Αφηρημένο

Εξωσώματα είναι 30-150nM μεμβράνη-δεσμεύεται εκκρίνονται κυστίδια που είναι απομονώνεται εύκολα από βιολογικά υγρά όπως τα ούρα (UEs). Εξωσώματα περιέχουν πρωτεΐνες, micro RNA (miRNA), αγγελιοφόρο RNA (mRNA), και μακρύ μη-κωδικοποίησης RNA (lncRNA) από τα κύτταρα καταγωγής τους. Αν και miRNA, πρωτεΐνες και lncRNA έχουν απομονωθεί από τον ορό ως πιθανοί βιοδείκτες για καλοήθεις και κακοήθεις παθήσεις, είναι άγνωστο αν lncRNAs σε UEs από ουροθηλιακό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (UBC) οι ασθενείς μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες. lncRNAs είναι & gt? 200 νουκλεοτιδίων μακρύ μεταγραφές που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες και παίζουν κρίσιμους ρόλους στη βιολογία του όγκου. Καθώς ο αριθμός των αναγνωρισμένων lncRNAs σχετίζονται με όγκους συνεχίζει να αυξάνεται, υπάρχει μια παράλληλη ανάγκη να συμπεριληφθούν lncRNAs σε βιοδεικτών ανακάλυψη και θεραπευτικών αλγορίθμων στόχου. Η lncRNA ΗΟΧ μεταγραφής αντιπληροφοριακού RNA (Hotair) έχει αποδειχθεί ότι διευκολύνει την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου και σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε αρκετούς καρκίνους. Η σημασία του θερμού αέρα στη βιολογία του καρκίνου έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον για τη χρήση θερμού αέρα ως βιοδεικτών και πιθανό θεραπευτικό στόχο. Εδώ μπορούμε να δείξουμε Hotair και πολλά που σχετίζονται με όγκους lncRNAs είναι εμπλουτισμένα σε UEs από ασθενείς UBC με υψηλής ποιότητας μυ-διεισδυτικής νόσου (HGMI pT2-pT4). Νοκ ντάουν του θερμού αέρα σε κυτταρικές σειρές UBC μειώνει

in vitro

μετανάστευση και την εισβολή. Είναι σημαντικό ότι, η απώλεια της έκφρασης Hotair σε κυτταρικές σειρές UBC μεταβάλλει την έκφραση των επιθηλιακών-to-μεσέγχυμα γονίδια μετάβασης (EMT), συμπεριλαμβανομένων SNAI1, TWIST1, ZEB1, ZO1, ΜΜΡ1 LAMB3 και LAMC2. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε RNA αλληλουχίας για τον εντοπισμό τέσσερις επιπλέον lncRNAs εμπλουτισμένο σε UEs ασθενή UBC. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η UE-προέρχεται lncRNA μπορεί δυνητικά να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες και θεραπευτικών στόχων

Παράθεση:. Berrondo C, Λίνο J, Κουτσέροφ V, Siebert Α, Osinski Τ, Rosenberg A, et al. (2016) Έκφραση του Long μη-κωδικοποίησης RNA Hotair συσχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και περιέχεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης του ασθενούς ουροποιητικού Εξωσώματα. PLoS ONE 11 (1): e0147236. doi: 10.1371 /journal.pone.0147236

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 12 Οκτ 2015? Αποδεκτές: 30ης Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Berrondo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. CTSI στο Πανεπιστήμιο του Ρότσεστερ 5UL1TR000042-09

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

lncRNAs, είναι μεταγραφές που είναι 5 ‘7-μεθυλογουανοσίνη ανώτατο όριο και είτε πολυ-αδενυλιωμένες ή unadenylated και είναι & gt? 200 νουκλεοτιδίων καιρό. Μόλις θεωρείται γονιδιωματικής θόρυβο, lncRNA αποδεικνύονται να είναι σημαντικοί μεσολαβητές της κανονικής κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων, αναπτυξιακές αποτύπωση, την αποζημίωση της δοσολογίας, και την κυτταρική διαφοροποίηση, καθώς και λειτουργίες μέσα σε ώριμα κύτταρα, όπως ο έλεγχος της συνένωσης και τη ρύθμιση των ορμονών [1,2]. Δυσλειτουργία της έκφρασης lncRNA έχει δειχθεί ότι είναι σημαντική σε κακοήθεις διεργασίες όπως την εξέλιξη του όγκου [3-6].

Με την έλευση των μεταγραφικό κλίμακα RNA-αλληλούχιση (RNA-seq) η αποκάλυψη lncRNAs έχει αυξηθεί σημαντικά. Πρόσφατα, Iyer

et al

εφαρμοστεί

ab initio

συναρμολόγησης στο RNA-αλληλουχίας (RNA-επόμενα) βιβλιοθηκών από διάφορους όγκους να αποκαλύψει χιλιάδες γενεαλογίας και σχετίζονται με τον καρκίνο lncRNAs υπογραμμίζοντας τη σημασία της συμπερίληψης lncRNA σε βιοδεικτών και θεραπευτικών αλγορίθμων ανακάλυψη στόχος [7].

Μια εξαιρετική πηγή για την ανακάλυψη βιοδεικτών είναι εξωσώματα. Τα εξωσώματα είναι 30-150nM εκκρίνονται κυστίδια δεσμευμένη σε μεμβράνη που καθαρίζονται εύκολα από τα μέσα καλλιέργειας και βιολογικά υγρά συμπεριλαμβανομένου του ορού, υγρό ασκίτη και τα ούρα (UEs) [8-14]. Εξωσώματα συμμετέχουν στην ενδοκυτταρική επικοινωνία με την παράδοση των πρωτεϊνών, miRNA, mRNA, και lncRNA σε κύτταρα δέκτες [15,16].

