Αφηρημένο

Για περισσότερο από μια δεκαετία, η κυτοκίνη ιντερλευκίνη-12 (IL-12 ) έχει χρησιμοποιηθεί, είτε μόνος του ή σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα, ως θεραπεία για τον καρκίνο. Οι πολυάριθμες ιδιότητες κατά του όγκου της IL-12 εξακολουθεί να δημιουργήσει ενδιαφέρον για την κλινική χρήση αυτής της κυτοκίνης, ακόμη και αν έχει επιδείξει τοξικότητα όταν χορηγείται συστημικά. Ως προσέγγιση για την υπερνίκηση αυτού του τοξικότητα, πολυάριθμα εργαστήρια έχουν προσπαθήσει να επάγει την έκφραση IL-12 στην θέση του όγκου. Ωστόσο, για όγκους που είναι δύσκολο να αφαιρεθούν χειρουργικά ή για τη θεραπεία των διάσπαρτων μεταστάσεων, συστημική έκφραση αυτής της κυτοκίνης παραμένει ως η πιο αποτελεσματική μέθοδος χορήγησης. Παρ ‘όλα αυτά, η εύρεση εναλλακτικών προσεγγίσεων για την χρήση της IL-12 στη θεραπεία του καρκίνου και διαλεύκανση της βάσης των αποτελεσμάτων IL-12-πλευρά παραμένουν μια πρόκληση. Στην παρούσα εργασία έχουμε αποδείξει ότι η συστημική έκφραση της IL-12 μέσω της υδροδυναμικής ένεση της IL-12 cDNA είναι σε θέση να προκαλέσει διάφορα είδη βλαβών του ήπατος που σχετίζεται με ένα τοξικό παθολογία. Ωστόσο αναφέρουμε εδώ ότι ηπατική τοξικότητα μειώνεται και η επιβίωση των ποντικών ενισχυμένη σε απουσία παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα (TNFa). Αυτή η παρατήρηση έρχεται σε αντίθεση με αρκετές μοντέλα ποντικών και κλινικές δοκιμές που αξιώνουν γάμμα ιντερφερόνη (ΙΡΝγ) ως το κύριο κυτοκίνη υπεύθυνος για την IL-12 τοξικότητα. Επιπλέον, η εργασία μας δείχνει ότι όταν η IL-12 cDNA είναι συν-ένεση με IL-18 cDNA ή όταν ποντίκια προ-επεξεργασία με μια χαμηλή δόση του IL-12 cDNA πριν από τη λήψη μιας υψηλής δόσης της IL-12 cDNA, συστημικά επίπεδα του TNFa έχουν σχεδόν πλήρως καταργηθεί, με αποτέλεσμα βελτιωμένη επιβίωση και λιγότερο ηπατική βλάβη. Σημαντικά, κατάργηση του TNFα σηματοδότηση δεν επηρεάζει την ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα της IL-12. Έτσι, εξουδετερώνοντας ΤΝΡα με ανταγωνιστές που έχουν ήδη εγκριθεί για ανθρώπινη χρήση και προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την κατάργηση της IL-12 παρενέργειες κατά τη διάρκεια της χρήσης αυτής της κυτοκίνης για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Barrios Β, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas Η, Νέοι ΗΑ, et al. (2014) Κατάργηση του TNFα παραγωγής κατά του καρκίνου ανοσοθεραπεία είναι ζωτικής σημασίας για την καταστολή Παρενέργειες λόγω του συστημικού έκφραση της IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10.1371 /journal.pone.0090116

Επιμέλεια: Ίρβινγκ Coy Allen, Virginia Tech University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Σεπτέμβρη 2013? Αποδεκτές: 27η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 28 Φεβρουαρίου, 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί εν μέρει με ομοσπονδιακά κεφάλαια από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Κέντρου για την Έρευνα του Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) , Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, καθώς και από Agencia Nacional de Promocion Científica y TECNOLOGICA (Αργεντινή) και Secretaria Επιστημών y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SeCyT-UNC, Αργεντινή). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανοσορυθμιστική και αντι-αγγειογενετική λειτουργίες της IL-12 έχουν παράσχει τη λογική για την αξιοποίηση αυτής της κυτοκίνης ως αντικαρκινικό παράγοντα. Πάνω από μια δεκαετία πριν, κλινικές δοκιμές χορήγηση IL-12 για τη θεραπεία των όγκων, συμπεριλαμβανομένων των Τ κυττάρων λεμφώματος [1], μη-Hodgkin λέμφωμα [2], το μελάνωμα [3], τον καρκίνο των ωοθηκών [4], το σάρκωμα Kaposi [5] , και ξεκίνησαν νεφρικό καρκίνωμα [6]. Η συστημική IL-12 αποδείχθηκε ότι είναι ικανά να καταστείλουν την ανάπτυξη του όγκου, μετάσταση, και την αγγειογένεση

in vivo

[7] – [11], αλλά η χρήση του έχει συσχετισθεί με σημαντική δόση και το χρονοδιάγραμμα που εξαρτάται από την τοξικότητα, που αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο εμπόδιο για την κλινική εφαρμογή του [1], [3], [4], [6], [7]. Βαθμού 1-4 τοξικότητα, έχει ανέστειλε την χρήση του IL-12 ως θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, εναλλακτικές προσεγγίσεις για τη χρήση της IL-12 βρίσκονται υπό εντατική έρευνα σε ζωικά μοντέλα καρκίνου και σε πρόσφατες κλινικές δοκιμές [12] – [16]

Αρκετές κλινικές μελέτες χρησιμοποιώντας IL-12 έδειξαν ότι η αυξημένη. επίπεδα των φλεγμονωδών ΙΡΝγ κυτοκίνης συνδυάζονται με διαφορετικές βαθμίδες της ηπατοτοξικότητας και άλλων τοξικών παρενεργειών [2], [4], [6], [17]. Επιπλέον, σε αρκετές μοντέλα ποντικών, η έκφραση ΙΡΝγ που προκαλείται μετά χορήγηση Ιί-12 βρέθηκε να είναι υπεύθυνος για τις περισσότερες από τις παρατηρούμενες δυσμενείς επιπτώσεις [18] – [21].

