Αφηρημένο

Τα τελευταία χρόνια, σημαντική προσοχή έχει δοθεί στη χρήση των φυσικές ουσίες, όπως αντικαρκινικά φάρμακα. Το φυσικό αντιοξειδωτικό διπεπτίδιο L-σαρκοσίνης ανήκει σε αυτήν την κατηγορία μορίων επειδή έχει αποδειχθεί ότι έχει σημαντική αντικαρκινική δράση in vitro και in vivo. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η L-σαρκοσίνης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος επηρεάζοντας την ΑΤΡ και αντιδρώντα είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή. Στην παρούσα μελέτη έχουμε εντοπίσει την υποξία Factor 1α (HIF-1α) ως πιθανός στόχος της L-καρνοσίνη στην κυτταρική σειρά HCT-116. πρωτεΐνη HIF-1α υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο και είναι η κύρια αιτία της αντίστασης στα φάρμακα και ακτινοβολία σε συμπαγείς όγκους. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος είναι πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι παραγωγή ROS παρέχει ένα σήμα οξειδοαναγωγής για επαγωγή HIF-1α, και είναι γνωστό ότι ορισμένα αντιοξειδωτικά είναι σε θέση να καταστείλει ογκογένεση μέσω αναστολής HIF-1α. Στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι η L-σαρκοσίνης μειώνει το επίπεδο της πρωτεΐνης HIF-1α που επηρεάζουν τη σταθερότητα της και μειώνει την μεταγραφική δραστικότητα HIF-1. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι η L-σαρκοσίνης εμπλέκεται σε σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος προώθηση αποικοδόμηση HIF-1α. Τέλος, συγκρίναμε την αντιοξειδωτική δράση της L-καρνοσίνη με εκείνη των δύο συνθετικά αντιοξειδωτικά δις-diaminotriazoles (δηλαδή 1 και 2, αντίστοιχα). Παρά αυτές τις τρεις ενώσεις έχουν την ίδια ικανότητα στη μείωση ενδοκυτταρικών ROS, 1 και 2 είναι πιο ισχυρό καθαριστές και δεν έχουν καμία επίδραση επί HIF-1α έκφραση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ανάλυση των αντιοξειδωτικών μονοπατιού L-καρνοσίνη θα αποσαφηνίσει το μηχανισμό που διέπει τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις αυτού του διπεπτιδίου σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ωστόσο, αν και ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο ρυθμίζει L-καρνοσίνη κάτω ή αναστέλλει την HIF-1α δραστηριότητα δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί, η ικανότητα αυτή μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη στη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με υποξία

Παράθεση:. Iovine Β, Oliviero G, Garofalo Μ, Orefice Μ, Nocella F, Borbone Ν, et al. (2014) Η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της L-Carnosine συσχετίζεται με μια μειωμένη έκφραση των υποξία επαγώγιμοι Factor 1 άλφα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10.1371 /journal.pone.0096755

Επιμέλεια: Sabato D’Auria, CNR, Ιταλία

Ελήφθη: δέκατης έβδομης Μαρτίου 2014? Αποδεκτές: 5η Απριλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2014

Copyright: © 2014 Iovine et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το «Finanziamento per l’Avvio di Ricerche ORIGINALI», Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. «Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale» επιχορήγηση το 2009 από την ιταλική Ministero dell’Università e della Ricerca, GO Σημείωση GP. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

