Abstract

σαλιγκάρι, ένας ισχυρός καταστολέας της έκφρασης Ε-καδερίνης, παίζει καθοριστικό ρόλο στην επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε επιθηλιακό καρκίνο. Πρόσφατα, EMT και βλαστική ικανότητα προγράμματα βρέθηκε συνδέονται μεταξύ τους. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση των σαλιγκαριών και τη συμβολή της στην έκφραση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC) δείκτης, εισβολής, αυτο-ανανέωση, κλωνογενοποιήσεως, και καρκινογένεση από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σαλιγκάρι ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε CSC

υψηλή κυτταρική σειρά Panc-1. Σταθερό, μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) μεσολάβηση Σαλιγκάρι knockdown μειώθηκε εισβολή σε κύτταρα Panc-1, σύμφωνα με αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μετατόπιση του από τον πυρήνα στην μεμβράνη. Σαλιγκάρι σίγηση σε Panc-1 επίσης ανέστειλε την έκφραση CSC δείκτη ΑΙ_ϋΗ, μαζί με μειωμένη σφαίρα και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών, η οποία ήταν σε μεγάλο βαθμό συνεπής με την έκφραση που σχετίζεται βλαστοκυττάρων παράγοντες μεταγραφής όπως Sox2 και Oct4. Σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού, knockdown του σαλιγκαριού οδήγησε σε μείωση του αριθμού των ποντικών που φέρουν όγκο και μειωμένο μέσο μέγεθος των όγκων, η οποία είχε ένα ισχυρότερο χρώση μεμβράνη του Ε-καδερίνης και ελαφρύτερα χρώση των Oct4. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα εμπλέκουν Σαλιγκάρι απαιτείται για τη διατήρηση της βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με φαινότυπο στον καρκίνο του παγκρέατος, και η αναστολή της Σαλιγκάρι θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με τη στόχευση ΚΕΠ

Παράθεση:. Zhou W, Lv Ε, Qi W, Wu D, Xu Υ, Liu W, et al. (2014) σαλιγκάρι συμβάλλει στη διατήρηση των Βλαστικών Κυττάρων-φαινότυπο κύτταρα στο ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10.1371 /journal.pone.0087409

Επιμέλεια: Μιχαήλ Klymkowsky, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 24η Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Zhou, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [81001095]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα είναι μια πολύ επιθετική επιθηλιακού καρκίνου με αναφερθεί ποσοστό επιβίωσης 5 ετών περίπου 5% [1]. Μόνο το 20% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι επιλέξιμοι για χειρουργική εκτομή, και μεταστατική νόσο συχνά αναπτύσσεται ακόμη και μετά την επέμβαση, ενώ οι τρέχουσες χημείο- και ραδιο-θεραπείες είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική [2]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μοριακών γεγονότων που διέπουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος είναι επειγόντως αναγκαία, η οποία μπορεί να κρατούν το κλειδί για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και νέες θεραπευτικές στρατηγικές.

Ένα αυξανόμενο ποσό επιστημονικά στοιχεία δείχνουν ότι οι όγκοι περιέχουν ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων, δηλαδή, τα καρκινικά κύτταρα στέλεχος που μοιάζει (ΚΕΠ) ή καρκίνο κύτταρα έναρξης (CICs), οι οποίες εμφανίζουν μια αυτο-ανανέωση ικανότητα, ανθεκτικό σε συμβατική χημειοθεραπεία και είναι υπεύθυνοι για την αποτυχία της θεραπείας, η υποτροπή του καρκίνου και μετάσταση [3 ]. Αν και η υπόθεση ΚΕΠ προτείνει ότι οι όγκοι μπορούν να προκύψουν από βλαστικά ή προγονικά κύτταρα, μελέτες από ορισμένα εργαστήρια υποδεικνύουν ότι τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), μια αναπτυξιακή διαδικασία στην οποία τα κύτταρα χάνουν τα επιθηλιακά χαρακτηριστικά και αποκτούν ιδιότητες μεσεγχυματικά όπως αυξημένη κινητικότητα και την εισβολή, μπορεί αποκτήσει κυττάρων με βλαστικά κύτταρα, όπως χαρακτηριστικά [4] – [6].