Υπάρχουν αναδυόμενες αποδείξεις ότι η συσκευασία μεταγραφή σε εξωσώματα δεν είναι στοχαστική και μπορούν να βασίζονται σε μοτίβα υπογραφή και δευτεροβάθμια δομή. [17-20]. Επιπλέον, ογκογόνο σηματοδότηση όπως KRAS αποτελέσματα στην εκλεκτική συσκευασία των miRNA σε εξωσωμάτων, υποδεικνύοντας ότι ο κυτταρικός μετασχηματισμός μπορεί να δημιουργήσει μια ειδική για τον καρκίνο του προφίλ εξωσωμάτων που θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες [21].

Αξίζει να σημειωθεί ότι, ποσοτικές συγκρίσεις των παραγωγών κυττάρων έναντι εξωσώματα δείχνουν ότι εξωσώματα είναι εμφανώς φτωχό σε mRNA, αλλά εμπλουτισμένο σε lncRNA [18-20]. Επιπλέον, lncRNAs δείχνουν μεγαλύτερη ειδικότητα από mRNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ως βιοδείκτες του καρκίνου [22]. Δεδομένου lncRNA είναι εμπλουτισμένα σε εξωσώματα και ειδικότητα εμφανίζουν καρκίνο που είναι ελκυστικοί υποψήφιοι για την ανακάλυψη βιοδεικτών.

Αρκετές ομάδες έχουν δείξει ότι miRNA, mRNA και της πρωτεΐνης στον ορό προερχόμενο (SES) και των ουροφόρων εξωσώματα (UEs) μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για καλοήθεις και κακοήθεις ασθένεια [23-36]. Για παράδειγμα, έχουμε προηγουμένως ταυτοποιηθεί, επιδερμικό αυξητικό επαναλήψεις παράγοντα όπως και δισκοϊδίνη τομείς Ι-σαν 3 (EDIL-3) πρωτεΐνης σε εξωσώματα από ουροθηλιακό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (UBC) κυτταρικές σειρές και UEs που απομονώθηκαν από ασθενείς UBC με υψηλού βαθμού μυϊκή επεμβατικές όγκους (HGMI pT2-pT4) [34,37].

προστάτη και UBC συνδέονται lncRNAs έχουν απομονωθεί από ακυρώνεται κύτταρα ή ελεύθερη διακύμανση στα ούρα, και αρκετές ομάδες έχουν εντοπίσει lncRNA στην UE από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [28, 38,39]. Ωστόσο, δεν έχει δημοσιευθεί μελέτες έχουν καταδείξει ότι UBC UE προερχόμενο lncRNAs μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες [28,38,39]. Ένα πλεονέκτημα της χρήσης UEs είναι ότι η μεμβράνη εξωσωμάτων προστατεύει τα περιεχόμενα από πρωτεάσες και ΚΝΑσες, τα οποία είναι πανταχού παρούσα στα ούρα [40]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι όγκοι πρωτογενούς UBC περιέχουν μοναδικά lncRNA, ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να συλλάβει τέτοιες lncRNA σε UE των ασθενών με νόσο UBC HGMI [7]. Ένα σημαντικό μέλος της κατηγορίας του σχετιζόμενου με τον όγκο lncRNAs είναι Hotair, η οποία υπερεκφράζεται, από όσο 2000-πλάσια σε όγκους ασθενών με καρκίνο του μαστού σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό [3]. Hotair υπερέκφραση συνδέεται επίσης με αυξημένη διεισδυτικότητα και φτωχή πρόγνωση [3,41]. Σημαντικά, Hotair έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει διάφορα γονίδια που εμπλέκονται σε επιθηλιακά-to-μεσεγχύματος μετάβασης (ΕΜΤ), συμπεριλαμβανομένων Σαλιγκάρι δάκτυλο οικογένεια ψευδαργύρου 1 (SNAI1), λαμινίνη, βήτα 3 (LAMB3), λαμινίνη, γάμμα 2 (LAMC2), συνενώσεως μόριο προσκόλλησης 2 (JAM2) και ABL πρωτο-ογκογονίδιο 2 (ABL2) [3,42-44].

Η σημασία του θερμού αέρα στο UBC έχει αρχίσει να έρχονται στο φως μέσα από πολλές πρόσφατες μελέτες. Για παράδειγμα, Γιαν

et al

. έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του Hotair προβλέπει υψηλού βαθμού μη-μυϊκό επεμβατική UBC (NMIBC) επανάληψη [45]. Θα πραγματοποιηθεί, επίσης,

In vitro

μελέτες για να δείξει ότι Hotair εμπλέκεται στη μετανάστευση και την εισβολή και την καταστολή της κανονικής Wnt πρωτεΐνη ανταγωνιστής του μονοπατιού WIF-1 [45].

Martinez-Fernandez

et al

. διερευνηθεί το ενδεχόμενο ότι η έκφραση θερμού αέρα θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για επανεμφάνιση της νόσου σε NMIBC [46]. Απέδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης Hotair είχε επίσης νωρίτερα υποτροπή της νόσου. Επιπλέον, έδειξαν ότι Enhancer της Zeste 2 Polycomb Κατασταλτικά υπομονάδας Συγκρότημα 2 (ΕΖΗ2) ρυθμίζει την έκφραση του θερμού αέρα. Τέλος, θα χρησιμοποιείται ο καρκίνος Γονιδιωματική Atlas (TCGA) σύνολο δεδομένων για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης για να δείξει ότι η έκφραση θερμού αέρα συσχετίζεται με το στάδιο της UBC με τις πιο επεμβατικές όγκους Τ4 που έχουν το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης Hotair.

Σε μια άλλη μελέτη , Ηλιόλουστη

et al

. απέδειξαν ότι η miR-205 είναι σημαντική για την αναστολή του πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυτταρικών σειρών UBC. Εντόπισαν τον κυτταρικό κύκλο γονιδιακής ρύθμισης κυκλίνης J (CCNJ) ως ένα νέο στόχο για miR-205. Είναι σημαντικό, έδειξαν ότι Hotair συμμετέχει στην αποσιώπηση του miR-205 έκφρασης σε κύτταρα UBC μέσω επιγενετικής ρύθμισης [47].