Χρησιμοποιώντας διαφορετικά μοντέλα όγκου ποντικού, έχουμε έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η συστημική επίπεδα της IL-12 μόνο του ή μαζί με IL-18, που επάγεται μετά την έγχυση υδροδυναμική των αντίστοιχων cDNAs, κατήργησε πλήρως την ανάπτυξη του υποδόριου όγκου και πνευμονική και ηπατικών μεταστάσεων [10]. Επιπλέον, η συν-έκφραση της IL-12 + IL-18 ήταν σε θέση να βελτιώσει την επιβίωση ελαττώνοντας επιδράσεις της IL-12 από την πλευρά της [10]. προηγούμενη εργασία μας έδειξαν επίσης ότι ΙΡΝγ ήταν εν μέρει υπεύθυνη για τις επιδράσεις της IL-12 από την πλευρά της. Επιπλέον, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι αυξημένη επιβίωση του IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή σχετίζεται με πρώιμη παραγωγή IL-10 και τη μείωση των επιπέδων στον ορό ΙΡΝγ και TNFa [10]. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα εργασία αποδεικνύει ότι με τη χρήση υδροδυναμική ένεση για να επάγει συστημική συν-έκφραση της IL-12 + IL-18 cDNAs ή με προ-έγχυση ενός χαμηλής δόσης της IL-12 cDNA πριν από μια μεγάλη δόση της IL-12 cDNA, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της επιβίωσης και μειωμένη ηπατοτοξικότητα. Είναι ενδιαφέρον ότι, και οι δύο μέθοδοι δείχνουν ότι το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαίτερα σχετίζεται με κατάργηση της έκφρασης TNFa, μια φλεγμονώδης κυτοκίνη που παίζει επίσης έναν παθολογικό ρόλο στην σήψη σοκ και

in vivo

LPS αγωγή [22] – [25]. Μαζί, τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτό το έργο συμβάλλει στην κατανόηση της βάσης για παρενέργειες IL-12-συστημική. Επιπλέον, προτείνουμε ότι ανάλογα με το σύστημα που χρησιμοποιείται για την επαγωγή συστημικών έκφραση IL-12? διαφορετικών τοξικών μεσολαβητών θα μπορούσαν να είναι οι πρωταγωνιστές των ανεπιθύμητων παρενεργειών. Επιπλέον, τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για τη μείωση της IL-12, την τοξικότητα κατά το σχεδιασμό μελλοντικών θεραπειών για τη θεραπεία του καρκίνου που αφορούν αυτήν την κυτοκίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

ποντίκια και κυτταρικές σειρές

C57BL /6 (Β6) ποντίκια, 6-10 εβδομάδων, χρησιμοποιήθηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Επαγώγιμης συνθάσης του νιτρικού οξειδίου (iNOS) νοκ άουτ (ΚΟ), TNFα ΚΟ και TNFa υποδοχέα ενός (TNFαR1) ΚΟ ποντίκια σε C57BL /6 γενετικό υπόβαθρο αγοράστηκαν από τα Jackson Laboratories, Bar Harbor, ΜΕ, USA. φροντίδα των ζώων χορηγήθηκε σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (ΝΙΗ-Δημοσίευση Νο 86-23, 1985). Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). εγκατάσταση των ζώων μας έχει λάβει ΝΙΗ διασφάλιση της καλής διαβίωσης των ζώων (διασφάλιση όχι. A5802-01, Γραφείο Εργαστήριο καλή μεταχείριση των ζώων, ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA). Προκειμένου να αποφευχθεί η ταλαιπωρία των ζώων, οι ποντικοί ταχέως θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Κατά τη διάρκεια ενδοσπληνική ένεση κυττάρων (I.S.) όγκου, ένας μικρότερος χρόνος της χειρουργικής επέμβασης εφαρμόστηκε και οι τομές έγιναν όσο το δυνατό λιγότερο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης από τη χειρουργική επέμβαση, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε θερμό κουβέρτες και τα μάτια τους ενυδατώθηκαν με ένα διάλυμα φυσιολογικού ορού. Τα ζώα επανατοποθετήθηκαν στους κλωβούς μετά ολική ανάκτηση από τη χειρουργική επέμβαση.

κύτταρα μελανώματος Β16-Ρ10 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Η κυτταρική γραμμή ήταν απαλλαγμένο από μόλυνση Mycoplasma και δοκιμάζεται με PCR κάθε 6 μήνες. κύτταρα μελανώματος Β16-Ρ10 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και μη απαραίτητα αμινοξέα στους 37 ° C, 5% CO

2.

Υδροδυναμική ενέσεις cDNA

Το υδροδυναμικό διαδικασία μεταφοράς γονιδίων έχει περιγραφεί στο παρελθόν [10], [26]. Εν συντομία, τα ζώα εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα σε λιγότερο από 8 δευτερόλεπτα, με τα αντίστοιχα cDNAs διαλύονται σε 1,6 ml στείρου διαλύματος χλωριούχου νατρίου 0,9% και χωρίζονται σε 3 ομάδες, έλεγχος: 5-15 μg του ORF cDNA ελέγχου κενού φορέα, IL- 12: 5 μg του IL-12 cDNA (pscIL-12, γονίδιο σύντηξης p40-p35) και IL-12 + IL-18: 5 μg του IL-12 cDNA (pscIL-12, γονίδιο σύντηξης ρ40-ρ35) συν 10 μg της IL-18 cDNA (pDEF pro-IL-18). Όλα τα πλασμίδια έκφρασης χρησιμοποιούν την επιμήκυνση ανθρώπινο προαγωγέα 1-α για να οδηγήσει την μεταγραφή.