L-καρνοσίνη (β-Ala-His) είναι ένα φυσικό διπεπτίδιο ιστιδίνη, που συνθέτεται ενδογενώς και συναντάται ευρέως στον εγκέφαλο, μύες, νεφρό, στομάχι, και, σε μεγάλες ποσότητες, στο σκελετικό μυ. Αυτό το διπεπτίδιο έχει αποδειχθεί να εκτελέσει μια σειρά από βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της αντι-οξειδωτική δραστικότητα, ικανότητα για τη χηλικοποίηση μεταλλικών ιόντων, η αναστολή της πρωτεΐνης γλυκοζυλίωσης, αντι-φλεγμονώδη και αντι-γήρανση ιδιότητες [1]. Μια άλλη άποψη της επίδρασης του L-σαρκοσίνης αφορά αντι-πολλαπλασιαστική δράση του σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Πρόσφατα, έχουμε καταδείξει ότι η L-σαρκοσίνης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HCT-116 κύτταρα ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινώματος επηρεάζοντας την παραγωγή ΑΤΡ και ROS και επάγοντας την διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1 [2]. Επιπλέον, μερικοί συγγραφείς, με πρωτεομική προσέγγιση, υποστηρίζουν την πιθανότητα ότι αυτό το διπεπτίδιο επηρεάζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων στα ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος και επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου in vivo σε ένα μοντέλο ποντικού ΝΙΗ3Τ3-HER2 /neu μέσω παρεμβολής με αναδίπλωση πρωτεϊνών /μεταποίησης και σηματοδότηση HIF-1α [3] – [4]. Στην πραγματικότητα, καταβλήθηκαν σημαντικές προσπάθειες έχουν κατευθυνθεί προς την ανακάλυψη των χημικών ή φυσικών μορίων που στοχεύουν πρωτεΐνη HIF-1α και ρυθμίζουν μονοπάτι σηματοδότησης HIF-1α μέσω μιας ποικιλίας μοριακών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφικής ρύθμισης, σταθεροποίηση, την υποβάθμιση και μετενεργοποίηση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο ρόλος των ROS και αντιοξειδωτικά μόρια στη ρύθμιση του HIF-1α. Πράγματι, μια σειρά ενώσεων, όπως rapamicin και ρεσβερατρόλη, έχουν δειχθεί ότι είναι αναστολείς της HIF-1α [5] – [6]. HIF-1α είναι ένα συστατικό του HIF-1 σύμπλοκο που παίζει κεντρικό ρόλο στην O

2 ομοιόσταση και, στην πραγματικότητα, θεωρείται ένας κεντρικός ρυθμιστής των αποκρίσεων προσαρμογή των καρκινικών κυττάρων στην υποξία [7]. HIF-1 σύμπλοκο είναι ένας ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που αποτελείται από Ο

2-ρυθμιζόμενη HIF-1α και συστατικώς εκφράζεται HIF-1β υπομονάδες. Υπό ορθοξικές συνθήκες, η ισομορφή προλυλ υδροξυλάσης PHD2 hydroxylates HIF-1α σε δύο λειτουργικά ανεξάρτητη υπολείμματα προλίνης, Pro

402 και Pro

564, εντός του τομέα ODD (οξυγόνο που εξαρτώνται από την υποβάθμιση) [8] – [9]. Υδροξυλιωμένα Pro υπολείμματα προώθηση της πρόσληψης του HIF-1α από Von Hippel-Lindau ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών (VHL), μια μονάδα αναγνώρισης της Ε3-ουβικιτίνης λιγάση, υπεύθυνη για ουβικουϊτινίωση του και μετέπειτα πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [10]. Υπό υποξικές συνθήκες η πρωτεΐνη HIF-1α διαφεύγει στην πρωτεόλυση, ρυθμίζεται προς τα πάνω, και σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με HIF-1β στο σύμπλεγμα HIF-1. Το συγκρότημα HIF-1 αναγνωρίζει και δεσμεύεται με το υποξία στοιχείο απόκρισης (HRE) των υποξία γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που επηρεάζουν την αγγειογένεση, το μεταβολισμό του σιδήρου, διαμόρφωση του μεταβολισμού της γλυκόζης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση, και εισβολή, ενεργοποιώντας έτσι την μεταγραφή τους [ ,,,0],11]. Τα τελευταία χρόνια, ο HIF-1 έχει αναδειχθεί ως ένα υποσχόμενο στόχο για θεραπευτικά του καρκίνου. Στην πραγματικότητα, ο HIF-1α υπερ-έκφραση είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των ανθρώπινων καρκίνων, όπου μεσολαβεί στην προσαρμογή στο υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου. Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί στην κυτταρική σειρά HCT-116 τα αποτελέσματα του L-σαρκοσίνης στην έκφραση του HIF-1α και HIF-1α-εξαρτώμενη γονίδια. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερο ενδιαφέρον υπήρξε ο ρόλος των ROS και αντιοξειδωτικές μορίων σε ρύθμιση HIF-1α [12]. Έτσι, για να κατανοηθούν οι μηχανισμοί υπεύθυνοι για την L-σαρκοσίνης αποτέλεσμα έχουμε επίσης εξέτασε τον τρόπο αυτό διπεπτίδιο επηρεάζει ROS ενδοκυτταρικά επίπεδα σε σύγκριση με δύο νέα αντιοξειδωτική δις-diaminotriazole ενώσεις (δηλαδή 1 και 2 αντίστοιχα) που διατίθεται από τα εργαστήρια μας και της οποίας η αντιοξειδωτική δραστηριότητα είναι ανέκδοτο. Παρά αυτές οι τρεις ενώσεις έχουν την ίδια ικανότητα στη μείωση ενδοκυτταρικών ROS, βρήκαμε ότι 1 και 2 δεν έχουν επίδραση επί HIF-1α έκφραση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Υποθέτουμε ότι η αντιοξειδωτική δράση της L-καρνοσίνη λειτουργεί με διαφορετικό μηχανισμό από τις ενώσεις 1 και 2. Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ανάλυση της αντιοξειδωτικής οδού L-καρνοσίνη θα αποσαφηνίσει το μηχανισμό που διέπει τις συνέπειες αυτού του διπεπτιδίου σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ΗΟΤ-116 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC) των ΗΠΑ. Η κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε στους 37 ° C και 5% CO