EMT προκαλείται από την καταστολή της έκφρασης Ε-καδερίνης από τις ρυθμιστικές αρχές EMT, όπως σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, και Twist. Η οικογένεια σαλιγκάρι του ψευδαργύρου-δακτύλου μεταγραφικοί καταστολείς καταστέλλει άμεσα Ε-καδερίνης in vitro και in vivo μέσω μιας αλληλεπίδρασης μεταξύ τους περιοχή ΟΟΟΗ-τερματικό και την αλληλουχία 5′-CACCTG-3 ‘στον υποκινητή Ε-καδερίνης [7]. Σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, η υπερέκφραση του σαλιγκαριού αναφέρθηκε ότι επάγει όχι μόνο EMT, αλλά και μια CSC φαινότυπο, η οποία ενισχύεται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή in vitro και μία αύξηση του σχηματισμού μετάστασης σε βιολογικό περιβάλλον [8]. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι Σαλιγκάρι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της εξέλιξης και της μεταστατικής ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου [9], [10]. Σε κλινικό περιβάλλον, σαλιγκάρι υπερέκφραση έχει προηγουμένως συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση και μια πιο επεμβατική φαινότυπο σε πολλές κακοήθειες [11] – [13]. Ωστόσο, υπάρχουν κάποιες αναφορές σχετικά με τη σχέση μεταξύ της έκφρασης σαλιγκάρι και το κέρδος του παγκρέατος ιδιότητες κατά του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκε η λειτουργία του σαλιγκαριού επί έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων, η ικανότητα αυτο-ανανέωσης σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής in vitro και ξενομοσχεύματος όγκων σχηματισμό in vivo. Η δουλειά μας αποκαλύπτει ότι η ρύθμιση του γονιδίου διαμεσολαβείται από σαλιγκάρι μπορεί να υποστηρίξει την ανθρώπινη ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος με τη διατήρηση του διαμερίσματος καρκίνο του παγκρέατος βλαστικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο παγκρέατος καρκινικές κυτταρικές σειρές Panc-1 και BxPC-3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco /Invitrogen, CA), πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Flow Laboratories, Rockville, MD). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C με 5% CO2. Gross μορφολογία των κυττάρων ως προς την παρουσία ή την απουσία μορφολογικά χαρακτηριστικά συνεπή με EMT αξιολογήθηκε από δύο παρατηρητές τυφλωμένο στις συνθήκες αγωγής. Εικόνες από κυτταρικές σειρές ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse TS100 ανεστραμμένο μικροσκόπιο και Pro-MicroScan κάμερα (Oplenic).

Αξιολόγηση της δραστηριότητας αφυδρογονάσης αλδεΰδης

Aldefluor υπόστρωμα (2,5 μΙ, Aldagen, Inc., Durham, NC) προστέθηκε σε 1 × 10

6 καρκινικών κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας 500 μΐ και επωάζονται για 60 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η επεξεργασία των κυττάρων με 5 μΐ του αναστολέα ΑΙ_ϋΗ διαιθυλαμινο-βενζαλδεϋδης (ϋΕΑΒ) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Οι φορείς λεντοϊών χωρίς φθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάλυσης FACS.

Σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού Σφαίρα πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε έξι φρεατίων ultralow πλάκες στερεώσεως (Corning Inc., Corning, ΝΥ) σε πυκνότητα 1000 κύτταρα /ml σε DMEM συμπληρωμένο με 1% συμπλήρωμα Ν2 (Gibco, Grand γη, ΝΥ), 2% Β27 συμπλήρωμα (Gibco, Grand Island, ΝΥ), 20 ng /ml ανθρώπινο αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (PeproTech, Rocky Hill, NJ) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO2. Σφαίρα καλλιέργειες πέρασαν μετά 7~10 ημέρες. Για σφαίρες πέρασμα, μέσα απομακρύνθηκαν και σφαίρες συλλέχθηκαν και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά σε 0,05% θρυψίνη (Solarbio, Beijing, Κίνα) και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο για την επαλήθευση διαστάσεως. Τα κύτταρα που λαμβάνονται από διαχωρισμό κοσκινίστηκαν μέσω ενός φίλτρου 40 μm και μετρήθηκαν με μετρητή χρησιμοποιώντας trypan μπλε χρωστική πριν επαναπόθεση.

δοκιμασία μαλακού άγαρ

Για να εκτιμηθεί κλωνογόνο δυναμικό, η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη ως εξής. Κάθε φρέαρ ενός τρυβλίου καλλιέργειας των έξι φρεατίων επικαλύφθηκε με 2 ml πυθμένα μίγμα άγαρ (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0,6% (w /v) άγαρ). Μετά το κάτω στρώμα στερεοποιήθηκε, 2 ml άγαρ κορυφής μέσου μίγμα (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0.3% (β /ο) άγαρ) που περιείχε 1 × 10

4 κύτταρα προστέθηκε, και οι δίσκοι επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 εβδομάδες. Οι πλάκες βάφτηκαν με 0,5 ml 0,005% κρυσταλλικού ιώδους για 1 ώρα και στη συνέχεια ένα ανατομικό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει τον αριθμό των αποικιών & gt?. 50 κύτταρα [15]

Transwell δοκιμασία εισβολής

Για την ανίχνευση εισβολής, χρησιμοποιήθηκε η 24-φρεατίων σύστημα πλάκα Transwell με μία μεμβράνη φίλτρο μεγέθους πόρου από πολυανθρακικό 8-μm (Corning Costar, Coming, ΝΥ). 1 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν στην κορυφή του θαλάμου επικαλυμμένα με Matrigel (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ). Ο κάτω θάλαμος περιείχε 10% FBS μέσο που περιέχει. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες και τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα από την Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, έπειτα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός σε τέσσερις τυχαία πεδία με τυφλό τρόπο.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση για έκφραση γονιδίου

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση, το ολικό RNA των κυττάρων εκχυλίζεται με χρήση του κιτ ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ισοδύναμες ποσότητες ολικού RNA (1 μg) με τυχαία εναρκτήρια μόρια σε μια 20 μΙ αντίστροφης μεταγραφάσης μίγμα της αντίδρασης (Promega, Madison, WI). Real-time PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν και αγοράστηκαν από Ruisai Inc (Shanghai, Κίνα) ως εξής:

σαλιγκάρι, προς τα εμπρός (5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 ‘)

και όπισθεν (5′ ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 ‘)?