Ο

in vivo

αποτελέσματα που παρατηρούνται κατά την επαγωγή της κυτοκίνης είναι καθαρά λόγω της έκφρασης των cDNA κυτοκίνης και όχι από LPS μόλυνση. WT και ΚΟ TLR4 ποντικοί αναπτύσσουν παρόμοια επίπεδα και την κινητική της έκφρασης του TNFa μετά IL-12 θεραπεία cDNA υποδεικνύοντας έτσι την απουσία LPS στην παρασκευή cDNA κυτοκίνης χρησιμοποιείται για την έγχυση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Δείγματα

Σπλήνα

Για κυτοκίνες ανάλυση του

in vitro

διεγερμένα κύτταρα, οι σπλήνες έσπασαν, αφαιρέθηκαν τα ερυθρά αιμοσφαίρια με επώαση σε ρυθμιστικό λύσης ACK (Biowhittaker, Walkersville, MD), πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε συμπληρωμένο μέσο (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 5 × 10

-5 Μ 2-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και μη απαραίτητα αμινοξέα). εναιωρήματα κυττάρων μετρήθηκαν και διεγέρθηκαν

in vitro

με συμπληρωμένα μέσα, αντι-CD3 επικαλυμμένα αντίσωμα (Ab) (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) στα 2 μg /ml ή LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στο 1 μg /ml για 72 ώρες σε ένα σύστημα επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2.

κυτοκίνης και ALT δοκιμασίες

οι οροί αναλύθηκαν για κυτοκίνη παραγωγή με ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Τα κιτ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: mIL-10, mIFNγ, mTNFα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). Αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) τα επίπεδα ορούς προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ειδικό χρωματομετρικό κιτ (Wiener Laboratories) και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Hystopathological ανάλυση του ηπατικού ιστού

Τα συκώτια που λαμβάνονται από ποντικούς στην διαφορετική μεταχείριση ομάδες συλλέχθηκαν την ημέρα 15 μετά την θεραπεία cDNA, μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη και στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε παραφίνη. 6 μm τομές παρασκευάζονται και αιματοξυλίνη /ηωσίνη (Η /Ε) ή περιοδική οξύ-Schiff (PAS) λεκέδες εφαρμόστηκαν στις τομές. Τομείς, χωρίς ταυτοποίηση, αναλύθηκαν για αλλοιώσεις του ιστού κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο από έναν παθολόγο.

κυτταρομετρία ροής

Για χρώση πολύχρωμα, fluorocrome συζευγμένο Abs (BD-Pharmingen, La Jolla, CA ) έναντι δείκτες γενεαλογίας χρησιμοποιήθηκαν σε διάφορους συνδυασμούς. Εν συντομία, υποδοχείς Fc σε κύτταρα αποκλείστηκαν με ένα αντι-CD16 /32 Ab επί 30 λεπτά στους 4 ° C και πλύθηκαν. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για δείκτες επιφάνειας για 30 λεπτά στους 4 ° C, πλύθηκαν δύο φορές και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής με ένα BD FACS Canto ™ II κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Για κυτταρομετρία ροής διαλογής κυττάρων, σπληνοκύτταρα από IL-12 + IL-18-cDNA αγωγή ποντικούς βάφτηκαν με fluorocrome-επισημασμένο CD4 (κλώνος RM4-5), CD8 (κλώνος 53-6.7), CD11b (κλώνος Μ1 /70) και CD11c (κλώνος HL3) αντισώματα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) και ταξινομούνται σε μία καθαρότητα από 97-99% χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα MoFlo (Dako Cytomation).

εκχύλιση mRNA και ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας μία διαδικασία εκχύλισης με φαινόλη /χλωροφόρμιο σε ένα στάδιο (ΤπζοΙ? Invitrogen Life Technologies). RT-PCR διεξήχθη με 100 ng του συνολικού RNA για κάθε δείγμα (Super Script III ένα βήμα RT-PCR με πλατίνα Taq, Invitrogen), που αποτελείται από μία αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής 15 λεπτών στους 45 ° C, 40 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C (15 s), αναδιάταξη στους 55 ° C (30 s) και επέκταση στους 68 ° C (60 μ), με μία τελική επέκταση επί 5 λεπτά στους 68 ° C. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν:. INOS, αίσθηση 5′-GCA ΤΤΤ GGG ΑΑΤ GGA GAC TG-3 ‘, αντιπληροφοριακό 5′-GTT GCA TTG GAA ΟΤΟ AAG CGT TTC-3’

Δυτική ανοσοαποτύπωση

σπληνοκύτταρα λύθηκαν με 150 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης παγωμένο και φυγοκεντρείται στις 14.000 rpm, 4 ° C για 5 λεπτά. Οι πρωτεΐνες εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πήκτωμα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια Immun-Blot PVDF μεμβράνη (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα, 0,1% Tween-20 σε TBS επί μία νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, ΜΑ), οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ένα σήμα υπέρ Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Pierce) και φιλμ ΒΙΟΜΑΧ-MR (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ).

αργινάση Δραστηριότητα Δοκιμασία

Triton Χ-100 (0.1%, 100 μΐ) προστέθηκε στα σφαιρίδια σπληνοκυττάρων που υποβλήθηκαν τότε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Μετά από 30 λεπτά επώαση, Tris-HCl και ΜηΟ

2 μίγμα (100 μΙ) προστέθηκαν στα κύτταρα για 10 λεπτά στους 56 ° C. Οι πλάκες επωάστηκαν με L-αργινίνη (100 μl) στους 37 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια ένα H

2SO

4 H

3PO

4 H

2O μίγμα //( 800 μΐ) προστέθηκε και θερμάνθηκε με α-ισοπροπυλιδενο νιτροβενζόλιο ακετόνη (50 μΐ) στους 95 ° C για 30 λεπτά. Το συγκρότημα σε κάθε φρεάτιο αραιώνεται 20 φορές με PBS για να ανιχνεύσει την οπτική πυκνότητα (OD) στα 540 nm με ένα φασματοφωτόμετρο UV.