2 σε ϋΜΕΜ (Τροποποιημένο κατά Dulbecco μέσο Eagle) που αγοράστηκε από την BioWhittaker Classic Cell Culture Media, Lonza – VWR INTERNATIONAL SRL, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco Laboratories).

Χημική Σύνθεση του δις-τριαζόλης ενώσεων 1 και 2

Οι δύο ενώσεις παρασκευάστηκαν με αντίδραση του το αντίστοιχο οξύ (trans-trans-μουκονικό οξύ και το φουμαρικό οξύ, αντίστοιχα) με διαμινογουανιδίνη μονοϋδροχλωριδίου σε πολυφωσφορικό οξύ ως παράγοντα αφυδάτωσης, ακολουθώντας τη διαδικασία που ήδη περιγράφηκε στο [13]. Τα χλωριούχα 1 και 2 παρασκευάστηκαν ως ακολούθως. Κάθε δις-diaminotriazole αιωρήθηκε σε νερό. Αραιό ​​υδροχλωρικό οξύ (10 mL συμπ. Σε 100 mL νερού) προστέθηκε, θερμαίνεται σε βρασμό μέχρις ότου το στερεό διαλύθηκε πλήρως. Κατά την ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου, 2 λήφθηκε ως καφέ πρισματικοί κρύσταλλοι. Στην περίπτωση του 1, η chlorohydrate (ωχροκαφέ πρισματικοί κρύσταλλοι) ελήφθη με την προσθήκη αιθανόλης στο διάλυμα νερού και ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου. Η δομή των χλωροενυδατωμένο και το πρωτονίωσης στο άτομο Ν-2 του δακτυλίου, αντί στις αμινομάδες, επιβεβαιώθηκε με ανάλυση απλού κρυστάλλου (εργασία σε προετοιμασία) και είναι σύμφωνο με παρόμοια αποτελέσματα που αναφέρονται στο [13].

Θεραπείες

L-σαρκοσίνης, που παρέχεται από την Sigma-Aldrich Καναδά, διαλύθηκε σε DMEM χωρίς ερυθρό της φαινόλης (Sigma-Aldrich). HCT-116 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε συγκέντρωση 3.0 × 10

6 κύτταρα σε πλάκες 100 mm. Μετά από επώαση για μία ημέρα στους 37 ° C σε 5% CO

2, L-σαρκοσίνης προστέθηκαν από 0.5 έως 100 mM? τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά. Η θεραπεία με τα δις-diaminotriazole ενώσεις (1 και 2) πραγματοποιήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις από 0,05 έως 0,5 mM. Για CoCl

2 θεραπεία 100 mM CoCl

2 προστέθηκε σε HCT-116 για 6 ώρες. MG132, που παρέχεται από την Calbiochem ΗΠΑ διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. HCT-116 κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα πριν από την L-σαρκοσίνης αγωγή [14]. 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης θεραπεία τα κύτταρα συλλέχθηκαν για πρωτεΐνη ανοσοκαταβύθιση.

