Αφηρημένο

Εποθειλόνες είναι μία νέα κατηγορία των μικροσωληνίσκων με ελπιδοφόρα προκλινική και κλινική δραστηριότητα σταθεροποίησης. κυτταρικό στόχο τους είναι β-τουμπουλίνης και παράγοντες που επηρεάζουν την ενδογενή ευαισθησία σε εποθιλόνες δεν είναι καλά κατανοητοί. Σε αυτή τη μελέτη, η λειτουργική σημασία συγκεκριμένων β-τουμπουλίνης ισοτύπων προς τα εγγενή ευαισθησία στην εποθιλόνη Β διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας γονίδιο knockdown siRNA κατά βII-, βIII- ή βIVb-τουμπουλίνες σε δύο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC), NCI-Η460 και Calu-6. Αγωγή με φάρμακο κλωνογόνων δοκιμασίες έδειξαν ότι η ευαισθησία προς εποθιλόνη Β δεν άλλαξε, μετά knockdown του βΙΙ-τουμπουλίνης στις δύο κυτταρικές σειρές NSCLC. Σε αντίθεση, knockdown του βIII-τουμπουλίνης αυξήθηκε σημαντικά την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β ενδιαφέρον, βIVb-τουμπουλίνης knockdowns ήταν σημαντικά λιγότερο ευαίσθητα στην εποθιλόνη Β, σε σύγκριση με ψευδώς και κύτταρα ελέγχου siRNA. Κυττάρων ανάλυση του κύκλου του βIII-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων έδειξε ένα υψηλότερο ποσοστό των νεκρών κυττάρων με συγκεντρώσεις εποθιλόνης Β τόσο χαμηλά όσο 0.5 ηΜ. Σε αντίθεση, βIVb-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων που εμφανίζεται μια μείωση στην εποθιλόνη Β-επαγόμενης G

2 Μ-συσσώρευση του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA. Σημαντικά, knockdowns βIII-τουμπουλίνης παρουσίασαν σημαντική δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων κατά την κατεργασία με εποθιλόνη Β, όπως ανιχνεύεται με τη χρήση 3/7 δραστηριότητα κασπάσης και χρώση Annexin-V. Υψηλότερες συγκεντρώσεις εποθιλόνης Β απαιτείται για την επαγωγή απόπτωσης στα knockdowns βIVb-τουβουλίνης σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA, τονίζοντας ένα δυναμικό μηχανισμό υποκείμενες μειωμένη ευαισθησία σε αυτό το μέσο. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η συγκεκριμένη β-τουμπουλίνης ισότυποι μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία με την εποθιλόνη Β και μπορεί να επηρεάσει την διαφορική ευαισθησία σε αυτό το πολλά υποσχόμενο νέο πράκτορα

Παράθεση:. Gan PP, McCarroll JA, Byrne FL, Garner J, Καβαλλάρη Μ (2011 ) Ειδικές β-τουμπουλίνης ισότυποι Μπορεί Λειτουργικά αυξήσετε ή να μειώσετε την εποθιλόνη Β Ευαισθησία σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 6 (6): e21717. doi: 10.1371 /journal.pone.0021717

Επιμέλεια: Παρασκευή Γιαννακάκου, Weill Cornell Medical College του Πανεπιστημίου Cornell, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Οκτ, 2010? Αποδεκτές: 9 του Ιουνίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Παιδικό Καρκίνο Ινστιτούτο Αυστραλίας Ιατρικής Έρευνας, το οποίο συνδέεται με το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας και του Σίδνεϊ Νοσοκομείο Παίδων και επιχορηγήσεις από την Ουαλία Συμβούλιο Νέας Νότιας Καρκίνο (ΜΚ). Προσπάθεια Διεθνές Μεταπτυχιακό Έρευνα Υποτροφία (PPG), το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας Ιατρική Σχολή Fellowship (JAM), το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας Ιατρική Σχολή Πρόωρη Βραβείο Σταδιοδρομίας Ερευνών (JAM), Balnaves Βραβείο (JAM), Anthony Βραβείο Rothe Μεταπτυχιακών Σπουδών (JLB ), και από ένα NHMRC Senior Fellowship (ΜΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. MK, PPG και μαρμελάδα, Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας 20100159030 μέθοδοι για την ανίχνευση και ρυθμίζοντας την ευαισθησία του καρκινικών κυττάρων να αντιμιτωτική ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΓΙΑ διαμόρφωση TUMORGENICITY 06/24/2010. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι ταξάνες (συμπεριλαμβανομένων paclitaxel και docetaxel) είναι εγκατεστημένοι φάρμακα που χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία πολλών τύποι στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του μαστού, του πνεύμονα και καρκίνο κεφαλής και λαιμού, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Η κλινική επιτυχία ταξανών έδωσε την ώθηση για να αναζητήσετε άλλους νέους παράγοντες με παρόμοιες ιδιότητες, αλλά με βελτιωμένη αποτελεσματικότητα. Οι εποθιλόνες είναι μία νέα κατηγορία μη ταξάνης παράγοντες σταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων που έχουν δείξει ελπιδοφόρα αντικαρκινική δράση. Μεταξύ αυτών, το ανάλογο εποθιλόνης Β, Ιξαβεπιλόνη (BMS-247550, αζα-ΕροΒ) εγκρίθηκε το 2007 από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία του μεταστατικού ή τοπικά προχωρημένο καρκίνο του μαστού ανθεκτικό σε ανθρακυκλίνες, ταξάνες και capecitabine, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με αυτούς τους παράγοντες [1]. Η φυσικώς απαντώμενη εποθιλόνη Β (patupilone, ΕΡΟ906), έχει επίσης δείξει υποσχόμενα δραστικότητα σε διάφορες προκλινικά μοντέλα που είναι ανθεκτικά σε ταξάνη χημειοθεραπεία με βάση και είναι προς το παρόν υπό φάσης ΙΙ /ΙΙΙ κλινικές δοκιμές [2], [3], [4], [5]. Παρά μικρή δομική ομοιότητα μεταξύ των εποθιλόνες και ταξάνες, και οι δύο παράγοντες μοιράζονται το ίδιο ή επικαλυπτόμενα θέση σύνδεσης επί β-τουμπουλίνης [6], [7]. Παρόμοια με ταξάνες, τις εποθιλόνες επάγουν μικτοσωληναρίων [6], καταστέλλουν δυναμική των μικροσωληνίσκων? που οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μιτωτική μπλοκ [8]. Αν και εποθιλόνες και ταξάνες σταθεροποιούν μικροσωληνίσκους έναντι του αποπολυμερισμού, παρουσιάζουν σαφείς διαφορές στην δραστικότητα και την αποτελεσματικότητα (που επισκοπείται στο [9], [10]).