δοκιμασία μετάστασης Ηπατική και υποδόρια ανάπτυξη όγκου

C57BL /6 και TNFαRI KO ποντίκια ήταν η ένεση με κύτταρα μελανώματος Β16-Ρ10 (0,5 × 10

6 κύτταρα /0,5 ml 0,9% διάλυμα χλωριούχου νατρίου) για ηπατική ανάλυση μετάσταση. Τρεις ημέρες αργότερα, τα cDNA που παραδίδονται από υδροδυναμική έγχυση. Έντεκα ημέρες αργότερα, τα συκώτια συλλέχθηκαν και ο αριθμός των μεταστάσεων προσδιορίστηκε κάτω από ένα ανατομικό μικροσκόπιο.

Για την αξιολόγηση της ανάπτυξης υποδόριου όγκου, C57BL /6 και TNFαRI ΚΟ ποντικοί ξυρίστηκαν και ενέθηκαν s.c. στο αριστερό πλευρό με 1 χ 10

6 Β16-Ρ10 κυττάρων μελανώματος σε 0,2 ml στείρου διαλύματος χλωριούχου νατρίου 0,9%. Μετά από 10-14 ημέρες, όταν στερεοί όγκοι ήταν ορατά (διάμετρος 4-5 mm), τα ποντίκια ενέθηκαν υδροδυναμικά με τα καθορισμένα cDNA. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με ένα παχύμετρο. Ημέρα 0 αντιστοιχεί στην ημέρα, όταν χορηγήθηκαν cDNA.

Η στατιστική ανάλυση

Για την στατιστική σημαντικότητα, τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη βοήθεια ενός φοιτητή αταίριαστο

t

δοκιμής (σύγκριση των 2 πειραματικές ομάδες) ή δοκιμή ANOVA (σύνθεση άνω των 2 πειραματικών ομάδων) με ρ & lt? 0,05 θεωρείται ως σημαντική. Μη-παραμετρική δοκιμασία (τεστ Kruskal-Wallis) χρησιμοποιήθηκε όταν

ν

ήταν λιγότερο από 10. Οι καμπύλες επιβίωσης Ποντίκι χαράσσονται ως Kaplan – Meier οικόπεδα χρησιμοποιώντας GraphPad Prism Version 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) και α ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

Αποτελέσματα

Αλλαγές στον αριθμό των λευκοκυττάρων μετά από συστηματική έκφραση της IL-12 ή IL-12 + IL18

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι. εξάντληση των Τ κυττάρων και ΝΚ κυττάρων /ΝΚΤ αυξάνει την επιβίωση του IL-12-αγωγή ποντικούς [10]. Ωστόσο, μια υπολειμματική τοξικότητα παραμένει μετά την εξάντληση Τ /ΝΚ ΝΚΤ κυττάρων /, υποδηλώνοντας ότι άλλοι τύποι κυττάρων θα μπορούσε επίσης να είναι μέρος των IL-12-δυσμενείς επιπτώσεις [10]. Ως ένα πρώτο βήμα για την διερεύνηση αυτού του ζητήματος αναλύσαμε τις σχετικές μεταβολές στον αριθμό των λευκοκυττάρων που υπάρχουν στο σπλήνα (και το ήπαρ, που δεν απεικονίζεται) σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, οι αριθμοί των ΝΚ και ΝΚΤ υποσύνολα είναι ιδιαίτερα μειωμένη μέχρι και 50 ημέρες μετά την αγωγή μετά από χορήγηση είτε IL-12 ή IL-12 + IL-18 cDNA. Αυτά τα δεδομένα φάνηκε αρκετά περίεργο αφού εξάντληση των κυττάρων /ΝΚΤ ΝΚ συσχετίζεται με βελτίωση στην επιβίωση των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με IL-12 cDNA. Ωστόσο, όταν αξιολογήσαμε τον φαινότυπο των κυττάρων ΝΚ που προέρχονται από IL-12 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή, παρατηρήσαμε ότι εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΙΡΝγ και του δείκτη πρώιμης ενεργοποίησης CD69 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι, ακόμη και αν βρίσκονται σε πολύ χαμηλούς αριθμούς, ΝΚ κύτταρα /ΝΚΤ επιδεικνύουν ένα ενεργοποιημένο φαινότυπο και έτσι μπορεί να είναι εν μέρει υπεύθυνη για την τοξικότητα που παρατηρήθηκε μετά από συστηματική έκφραση της IL-12.

C57BL /6 ποντίκια ήταν υδροδυναμικά ένεση με έλεγχο, IL-12 και /ή IL-18 cDNA. Έως 50 ημέρες μετά την ένεση, τα ζώα θυσιάστηκαν και λήφθηκαν αιωρήματα μονών κυττάρων σπληνός κύτταρα. Το ποσοστό των διαφορετικών υποσυνόλων λήφθηκε με χρώση γενεαλογία επιφάνεια με συνδυασμό των ακόλουθων Abs: ΝΚ1.1, CD3, CD11b, CD19, CD4 και CD8 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Σχετική αριθμούς των κυττάρων των διαφορετικών πληθυσμών κυττάρων υπολογίστηκαν διαιρώντας τις απόλυτους αριθμούς κυττάρων που λήφθηκαν από τα ποντίκια κυτοκίνη αντιμετωπίζονται από τους απόλυτους αριθμούς των κυττάρων που λαμβάνονται από ποντικούς ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση μιας δεξαμενής 4 διαφορετικά πειράματα (σύνολο η = 12 ποντίκια ανά ομάδα). * 12 + 18 και 12 vs ελέγχου p & lt? 0,05,

# 12 vs 12 + 18 p & lt?. 0.05

Η

Επίσης, παρατηρήθηκε μεταβολή στον αριθμό των Τ-λεμφοκυττάρων μετά από χορήγηση cDNA κυτοκινών. Ενώ CD4

+ Τ κύτταρα εμφανίζουν μια χαμηλότερη κυτταρικότητα κατά το μεγαλύτερο χρονικές περιόδους που αναλύθηκαν, CD8

+ Τ κύτταρα υποβάλλονται σε αύξηση του αριθμού των κατά την πρώτη εβδομάδα μετά τη θεραπεία αλλά στη συνέχεια επιστρέφουν στα φυσιολογικά επίπεδα (σχήμα 1).