μικροσκόπιο φθορισμού

HCT116 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 mM L-σαρκοσίνης. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά και στη συνέχεια έγιναν διαπερατά με 0,4% Triton Χ100 σε PBS 1Χ. Μετά από 10 λεπτά, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1Χ /0.4% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πρώτα σε επεξεργασία με αντισώματα HIF-1α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε PBS 1Χ /0.4% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια με ALEXA 568 (Alexa Molecular Probes ‘Fluor 568) δευτερεύοντα αντισώματα σε PBS 1Χ /0.4% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα βάφτηκαν με μέσο στερέωσης για φθορισμό με DAPI (εργαστήρια Vector). Τα αποτελέσματα εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού σε ένα Zeiss Axiophot σε 40Χ ανάλυση.

Αντιοξειδωτική Δράση Μέτρηση με τη μέθοδο DPPH

μέθοδο απόσβεσης

DPPH (1,1-διφαινυλο-2-picrylhydrazyl) χρησιμοποιήθηκε για την η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των 1, 2 και L-σαρκοσίνης [15]. Η ικανότητα των δειγμάτων να σαρώνουν τη ρίζα DPPH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Brand-Williams [16]. Δείγματα (60 μλ) του 1 mM διαλύματος 1, 2 και L-σαρκοσίνης προστέθηκαν σε 3 mL διαλύματος DPPH (6 × 10

-4 Μ) και η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 515 nm (Philips PU 8620 σειρά UV /ορατού) κάθε 5 λεπτά έως ότου η σταθερή κατάσταση. Για κάθε αντιοξειδωτικό δοκιμασίας, ένα κλάσμα Trolox χρησιμοποιήθηκε για να αναπτυχθεί ένα 50-500 mM πρότυπη καμπύλη. Όλα τα δεδομένα στη συνέχεια εκφράζονται ως Trolox Ισοδύναμα (mmol TE /L).

Ανάλυση Βιωσιμότητας Κυττάρου

Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει ήδη αναφερθεί [17]. HCT-116 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων. Στη συνέχεια, οι δις-diaminotriazole ενώσεις (1 και 2) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις από 0,05 έως 0,5 mM. Μετά από 24 ώρες επώασης, 10 μL 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) (Sigma Aldrich) (0,05 mg /mL) προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας. Μετά από 4 ώρες στους 37 ° C, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και 200 ​​μλ DMSO προστίθενται για να διαλυθούν τα άλατα του φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε με 96 φρεάτια πλάκας φασματοφωτόμετρο στα 570 nm. Τα πειράματα ανεξάρτητα εκτελείται τρεις φορές και κάθε πείραμα περιείχε τριπλής επαναλήψεις. Τα δείγματα ελέγχου που περιέχει ένα πλήρες μέσο καλλιέργειας άνευ κυττάρων ή κυττάρων ελέγχου χωρίς L-σαρκοσίνης επίσης περιλαμβάνονται σε κάθε πείραμα.

κλωνογονική δοκιμασία

κύτταρα HCT116 επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 500 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων σε 500 μλ φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει πλήρες DMEM με 20-50-100 mM L-σαρκοσίνης ή δις-diaminotriazole ενώσεις (1 και 2) (από 0,05 έως 0,5 mM). Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1Χ και βάφτηκαν με ένα διάλυμα 0,2% κρυσταλλικό ιώδες, 50% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ σε H

2O για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με απιονισμένο H

2O και φωτογραφήθηκαν.

Μέτρηση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

Ο σχηματισμός των ROS αξιολογήθηκε με τη βοήθεια του 2,7-διχλωρο διοξικού ανιχνευτή (H2DCF-DA) (αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich). HCT-116 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε 100 μλ φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει ϋΜΕΜ χωρίς ερυθρό φαινόλης. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2, τότε ί-σαρκοσίνης (από 0,5 έως 100 mM) ή ενώσεις 1 και 2 (από 0,05 έως 0,5 mM) προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας . Το μέτρο ROS διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει ήδη αναφερθεί [18]. Ο φθορισμός παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα LS 55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield, England). Σε κάθε πείραμα, η αύξηση του φθορισμού μετρήθηκε σε τρεις πανομοιότυπες καλλιέργειες για κάθε κατεργασία.