Στο σύνολό τους αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν Hotair παίζει κρίσιμο ρόλο στην UBC. Δεδομένης της σημασίας του θερμού αέρα στην πρόοδο του όγκου, υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για τη χρήση θερμού αέρα ως βιοδείκτη, καθώς και ένα θεραπευτικό στόχο σε καρκίνους στο οποίο Hotair εκφράζεται μη φυσιολογικά [2,48,49]. Είναι σημαντικό, έχουν μια μη επεμβατική τρόπο για την ανίχνευση θερμού αέρα σε ασθενείς με καρκίνο, όπως UEs, θα ήταν ιδανικό για την ανάπτυξη βιοδείκτη [15,16,23].

Εδώ, έχουμε επεκτείνει το πεδίο εφαρμογής της συμμετοχής Hotair σε UBC βιολογία. Για παράδειγμα, έχουμε εντοπίσει πρόσθετους παράγοντες EMT που επηρεάζονται από την έκφραση του θερμού αέρα. Κριτικά δείχνουμε θερμού αέρα και άλλες lncRNA συμπεριλαμβανομένων των όγκων που σχετίζονται με lncRNAs Hoxa αντιπληροφοριακό σύμπλεγμα RNA 2 (HOX-AS-2), Antisense μη κωδικοποιητικού RNA στο

ΙΝΚ4

τόπου (ANRIL), μακρύ διαγονιδιακές RNA Ρυθμιστής της επαναπρογραμματισμός (LINC-RoR), υπερεκφράζονται σε κυτταρικές σειρές UBC και είναι εμπλουτισμένα σε εξωσώματα απομονώνονται από κυτταρικές σειρές UBC. Δείχνουμε επίσης ότι Hotair, HOX-AS-2, Μετάσταση που σχετίζονται με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα μεταγραφή 1 (MALAT1), και lincRoR υπερεκφράζονται σε όγκους και εμπλουτισμένο σε UEs από ασθενείς με νόσο του UBC HGMI (pT2-pT4 στην τελική παθολογία κυστεκτομή). Είναι σημαντικό, χρησιμοποιήσαμε RNA-επόμενα για τον εντοπισμό πρόσθετων και νέα lncRNAs εμπλουτισμένο σε UEs από ασθενείς με HGMI (pT2-pT4) UBC σε σύγκριση με υγιείς εθελοντές. Βρήκαμε τέσσερις τέτοιες lncRNAs? Μύλη mole συνδέονται και αποτυπώνεται κωδικοποίησης RNA 1 (HYMA1), Long διαγονιδιακές μη-πρωτεΐνης που κωδικοποιεί RNA 477 (LINC00477), LOC 100506688, Orthodenticle ομοιοκυτίου 2 αντιπληροφοριακό RNA 1 (OTX2-AS1)

Υλικά και Μέθοδοι μη-πρωτεΐνης

ασθενείς και εθελοντές

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Ερευνητικό Θέματα Review Board του Πανεπιστημίου του Rochester Medical Center (αριθμός έγκρισης RSRB IRB # 46706). Είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία ασθενείς που υποβλήθηκαν σε κυστεκτομή για τη νόσο του HG (τελική παθολογία κυστεκτομή pT2-pT4) συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες, και φυλάσσονται σε ασφαλή αρχεία σύμφωνα με τους κανονισμούς RSRB. Ερευνητικά δεδομένα κωδικοποιήθηκαν για να εξασφαλιστεί ότι τα άτομα δεν θα μπορούσε να προσδιοριστεί, άμεσα ή μέσω του συνδεδεμένου αναγνωριστικά, σύμφωνα με το Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των κανονισμών για την Προστασία των Ανθρωπίνων Θέματα (45 CFR 46.101 (β)). Θέμα αριθμούς αναγνώρισης ήταν επίσης εκ νέου κωδικοποιημένα για δημοσίευση. Συλλέξαμε τα ούρα, οι όγκοι, και άπω κανονικό ιστό (DNT) από τους ασθενείς. Ο ιστός ελήφθη από παθολογία σε φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) μπλοκ. Ιστός αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματίζονται για να προσδιοριστεί ιστού όγκου έδρανο και DNT (τουλάχιστον 3 cm μακριά από τον όγκο, όπως μετράται από έναν ανεξάρτητο παθολόγο). Οι εθελοντές ήταν υγιείς 18+ ετών χωρίς ιστορικό ουρολογικής νόσου.

RNA-αλληλουχίας και ανάλυση δεδομένων

ποσότητας RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop και την ποιότητα προσδιορίστηκε με Agilent Bioanalyzer, χρησιμοποιώντας η δοκιμασία Pico. RNA ελέγχου της ποιότητας, την προετοιμασία βιβλιοθήκη και αλληλούχιση πραγματοποιήθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Rochester Genomics Research Center (GRC) με τη χρήση ριβο-εξαντλημένο βιβλιοθήκες cDNA που παράγεται από το κιτ TruSeq RNA V2 (Illumina). cDNA ήταν κατακερματισμένη, γραμμικό κώδικα με Illumina κατασκευάζονται προσαρμογείς, και ενισχύθηκε με PCR. Illumina HiSeq2500 χρησιμοποιήθηκε για υψηλής απόδοσης RNA-αλληλουχίας. Είκοσι εκατομμύρια 125 bp ζεύγος έληξε διαβάζει /δείγμα ελήφθησαν