στη συνέχεια αξιολογήσαμε τον πληθυσμό μακροφάγων (Μφ) στα ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν. IL-12 μόνο του επάγει μια πρόωρη αύξηση του αριθμού των Μφ ενώ αντίθετα, ο αριθμός αυτών των κυττάρων σε IL-12 + IL-18 αγωγή ποντίκια δεν διαστέλλεται (ημέρες 2 και 3 μετά τη θεραπεία). Επιπλέον, ακόμη κι αν οι αριθμοί Μφ επιτευχθεί υψηλότερη κορυφή στο IL-12 + IL-18 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή κατά την ημέρα 10, επιστρέφουν στα φυσιολογικά επίπεδα κατά την ημέρα 50 μετά την αγωγή, ενώ ο αριθμός των Μφ στην ομάδα IL-12 αγωγή εξακολουθεί να είναι αυξημένα . Το γεγονός ότι ένα παθογόνο ρόλο για τα κύτταρα αυτά σε ένα άλλο μοντέλο ποντικού της IL-12 + IL-18 συστημική έκφραση έχει αναφερθεί προηγουμένως [19], υποθέτουμε ότι μεσολαβητές που παράγονται από Μφ μπορούσε να είναι υπεύθυνη, τουλάχιστον εν μέρει, για την τοξική παρενέργειες που παρατηρούνται μετά από συστηματική IL-12 αγωγή.

Η ισορροπία μεταξύ μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) έκφραση και δραστικότητα αργινάσης προτείνει μια περισσότερο φλεγμονώδες προφίλ σε μακροφάγα από IL-12 σε σύγκριση με το IL-12 + IL-18 κατεργασμένα ποντίκια

στη συνέχεια, διερευνήσαμε το ρόλο του ΝΟ ως βάση για τις επιδράσεις της IL-12 από την πλευρά της ως ΝΟ είναι γνωστό ότι προκαλείται από Μφ παρουσία IL-12 + IL-18 [27] . Η παραγωγή του ΝΟ από ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα αυξάνεται σε σηπτικούς ασθενείς και την επιμονή τους σχετίζεται με κακή κλινική έκβαση [28]. Επιπλέον, η υπερβολική ΝΟ σχηματισμός παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του σοκ και ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων κατά τη σήψη και σε οξεία πνευμονική βλάβη [29]. Σε αυτό το πλαίσιο, αναλύσαμε πρώτα αν NO /iNOS εκφράζεται σε πειραματικό μοντέλο μας. Όπως μπορεί να φανεί στην Εικόνα 2Α, η έκφραση RNA iNOS είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε αμφότερα IL-12 και IL-12 + 18-ποντίκια με αγωγή νωρίς μετά τη χορήγηση cDNA και επιμένει για τουλάχιστον 15 ημέρες μετά την αγωγή (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανάλυση της πρωτεΐνης έδειξε ότι μετά από 15 ημέρες μετά την αγωγή, η έκφραση iNOS είναι ακόμα πάνω ρυθμισμένα σε ποντικούς IL-12 αγωγή αλλά μικρότερη ή καθόλου έκφραση παρατηρείται σε IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή (Εικ. 2Β) . Επιπλέον,

in vitro

επίπεδα ΝΟ αξιολογείται κατά την ημέρα 15 μετά τη θεραπεία από σπληνοκύτταρα διεγερμένα με LPS έδειξε μια χαμηλότερη έκφραση σε κύτταρα που λαμβάνονται από IL-12 + IL-18 αγωγή ποντικών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα μας οδήγησαν να καθορίσει εάν η χαμηλότερη έκφραση του iNOS /ΝΟ σε IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή θα μπορούσε να εξηγήσει το βελτιωμένο αποτέλεσμα επιβίωση παρατηρήθηκε σε αυτήν την ομάδα, σε σύγκριση με IL-12 αγωγή ποντικούς [10]. Απροσδόκητα, όταν παρακολουθείται η επιβίωση σε WT και ΚΟ iNOS μετά IL-12 ή IL-12 + IL-18 χορήγηση cDNA, παρατηρήσαμε ότι η έλλειψη έκφρασης iNOS δεν βελτιώνει την αντίσταση στις θεραπείες (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι ΔΕΝ μπορεί να μην εμπλέκεται άμεσα ως τοξική διαμεσολαβητή από αυτές τις θεραπείες, αλλά η σχέση μεταξύ Μφ ΟΧΙ έκφραση /αργινάσης θα μπορούσαν να παρέχουν πληροφορίες για τη φλεγμονώδη περιβάλλον που προκύπτουν από τις διαφορετικές θεραπείες. Κατά συνέπεια, το σχήμα 2D δείχνει ότι σπληνοκύτταρα από IL-12 αγωγή ποντικοί έχουν σημαντικά χαμηλότερη δραστικότητα αργινάσης όταν συγκρίνονται με σπληνοκύτταρα από IL-12 + ποντικό IL-18 αγωγή. Μαζί με τα δεδομένα iNOS, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο αργινάσης αναλογία NO /είναι υψηλότερη σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με IL-12 και μόνο σε σχέση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με IL-12 + IL-18. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η αγωγή με IL-12 + IL-18 που επάγεται ένα φαινότυπο μακροφάγου λιγότερο φλεγμονώδη σε σύγκριση με τα ποντίκια IL-12 αγωγή.