Δοκιμασία Επιμόλυνση και Δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το στοιχείο απόκρισης υποξίας (HRE) -luciferase ανταποκριτή πλασμίδιο ή με ένα φορέα που περιέχει τον τομέα οξυγόνο-εξαρτώμενες αποικοδόμηση (ODD) του HIF-1α, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Γερμανία) σε OptiMEM-1 μέσο άνευ ορού (Lonza, Verviers, Βέλγιο), σύμφωνα με το τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24-48 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης αξιολογήθηκε με την Dual-Luciferase Reporter σύστημα δοκιμασίας (Promega, Madison WI, USA) και με ένα Promega GloMax 20/20 λουμινόμετρο, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή.

Παρασκευή Total, πυρηνικών και κυτταροπλασματική πρωτεΐνη εκχυλίσματα

Σύνολο εκχυλίσματα HCT-116 παρασκευάστηκαν 24 ώρες μετά τη θεραπεία με L-σαρκοσίνης από 0.5 έως 100 mm, ή με 1 ή 2 από 0,05 έως 0,5 mM. Τα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS 1Χ και φυγοκεντρήθηκε στα 240 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ψυχρό ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1% Triton Χ100, 0.1% SDS, 0.1% NaN

3, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.1 mM Na

3νο

4, 10 mM NaPPi, 0.5 mM PMSF και 10 μg /mL απροτινίνη, λευπεπτίνη και πεπστατίνη στους 4 ° C για 30 λεπτά επί πάγου. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 20,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Για συλλέχθηκαν εκχυλίσματα κυτταρολύματος και πυρήνων κυττάρων HCT116, πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS 1Χ και φυγοκεντρήθηκαν στα 240 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 100 μL παγωμένου υποτονικού ρυθμιστικού λύσης (10 mM HEPES ρΗ 7,9, 10 mM ΚΟΙ, 1 mM PMSF, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Να

3νο

4, 10 μg /mL από το καθένα από απροτινίνη, λευπεπτίνη και πεπστατίνη) και επωάστηκαν με ανακίνηση στους 4 ° C για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν με προσθήκη 5% ΝΡ40. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στα 500 χ g και το υπερκείμενο που περιέχει το κυτοσολικό κλάσμα στη συνέχεια λαμβάνεται μετά από περαιτέρω φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 20.000 χ g.

Το πυρηνικό δισκίο εναιωρείται εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης υψηλού άλατος ( 20 mM HEPES ρΗ 7,9, 0,4 Μ NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 μg /mL από το καθένα από απροτινίνη, λευπεπτίνη και πεπστατίνη) και επωάστηκαν με ανακίνηση στους 4 ° C για 15 λεπτά . Το πυρηνικό εκχύλισμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 15 λεπτά σε 20,000 χ g, και το υπερκείμενο δειγματίσθηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίζεται με κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Για τις αναλύσεις Western Blot, οι πρωτεΐνες που λαμβάνονται προκλήθηκαν με αντισώματα έναντι HIF-1α (κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα από την Santa Cruz Biotechnology), αλδολάση Α (ABNOVA), αλδολάση C (κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα από την Santa Cruz Biotechnology) και β-ακτίνη (ποντικού μονοκλωνικά από την Santa Cruz Biotechnology). Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ECL (GE Healthcare).

Ανοσοκαταβύθιση

HCT-116 κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 250 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1% ΝΡ-40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 5 mM EDTA, και 1 mM DTT) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης. Τα δείγματα (800 μg) προκαταρκτική διαύγαση με 30 μι Πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology) για 2 ώρες στους 4 ° C. Το αντι-HIF-1α αντίσωμα (κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα από την Santa Cruz Biotechnology) προστέθηκε σε λύματος και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια 30 μL του Πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης προστέθηκαν στο προϊόν λύσης. Μετά από 1 ώρα στους 4 ° C οι πρωτεΐνες ανακτήθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli, διαχωρίστηκαν σε 8% μετουσιωτική πηκτή και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανοσοστύπωμα.

Real-time PCR Δοκιμασία

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από HCT -116 κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen) και χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση του cDNA με τυχαίους εκκινητές εξανουκλεοτιδίου και MultiScribe αντίστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) στους 48 ° C για 1 ώρα. Το cDNA στη συνέχεια ενισχύθηκε σε ένα σύστημα iCycler iQ πραγματικού χρόνου PCR ανίχνευση (Bio-Rad Laboratories) χρησιμοποιώντας iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Οι αντιδράσεις PCR και η σχετική γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποίηση Real-Time διεξήχθησαν, όπως αναφέρεται στο [19]. Οι αναλογίες μεταξύ 2

-ΔΔ

CT

πριν από τη θεραπεία με L-καρνοσίνη και αυτά που υπολογίστηκαν για τα δείγματα επωάστηκαν με L-σαρκοσίνης από 5 έως 100 mM εκφράζονται ως φορές αλλαγές.