Για την επεξεργασία των δεδομένων NSG.? πρώτων 125 bp διαβάζει ήταν de-mutiplexed. Χαμηλή πολυπλοκότητα διαβάζει και μόλυνση φορέα αφαιρέθηκαν. Η εργαλειοθήκη FASTX (fast_quality_trimmer) χρησιμοποιήθηκε για να απομακρυνθούν οι βάσεις με τα αποτελέσματα της ποιότητας κάτω από Q = 13 και ευθυγραμμισμένο με το ανθρώπινο γονιδίωμα έκδοση συναρμολόγηση hg19 /GRCh37 χρησιμοποιώντας Burrows-Wheeler Aligner με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Διαβάστε μετράει παρήχθησαν με HTSeq και μανικετόκουμπα /ΤΟΡΗΑΤ C χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης [50]

τηλέφωνα Γραμμές

π.Χ. κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται:. SV-HUC, 5637, TCC-SUP, T24 , UMUC3, ΗΤ1376, J82, και RT4, που λαμβάνεται από την ATCC. ΗΕΚ293 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ιική συσκευασία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κατάλληλα μέσα και σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC. UBC ταυτότητα κυτταρική γραμμή γενετικά επικυρωθεί από DDC Ιατρική

shHOTAIR και shScramble σταθεροί κλώνοι

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια:. PSPAX2, pMD2G, και GFP που εκφράζουν shRNA Hotair (shHOTAIR) ή Scramble ελέγχου (shScramble) κατασκευάσματα φορέα λεντοϊού, η οποία ήταν πλούσια δώρα από την Συστήματα BioScience (Mountain View, CA). TCC-SUP και τα κύτταρα Τ24 μολύνθηκαν με shHOTAIR ή shScramble φακοϊό και επιλέγονται από πουρομυκίνη (2 μg /ml) και FACs ταξινομημένο. Εξόντωση Hotair επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR.

siRNA

κύτταρα Τ24 επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε συγκέντρωση 6×10

4 κύτταρα /φρεάτιο, και επωάζονται όλη τη νύκτα. Η επώαση και επιμόλυνση του siRNA με χρήση αντιδραστηρίου DharmaFECT 1 (GE Life Sciences, Dharmacon) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, για κάθε φρεάτιο, χρησιμοποιήθηκαν 2,5 μΙ 5μΜ siRNA και 1.37μL των DharmaFECT 1 αντιδραστηρίου (GE Επιστημών Ζωής Dharmacon). Το siRNA που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως δημοσιευθεί: siHOTAIR (siRNA-1 UAACAAGACCAGAGAGCUGUU? SiRNA-2 CCACAUGAACGCCCAGAGAUU)? και τον έλεγχο siGFP (CUACAACAGCCACAACGUCdTdT.) ελήφθη από την GE Life Sciences Dharmacon [51].

εξωσωμάτων Προετοιμασία και Παρακολούθηση Ανάλυση

εξωσωμάτων που παράγουν κυτταρικές σειρές TCC-SUP και Τ24 αναπτύχθηκαν σε Bioflasks ως σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (κυτταρική οικογένεια 1000AD) στο κατάλληλο μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% εξωσωμάτων χωρίς FBS (EF-FBS). EF-FBS παρασκευάστηκε με υπερφυγοκέντρηση στα 100.000 χ g στους 4 ° C για 18 ώρες.

Εξωσώματα συλλέχθηκαν με σειριακή φυγοκέντρηση και υπερφυγοκέντρηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34,52]. πρωτεΐνη εξωσωμάτων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ microBCA (Pierce) και η ανάλυση των σωματιδίων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα χαρακτηρισμού νανοσωματιδίων LM10 (NanoSight) εφοδιασμένο με το μπλε λέιζερ 488.

επούλωση της πληγής, Trans-well και 3D εισβολή Δοκιμασίες

Μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της μετανάστευσης [53]. Τα τραύματα μετρήθηκαν σε χρόνο μηδέν, μόλις μετά καθιστώντας το τραύμα και τέσσερα αργότερα. Το κλείσιμο της πληγής μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Ένας προσδιορισμός trans-φρεατίων χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό εισβολής όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τροποποιήσεις [54]. 1 × 10

5 κύτταρα σε βασικό μέσο προστέθηκαν σε 8um πόρου ένθετα trans-φρεατίων (Corning Inc.) προ-επικαλυμμένες με μειωμένη αυξητικό παράγοντα Cultrex (Trevigen Inc). Ένθετα συλλέχθηκαν, σταθερό, και βάφονται με 1% μπλε τολουϊδίνης, φωτογραφήθηκε, και το συνολικό εμβαδόν του μπλε-χρωματισμένο κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δυνατότητα ανάλυσης σωματιδίων του λογισμικού ImageJ.

Για την ανάλυση 3D εισβολή, 1325 κύτταρα /190 ul σπάρθηκαν σε 3D mictrotissue

® πλάκες (Sigma) κατά την ημέρα 0 [55,56]. Μετά το σχηματισμό σφαιροειδές, το μέσο αντικαταστάθηκε με εκχύλισμα βασικής μεμβράνης (BME) (Cultrex). Σφαιροειδές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Progres

® CapturePro 2.7.7 (Jenoptik) είδαν με Axio παρατηρητή Α1 μικροσκόπιο (Zeiss). Εισβολή μετρήθηκε ως το μήκος και ο αριθμός των προεξοχών εντός του μέσου χρησιμοποιώντας ImageJ.

Western Blotting Ανάλυση

Για Western 20ug κηλίδωση του εξωσωμάτων ή κυτταρικό λύμα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με 10% SDS PAGE. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ microBCA (Pierce) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Alix (3A9) (Cell Signaling Technology, Cat # 2171, 1: 1000 αραίωση), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Cat # SC-32233, αραίωση 1: 200), σαλιγκάρι (C15D3) (Cell Signaling Technology, Cat # 3879, 1: 1000 αραίωση), ZEB1 (Η-102) (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, αραίωση 1: 200), και β-τουμπουλίνης (Cell Signaling Technology, Cat # 2128, αραίωση 1: 1000). Αντι-Κουνελιού IgG-υπεροξειδάση αρμορακίας, αντι-κατσίκα IgG-υπεροξειδάση αρμορακίας και IgG αντι-ποντικού-υπεροξειδάσης αρμορακίας χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology). Χημειοφωταύγειας ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Super Signal West Femto μέγιστη ευαισθησία Υπόστρωμα (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. λήψη εικόνας εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης ChemiDoc (Bio-Rad).