Slug, προς τα εμπρός (5′-AGCGAACTGGACACACATAC-3′)

και να αντιστραφεί (5′-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 ‘)?

Twist 1 , προς τα εμπρός (5′-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ‘)

και να αντιστραφεί (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′)?

ZEB1, προς τα εμπρός (5′-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 ‘)

και να αντιστραφεί (5′-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 ‘)?

ZEB2, προς τα εμπρός (5′-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3′)

και όπισθεν (5′-CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 ‘) ?.

GAPDH, προς τα εμπρός (5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 ‘)

και όπισθεν (5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′)

Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 20 υΙ που περιέχει 1 μΐ από κάθε εκκινητή, 10 ul LightCycler FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) και 1 υΙ 1:10 αραιωμένου cDNA. Οι αντιδράσεις PCR παρασκευάστηκαν εις διπλούν και θερμαίνεται στους 95 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 ° C για 20 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 20 sec. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση

μέθοδος ΔΔCt. Η n-φορές αλλαγή στην έκφραση mRNA που προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο της 2-

ΔΔCT.

λεντοϊών μεσολάβηση RNAi των σαλιγκαριών

Η pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR διάνυσμα αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Διπλής έλικας Τα siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη σαλιγκάρι έχουν σχεδιαστεί από BLOCK-i T ™ RNAi Designer. Η στοχευμένη αλληλουχία 1 ήταν 5′-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 ‘? στοχευμένη αλληλουχία 2 ήταν 5’-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 ‘. Αμφότερες οι στοχευμένες αλληλουχίες επαληθεύτηκαν ως ειδικά για Σαλιγκάρι με Blast ψάχνοντας κατά του ανθρώπινου γονιδιώματος. Καθολική μη στόχευσης ελέγχου shRNA (αλληλουχίες: 5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ‘? 5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3’) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα siRNAs συντέθηκαν και κλωνοποιήθηκε σε pcDNA6.2-GW /EmGFP-Mir, στη συνέχεια μεταφέρθηκε στο πλασμίδιο έκφρασης λεντοϊού pLenti6 /V5-DEST με την τεχνολογία ανασυνδυασμού πύλη. Λεντοϊών παραγωγή έγινε με επιμόλυνση των κυττάρων 293 Τ με shRNA ή αρνητικό πλασμίδιο ελέγχου και συσκευασίας Mix (Invitrogen) παρουσία του αντιδραστηρίου POLOdeliverer ™ 3000 Επιμόλυνσης (Ruisai Inc, Σαγκάη, Κίνα). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και, στη συνέχεια, διηθούνται? οι ιικοί τίτλοι προσδιορίστηκαν κατόπιν με πραγματικού χρόνου PCR. Υποσυρρέοντα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό σε πολλαπλότητα μόλυνσης 50, παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich). Panc-1 κύτταρα με σταθερό σίγηση του γονιδίου Σαλιγκάρι επελέγησαν με 2 μg /ml του Blasticidin για 4 εβδομάδες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 1 μg /ml Blasticidin. Ένας άλλος αρνητικός έλεγχος shRNA πλασμίδιο (sc-108 060) από την Santa Cruz Biotechnology, το οποίο κωδικοποιεί ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία shRNA, χρησιμοποιήθηκε για παροδική διαμόλυνση σύμφωνα με το πρωτόκολλο.