Και οι δύο εποθιλόνες και ταξάνες μπορούν να σταθεροποιήσουν μικροσωληνίσκων κατά του αποπολυμερισμού, όμως παρουσιάζουν διακριτές διαφορές στη δραστηριότητα και την αποτελεσματικότητα (που επισκοπείται στο [9], [10]). Οι λόγοι για τις διαφορές στη δραστηριότητα είναι ελάχιστα κατανοητή. Μέχρι σήμερα, οι μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην επίκτητη ανθεκτικότητα σε εποθιλονών χρησιμοποιώντας φάρμακο που επιλέγεται πληθυσμούς που επιδεικνύουν μηχανισμούς πολλαπλής αντίστασης συμπεριλαμβανομένων αλλαγών στην έκφραση ισότυπο τουμπουλίνης και μεταλλάξεις σε β-τουμπουλίνης [11], [12], [13], [14]. Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως ανθεκτικά εποθιλόνη Β αναλόγου λευχαιμίας κύτταρα που εμφανίζουν πολλαπλές αλλοιώσεις μικροσωληνίσκων συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης έκφρασης του βIII-τουμπουλίνης, αυξημένη έκφραση ΜΑΡ4, και οι μεταλλάξεις σε βΙ-τουμπουλίνης [13]. Ενώ έχει περιγραφεί επίκτητη αντοχή σε εποθιλόνες, η έρευνα σε εγγενείς παράγοντες που μεσολαβούν ευαισθησία σε εποθιλόνες και που σχετίζονται με την κυτταρική στόχο του φαρμάκου, τουμπουλίνης, υπήρξαν λιγοστές. Καθώς αυτοί οι παράγοντες πρόοδο στην κλινική, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε πώς αυτή η κατηγορία ένωση αλληλεπιδρά διαφορετικών ισοτύπων τουμπουλίνης και πώς εγγενή επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα.

Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία RNAi, έχουμε δείξει παλαιότερα ότι βIII-τουμπουλίνης μεσολαβεί ευαισθησία στην πακλιταξέλη και

Vinca

αλκαλοειδή στα κύτταρα NSCLC [15]. Αποσιώπηση της έκφρασης του βII- και βIVb-τουμπουλίνης ισοτύπων, από την άλλη πλευρά, ενισχύουν την ευαισθησία αυτών των κυττάρων σε

Vinca αλκαλοειδή

αλλά όχι paclitaxel [16]. Αποδειξις ότι προς τα πάνω ρύθμιση βIII-τουμπουλίνης δεν διαμεσολαβεί αντίσταση στην εποθιλόνη Β έχει επίσης αναφερθεί [12]. Ωστόσο, η υπερέκφραση του βIII-τουμπουλίνης σε κύτταρα HeLa καθιστά τα κύτταρα λιγότερο ευαίσθητα στην εποθιλόνη Β [17]. Δεν είναι γνωστό εάν η διαφορική έκφραση του β-τουμπουλίνης ισότυποι απόκριση επιρροή για εποθιλόνες. Η κατανόηση αυτής της αλληλεπίδρασης είναι ιδιαίτερα επιθυμητή για την ανάπτυξη της έξυπνης δεικτών για την παροχή πιο προσαρμοσμένη θεραπεία για τους ασθενείς με NSCLC και άλλους ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με εποθιλονών.

Για να διερευνηθεί η λειτουργική σημασία αυτών των β-τουμπουλίνης ισοτύπων σε απόκριση προς εποθιλόνη Β σε NSCLC, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογία RNAi να knockdown ειδικά την έκφραση αυτών των ισοτύπων σε δύο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές NSCLC και χαρακτηρίζουν τα αποτελέσματα επί κυτταρική μορφολογία, ευαισθησία στο εποθιλόνη Β και προκαλούμενη από φάρμακο απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, siRNA επιμόλυνση και κυτταροτοξικά

φάρμακο

Η460 και Calu-6 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC (Μανασσή, VA, USA) και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Οι κυτταρικές γραμμές ρουτίνα διαλογή και χωρίς μυκόπλασμα. Όλες οι διαδικασίες επιμόλυνσης εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15]. Η ισχύς και η εξειδίκευση των siRNAs που στοχεύουν σε κάθε β-τουμπουλίνης ισοτύπου έχουν επικυρωθεί προηγουμένως [15], [16]. Εποθιλόνη Β (Calbiochem Biosciences, Merck) παρασκευάστηκε σε μία συγκέντρωση αποθέματος 100 μΜ σε DMSO.