(Α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου iNOS σε σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με τις ορισθείσες cDNAs, 12 + 18 και 12 vs ελέγχου p & lt? 0.05. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης των σπληνοκυττάρων που λαμβάνονται από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με τις ορισθείσες cDNAs, 12 vs 12 + 18, ρ & lt? 0.05. (Γ) Η επιβίωση παρακολουθήθηκε σε Β6 (WT) ή iNOS ΚΟ ποντικών στις ημέρες μετά την IL-12 ή IL-12 + ένεση IL-18-cDNA. (D) δραστηριότητα αργινάση μετριέται προσδιορισμό των επιπέδων ουρίας σε 1 × 10

6 σπλήνας. Τα δεδομένα σε Α, Β και D εκφράζονται ως ο μέσος όρος των 2 διαφορετικών πειραμάτων με 4-5 ποντίκια ανά ομάδα. καμπύλη επιβίωσης χτίστηκε ως ένα σύνολο 2 διαφορετικά πειράματα με 5 ποντίκια ανά ομάδα. * 12 + 18 vs 12 ρ & lt?. 0.05

Η

Η έκφραση ΙΡΝγ, TNFa και IL-10 μετά από IL-12 + IL-18 θεραπεία

Έχουμε αναφερθεί ότι σε IL- 12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή, η πρώιμη έκφραση της IL-10 ελέγχει τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτοκινών ΙΡΝγ και ΤΝΡα [10]. Ωστόσο, παρόλο που πραγματοποιήσαμε τα πειράματα αυτά με τη μείωση διαφορετικούς πληθυσμούς λευκοκυττάρων και την αξιολόγηση της επιβίωσης σε κάθε περίπτωση, δεν θα μπορούσαμε να εντοπίσει τις πηγές των κυτοκινών [10]. Για να διερευνηθεί αυτό το θέμα, αξιολογήσαμε την παραγωγή της IL-10, ΙΡΝγ και TNFa από ταξινομημένη σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή την ημέρα 3 μετά τη θεραπεία, ένα χρονικό σημείο κατά το οποίο είχαμε προηγουμένως παρατηρήθηκε παραγωγή αυτών των κυτοκινών (Σχήμα 3). Παρατηρήσαμε ότι ο TNFa είναι ιδιαίτερα παράγεται από CD8

+ Τ κυττάρων και CD11b

+ συν CD11c

+ κύτταρα (Μφ, δενδριτικά κύτταρα (DCs) και φυσικά κύτταρα φονείς (ΝΚ) ταξινόμηση μαζί). Δεδομένου ότι τα κύτταρα ΝΚ και τα DCs αντιπροσωπεύουν ένα πολύ μικρό πληθυσμό σπληνοκυττάρων σε αυτά τα ποντίκια (Εικ. 1 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), ταξινομήσαμε όλα αυτά τα κύτταρα μαζί για να αυξηθεί ο αριθμός των ανακτηθέντων κυττάρων. Για να προσδιοριστεί η συμβολή των Μφ και μόνο, αξιολογήσαμε την έκφραση κυτοκινών σε καλλιέργειες εμπλουτίζονται προσκολλημένων σπληνοκυττάρων (& gt? 85% Μφ) και παρατήρησε ότι αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν επίσης υψηλά επίπεδα TNFα. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι η έκφραση του TNFα μπορεί να προέρχονται κυρίως από Μφ και όχι τους άλλους τύπους 2 κυττάρων που υπάρχουν στο CD11b /c

+ διαλεγμένα ομάδα (Εικ. 3Α). Σε αντίθεση, ΙΡΝγ εκφράζεται από CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα, αλλά όχι από Μφ, αποδεικνύοντας ότι CD11b έκφραση /c είναι πιθανόν να οφείλεται στην παρουσία των κυττάρων ΝΚ σε αυτήν την ομάδα (Σχ. 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, το IL-10 παράγεται από CD4

+ Τ κυττάρων και επίσης με DCs ή τα κύτταρα ΝΚ αλλά όχι από Μφ (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η εξάντληση των κυττάρων Τ, ΝΚ και ΝΚΤ, θα μπορούσε να εξαλείψει τις πηγές της ΙΡΝγ (όπως έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν [10]), αλλά Μφ εξακολουθούν να παραμένουν ως μια πολύ σημαντική πηγή TNFα. Το εύρημα αυτό είναι πιθανώς ο λόγος εξάντληση των λεμφοκυττάρων βελτιώθηκε μόνο εν μέρει την επιβίωση σε IL-12-αγωγή ποντικούς [10]. Επιπλέον, το γεγονός ότι το προφίλ Μφ φαίνεται να είναι περισσότερο φλεγμονώδη βάση τα /αργινάσης δεδομένα NO, θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί τα ποντίκια IL-12 αγωγή παρουσιάζουν πολύ χαμηλότερη από ό, τι επιβίωση IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή.