Western ανάλυση κηλίδος

Για ολόκληρο κύτταρο εκχύλιση πρωτεΐνης, τα κύτταρα λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιέχει 1 mM PMSF και φυγοκεντρείται στα 14000 g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο που περιέχει την απομονωμένη πρωτεΐνη ποσοτικά με εμπορικά διαθέσιμο τροποποιημένη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). δείγματα Western blot πρωτείνης παρασκευάσθηκαν δια βρασμού απομονωθεί πρωτεϊνών με ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης του δείγματος. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBS και 0.1% Tween 20 για 1 ώρα και ανιχνεύθηκαν με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με το κατάλληλο συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερεύον αντίσωμα (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση ενός εμπορικά διαθέσιμο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) κιτ (Thermo Scientific). Για την επαλήθευση της ακρίβειας της φόρτωσης πρωτεΐνης που απομονώθηκε από ολόκληρο κυτταρικής λύσης, οι κηλίδες απογυμνώθηκαν, πλύθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα GAPDH (Bioworld) ως έλεγχος φόρτωσης. Εικόνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL Detection (Amersham, Arlington Heights, IL). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις κηλίδος Western ήταν ως ακολούθως: mAb κουνελιού αντι-σαλιγκάρι, mAb αντι-Ε-καδερίνης, mAb αντι-βιμεντίνη, mAb αντι-Bmi1, κουνέλι mAb αντι-Nanog, mAb αντι-Oct4, κουνέλι mAb αντι-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). Πυκνομετρία Western blots αναλύθηκε με χρήση λογισμικού Image J.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά, διαπερατά με 0,2% Triton Χ -100 για 10 λεπτά, και αποκλείστηκε σε 10% ορό κατσίκας σε PBS-0.2% Tween για 1 ώρα. Οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με Ε-καδερίνης αντίσωμα (BD Biosciences, 1:200 αραίωση) σε διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση των κυττάρων με PBS-0.2% Tween, επωάσαμε τα κύτταρα για 1 ώρα με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG Alexa 594 (αραίωση 1:1000? Invitrogen). Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Τα πλακίδια πλύθηκαν εκτεταμένα με PBS και στερεώθηκαν με Fluoromount-G. Τα δείγματα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού μικροσκόπιο.

In vivo ανάλυση της ανάπτυξης του όγκου

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και Χρήση των Zhejiang University School of Medicine (ZYXK2010-0149). Αιωρήματα μονών κυττάρων (2 χ 10

5 σε έναν συνολικό όγκο 100 μι 1/1 (ν /ν) PBS /Matrigel) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά και αριστερά midabdominal περιοχή αρσενικών γυμνών ποντικών /στέλεχος C (BALB ) ηλικίας 8 εβδομάδων. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά με δαγκάνες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αυτοψία σε 28 ημέρες μετά την εμφύτευση αξιολογήθηκε αύξησης κυττάρων και όγκων.

ανάλυση Ανοσοϊστοχημεία του ξενομοσχεύματος ιστού

Οι υποδόριοι όγκοι σχηματίζονται σε ποντικούς σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού και ενσωματωμένα σε παραφίνη. 4-μm πάχους τομές αποπαραφινώθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο, και ενυδατωμένο με διαβαθμισμένη σειρά από πλύσεις αιθανόλης. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με 10-λεπτών επώαση σε 3% Η

2O

2. Μετά την επώαση με διάλυμα αποκλεισμού για 30 λεπτά, οι τομές επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα από το BD Biosciences (αντι-σαλιγκάρι, 1:200 αραίωση? Αντι-Ε-καδερίνης, 1:200 αραίωση, και αντι-Oct4, 1:300 αραίωση) για 1 ώρα, ένα βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα για 20 λεπτά και στη συνέχεια με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη (HRP) για 10 λεπτά. Το αντίσωμα οπτικοποιήθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρωμογόνο, και οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με Η &? Ε

Στατιστική ανάλυση

Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίζονται με δοκιμασία t του Student για ανεξάρτητα δείγματα κατά περίπτωση με τη χρήση SPSS λογισμικού στατιστικής ανάλυσης (έκδοση 13.0) (SPSS Inc., Chicago, IL). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων υπολογίστηκαν σε P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Σαλιγκάρι έκφρασης και βλαστικών ΑΙ_ϋΗ δείκτη κυττάρων σε παγκρεατικά κυτταρικές σειρές

Κάτω από το μικροσκόπιο, BxPC-3 κύτταρα μορφολογικά επιθηλιακά στη φύση. Σε αντίθεση, τα κύτταρα Panc-1 αναμίχθηκαν πληθυσμούς επιθηλιακών κυττάρων και τύπου μεσεγχυματικών σχήματος ατράκτου (Σχήμα 1 Α). Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, κακώς-διαφοροποιημένη κυτταρική σειρά Panc-1 χαρακτηρίστηκε ως CSC