Στατιστική Ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SDS (τυπικές αποκλίσεις) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης της διακύμανσης ANOVA και τιμή Ρ για ένα τεστ πολλαπλής σύγκρισης. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε ως ** p & lt? 0.001, *** p & lt? 0.0001 [2]. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού GraphPad PRISM (έκδοση 3.0? GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, USA, 2002) σε μια πλατφόρμα των Windows

Αποτελέσματα

L-καρνοσίνη Μειώνει HIF. -1α επίπεδα πρωτεΐνης που επηρεάζουν τη σταθερότητα της σε HCT-116 κύτταρα

προκειμένου να καθοριστεί η επίδραση του διπεπτιδίου L-σαρκοσίνης στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α, κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος κόλου (HCT-116) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις L-σαρκοσίνης (από 0.5 έως 100 mM). Ειδικότερα, η ανάλυση RT-PCR, 24 ώρες μετά την προσθήκη L-σαρκοσίνης, αποκάλυψε μια σταθερή κατάσταση του HIF-1α επίπεδα mRNA, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα του L-σαρκοσίνης επί έκφρασης πρωτεΐνης HIF-1α στα κύτταρα HCT-116 με ανάλυση κηλίδας Western. Τα επίπεδα πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν τόσο σε υποξία και νορμοξία, καθώς και με την παρουσία (από 0.5 έως 100 mM) και απουσία L-σαρκοσίνης. Στα νορμοξικά κύτταρα HCT-116, 50-100 mM L-σαρκοσίνης μείωσαν την έκφραση του HIF-1α σε σύγκριση με ένα δείγμα ελέγχου που δεν έλαβαν θεραπεία με L-σαρκοσίνης (Εικόνα 1Β). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η υποξία προκαλούμενη (με CoCl

2) έκφραση του HIF-1α μειώθηκαν μετά από αγωγή με 50 ή 100 mM ί-σαρκοσίνης (Σχήμα 1 C). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν πάλι με αντισώματα έναντι β-ακτίνης για να επιβεβαιώσει την ισοδυναμία φορτίο πρωτεΐνης. Για να επιβεβαιώσετε τη μείωση του HIF-1α πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης. Βρήκαμε ότι το ανοσοΐζημα HIF-1α-αντισώματος περιείχε σημαντικά επίπεδα HIF-1α πρωτεΐνη μόνο στο δείγμα ελέγχου (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της L-σαρκοσίνης κατά τη σύνθεση πρωτεΐνης HIF-1α σε κύτταρα κατεργασμένα με κυκλοεξιμίδιο (CHX). Η ανάλυση της σταθερότητας πρωτεΐνης HIF-1α σε κύτταρα CHX-αγωγή έδειξε ότι το επίπεδο του HIF-1α μειώθηκαν σε L-σαρκοσίνης κύτταρα που υπέστησαν αγωγή (50-100 mM), προτείνοντας ότι η L-σαρκοσίνης επηρεάζει την HIF-1α σταθερότητα πρωτεΐνης (Σχ. 2Β). Επιπλέον, εξετάσαμε αν αυτό διπεπτίδιο θα μπορούσε να εμπλέκεται στην αποικοδόμηση του πρωτεασώματος HIF-1α. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκε με ανάλυση κηλίδος western την επίδραση του αναστολέα πρωτεασώματος MG132 επί HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία με 50-100 mM L-σαρκοσίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, την επεξεργασία με 1 mM MG132 και L-καρνοσίνη για 24 ώρες αύξησε το επίπεδο της πρωτεΐνης HIF-1α σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ή σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με MG132 μόνο. Μια περαιτέρω ένδειξη για την εμπλοκή του L-σαρκοσίνης σε HIF-1α αποικοδόμηση πρωτεασώματος ελήφθη με μορφομετατροπή ενός φορέα που περιέχει την περίεργη περιοχή του HIF-1α. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, η δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε αισθητά 24 ώρες μετά τη θεραπεία με L-σαρκοσίνης (100 mM).