ανοσοφθορισμού χρώση

Εν συντομία, siRNA επιμολυσμένα Calu-6 κύτταρα που αναπτύσσονται σε πλακίδια θαλάμου γυαλιού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την εποθιλόνη Β στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 1 ώρα. χρώση ανοσοφθορισμού των κυττάρων siRNA επιμολυσμένα στη συνέχεια διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [16].

κλωνογενείς δοκιμασίες αγωγή με φάρμακο

αγωγή με φάρμακο κλωνογόνων δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15 ], [16]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ένα κλάσμα επιβίωσης και ανασταλτική δόση (ID

50) ήταν παρέκταση από την καμπύλη δόσης-απόκρισης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GraphPad Prism [15], [16].

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Για την ανάλυση του περιεχομένου του DNA με χρώση ιωδιούχου προπιδίου, Η460 και Calu-6 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν 6 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν με siRNA. Μετά από 72 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εποθιλόνη Β στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Την ημέρα της ανάλυσης, τόσο προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 80% αιθανόλη για τουλάχιστον 24 ώρες στους 4 ° C. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει ml ιωδιούχου προπιδίου /50 μg, και 2 μg /ml άνευ ϋΝάσης RNase για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. περιεκτικότητα DNA μετρήθηκε με μία ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD). Το πρόγραμμα CellQuest χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της κατανομής των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου: υπο-G

1 (νεκρά ή αποσπασματική), G

1, S και G

2-Μ [15], [ ,,,0],16].

δοκιμασίες απόπτωσης

κυτταρική απόπτωση προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης 3/7 χρησιμοποιώντας το 3/7 δοκιμασίας κασπάσης-Glo όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις [18], [19 ]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA για 24 ώρες και απλώνονται εκ νέου σε πλάκες 96-φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις εποθιλόνης για 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα επωάστηκαν με Caspase-Glo αντιδραστήριο 3/7 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και η φωταύγεια μετρήθηκε με ένα φωτόμετρο (PerkinElmer Victor 3). Επιπλέον, η απόπτωση προσδιορίστηκε επίσης με Annexin V-FITC κιτ χρώσης (Becton Dickinson) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [19].

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ANOVA ή

t

δοκιμή Student ακολουθούμενο από το μη παραμετρικό Mann Dunnett ή-Whitney δοκιμές χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GraphPad Prism. AP τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Διαφορικές ευαισθησία στην εποθιλόνη Β παρακάτω βII-, βIII- ή βIVb-τουμπουλίνης νοκ ντάουν

Η ιδιαιτερότητα του κάθε της β-τουμπουλίνης siRNA επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα S1). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας, βII-, βIII-, και βIVb-τουμπουλίνης siRNA αναστέλλεται ισχυρά πρωτεΐνη έκφραση του καθενός από αυτούς τους στόχους, αντίστοιχα, χωρίς να επηρεάζει την έκφραση των άλλων μεγάλων β-τουμπουλίνης ισοτύπων στις κυτταρικές γραμμές NSCLC (Σχήμα S1) [15] , [16]. Για να διερευνηθούν οι επιδράσεις αυτών των β-τουμπουλίνης ισοτύπων σε απόκριση προς εποθιλόνη Β σε κύτταρα NSCLC και για την ποσοτικοποίηση τυχόν αλλαγές στην ευαισθησία φαρμάκου, διεξήχθησαν δοκιμασίες κλωνογόνων υποστεί αγωγή με φάρμακο. Knockdown του βΙΙ-τουμπουλίνης έκφραση τόσο Η460 και Calu-6 κυττάρων δεν επηρέασε την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β (Εικ. 1Α). Σε αντίθεση, knockdown του βIII-τουμπουλίνης ευαισθητοποιημένα σημαντικά δύο κυτταρικές σειρές NSCLC να εποθιλόνη Β (Εικ. 1Β). Πρόσφατα, περιγράφηκε η ανάπτυξη και ο χαρακτηρισμός του Η460 κύτταρα επιλέγονται για σταθερή έκφραση του shRNA έναντι βIII-τουμπουλίνης, και την αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων αυτών σε πακλιταξέλη, σισπλατίνη και καρβοπλατίνη αναλόγου του [19]. Είναι σημαντικό ότι, η αυξημένη ευαισθησία σε εποθιλόνη Β χρησιμοποιώντας παροδική νοκ ντάουν της βIII-τουμπουλίνης επιβεβαιώθηκε επίσης με τη χρήση των σταθερών Η460 βIII-τουμπουλίνης νοκ ντάουν κύτταρα shRNA (Εικόνα S2), ενισχύοντας περαιτέρω τα ευρήματά μας με αυτό το ισοτόπου. Είναι ενδιαφέρον, knockdown του βIVb-τουμπουλίνης μείωσε σημαντικά την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, σε σύγκριση με ψευδώς και τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 1C), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι όγκοι εκφράζουν υψηλά επίπεδα αυτής της ισοτύπου μπορεί να είναι πιο ευαίσθητοι στην εποθιλόνη Β από τους όγκους με χαμηλά επίπεδα αυτού του ισότυπου.