υψηλή κυττάρων με περισσότερους ΑΙ_ϋΗ

υψηλή πληθυσμού, ενώ καλά διαφοροποιημένο κυτταρική σειρά BxPC-3 ως CSC

χαμηλή κελί με λιγότερο ΑίϋΗ

υψηλή πληθυσμιακή (Σχήμα 1 Β). δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας αποκάλυψε επίσης ότι Panc-1 σχηματίζεται όλο και μεγαλύτερες σφαίρες από BxPC-3 είχε (Σχήμα 1 Α). Για να αποκτήσουν εικόνα για τον κρίσιμο ρόλο των ρυθμιστικών αρχών EMT, εξετάσαμε την βασική έκφραση σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, Twist1, ZEB1 και ZEB2 στο Panc-1 και BxPC-3. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αναλύσεις έδειξαν ότι Panc-1 κύτταρα είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του σαλιγκαριού και ZEB1 mRNA (περίπου 6 φορές και 4 φορές, αντίστοιχα, Ρ & lt? 0,01) σε σύγκριση με BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 1 ΝΤΟ). Υπήρχε μια συσχέτιση μεταξύ της κακής διαφοροποίησης, σαλιγκάρι και ZEB1 επίπεδα έκφρασης και την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε αυτούς τους δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Εμείς επιλέξαμε την κυτταρική σειρά Panc-1 για αργότερα σαλιγκάρι φίμωση πειράματα λόγω του σχετικά υψηλού επιπέδου έκφραση του σαλιγκαριού και την άριστη λεντοϊού αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Α. Μορφολογία Panc-1 και BxPC-3 κύτταρα και σφαίρες τους. Σημειώστε ότι τα κύτταρα Panc-1 έχει περισσότερο ατρακτοειδή πληθυσμούς μεσεγχυματικών και μπορούν να σχηματίσουν όλο και μεγαλύτερες σφαίρες. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με BxPC-3. δραστηριότητα Β ΑΙ_ϋΗ σε Panc-1 και κύτταρα BxPC-3. Dot οικόπεδα των κυττάρων που αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη δραστηριότητα ALDH. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπόστρωμα Aldefluor παρουσία ή απουσία αναστολέα ALDH ϋΕΑΒ. Μετά την κατεργασία, τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την παρουσία ΑΙ_ϋΗ

υψηλής κύτταρα. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσοι όροι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Γ πραγματικό χρόνο RT-PCR quantifing σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, Twist1, ZEB1, και η έκφραση ZEB2 mRNA σε Panc-1 και BxPC-3 κύτταρα. γραφήματα Bar δείχνουν την αναλογία του επιπέδου έκφρασης σε κύτταρα Panc-1 με αυτό στο BxPC-3 κύτταρα. ** P & lt?. 0.01

Η

σαλιγκάρι προκαλεί EMT-όπως αλλαγές σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Για να εξεταστεί ο ρόλος των σαλιγκαριών στην επαγωγή EMT και την παραγωγή CSC, θα παρήγαγε μια σταθερά σαλιγκάρι νοκ ντάουν Panc-1 κυτταρική γραμμή (Panc-1 /shSnail) με βραδέος διαμόλυνση.

Δύο ανεξάρτητοι σταθερό shSnail-κλώνους έκφρασης (S1, S2) και ένα σταθερό αρνητικό έλεγχο shRNA κλώνος (NC) αναλύθηκαν ως προς την έκφραση του mRNA σαλιγκάρι . S1 και S2 έδειξε μέχρι 80% ρύθμιση προς τα κάτω των επιπέδων σαλιγκάρι mRNA, ενώ ο κλώνος έλεγχος δεν παρουσιάζει καμία σημαντική μείωση στην Σαλιγκάρι mRNA (Σχήμα 2Α). Εμείς επιλέξαμε S1 κλώνο ως Panc-1 /shSnail για ακόλουθο πείραμα λόγω του υψηλότερου βαθμού της σαλιγκάρι σιγαστήρα. Εξόντωση σαλιγκάρι σε κύτταρα Panc-1 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 2Β και C). Κουνέλι mAb αντι-σαλιγκάρι ελέγχθηκε έναντι κυτταρολύματα από κυτταρικές σειρές Capan-1 Panc-1, MIA-PaCa2, BxPC-3, και. Το πρότυπο χρώσης ήταν παρόμοια με εκείνη της προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα (Εικόνα S1) [9], [16]. Για να αποκλειστεί η ετερογένεια που προκαλείται από σταθερή επιμόλυνση και το πρωτόκολλο επιλογής, χρησιμοποιήσαμε ένα άλλο αρνητικό μάρτυρα shRNA πλασμίδιο (SC-108060) για την παροδική επιμόλυνση. Real-time RT-PCR και στυπώματος Western αποκάλυψαν καμία σημαντική διαφορά της έκφρασης Σαλιγκάρι μεταξύ σταθερώς και παροδικά επιμολυσμένων κλώνων ελέγχου (Εικόνα S2).