(Α) HIF-1α mRNAs μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε ολικό RNA από παρασκεύασμα HCT -116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης θεραπεία. Λευκό μπάρες δείχνουν φορές μεταβολές του mRNA σε σχέση με την ποσότητα του HIF 1α-mRNA σε μη επεξεργασμένα κύτταρα αναφέρονται ως τιμή 1? (Β) κηλίδωση Western ανάλυση του συνόλου των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-καρνοσίνη και (C) L-καρνοσίνη και CoCl

2 θεραπεία ανιχνεύθηκαν με HIF-1α και β-ακτίνη αντισώματα. Σχετικές ιστογράμματα αναφέρουν τα πυκνομετρική τιμές του HIF-1α αναλογία /β-ακτίνης. Οι πυκνομετρικές τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ ** & lt? 0.001, *** ρ & lt? 0,0001

Η

(Α) ανάλυση κηλίδωσης Western διερευνήθηκαν με αντι-HIF-1α αντισώματος της ανοσοκαταβυθίζονται πρωτεϊνών σε HCT-116.? (Β) κηλίδωση Western ανάλυση του συνόλου των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης (100 mM) ή L-σαρκοσίνης (100 mM) συν 10 mM κυκλοεξιμίδιο (CHX) κατεργασία ανιχνεύθηκαν με HIF-1α και β-ακτίνης αντισώματα. Σχετικές ιστογράμματα αναφέρουν τα πυκνομετρικές τιμές του HIF-1α αναλογία /β-ακτίνης? (Γ) κηλίδωση Western ανάλυση του συνόλου των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης (100 mM) ή L-σαρκοσίνης (100 mM) συν 1 mM θεραπεία MG132 ανιχνεύθηκαν με HIF-1α και β-ακτίνη αντισώματα. Οι πυκνομετρικές τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε ** p & lt? 0.001, *** p & lt? 0,0001? (Δ) Σχηματική αναπαράσταση του φορέα ρεπόρτερ ODD-LUC. διάνυσμα ODD-LUC περιέχει την περιοχή οξυγόνο-εξαρτώμενες αποικοδόμηση (ODD) του HIF-1α κλωνοποιείται ανοδικά από το γονίδιο της λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αντιπροσωπεύει το μέσο ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές έχουν αναφερθεί ως ποσοστά της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με το 100% των μη κατεργασμένων κυττάρων.

Η

L-σαρκοσίνης Επιρροή HIF-1α Πυρηνικής Μετατόπισης Η μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας του υποξία στοιχείο απόκρισης (HRE) και η έκφραση του κατάντη γονιδίων του

Σταθεροποιημένο HIF-1α πρωτεΐνη μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, όπου διμερίζεται με HIF-1β που σχηματίζει το σύμπλοκο μεταγραφικά ενεργή HIF-1. Ως εκ τούτου, ο πυρηνικός εντοπισμός του HIF-1α είναι απαραίτητη για την μεταγραφική δραστικότητα του HIF-1α. Η επίδραση της L-σαρκοσίνης για την ενδοκυτταρική εντόπιση του HIF-1α αναλύθηκε σε ένα πρώτο βήμα με κηλίδωση Western δοκιμασία χρησιμοποιώντας κυτταροπλασματικά και πυρηνικά πρωτεϊνικά κλάσματα, και στη συνέχεια με ανάλυση ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Α και 3Β, η L-σαρκοσίνης επηρεάζει την μετατόπιση του HIF-1α από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Στην πραγματικότητα, όταν HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με L-σαρκοσίνης τα επίπεδα πυρηνική πρωτεΐνη του HIF-1α μειώθηκε αισθητά, ενώ δεν επηρεάστηκαν τα κυτοσολικά επίπεδα. Επίσης, στην ανάλυση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 3C) ο HIF-1α σήματος σε L-σαρκοσίνης επεξεργασμένα κύτταρα ήταν ασθενώς ανιχνεύσιμη σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ή να CoCl