κλωνογόνος δοκιμασίες διεξήχθησαν επί mock (κλειστά τετράγωνα, στερεά γραμμή), ελέγχουν siRNA (ανοικτά τετράγωνα, στερεά γραμμή) και ειδικές ισότυπου κύτταρα siRNA επιμολυσμένα β-τουμπουλίνης (κλειστός διαμάντια, διακεκομμένη γραμμή) σε δύο κυτταρικές σειρές NSCLC, Η460 (αριστερό πάνελ) και Calu-6 (δεξιά πλευρά). Τα γραφήματα δείχνουν την κλωνογόνο επιβίωση του (Α) βΙΙ-τουμπουλίνης? (Β) βIII-τουμπουλίνης και (Γ) βIVb-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων που εκτίθενται σε εποθιλόνη εκφράζεται ως κλάσμα επιβίωσης. Μπαρ, μέση ± SEM από τουλάχιστον τέσσερις μεμονωμένες δοκιμασίες. Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν με τη σύγκριση της επιβίωσης κλάσματος των νοκ ντάουν κυττάρων με τα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα σε κάθε συγκέντρωση του φαρμάκου. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Θα εξεταστούν επίσης τα διαφορικά αποτελέσματα της εποθιλόνης Β σε μικροσωληνίσκους και τη μορφολογία των κυττάρων στην βΙΙ -, βIII- και βIVb-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S3, όλοι οι μη επεξεργασμένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα δεν έδειξαν προφανείς αλλαγές στις δομές μικροσωληνίσκων, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας [15], [16]. Ωστόσο, εποθιλόνη Β (5 ηΜ) είχε σημαντική επίδραση στα κύτταρα με βIII-τουμπουλίνης εξαντλημένο μικροσωληνίσκων. δέσμες μικροσωληνίσκων ήταν πιο εμφανείς στα βIII-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν. Σε αντίθεση, τα δίκτυα μικροσωληνίσκων παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό οργανώνονται και ανέπαφο στον έλεγχο siRNA, βII- και βIVb-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown αντιμετωπίζονται στην ίδια συγκέντρωση. Στο 20 nM εποθιλόνη Β, τόσο τον έλεγχο και βΙΙ-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν αρχίζουν να εμφανίζουν μικροσωληνίσκων δέσμες σε σύγκριση με τις βIVb-τουμπουλίνης knockdowns. Τα ευρήματα αυτά συμπληρώνουν το κλωνογονικού δεδομένα και προτείνουν ότι τα κύτταρα ανταποκρίθηκαν με διαφορετικό τρόπο για να εποθιλόνης Β μετά από ειδική νοκ ντάουν του κάθε ατόμου β-τουμπουλίνης ισοτόπου.

Νοκ ντάουν της βIII-τουμπουλίνης μειώνει εποθιλόνης Β που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και ενισχύει τον κυτταρικό θάνατο

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη δίπλα για να προσδιοριστεί αν knockdown του κάθε β-τουμπουλίνης προφίλ επιρροές ισότυπος του κυτταρικού κύκλου με την παρουσία της εποθιλόνης Β για 24 ώρες. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0.5 ηΜ εποθιλόνη Β, οι βIII-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε υπο-G

1 περιεχομένου, ενδεικτική κυτταρικού θανάτου (Εικ. 2). Μια μεγαλύτερη διαφορά παρατηρήθηκε με 20 ηΜ εποθιλόνης Β, με τον έλεγχο siRNA- και βΙΙ-τουμπουλίνης siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν μια αξιοσημείωτη G

block 2-M, ενώ οι βIII-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων που εμφανίζεται μια αύξηση στην υπο-G

1 πληθυσμού (Εικ. 2). βIII-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων είχαν λιγότερο κύτταρα συσσωρεύονται στο G2-M σύγκριση με τους ελέγχους, υποδεικνύοντας ότι ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να συμβαίνει ανεξάρτητα από μιτωτική σύλληψη. Είναι προφανές ότι knockdown του βIII-τουμπουλίνης αυξάνεται κατά πολύ την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β μέσω αυξημένο κυτταρικό θάνατο, επειδή το υπο-G

1 πληθυσμός αυξήθηκε σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Σε βIVb-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων από την άλλη πλευρά, μια χαμηλότερη περιεκτικότητα G

2-Μ παρατηρήθηκε σε σύγκριση με τα siRNA ελέγχου κατεργασμένα κύτταρα σε 20 ηΜ εποθιλόνη Β (Εικ. 2). Το

1 περιεχόμενο υπο-G δεν διέφεραν μεταξύ βIVb-τουμπουλίνης νοκ ντάουν και ελέγχου siRNA-κατεργασμένων κυττάρων στο 20 nM. Σε αντίθεση, knockdown του βIVb-τουμπουλίνης, έδειξε μια μείωση του αριθμού των κυττάρων που είναι αποκλεισμένα σε G

2-Μ, επιβεβαιώνοντας έτσι την μείωση της ευαισθησίας των κυττάρων αυτών να εποθιλόνη Β

Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου που αναγράφεται στην κορυφή του σχήματος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή του φαρμάκου 24 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για περιεχόμενο DNA τους με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζονται. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Για να προσδιορίσετε αν η εποθιλόνη Β που προκαλείται G

2-M του κυτταρικού κύκλου καθυστέρηση συνέβαινε σε προηγούμενα χρονικά σημεία, η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση Η460 και Calu-6 κυττάρων πραγματοποιήθηκε στις 4, 8 και 12 ώρες με την παρουσία ή απουσία της εποθιλόνης Β (20 ηΜ). Με την παρουσία του φαρμάκου, G

2-Μ διακοπή του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε ήδη από 4 ώρες για Η460 κύτταρα (Πίνακας S1) και 8 ώρες για Calu-6 κυττάρων (Πίνακας S2) τόσο βIII-τουμπουλίνης knockdown και ελέγχου-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Στις 8 και 12 ώρες το ποσοστό των κυττάρων Η460 αποκλεισμένα σε G

2-Μ ήταν μικρότερη από τον έλεγχο (Πίνακας S1), αν και μια παρόμοια τάση δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα Calu-6 (Πίνακας S2).