ανοσοφθορισμού

Για ανοσοφθορισμό των κυττάρων shHOTAIR και shScramble TCC-SUP, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και μπλοκάρει στο 0,5% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBST (0,3% Triton Χ-100 σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ZEB1 (H-102) αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25388, 1:50 αραίωση σε PBST) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, κατόπιν επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα αίγας αντι- Κουνέλι IgG (H + L) Alexa Fluor

® 594 σύζευξης για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (Thermo Scientific # Καταλόγου: Α 11012-1: 200 αραίωση σε PBST). Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, χρωματισμένο κύτταρα τοποθετούνται σε Vectashield HardSet αντιξεθωριάσματος Τοποθέτηση Μεσαίο με DAPI. ICC απεικόνισης:

Τα κύτταρα βάφονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία ταυτόχρονα. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα FV1000 Ολύμπου σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο με 20x στόχο την URSMD Φως Μικροσκοπίας κοινόχρηστο πόρο. Ρυθμίσεις λέιζερ και η τάση ρυθμίστηκαν έτσι ώστε τα επίπεδα έντασης του DAPI και Alexa 594 έκφρασης ήταν μέσα στην γραμμική περιοχή για τα όλες οι εικόνες και οι ρυθμίσεις παραμένουν οι ίδιες για όλες τις εικόνες. Αποκτήστε και την αντιστάθμιση προσαρμόστηκαν για την αρχική εικόνα ελέγχου και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για όλες τις εικόνες. Χρησιμοποιήθηκαν Μια αναλογία διαστάσεων 1024 x 1024 και ένα μέσου όρου Kalman 2. Όλες οι ρυθμίσεις ήταν ταυτόσημες για όλους τους τέσσερις ομάδες. Τα σχέδια που δημοσιεύονται σε αυτό το χειρόγραφο έχουν αναπαραχθεί σε δύο ξεχωριστά πειράματα και τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν την επαναλήψιμη αποτέλεσμα των θεραπειών και χρώση για αυτές τις πρωτεΐνες.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

5υΙ προετοιμασίας εξωσωμάτων τοποθετήθηκε στην 200 mesh πλέγματα χαλκού επικαλυμμένα με Formvar /άνθρακα και επωάζεται 1-2 λεπτά. Πλέγματα βάφτηκαν με 20 υΙ 2.0% φωσφοβολφραμικό οξύ (ρΗ 6,5) και αφέθηκε να στεγνώσει. Μια Hitachi 7650 Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο στα 80kV χρησιμοποιήθηκε για να δείτε δείγματα. Εκπρόσωπος ηλεκτρονικές μικρογραφίες συνελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Gatan Erlangshen 11 megapixel ψηφιακή φωτογραφική μηχανή.

προετοιμασία RNA

Τα ούρα συλλέχθηκαν από ασθενείς HG στο χειρουργείο μετά την επαγωγή της γενικής αναισθησίας. Ούρων συλλέχθηκαν από υγιείς εθελοντές σε εξωτερικά ιατρεία. Τα ούρα υπέστη επεξεργασία αμέσως για την απομάκρυνση των κυτταρικών τρίμματα και μεγάλο εξωκυτταρικό κυστίδια με σειριακή χαμηλής ταχύτητας και φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας [40]. Τα ούρα μετά μεταφέρονται σε δείγματα 40ml και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C έως ότου καθοριστεί η τελική παθολογία.

Μόνο δείγματα από ασθενείς οι οποίοι είχαν τελική παθολογία κυστεκτομή όγκου ρΤ2-pT4 υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία για RNA χρησιμοποιώντας τα ούρα εξωσωμάτων RNA κιτ απομόνωσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Norgen). RNA υποβλήθηκε αμέσως μετά την απομόνωση για RNA-αλληλουχίας. Το υπόλοιπο RNA φυλάχθηκε στους -80 ° C μέχρι τα δεδομένα RNA-αλληλούχιση διατέθηκε και το RNA που απαιτούνται για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων RNA-αλληλούχιση.

Η γραμμή κυττάρων εξωσωμάτων RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Thermo Fisher Scientific) ως σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η γραμμή κυττάρων RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το Rneasy μίνι συν κιτ (Qiagen) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ο ιστός RNA απομονώθηκε με κιτ RNeasy FFPE (Qiagen) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Σε όλες τις περιπτώσεις, το RNA παρασκευάστηκε και αμέσως χρησιμοποιούνται για την παραγωγή cDNA και μεταγενέστερη qRT-PCR.

cDNA παρήχθη με το κιτ σύνθεσης Bio-Rad iScript cDNA. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με Bio-Rad SYBR πράσινο και Bio-Rad CFX96 συστήματος σε πραγματικό χρόνο. Σώμα διατηρώντας τα γονίδια που περιλαμβάνονται GAPDH και 18S, τα οποία συσκευάζονται σε εξωσώματα [57]. Το πρόγραμμα Normfinder χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορισθεί το κατάλληλο γονίδιο οικοκυρική για εξομάλυνση των δεδομένων qRT-PCR. Με βάση την αξιολόγηση των β-ακτίνη, GAPDH και 18S, η ανάλυση επιλέγεται είτε GAPDH ή 18S. Το επιλεγμένο γονίδιο καθαριότητας τεκμηριώνεται σε κάθε μύθο σχήμα [58]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Αποτελέσματα

κυτταρικές σειρές UBC περιέχει mRNA που σχετίζονται με όγκους και lncRNA

Για να εντοπίσει στόχο lncRNA για ανάλυση σε UBC σε έλεγχο επιλεγμένων μας lncRNAs και mRNAs εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου σε άλλους επιθηλιακούς όγκους. Εμείς επιλέξαμε πέντε lncRNAs (Hotair, Hoxa-AS-2, lincRNA-ROR, MALAT1, και ANRIL) και τρεις mRNA ομοιοκυτίου Α13 (HOXA13), SRY-box 2 (SOX2) και της κατηγορίας POU 5 ομοιοκυτίου 1 (POU5F1 /Oct4) εμπλέκονται σε ένα εύρος καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων UBC.