σπληνοκύτταρα από IL-12 + ελήφθησαν IL-18 ποντικούς και χρωματίστηκαν με αντι-CD4, αντι-CD8 και αντι-CD11b /c fluorocrome επισημασμένο Abs και στη συνέχεια ταξινομούνται σε μία καθαρότητα 97-99% χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα MoFlo (Dako Cytomation). Ταξινόμηση κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία αντι-CD3 επικαλυμμένα Ab (2 μg /ml) και LPS (1 μg /ml) για 72 ώρες. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και (Α) TNFa, (Β) ΙΡΝγ και (C) IL-10 έκφραση αξιολογήθηκαν με ELISA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος των 2 διαφορετικών πειραμάτων με 4-5 ποντίκια ανά ομάδα. * Παρακινημένοι vs μη διεγερμένα, ρ & lt?. 0.001

Η

TNFα είναι μια σημαντική κυτοκίνη που μεσολαβεί IL-12 συστηματική τοξικότητα

Για να ερευνηθεί ο ρόλος του TNFα ως ένα τοξικό μεσολαβητής μετά IL -12 συστημική έκφραση, αναλύσαμε την επιβίωση του TNFa ΚΟ ή ποντίκια TNFαR1 ΚΟ μετά IL-12 αγωγή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, κατάργηση του ΤΝΡα ή γονιδίων υποδοχέα του τύπου 1 αύξησε σημαντικά την επιβίωση του IL-12-αγωγή ποντικούς σε σύγκριση με ποντικούς WT. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν αναλύσαμε την κινητική των επιπέδων στον ορό TNFa, παρατηρήσαμε ότι κορυφές έκφραση πρωτεΐνης περίπου ημέρες 4 τόσο σε IL-12 + IL-18 και IL σε 12-αγωγή-ποντικούς? Ωστόσο, τα επίπεδα είναι πολύ χαμηλότερα σε IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή (Σχ. 6C). Επιπλέον, με την ημέρα 8 και μέχρι την ημέρα 12 μετά τη θεραπεία, τα επίπεδα ορών ΤΝΡα αρχίζουν να μειώνονται σε αμφότερες τις ομάδες? Ωστόσο, παραμένει επίμονη και πάντοτε υψηλότερη στην ομάδα θεραπείας IL-12 (Εικ. 4Β).

(Α) Η επιβίωση παρακολουθήθηκε σε WT, TNFa ΚΟ και τα ποντίκια TNFRI ΚΟ στις ημέρες μετά IL-12 θεραπεία cDNA. * WT vs TNFα ΚΟ και TNFRI KO, σ & lt? 0,01. (Β) Ποντίκια από τον έλεγχο, IL-12 ή IL-12 + IL-18-cDNA αγωγή ομάδες αφαιμάσσονται και τα επίπεδα του TNFa ορούς προσδιορίστηκαν κατά τις ημέρες μετά την αγωγή. (C) Σπληνοκύτταρα από τον έλεγχο, IL-12 ή IL-12 + IL-18 λήφθηκαν ποντικοί cDNA αγωγή και καλλιεργήθηκαν παρουσία μέσου (NS), αντι-CD3 επικαλυμμένα Ab ή LPS για 72 ώρες. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και η έκφραση του TNFa εκτιμήθηκε με ELISA. * IL-12 έναντι IL-12 + IL-18, ρ & lt? 0.05. (D) Οροί από λήφθηκαν Β6 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο ή IL-12 cDNA και από TNFRI ΚΟ ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με IL-12 cDNA κατά τις ημέρες μετά την αγωγή. επίπεδα ALT προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ειδικό χρωματομετρικό κιτ. Τα δεδομένα σε Α, Β και Γ εκφράζονται ως μέσος όρος από 2 διαφορετικά πειράματα με 4 ποντικούς ανά ομάδα. Τα δεδομένα στο D εκφράζονται ως ο μέσος της ομάδας 3 διαφορετικά πειράματα (WT = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12 cDNA vs TNFRI KO IL-12 cDNA, ρ & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, συγκρίναμε TNFα

in vitro

έκφρασης με σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία

in vivo

με IL-12 μόνο ή με IL-12 + IL-18. Ενώ ΤΝΡα που παράγεται μετά

in vitro

διέγερση με αντι-CD3 Ab (διέγερση των Τ κυττάρων) είναι αρκετά παρόμοια μεταξύ των κυττάρων που λαμβάνονται από τις δύο ομάδες, είναι σημαντικά χαμηλότερη σε IL-12 + IL-18-ποντικούς αγωγής όταν διεγείρονται

in vitro

με LPS (δηλ Μφ και DCs διέγερση) (Σχ. 4C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα χαμηλότερα επίπεδα συστημικής ΤΝΡα παρατηρήθηκε σε IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή είναι πιθανόν να οφείλεται σε μειωμένη συμβολή των Μφ και DCs στην έκφραση αυτής της κυτοκίνης σε αυτήν την ομάδα αγωγής.

η συστημική IL-12 ή IL-12 + IL-18 θεραπεία προκαλεί παθολογικές επιδράσεις στην ανοσολογική ιστούς και το ήπαρ

η συστημική έκφραση της IL-12 έχει αναφερθεί ότι επάγουν διάφορους τύπους παθολογικών αλλαγών σε μοντέλα ποντικού και στον καρκίνο ασθενείς [2], [4], [6], [17]. Για να αξιολογηθεί η γενική τοξικότητα της IL-12 θεραπεία, έχουμε θυσιάζονται ελέγχου και ασθενών IL-12 και IL-12 + IL-18 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή και εκτελέστηκε μια πλήρη ανάλυση της παθολογίας οργάνων. Όπως μπορεί να φανεί στον Πίνακα S1, οι μεγάλες μεταβολές που παρατηρούνται είναι ατροφία του θύμου εξάντληση και λεμφοειδών, και οι αλλαγές αυτές εμφανίστηκαν παρόμοια σε IL-12 και IL-12 + IL-18 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή.

Ωστόσο, η ανάλυση αποκάλυψε επίσης μια πιο έντονη ιστιοκυττάρωση σε λεμφαδένες (LNs) που λαμβάνεται από IL-12 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή σε σύγκριση με IL-12 + IL-18-ποντίκια με αγωγή. Ιστιοκύτωση συνδέεται με την παρουσία μακροφάγων στον ιστό, έτσι ώστε η επιδεινώνεται παθολογία σε ποντικούς υπό αγωγή IL-12 συνδέεται με μια σημαντική επέκταση /παρουσία μακροφάγων σε LNs.