ευαισθησία σε εποθιλόνης Β συσχετίζεται με το επίπεδο της επαγωγής απόπτωσης

για την αντιμετώπιση είτε την αυξημένη ή μειωμένη ευαισθησία σε εποθιλόνη Β ειδικές για κάθε β-τουμπουλίνης ισοτύπου σχετιζόταν με επαγωγή της απόπτωσης, μετρήσαμε κασπάσης 3/7 δραστηριότητα σε αυτά τα κύτταρα μετά την αγωγή του φαρμάκου 24 ώρες. Κασπάση 3/7 δραστηριότητα στα κύτταρα βIII-τουμπουλίνης knockdown αυξήθηκε τουλάχιστον 2-φορές πάνω από ότι στον έλεγχο siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (Σχ. 3). Η αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης στα βIII-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown συσχετίζεται με την αυξημένη κυτταρικό θάνατο που παρατηρείται σε αυτά τα κύτταρα κατά την αγωγή του φαρμάκου. Σε αντίθεση, κασπάσης 3/7 δραστηριότητα παρέμεινε σε επίπεδα υποβάθρου στα βII- και βIVb-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown, παρόμοια με τα κύτταρα siRNA ελέγχου σε ≤1 ηΜ εποθιλόνης Β Σημαντικά, υπήρχε μία σημαντική μείωση της δραστηριότητας της κασπάσης στα βIVb knockdown κυττάρων σε ≥2 ηΜ, υποδεικνύοντας την βIVb-τουμπουλίνης knockdowns ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην εποθιλόνη επαγόμενη απόπτωση.

siRNA επιμολυσμένα Η460 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες επώαση παρουσία ή απουσία της εποθιλόνης Β και στη συνέχεια αναλύθηκαν για απόπτωση επαγωγή από δοκιμασία δραστηριότητα κασπάσης. Ανοικτό μπαρ: έλεγχος κύτταρα siRNA επιμολυσμένα? ανοιχτό γκρι στερεό μπαρ: βΙΙ-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν? μαύρες μπάρες: βIII-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν? σκούρο γκρι στερεό μπαρ: βIVb-τουμπουλίνης νοκ ντάουν κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Για να ορίσετε περαιτέρω ο ρόλος της β-τουμπουλίνης ισότυποι στην εποθιλόνη Β-επαγόμενη απόπτωση, χρώση Annexin V-FITC πραγματοποιήθηκε επίσης μετά από 48 ώρες θεραπεία με εποθιλόνη Β Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, η θεραπεία της βIII-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown Η460 απόπτωση που επάγεται από μια συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 320 ρΜ εποθιλόνης Β Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα βIII-τουμπουλίνης κύτταρα siRNA-θεραπεία σε σχέση με τον έλεγχο, βII- ή βIVb- τουμπουλίνη siRNA-κατεργασμένων κυττάρων σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (Σχ. 4Α). Σε αντίθεση, μία υψηλότερη συγκέντρωση εποθιλόνης Β ήταν αναγκαία για να διεγείρει απόπτωση σε βIVb-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown σε σύγκριση με είτε έλεγχο ή βΙΙ-τουμπουλίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα δείχνει ότι η αυξημένη επαγωγή απόπτωσης μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς που διέπουν την υπερευαισθησία στην εποθιλόνη Β παρακάτω βIII-τουμπουλίνης νοκ ντάουν. Εξόντωση βIVb-τουμπουλίνης, από την άλλη πλευρά, μειωμένη ευαισθησία στην εποθιλόνη επαγωγή απόπτωσης Β-επάγεται σε NSCLC

Άνοιγμα ράβδους: κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα?. ανοιχτό γκρι στερεό μπαρ: βΙΙ-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν? μαύρες μπάρες: βIII-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν? σκούρο γκρι στερεό μπαρ: βIVb-τουμπουλίνης νοκ ντάουν κύτταρα. Σημείωση εποθιλόνη Β ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση στα βIII-τουμπουλίνης κύτταρα knockodown σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0,32 μ.μ. (Α), ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις εποθιλόνης Β επάγουν σημαντικά χαμηλότερη απόπτωση στα βIVb-τουμπουλίνης knockdown κυττάρων (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Οι εποθιλόνες αντιπροσωπεύουν μία νέα κατηγορία παραγόντων σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων που θα μπορούσαν ενδεχομένως να προσφέρουν μια άλλη προσέγγιση για να ξεπεράσει την αντίσταση πακλιταξέλη. Εποθιλόνες έχουν δείξει ελπιδοφόρα κλινική δραστηριότητα σε μια μελέτη φάσης ΙΙ σε ασθενείς με ΜΜΚΠ [20] και έχουν πρόσφατα εγκριθεί για χρήση στο μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Δεν είναι γνωστό το πώς αυτή η κατηγορία ένωση αλληλεπιδρά με διαφορετικών ισοτόπων τουμπουλίνης και πώς αυτά επηρεάζουν την εποθιλόνη ευαισθησία Β. Εδώ μέσα, δείχνουμε ότι η ειδική β-τουμπουλίνης ισοτύπων επηρεάζουν διαφορικά NSCLC ευαισθησία των κυττάρων προς εποθιλόνες (Πίνακας 1).