για παράδειγμα, Hoxa-AS-2 έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την απόπτωση σε προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας κύτταρα [59]. Η lincRNA-RoR δείχθηκε ότι επάγει EMT σε μαστού και το ηπατοκυτταρικό καρκίνων [60]. Αξίζει να σημειωθεί ότι Hotair δείχθηκε να συσκευαστεί σε εξωσώματα και επηρεάζουν έτσι χημειοευαισθησία και επιβίωση κάτω από συνθήκες υποξίας σε κύτταρα δέκτες [16].

MALAT1 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα προγνωστικός δείκτης της μετάστασης σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων UBC [61 , 62]. ANRIL αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μειώνει την απόπτωση σε κύτταρα UBC [63]. Ενώ HOXA13 αυξάνει τόσο τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή, καθώς επίσης και αναστέλλει την απόπτωση σε γλοιοβλαστώματος πολύμορφη κύτταρα [64]. Το παράγοντες μεταγραφής SOX2 και Oct4 κανονικά οδηγούν την πλειοδυναμία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, αλλά τώρα έχουν ενοχοποιηθεί για τη διατήρηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να χρησιμεύσουν ως ογκογενή κύτταρα για ένα μεγάλο αριθμό όγκων [65].

σύγκριση με το επίπεδο έκφρασης αυτών των επιλεγμένων lncRNA και mRNA στον έλεγχο SV-40 αθανατοποιημένη μη ογκογόνων urothelial κυτταρική γραμμή SV-HUC βρήκαμε αυξημένη έκφραση του θερμού αέρα, Hoxa-AS-2, ANRIL, και HOXA13 σε κύτταρα Τ24 UBC . Ενώ στην κυτταρική σειρά TCC-SUP UBC βρήκαμε Hotair, HOX-AS-2, LINC-RoR, ANRIL και HOXA13 ήταν αυξημένα (Σχήμα 1Α και 1Β, αντίστοιχα).

qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε λύματα κυττάρων από μια σειρά κυτταρικών γραμμών UBC και τον έλεγχο SV-40 αθανατοποιημένη κυτταρική γραμμή urothelial SV-HUC. Το επίπεδο της έκφρασης του mRNA και lncRNA ήταν η πρώτη ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH και πολλαπλή μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές επιμέρους UBC συγκρίθηκε με τα κύτταρα SV-HUC ελέγχου. λύματα (Α) Τ24 κυττάρων (Β) λύματα κυττάρων TCC-SUP. (C) qRT-PCR του θερμού αέρα σε κυτταρικές σειρές UBC κανονικοποιούνται σε επίπεδα μεταγραφής κυτταρική σειρά SV-HUC. (Η = 3 πειράματα). t-tests του Student χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα για τον προσδιορισμό στατιστική σημασία στην έκφραση μεταξύ UBC και ελέγχου SV-HUC κύτταρα (Σχ 1Α-1C) * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.001, *** ρ & lt?. 0.0001

Λόγω της σημασίας του θερμού αέρα στην πρόοδο του όγκου αξιολογήσαμε την έκφραση του αριθμού των κυτταρικών σειρών UBC κυμαίνονται από Grade II στο βαθμό IV. Βρήκαμε ότι κυτταρικές σειρές UBC έχουν ένα ευρύ φάσμα της έκφρασης Hotair με TCC-SUP (Βαθμός IV) που έχει την υψηλότερη και T24 (Grade III) ένα ενδιάμεσο επίπεδο έκφρασης (Σχήμα 1 C). Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν δημοσίευσε πρόσφατα τις παρατηρήσεις της το ευρύ φάσμα της έκφρασης Hotair σε κυτταρικές σειρές UBC [66]. Δεδομένου ότι Τ24 εκφράζεται ενδιάμεσα επίπεδα και TCC-SUP εκφράζεται σχετικά υψηλότερα επίπεδα του θερμού αέρα σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές UBC (Εικ 1C), επιλέξαμε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές για την αξιολόγηση των λειτουργικών ρόλων των Hotair σε UBC.

Hotair επηρεάζει τη μετανάστευση UBC κυττάρων και εισβολή

in vitro

η

θερμού αέρα έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τη μετανάστευση και την εισβολή του μαστού, του στομάχου, του οισοφάγου και του παχέος εντέρου [3,51,67,68]. Για να αποδείξει ότι Hotair έχει λειτουργικό ρόλο στην UBC, δημιουργήσαμε την πρώτη νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές Hotair με shRNA έναντι Hotair σε Τ24 και τα κύτταρα TCC-SUP. (S1 Α και S1B σχήμα, αντίστοιχα). Εξόντωση Hotair σε κυτταρικές γραμμές UBC T24 και TCC-SUP οδηγούν σε μειωμένη μετανάστευση σε μια πρότυπη δοκιμασία γρατσουνιά-πληγής (Σχ 2Α και 2Β, αντίστοιχα).