A. έκφραση σαλιγκάρι mRNA σταθερών shSnail εκφράζουν (S1, S2) και αρνητικό μάρτυρα shRNA εκφράζουν (NC) Panc-1 κλώνων. Οι τιμές είναι οι μέσοι όροι και οι τυπικές αποκλίσεις των μετρήσεων εις τριπλούν. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το NC. Β Western blot που δείχνει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά δείκτες σαλιγκάρι, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, Ε-καδερίνης και βιμεντίνη σε κύτταρα Panc-1 επιμολυσμένα με φακοϊό μεσολάβηση αρνητικός έλεγχος shRNA (Panc-1 /NC) ή shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Γ ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης των σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-cadherin και βιμεντίνης σε Panc-1 /NC και Panc-1 κύτταρα /shSnail. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Μετά από λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό, τυφλωμένοι ερευνητές παρατηρούμενες διαφορές στην ακαθάριστη εμφάνιση των κυττάρων. Σταθερή μόλυνση των κυττάρων Panc-1 από shSnail αυξηθεί σημαντικά μεσοκυττάρια πρόσφυση και πλακόστρωτα-όπως το σχήμα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3Α). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την έκφραση και εντοπισμός του Ε-καδερίνης χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού. Σε σύγκριση με Panc-1 κύτταρα /NC, κύτταρα Panc-1 /shSnail είχαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης και μετεγκατάσταση του Ε-καδερίνης από το πυρηνικό διαμέρισμα σε κυτταρική μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα 3Β). Οι αλλαγές αυτές ήταν τυπικές των κυττάρων με ένα επιθηλιακό φαινότυπο, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα που υποβάλλονται σε μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) μετά σαλιγκάρι σίγηση. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η παρατήρηση, εκτιμήσαμε την έκφραση του μορίου προσκόλλησης επιθηλιακών Ε-καδερίνης, βιμεντίνη δείκτης κυττάρων μεσεγχυματικού και άλλα μεταγραφής EMT παράγοντες Slug, Twist1, ZEB1 και ZEB2 με κηλίδωση Western επί προϊόντων λύσης κυττάρου. Όπως αναμενόταν, μετά την φίμωση του σαλιγκαριού σε Panc-1, η έκφραση της Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε να αυξάνεται. Αντιστρόφως, μία μείωση στην έκφραση της βιμεντίνης και ZEB1 παρατηρήθηκε μετά σαλιγκάρι knockdown. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της πρωτεΐνης του Slug, Twist1 και ZEB2 (Σχήμα 2 Β, C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια σαφή σχέση μεταξύ των σαλιγκαριών και E-cadherin, και επίσης να προτείνει μια άμεση ή έμμεση αλληλεπίδραση μεταξύ σαλιγκάρι και ZEB1, οι οποίες κατέχουν τη δυνατότητα να καταστείλουν τη μεταγραφή E-cadherin.

Α. Μορφολογικές αλλοιώσεις των κυττάρων Panc-1 μετά από σαλιγκάρι αποσιώπηση δείχνουν μια αλλαγή στον τρόπο διεξαγωγής της κυτταρικής ανάπτυξης από μεσεγχυματικά προς ένα επιθηλιακό φαινότυπο. χρώση ανοσοφθορισμού Β για την έκφραση και την κυτταρική εντόπιση του Ε-καδερίνης σε σταθερούς κλώνους του Panc-1 /NC και Panc-1 /shSnail. Πυρηνικό DNA ανιχνεύθηκε με χρώση ϋΑΡΙ. Σταθερό Σαλιγκάρι knockdown οδηγεί σε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μετατόπιση του από τον πυρήνα στην μεμβράνη. Γ σαλιγκάρι αποσιώπηση αναστέλλει Panc-1 εισβολής σε δοκιμασίες εισβολής in vitro Matrigel. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με Panc-1 /NC. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

Σαλιγκάρι αυξάνει την ικανότητα των κυττάρων εισβολή σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Δεδομένου ότι οι διαδικασίες της ΕΜΤ έχουν συνδεθεί με κυτταρικό εισβολή, εμείς επόμενο ρώτησε αν η έκφραση σαλιγκάρι έχει κάποια επίδραση στην ικανότητα των κυττάρων εισβολή σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας την Matrigel σε δοκιμασία εισβολής vitro, βρήκαμε Panc-1 κύτταρα με Σαλιγκάρι σίγηση είχαν μειωθεί σημαντικά την ικανότητα για εισβολή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3 C). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η έκφραση Σαλιγκάρι ενισχύει την επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, και η αδρανοποίηση των σαλιγκάρι οδηγεί σε ΚΟΑ με λιγότερο επεμβατική χαρακτηριστικά.

σαλιγκάρι ενισχύει βλαστικών κυττάρων, όπως ακίνητα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Όπως σαλιγκάρι εκφράζεται έντονα στο CSC

υψηλή σε σύγκριση με CSC

χαμηλή κύτταρα, μπορούμε, συνεπώς, εξέτασε κατά πόσον σαλιγκάρι θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση της ΑΙ_ϋΗ δείκτη βλαστικών κυττάρων. Σαλιγκάρι σιγήσει κύτταρα Panc-1 έδειξαν μια σημαντική μείωση στο υψηλό πληθυσμό ΑΙ_ϋΗ

(1,60%) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (6,01%) (Σχήμα 4 Α). Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιούνται σε δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα vitro να εξετάσει κατά πόσον σαλιγκάρι συμμετέχει στην ανανέωση CSC κατά σειριακό πέρασμα. Δείξαμε ότι Σαλιγκάρι νοκ ντάουν επηρέασε όχι μόνο την αρχική διαμόρφωση των σφαιρών, αλλά και οδήγησε σε μια συνεχή μείωση του αριθμού σφαίρας στις επόμενες γενιές. δοκιμή σχηματισμός αποικίας έδειξε επίσης ότι σίγηση του σαλιγκαριού μπλοκάρει σημαντικά την ανάπτυξη αποικία Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 4 Β). Αυτά τα πειράματα εμπλέκουν ότι σαλιγκάρι έχει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του παγκρέατος περιεχομένου CSC και είναι αναγκαία για την αυτο-ανανέωση ικανότητας.