Η

Αν και αλλοιωμένη έκφραση της β-τουμπουλίνης ισοτύπων έχει συσχετιστεί εκτενώς με αντίσταση ταξάνης, περιορισμένες πληροφορίες είναι διαθέσιμη για το ρόλο της β-τουμπουλίνης ισοτύπων στην ευαισθησία προς εποθιλονών. Σε αυτή τη μελέτη, βΙΙ-τουμπουλίνης δεν επηρέασε την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β σε καμία από τις δύο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές NSCLC που εξετάστηκαν, Η460 και Calu-6 κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ευαισθησία προς την πακλιταξέλη παράγοντα σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων δεν φαίνεται να επηρεάζεται από την υπερέκφραση ή καταστολή της έκφρασης βΙΙ-τουμπουλίνης [16], [21]. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη μας εξετάζει

vinca

αλκαλοειδή, όπου η καταστολή της βΙΙ-τουμπουλίνης ενισχύει την ευαισθησία σε αυτούς τους παράγοντες [16].

προκλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει προηγουμένως ότι η αντίσταση στο φάρμακο να TBAs συνδέεται συχνά με βIII-τουμπουλίνης αυξητική ρύθμιση (που επισκοπείται στο [10], [22]). Υπήρξε εικασίες και συσχετικός αποδείξεις ότι οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των εποθιλονών είναι ανεξάρτητες από βIII-τουμπουλίνης έκφραση λόγω της δραστηριότητάς τους σε βIII-τουμπουλίνης κύτταρα που υπερεκφράζουν

in vitro

και σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου [9], [12] . Ωστόσο, η οριστική απόδειξη δεν έχει αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα της εποθιλόνης είναι πραγματικά ανεξάρτητη από βIII-τουμπουλίνης έκφρασης. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία RNAi, δείχνουμε ότι knockdown του βIII-τουμπουλίνης οδηγεί σε σημαντική αύξηση στην ευαισθησία προς εποθιλόνη Β Σε συμφωνία, σταθερή υπερέκφραση βIII-τουμπουλίνης σε κύτταρα HeLa βρέθηκε να επιφέρει αντίσταση σε μια σειρά από TBAs συμπεριλαμβανομένων εποθιλόνης Β [17 ]. Μια έκθεση περιγράφεται η εποθιλόνη-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με μειωμένη βIII-τουμπουλίνης έκφρασης [12]. αντοχή στα φάρμακα είναι πολυπαραγοντική και διαφορετικά μοντέλα κυτταρική σειρά θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές. Σημαντικά, άλλες αλλαγές σε β-τουμπουλίνης ισοτύπων και μεταλλάξεις βΙ-τουμπουλίνης σημείο παρατηρήθηκαν επίσης στις κυτταρικές σειρές Β-ανθεκτικές εποθιλόνης [12], υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι παράγοντες μπορούν να έχουν επίσης συμβάλει στο ανθεκτικό φαινότυπο. Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως ανθεκτικό ανάλογο εποθιλόνης Β κύτταρα λευχαιμίας που εμφανίζεται πολλαπλές αλλοιώσεις μικροσωληνίσκων συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης έκφρασης του βIII-τουμπουλίνης έκφραση και βΙ-τουμπουλίνης μεταλλάξεων [13]. Μέχρι σήμερα, οι συνεισφορές των μηχανισμών αντίστασης Β αποκτήσει εποθιλόνης δεν έχουν συσχετίζεται καλά με εγγενή ευαισθησία σε εποθιλόνες. Θα πρέπει να τονιστεί ότι οι δύο ανεξάρτητες κύτταρα NSCLC που χρησιμοποιήθηκε στην τρέχουσα μελέτη ούτε έχουν υποβληθεί σε επιλογή πριν φάρμακο ούτε εκφράζουν Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) και επομένως παρέχουν μια ευκαιρία για την αξιολόγηση της ευαισθησίας στην εποθιλόνη Β που παρέχονται από κάθε μία από τις β τουμπουλίνης ισότυπους εξετάστηκαν.

Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ χτυπήσει κάτω βIII-τουμπουλίνης hypersensitizes τα κύτταρα να εποθιλόνη Β, νοκ ντάουν της βIVb-τουμπουλίνης μείωσε την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC με την εποθιλόνη Β Πρόσφατα, Cabral και συν-εργαζόμενοι έχουν ανέφεραν ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν βIVb-τουμπουλίνης εμφάνισαν μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση στην ευαισθησία προς εποθιλόνη Α [23]. Σε συνδυασμό με τη μελέτη μας, η έκφραση βIVb-τουμπουλίνης μπορεί να είναι ένα ευνοϊκό θεραπευτικό δείκτη για τη θεραπεία εποθιλόνης Β. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι knockdown του βII- και βIVb-τουμπουλίνες στα κύτταρα NSCLC χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή δεν επηρέασε σημαντικά την ευαισθησία πακλιταξέλη, αλλά αύξησε σημαντικά την ευαισθησία σε αλκαλοειδή της βίνκα [16]. Ως εκ τούτου, παρά την πακλιταξέλη και την κοινή χρήση εποθιλόνης Β επικαλυπτόμενες θέσεις σύνδεσης επί β-τουμπουλίνης, βIVb-τουμπουλίνης επίπεδα έκφρασης εκμαιεύσει διακριτές επιδράσεις στην ευαισθησία στην πακλιταξέλη και εποθιλόνη Β Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις που δείχνουν ότι η πρόσδεση των εποθιλονών και πακλιταξέλη σε τουμπουλίνη μπορεί να μην είναι ταυτόσημες [13], [24]. Προφανώς, ορισμένες σημειακές μεταλλάξεις στο β-τουμπουλίνης απονέμουν υπομονάδας paclitaxel αλλά όχι εποθιλόνης αντίσταση σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων [7], [25], υποδηλώνοντας ότι οι εποθιλόνες και ταξάνια μπορεί να έχουν διακριτές αλληλεπιδράσεις με β-τουμπουλίνη ισοτύπων. Μια ορθολογική οργάνωση για τις διαφορές στην ευαισθησία που προκαλείται από την έκφραση ισοτύπου β-τουμπουλίνης μπορούν να σχετίζονται με τις διαφορές αμινο οξέος μεταξύ των ισοτύπων. Βήτα-τουμπουλίνης ισοτύπων βΙ, βΙΙ, βIVa και βIVb, μοιράζονται τουλάχιστον 95% ταυτότητα και έχουν περιορισμένο αριθμό υποκαταστάσεων μη συντηρητικών αμινοξέων (Σχήμα S4) [26]. Σε αντίθεση, βIII-τουμπουλίνης διαφέρει ως μοιράζεται μόνο 92% ταυτότητα με τα παραπάνω ισότυπους β-τουμπουλίνης. Εντός του /θύλακα σύνδεσης εποθιλόνης πακλιταξέλη, σε βΙΙ και βIVb ισοτύπων, Ser275 έχει ενοχοποιηθεί ως ένας μεσολαβητής διάχυσης paclitaxel μέσω nanopores [27] και μπορούν δεσμό υδρογόνου με Gln279 και Lys216, σταθεροποιώντας το M-βρόχο (Εικ. 5). Με τη σειρά του, αυτό μπορεί να ενισχύσει τους δεσμούς υδρογόνου που παρατηρούνται μεταξύ Arg276 προς το καρβονύλιο λακτόνης και Thr274 προς την κετόνη οξυγόνο επί C5 εποθιλόνης Α (και πιθανώς εποθιλόνη Β). Σε βIII-τουμπουλίνης, υπάρχει μια Ser275Ala μετάλλαξη που θα μπορούσε να αποσταθεροποιήσει το M-βρόχο και με αυτόν τον τρόπο να αποδυναμώσει τους δεσμούς υδρογόνου Arg226 και Thr274 με το συνδετήρα, συμβάλλοντας στην μειωμένη ευαισθησία της. Ωστόσο, αυτό δεν εξηγεί τη διαφορά ευαισθησίας που παρατηρείται μεταξύ βIII-τουμπουλίνης και βIVb, όπως οι αλληλουχίες αμινοξέων αναγνωρίστηκαν ως σημαντικό εντός του paclitaxel /εποθιλόνης δεσμευτική τσέπη, ή δεσμευτικό το ΑΕΠ ιστοσελίδα δεν διαφέρουν μεταξύ αυτών των δύο ισοτύπων [24]. Η τρέχουσα μελέτη δεν μπορεί να αποκλείσει την πιθανότητα ότι η διαφορική έκφραση ειδικών β-τουμπουλίνης ισότυποι επηρεάζει την πρόσδεση του εποθιλονών στον τοίχο μικροσωληνίσκων, ή μέσω σταθεροποίηση των επαφών μεταξύ των διμερών στη διαμόρφωση πρωτονηματίων. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη με εποθιλόνη Α έδειξε ότι δεσμεύεται εξίσου καλά τόσο βI- και βIII-τουμπουλίνης [28]. Μια παρόμοια μελέτη που εξετάζει την σύνδεση του εποθιλόνης Β και των ειδικών β-τουμπουλίνης ισοτύπων θα ήταν σημαντικό να προσδιοριστεί πώς αυτές οι ισότυποι επηρεάζουν την αλληλεπίδραση αυτού του φαρμάκου με τουμπουλίνη.

εποθιλόνη Β δείχνεται ως sticks (ανοιχτό γκρι άνθρακες). Οι δεσμευτικές υπολείμματα τσέπη του 1TVK εμφανίζεται ως sticks (σκούρο γκρι άνθρακες). Τα μη-πολικά υδρογόνα παραλειφθεί για λόγους σαφήνειας. Οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται σαν διακεκομμένες πράσινες γραμμές. Ser275 μπορούν να σχηματίσουν 3 δεσμούς υδρογόνου με Gln292 και Lys216. Εικόνες που δημιουργούνται σε DS Modelling 3.0 (Accelrys®).

Η

Η αντικαρκινική δράση των εποθιλονών διαμεσολαβείται από την καταστολή της δυναμικής μικροσωληνίσκων, μιτωτική σύλληψη στο G 2-M φάση του κυτταρικού κύκλου

που ακολουθείται από την απόπτωση. Για την αντιμετώπιση των πιθανών μηχανισμών που διέπουν τη διαφορική απόκριση σε εποθιλόνη Β μετά knockdown ενός ειδικού ισότυπου β-τουμπουλίνης, εξετάσαμε την τάση των κυττάρων να υποστούν επαγόμενη από φάρμακα αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Μετά την επώαση με εποθιλόνη Β, βIII-τουμπουλίνης knockdown έδειξαν αύξηση στην υπο-G

