sup. καταστάλθηκε με κατεργασία με CPN (Σχ 3G και 3Η), γεγονός που υποδηλώνει ότι η εκκρινόμενη BBF2H7 Ο-άκρο δρα ανάντη του ΠΕΑ και ενισχύει εξαρτώμενη από τον υποκαταστάτη πολλαπλασιασμό Hh.

Επιδράσεις της

Bbf2h7

siRNA επί 0.001. *

P

& lt? 0.001. *

P

& lt? *

P

& lt? 0.001. *

P

& lt?