Α. Σαλιγκάρι σιγαστήρα μειώνεται ΑΙ_ϋΗ

υψηλή πληθυσμιακή σε κύτταρα Panc-1. Dot οικόπεδα των κυττάρων που αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη δραστηριότητα ALDH. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσοι όροι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Β Σαλιγκάρι φίμωση αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας με σειριακό πέρασμα και την ικανότητα της ικανότητας κλωνισμού σε κύτταρα Panc-1. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες της αποικίας φαίνεται παραπάνω διάγραμμα στήλης. Παρόμοια πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με Panc-1 /NC. ανάλυση κηλίδος Γ Western των κυτταρικών εκχυλισμάτων από Panc-1 /NC και τα κύτταρα Panc-1 /shSnail για Bmi1, Nanog, Sox2, και την έκφραση Oct4. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του Bmi1, Nanog, Sox2, και Oct4 στο Panc-1 /NC και Panc-1 κύτταρα /shSnail. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με Panc-1 /NC

Η

Σαλιγκάρι αυξάνει την έκφραση των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται παράγοντες μεταγραφής

Ως έκφραση σαλιγκάρι έχει κάποια σχέση με. περιεχόμενο CSC, χρησιμοποιήσαμε κηλίδωση Western για να προσδιορισθεί αν η έκφραση σαλιγκάρι έχει ρόλους σε μεταβαλλόμενες έκφραση Bmi1, Nanog, Sox2, και Oct4, τα οποία απαιτούνται για τη διατήρηση της πλειοδυναμία σε βλαστικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 Γ και Δ, λεντοϊού επιμόλυνση σαλιγκάρι shRNA προκάλεσε μία δραματική μείωση στην έκφραση του Sox2 και Oct4 (Ρ & lt? 0,05 και Ρ & lt? 0,01, αντίστοιχα) σε κύτταρα Panc-1, η οποία ήταν σύμφωνη με την απώλεια του CSC φαινότυπο, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση αυτών των παραγόντων μπορεί να είναι σημαντικό για σαλιγκάρι που προκαλείται σχηματισμός CSC σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

σαλιγκάρι ενισχύει παγκρεατικού ογκογονικότητα των καρκινικών κυττάρων in vivo

από in vitro μελέτες μας προτείνεται ότι σαλιγκάρι παίζει ένα ρυθμιστικό ρόλο σε παγκρεατικά εισβολή των καρκινικών κυττάρων και το σχηματισμό CSC, εμείς εμφυτεύονται υποδόρια ίσο αριθμό Panc-1 /NC και Panc-1 /shSnail στα γυμνά ποντίκια και μετράται το προκύπτον ανάπτυξη του όγκου. Όταν ενίεται 2 × 10

5 κύτταρα, Panc-1 /NC είχε σχηματισμό (8/8) όγκου 100%, ενώ μόνο το 2/8 ποντίκια ένεση με Panc-1 /shSnail έδειξε παγκρέατος εμφύτευση του όγκου. Επιπλέον, μια τάση στο σχηματισμό καθυστέρηση όγκου και μία μείωση στα μεγέθη των όγκων παρατηρήθηκαν σε όγκους που προέρχονται από Σαλιγκάρι αποσιώπηση κυττάρων σε σύγκριση με εκείνες από κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 5Α). Ανοσοϊστοχημεία των όγκων έδειξε μια ελαφρύτερη χρώση σαλιγκάρι και Oct4, ενώ μια ισχυρότερη χρώση μεμβράνη του Ε-καδερίνης σε όγκους Panc-1 /shSnail, σε σύγκριση με αυτές του Panc-1 /NC όγκοι (Σχήμα 5Β). Τα στοιχεία αυτά είναι σε συμφωνία με μας in vitro παρατηρήσεις και υποστηρίζουν το ρόλο των σαλιγκαριών στη διατήρηση του παγκρέατος διαμερίσματος CSC.

Α. Γραφική αναπαράσταση των ρυθμών αύξησης του υποδόριου ξενομοσχεύματος όγκων χρησιμοποιώντας κύτταρα Panc-1 /NC και Panc-1 /shSnail. 2 × 10

5 κάθε κυψέλης μεταμοσχεύθηκε σε οκτώ ποντικών ανά ομάδα. Όλα τα ποντίκια στην ομάδα Panc-1 /NC, ενώ μόνο 2 ποντίκια στην ομάδα Panc-1 /shSnail είχε σχηματισμό όγκου. Β Έκφραση των σαλιγκάρι, E-cadherin, και Oct4 σε όγκους ξενομοσχεύματος. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα σαλιγκάρι, E-cadherin, και την έκφραση Oct4 καθορίζεται με ανοσοϊστοχημεία. Έντονα θετική σαλιγκάρι έκφρασης είναι παρόν στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα των Panc-1 /NC όγκων (α), αλλά όχι σε όγκους Panc-1 /shSnail (β). Η έκφραση του Ε-καδερίνης είναι αδύναμα και ανομοιογενή στους όγκους Panc-1 /NC (γ), αλλά πιο εντατική στη μεμβράνη του Panc-1 /shSnail όγκους (δ). Χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης Oct4 είναι παρούσα στους όγκους Panc-1 /shSnail (στ), σε σύγκριση με εκείνη του Panc-1 /NC όγκοι (ε). Ράβδοι κλίμακας: 10 μm