Απόσταση μετανάστευσης μετρήθηκε εξής γρατσουνιά-πληγή δοκιμασία λεντοικής shRNA νοκ ντάουν του θερμού αέρα έναντι του ελέγχου shScramble (Α) Τ24 και (Β) κυτταρικές σειρές TCC-SUP UBC. δοκιμασίας Trans-well εισβολή του shHOTAIR έναντι του ελέγχου shScramble (C) Τ24 και (D). κυτταρικές σειρές TCC-SUP (Ε) δοκιμασία εισβολής 3-D σύγκριση shScramble ελέγχου κύτταρα TCC-SUP στα κύτταρα shHOTAIR TCC-SUP. Τα κύτταρα εμβολιάζονται σε microtissue

® παράγονται πηκτώματα άχνη και αφέθηκαν να σχηματίσουν σφαιροειδή. Μετά σχηματίζονται σφαιροειδή, ΒΜΕ ήπια επιστρώνεται πάνω από την γέλη άχνη. Τα σκούρα κυκλική σφαιροειδή εμφανίζονται και βέλη δείχνουν προς τις προβλέψεις της εισβολής κυττάρων στον περιβάλλοντα BME. F. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, τα μήκη προεξοχή μετρήθηκαν από σφαιροειδές επιφάνεια στο απώτατο άκρο χρησιμοποιώντας ImageJ και τη μέση διάρκεια της προβολής προσδιορίζεται για κάθε κυτταρικό τύπο. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε κάθε πείραμα παρουσιάζονται (AF) * ρ & lt? 0.1, ** ρ & lt? 0,05, *** ρ & lt?. 0.01 (n = 3-6 πειράματα /panel)

εισβολή ερευνήθηκε από τα δύο συστήματα προσδιορισμού trans-καλά και 3-D (microtissues

®). Σε 3-D κύτταρα καλλιέργειας καρκινικών σχηματίζονται αυθόρμητα σφαιροειδή. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι τα κύτταρα καλλιεργούνται ως σφαιροειδή 3-D μεγιστοποιηθεί κύτταρο-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεων και μιμούνται στενότερα ενδογενή συμπεριφορά των ιστών [55,56]. κύτταρα νοκ ντάουν Hotair ήταν λιγότερο επεμβατική τόσο trans-καλά (Σχήμα 2C και 2D) και αναλύσεις 3-D (Σχήμα 2Ε και 2F).

θερμού αέρα επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου μετάβαση επιθηλιακών-to-μεσέγχυμα

EMT πιστεύεται ότι είναι ένα ουσιαστικό ογκογόνο μετάβασης όπως τα καρκινικά κύτταρα διασπώνται από τα φύλλα του επιθηλίου και να εισβάλουν σε περιβάλλοντες ιστούς. Hotair έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τόσο την ενεργοποίηση και καταστολή των γονιδίων οδού που διαμεσολαβούν πολλές EMT σε διάφορα επιθηλιακά καρκίνους [3,69,70]. Οι EMT γονίδια έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την εισβολή όγκου σε

in vitro

δοκιμασίες όπως η δοκιμασία trans-φρεατίων και

in vivo

κατά την εισβολή του όγκου σε κάθε όγκο που εξετάστηκαν [71,72].

αναμένεται ότι η μειωμένη μετανάστευση και εισβολή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα knockdown UBC Hotair φαίνεται στο Σχ 2Α-2F οφειλόταν στις επιδράσεις των Hotair επί EMT γονιδιακή έκφραση. Hotair έχει αποδειχθεί τόσο την πρόκληση και να καταστείλουν πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην EMT συμπεριλαμβανομένων SNAI1, LAMC2, LAMB3, ABL2, JAM2, PCDHB5 και PCDHB10 [3]. Ωστόσο, Hotair δεν ρυθμίζει αυτά τα γονίδια σε κάθε τύπο όγκου [48].

Για την αντιμετώπιση της σχέσης /EMT οδού Hotair στο UBC, χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR για την αξιολόγηση των γονιδίων-στόχων Hotair προηγουμένως εντοπιστεί εκτός από αρκετές άλλους παράγοντες EMT στην shScramble κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές shHOTAIR UBC.

Σχήμα 3Α και 3Β δείχνει ότι κυτταρικές σειρές τόσο shHOTAIR Τ24 και shHOTAIR TCC-SUP είχαν μειωμένη έκφραση του SNAI1, έναν κύριο ρυθμιστή της EMT, καθώς και ως EMT γονίδια οδού LAMB3 και LAMBC2 mRNA σε σύγκριση με shScramble ελέγχους. Ωστόσο, δεν βρήκαμε ότι Hotair νοκ ντάουν επηρεάζονται έκφραση JAM2, ABL2, PCDHB5 ή PCDHB 10 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, ελέγξαμε το βασικό επίπεδο έκφρασης αυτών των γνωστών στόχων Hotair σε T24 και TCC-SUP κυττάρων (S2 Εικ). Αν και οι προηγουμένως εντοπιστεί στόχοι Hotair εκφράστηκαν τόσο T24 και TCC-SUP, η έκφρασή τους δεν επηρεάστηκε από την απώλεια του θερμού αέρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) qRT-PCR γνωστών γονιδίων στόχων Hotair και κλασική EMT παράγοντες mRNA σε shHOTAIR Τ24 σε σύγκριση με τα κύτταρα shScramble Τ24 UBC. έκφραση mRNA (Β) του γονιδίου-στόχου σε κύτταρα ΕΜΤ shHOTAIR TCC-SUP σύγκριση με τα κύτταρα shScramble TCC-SUP (σε πλαίσια Α και Β τα επίπεδα mRNA EMT ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH). (C) siRNA που στοχεύουν ενάντια θερμού αέρα ή GFP χρησιμοποιήθηκε στα κύτταρα Τ24 και EMT παράγοντες ZEB1 και SNAI1 mRNA έκφραση αξιολογούνται από qRT-PCR (mRNA ομαλοποιήθηκε με 18s). (D) Ανοσοστύπωμα T24 siGFP και κύτταρα siHOTAIR που δείχνουν μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης των ZEB1 και SNAI1. GAPDH είναι ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του ελέγχου και των κυττάρων knockdown Hotair στις qRT-PCR πειραμάτων παρουσιάζονται (AC) * ρ & lt? 0.1, ** ρ & lt? 0,05, *** ρ & lt? 0,01 (πειράματα n = 3-6 /πίνακα).