1 πληθυσμούς (κυτταρικό θάνατο), ενώ μία μείωση στην G block

2-Μ σε σύγκριση με τα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα ελέγχου. Εξόντωση βIII-τουμπουλίνης μπορεί να μειώσει σημαντικά την έκταση της μιτωτικής μπλοκ που επάγεται από επώαση είτε με πακλιταξέλη ή βινκριστίνη [15], ενώ η αύξηση του επιπέδου του κυτταρικού θανάτου. Η επίδραση στην ευαισθησία εποθιλόνης Β δεν μπορεί να εξηγηθεί απλά από μια αλλαγή στη δυναμική των μικροσωληνίσκων, όπως πρόσφατα απέδειξαν ότι η δυναμική των μικροσωληνίσκων δεν αλλάζουν σε Η460 κύτταρα μετά βIII-τουμπουλίνης knockdown [29]. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι knockdown του βIII-τουμπουλίνης μπορούν να ενισχύσουν ΤΒΑ επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω ενός ξεχωριστού οδού που είναι ανεξάρτητη από μιτωτική σύλληψη. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι τα αποτελέσματα κατά του όγκου της πακλιταξέλης, συσχετίζεται με πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση αλλά όχι με μιτωτική σύλληψη [30]. Εποθιλόνες θα μπορούσε να έχει ένα παρόμοιο μηχανισμό δράσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, βIVb-τουμπουλίνης knockdown κύτταρα είχαν μια μείωση στον αριθμό των κυττάρων που είναι αποκλεισμένα σε G

2-Μ (εποθιλόνη Β 20 ηΜ) σε σύγκριση με τον έλεγχο και βΙΙ-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown, αν και σε επίπεδο υψηλότερο από το βIII- τουμπουλίνης νοκ ντάουν κύτταρα. Ωστόσο, σε αντίθεση με βIII-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν, βIVb-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν υφίστανται κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από φάρμακα σε παρόμοιο επίπεδο με τον έλεγχο και την βΙΙ-τουμπουλίνης κύτταρα νοκ ντάουν. Περαιτέρω, τόσο η δραστηριότητα κασπάσης 3/7 και χρώση αννεξίνης V έδειξε ότι βIII-τουμπουλίνης κύτταρα knockdown είχαν σημαντική αύξηση στην επαγωγή της απόπτωσης εποθιλόνη Β που επάγεται σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Σε αντίθεση, knockdown του βIVb-τουμπουλίνης προστατεύονται κύτταρα έναντι εποθιλόνη Β όπως αντανακλάται στην μειωμένη επαγωγή απόπτωσης. Ως εκ τούτου, η επαγωγή απόπτωσης θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένας από τους μηχανισμούς που διέπουν την αυξημένη ή μειωμένη ευαισθησία παρατηρήθηκε με αυτά τα συγκεκριμένα β-τουμπουλίνης ισοτύπων σε απόκριση προς εποθιλόνη Β

Η μοριακή σχέση μεταξύ β-τουμπουλίνης και εποθιλόνη Β-επαγόμενη απόπτωση μένει να αποδειχθεί. Έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι η εποθιλόνη Β που επάγεται απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος αυξάνοντας την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου από τα μιτοχόνδρια και στη συνέχεια επανατοπικοποίηση της προαποπτωτική πρωτεΐνη Bim στο διαμέρισμα μιτοχόνδρια [31]. Οι μελλοντικές έρευνες θα καθορίσει αν παραγωγή και τα μιτοχόνδρια ή έκφραση διαφορετικών προ- και αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες ROS είναι υπεύθυνες για την ικανότητα του βIII-τουμπουλίνης ή βIVb-τουμπουλίνης να επηρεάσουν διαφορικά εποθιλόνη Β αποπτωτικών σημάτων επαγόμενη, και εάν αυτά τα σήματα να συμβεί ανεξάρτητα από μιτωτική σύλληψη .

Η σημασία της διαφορικής β-τουμπουλίνης ισοτύπων στην ευαισθησία προς εποθιλόνη Β απαιτεί περαιτέρω επικύρωση στο κλινικό περιβάλλον για την αξιολόγηση της δυνατότητας εφαρμογής στην πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της εποθιλόνης Β θα είναι επίσης μεγάλο ενδιαφέρον να καθοριστεί εάν η έκφραση του βIVb-τουμπουλίνης θα συσχετίζονται με την κλινική απόκριση σε καρκίνους που έλαβαν θεραπεία με εποθιλόνης, καθώς με βάση τα αποτελέσματα σε αυτή τη μελέτη, οι όγκοι με υψηλή βIVb-τουμπουλίνης επίπεδα θα πρέπει να αναμένεται να είναι περισσότερο ευαίσθητοι σε αυτό το μέσο.

στο σύνολό τους , αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι β-τουμπουλίνης σύνθεση ισότυπου ενός κυττάρου επηρεάζει την ευαισθησία στην εποθιλόνη Β κλινικές μελέτες είναι δικαιολογημένη για την αξιολόγηση της θεραπευτικής αξίας της διαφορικής έκφρασης β-τουμπουλίνης ισοτύπων στον NSCLC και το ρόλο τους στην κλινική απόκριση σε εποθιλόνες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

siRNA που στοχεύει βΙΙ, βIII ή βIVb-τουμπουλίνης σιωπές ειδικά την έκφραση τους σε Η460 και Calu-6 κυττάρων NSCLC. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες Western που δείχνει siRNA που στοχεύει βΙΙ (Α), βIII (Β), ή βIVb-τουμπουλίνης (C) αναστέλλει την πρωτεϊνική έκφραση του σε Η460 και Calu-6 κυττάρων NSCLC σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με έλεγχο siRNA ή Mock (λιποφεκταμίνη 2000 μόνο) . Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση των άλλων ισοτύπων β-τουμπουλίνης. Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) έκφραση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εκπρόσωπος τζελ.