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας δείχνει ότι Σαλιγκάρι η οποία σχετίζεται με EMT των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και πλειοδυναμία διατήρηση παράγοντες μεταγραφής. , διαμορφώνοντας την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και της ικανότητας κλωνισμού. Μαζί με την μελέτη εμφύτευση του όγκου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των σαλιγκάρι απαιτείται για τη διατήρηση της κυτταρικής σαν γνωρίσματα καρκινικά βλαστικά, η οποία επηρεάζει άμεσα την έναρξη του όγκου, την ανάπτυξη in vivo. Εχουμε καταδείξει πειστικά ότι η αναστολή του σαλιγκαριού θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια νέα στρατηγική για την ενίσχυση των βιολογικών αποτελεσμάτων των αντικαρκινικών και χημειοαποτρεπτικών παραγόντων.

Οι ερευνητές συνήθως προσδιορίζονται ΚΕΠ από καρκίνο του παγκρέατος με βάση την έκφραση των αντιγόνων κυτταρικής επιφάνειας όπως CD44 , CD24, επιθηλιακά-ειδικό αντιγόνο (ESA), και CD133 [17] – [20]. Υπάρχουν διαφορετικά συμπεράσματα σε ξεχωριστές μελέτες ως προς το ποια δείκτη καλύτερο εμπλουτίζει για παγκρέατος ΚΕΠ. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πληθυσμοί κυττάρων εμπλουτισμένο με υψηλή δραστικότητα ALDH μόνο είναι επαρκής για την αποτελεσματική όγκο έναρξη με ενισχυμένη ογκογόνο δυναμικό [21]. Στο πείραμά μας, νοκ ντάουν του κλειδιού EMT επαγωγέα Σαλιγκάρι μείωσε σημαντικά την ALDH

πληθυσμό υψηλού κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΕΜΤ προικίζει τα καρκινικά κύτταρα με ιδιότητες βλαστικών κυττάρων-παρόμοια. Τα αποτελέσματά μας είναι σύμφωνα με την έρευνα από Chen et al, το οποίο βρέθηκε ALDH

υψηλής κύτταρα στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνο πλακωδών έχοντας ΕΜΤ μετατόπιση και ενδογενώς συνεκφράζονται σαλιγκάρι. Περαιτέρω, η knockdown έκφρασης Σαλιγκάρι ελάττωσε σημαντικά την έκφραση του ΑΙ_ϋΗ, ανέστειλε καρκίνος ιδιότητες βλαστικών σαν [22]. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με σχηματισμό σφαίρα in vitro και καρκινικά εμφύτευση in vivo, όπου σαλιγκάρι knockdown οδήγησε σε λιγότερο και μικρότερα μεταμόσχευση. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με εκείνα της Μάνης και οι συνεργάτες του [4] που έδειξαν ότι ανάγκασε την έκφραση της EMT που σχετίζονται με μόρια όπως σαλιγκαριών και τα αποτελέσματα Twist σε κύτταρα με φαινότυπο του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. EMT προσφέρει έναν εναλλακτικό τρόπο για να δημιουργήσει τις ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων από διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Η υπόθεση της αποδιαφοροποίηση υποστηρίζεται από την περιέγραψε πρόσφατα γενιά των πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων από φαινομενικά τελικά διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα [23].

Είναι γενικά θεωρείται ότι Sox2 και Oct4 είναι το κλειδί ρυθμιστές της μεταγραφής των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ESC) αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία [24] – [26]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής της ΟΚΕ εκφράζεται από CSC-όπως τα κύτταρα σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Knockdown από αυτά τα γονίδια θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένη φαινότυπο CSC, μείωση των κλωνογόνων και ογκογόνο δυνατότητες των καρκινικών κυττάρων. [27] – [29]. Επίσης, είναι επαρκείς για να επαναπρογραμματίσει ανθρώπινα σωματικά κύτταρα να πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα που παρουσιάζουν τα ουσιώδη χαρακτηριστικά των ΟΚΕ [23]. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Sox2 και Oct4 ήταν μειωμένες σε Σαλιγκάρι-αποσιώπηση Panc-1 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτό υποδηλώνει ότι οι λειτουργίες σαλιγκάρι ως κύριος διακόπτης κατά τη διάρκεια ρύθμιση των πολυδύναμων δυνατότητες των βλαστικών κυττάρων. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε άλλες έρευνες, στις οποίες υψηλή έκφραση του Oct4 και Nanog προωθεί EMT, και σχετίζεται με αντοχή φαρμάκου, μετάσταση όγκου και κακή πρόγνωση σε διαφόρους ανθρώπινους malignances. [30], [31].