η

Είναι σημαντικό, η έκφραση των δύο άλλων κλασικών δεικτών της EMT, ψευδαργύρου-δακτύλου δεσμευτική E-box ομοιοκυτίου 1 (ZEB1), και η οικογένειά Twist παράγοντα μεταγραφής bHLH 1 (TWIST1) μειώθηκαν στην shHOTAIR knockdown κυτταρικές γραμμές UBC (Εικ 3Α και 3Β).

Η έκφραση της Ε-καδερίνης (Cdh1) και βιμεντίνης (VIM) mRNA εκτιμήθηκε σε κυτταρικές γραμμές shScramble και shHOTAIR T24 και TCC-SUP. Τόσο Cdh1 και VIM mRNA εκφράστηκαν σε εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα και παρέμειναν αμετάβλητες μεταξύ των κυτταρικών σειρών shScramble και shHOTAIR υποδεικνύοντας ότι Hotair πιθανότατα δεν μεσολαβούν διεισδυτικότητα γραμμή UBC κύτταρο μέσω μεταβολών σε αυτά τα δύο παίκτες EMT (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με παλαιότερα δημοσιευμένες εκθέσεις δείχνουν ότι Cdh1 και VIM είναι ελάχιστα εκφράζονται σε Τ24 και TCC-SUP [73,74].

Είναι ενδιαφέρον, Matrix μεταλλοπεπτιδάση 1 (ΜΜΡ1) η έκφραση του mRNA μειώθηκε σε shHOTAIR TCC- κύτταρα SUP UBC (σχήμα 3Β). ΜΜΡ-1 πρωτεΐνη διασπά διάμεσης κολλαγόνα στην εξωκυτταρική μήτρα, διευκολύνοντας έτσι την εισβολή του όγκου [75]. Αντίθετα, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης σφιχτό κόμβο 1 (TJP1 /ZO1) mRNA σε κύτταρα shHOTAIR TCC-SUP UBC σε σύγκριση με shScramble κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Β). ΖΟ-1 πρωτεΐνη διατηρεί ενδοκυτταρικών στεγανών συνδέσεων απαραίτητη για επιθηλιακό ακεραιότητα φύλλου [76]. Η συσχέτιση της απώλειας Hotair με αυξημένη έκφραση του ZO1 υποδηλώνει ότι τα κύτταρα shHOTAIR TCC-SUP επιστροφή σε μια πιο επιθηλιακό φαινότυπο. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Hotair μπορεί να παίζει ρόλο στην καταστολή μερικά γονίδια που σχετίζονται με επιθηλιακά κύτταρα σε TCC-SUP.

Για να υποστηρίζουν τα αποτελέσματα των δεδομένων knockdown shHOTAIR έχουμε χρησιμοποιήσει προηγουμένως δημοσιευθεί siRNA που κατευθύνεται έναντι Hotair να δημιουργήσει siHOTAIR νοκ ντάουν κύτταρα Τ24 UBC [51] (S3 Εικ). Δεδομένου ότι η έκφραση του SNAI1 και ZEB1 mRNA και οι δύο επηρεάζονται από Hotair knockdown σε Τ24 και κύτταρα TCC-SUP UBC (σχήμα 3Α και 3Β, αντιστοίχως), αξιολογήσαμε το mRNA (Σχήμα 3C) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 3D) του SNA1 και ZEB1 στα κύτταρα siGFP και siHOTAIR Τ24. Και τα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης SNA1 και ZEB1 μειώθηκαν σε siHOTAIR κύτταρα knockdown Τ24 (Σχήμα 3D). Συνολικά, τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν τη συσχέτιση μεταξύ απώλειας έκφρασης θερμού αέρα με μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή και την έκφραση του παράγοντα EMT σε κυτταρικές σειρές UBC.

Τα HGMI (pT2-pT4) UBC όγκους εμπλουτισμένο σε όγκο που σχετίζεται lncRNA και mRNA

οι όγκοι και DNT από χημειοθεραπεία αφελείς ασθενείς που υποβλήθηκαν σε κυστεκτομή για τη νόσο του HG (επιβεβαιώθηκε τελική παθολογική στάδιο pT2-pT4) απομονώθηκαν με IRB έγκριση. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον πίνακα S2.

Χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR για τον εντοπισμό σχετίζονται με όγκους lncRNA και mRNA σε όγκους σε σύγκριση με DNT επιθήλιο από τους ίδιους τους ασθενείς (Σχήμα 4Α). Βρήκαμε ότι Hotair, ΗΟΧ-AS-2, MALAT1 και δύο mRNA Oct4 και SOX2 έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης από ό, τι DNT (το επίπεδο έκφρασης των ατομικών όγκων συγκεντρώθηκε και σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης ομαδοποιήθηκαν DNT).

( Α) qRT-PCR των mRNAs και lncRNAs που σχετίζονται με όγκους σε όγκους από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε κυστεκτομή για τη νόσο HG (τελική παθολογία ρΤ2-pT4). Tumor και άπω φυσιολογικού ιστού (DNT) mRNA ή lncRNA ομαλοποιήθηκε για 18s και στη συνέχεια υπολογίστηκε η αναλογία του όγκου σε DNT. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student για σύγκριση των όγκων να DNT ομαλοποιημένη έκφραση, * ρ & lt? 0.05. (N = 10 ασθενείς). chemotherapy.

doi:10.1371/journal.pone.0147236.s006

(DOCX)

Acknowledgments

Functional