Μεταβολές στα ηπατικά ιστού μετά συστημική έκφραση της IL -12 ή IL-12 + IL-18

Ακόμα κι αν εμείς δεν παρατηρούμε διαφορές στην ιστιοκυττάρωση κατά τη σύγκριση των συκώτια της IL-12 και IL-12 + IL-18 ποντίκια, τα προηγούμενα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα επίπεδα ορών της ο ηπατικών ενζύμων ALT και ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) ήταν σημαντικά υψηλότερα στην IL-12 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή [10]. Δίπλα αποφασίσαμε να αξιολογηθεί η παθολογία αυτού του οργάνου στη θέση του στο εύρημα ότι μία από τις πιο ανεπιθύμητες επιδράσεις της συστηματικής IL-12 θεραπεία είναι η ηπατοτοξικότητα που παρατηρήθηκε μετά τη χορήγηση αυτής της κυτοκίνης [2], [4], [6], [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, IL-12 θεραπεία του ΤΝΡα υποδοχέα τύπου 1 ΚΟ καταργεί την κορυφή ALT παρατηρήθηκαν κατά την ημέρα 15 σε ποντικούς WT.

Τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά που υπάρχουν στο ήπαρ των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με IL- 12 ή IL-12 + IL-18 cDNAs αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στον ιστό, συμπεριλαμβανομένης της εμφάνισης του: τα κύτταρα με ένα στρογγυλό σχήμα (αερόστατο κυττάρων) (σχήμα 5Β.) σε σύγκριση με την κλασική εξαγωνικό σχήμα των ηπατοκυττάρων από ποντικούς ελέγχου (Σχ. 5Α). Επιπλέον, οι ήπατα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή δείχνουν την απώλεια των ηπατικών ημιτονοειδών που μπορεί να παρατηρηθεί σαφώς στα ποντίκια ελέγχου (Σχ. 5Α vs 5Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε εστίες έκτοπη αιμοποίηση (Εικ. 5C) με την παρουσία των μεγακαρυοκυττάρων (Σχ. 5D) σε όλο το ήπαρ σε IL-12 ή IL-12 + ποντικό IL-18 αγωγή, αλλά όχι σε ποντίκια ελέγχου. Τόσο Mallory φορείς (Σχ. 5Ε) και Councilman φορείς (Εικ. 5F) και εστίες νεκρωτικό ιστό (Εικ. 5G) μπορεί να θεωρηθεί μόνο σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τα cDNA της κυτοκίνης. Τέλος, παρατηρήσαμε ότι οι καταθέσεις γλυκογόνο είναι ιδιαίτερα μειωμένος σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με IL-12 ή IL-12 + IL-18 (Εικ. 5Θ) σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (Εικ. 5Η). Ακόμη και αν όλα αυτές οι αλλοιώσεις είναι παρών καθ ‘όλη τη ηπατικό ιστό σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή είτε με IL-12 cDNA μόνο του ή IL-12 + IL-18 cDNAs (οξύνοντας μεταξύ των ημερών 14-16), συν-χορήγηση IL-12 και IL-18 είναι σε θέση να μειώσει την συχνότητα εμφάνισης αυτών των IL-12 που σχετίζονται με ανωμαλίες της ηπατικής (Πίνακας S2). Αυτές οι παρατηρήσεις συσχετίζονται με προηγούμενα δεδομένα μας που έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα ALT και AST ορούς σε 12 + IL-18 αγωγή ποντικούς [10]. Επιπλέον, TNFαR1 ΚΟ ποντίκια (Σχ. 5K) εμφάνισαν μια χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης αυτών των παθολογικών χαρακτηριστικά μετά IL-12 θεραπεία cDNA από ό, τι παρατηρήθηκε σε αγωγή WT ποντικούς (Εικ. 5J), ειδικά στον αριθμό και το μέγεθος των διηθήματος εστιών (Πίνακας S2 ).

τα συκώτια που λαμβάνονται από ποντικούς στις διάφορες ομάδες ελήφθησαν σε ημέρες 14-16 θεραπεία μετα-cDNA. Ελήφθησαν τομές 6 μm και (Α-G) αιματοξυλίνη /ηωσίνη (Η /Ε) ή (Η-Ι) Περιοδική οξύ-Schiff (PAS) λεκέδες εφαρμόστηκαν στις τομές. (Α) Τα ηπατοκύτταρα και αιμοφόρα αγγεία από ένα ποντίκι ελέγχου, 100 ×. (Β) ηπατοκύτταρα Ballooning και απουσία ηπατικών ημιτονοειδών σε ένα IL-12 cDNA αγωγή ποντικού, 100 ×. (Γ) Η εστίαση της έκτοπης αιμοποίησης σε ένα IL-12 cDNA αγωγή ποντικού, 100 ×. (D) μεγακαρυοκυττάρων σε IL-12-cDNA αγωγή ποντικού, 100 ×. (Ε) Mallory και (F) Councilman φορείς σε IL-12-cDNA αντιμετωπίζεται το ποντίκι, 100 ×. (G) Εστίαση της νέκρωσης? 10 ×. καταθέσεις γλυκογόνου που λαμβάνονται σε ένα ποντίκι από (H) στην ομάδα ελέγχου ή (Ι) η ομάδα της IL-12-cDNA, 20 ×. τομές ήπατος από (J) WT ή ποντίκια (K) TNFR1 KO 15 ημέρες μετά την IL-12 θεραπεία cDNA. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των 2 διαφορετικών πειραμάτων με 4-5 ποντίκια ανά ομάδα.

Η

ποντίκια Β6 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-12 cDNA μόνο (μαύρος κύκλος), IL-12 + IL-18 cDNA (ανοικτός κύκλος