2-κατεργασμένα κύτταρα. Στα καρκινικά κύτταρα, η ενεργοποίηση του συμπλόκου HIF-1 συνεπάγεται σύνδεσή του με το μοτίβο HRE στις ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στη γλυκολυτική διαδικασία. Για το λόγο αυτό, HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο αναφοράς HRE-λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, η θεραπεία με 100 mM L-σαρκοσίνης προκάλεσε αξιόλογη μείωση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης (24 ώρες μετά την θεραπεία). Ακολούθως, αξιολογήσαμε τα mRNAs μερικών HIF-1α-εξαρτώμενη γονίδια. Μετρήσαμε με ανάλυση RT-PCR τα αποτελέσματα διαφορετικών συγκεντρώσεων του L-σαρκοσίνης (0,5, 5, 50 και 100 mM) για τα επίπεδα του mRNA αλδολάσης Α και PDK-1. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, αλδολάσης Α και τα επίπεδα PDK-1 mRNAs μειώθηκε μετά από αγωγή με L-σαρκοσίνης, ειδικά μεταξύ 50 και 100 mM. Η ανάλυση κηλίδος western αλδολάσης Α επέδειξε επίσης μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης (Σχήμα 4C). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης GLUT-1, όπως επίσης και της πρωτεΐνης αλδολάσης C, μειώθηκαν μετά L-σαρκοσίνης θεραπεία (Σχήμα 4D και 4Ε). Αλδολάση C είναι ένας εγκέφαλος-ειδική ισομορφή αλδολάσης, αλλά πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι το επίπεδο του mRNA αλδολάσης C είναι 30 φορές υψηλότερη σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις RT-PCR αναφέρονται στο Σχήμα 4Α.

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση του κυτοσολίου και (Β) πυρηνικών εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την 20-50-100 mM L-σαρκοσίνης θεραπεία ανιχνεύθηκαν με HIF-1α, β-ακτίνη και ιστόνης Η3 αντισώματα. Σχετικές ιστογράμματα αναφέρουν τα πυκνομετρική τιμές του HIF-1α /β-ακτίνης και αναλογία HIF-1α /H3. Οι πυκνομετρικές τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ *** & lt? 0,0001? (C) HCT-116 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CoCl

2 και 100 mM L-σαρκοσίνης για 24 ώρες εξετάζονται με μικροσκόπιο φθορισμού σε μεγέθυνση 40x χρησιμοποιώντας φίλτρα για δευτερογενές αντίσωμα έναντι HIF-1α πρωτεΐνη και για 4′-6′-diaminodino-2 -phenylindole (DAPI)? (Δ) Σχηματική αναπαράσταση του φορέα ρεπόρτερ HRE-LUC. διάνυσμα HRE-LUC περιέχει εννέα επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του υποξία Response Element (HRE) κλωνοποιήθηκε ανοδικά από το γονίδιο της λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αντιπροσωπεύει το μέσο ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές έχουν αναφερθεί ως ποσοστά της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με το 100% των μη επεξεργασμένων κυττάρων

Η

(Α) Ο πίνακας παρουσιάζει τις αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα Real Time PCR.? (Β) αλδολάσης Α και PDK-1 mRNA

S μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε ολικό RNA από παρασκεύασμα HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης θεραπεία. Μπάρες δείχνουν πολλαπλές μεταβολές του mRNA

S σε σχέση με την ποσότητα του αλδολάσης Α και PDK1 mRNAs σε ακατέργαστα κύτταρα αναφέρονται ως τιμή 1? (Γ), (Δ) και (Ε) κηλίδωση Western αναλύσεις της συνολικής πρωτεΐνης εκχυλισμάτων από HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την L-σαρκοσίνης θεραπεία ανιχνεύθηκαν με αλδολάσης Α, αλδολάση C, GLUT-1 και β-ακτίνης αντισώματα. Ιστογράμματα αναφέρουν τα πυκνομετρική τιμές του λόγου αλδολάσης Α /β-ακτίνης, αλδολάση αναλογία C /β-ακτίνης αναλογία και GLUT-1 /β-ακτίνης. Οι πυκνομετρικές τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε ** p & lt? 0.001, *** p & lt? 0,0001

Η

Η αντιοξειδωτική δράση των Ενώσεων 1 και 2 Σε σύγκριση με το L-καρνοσίνη

Η γενιά. Reactive Oxygen είδη (ROS) κατά τη διάρκεια της υποξίας παρέχει ένα σήμα οξειδοαναγωγής για την επαγωγή του HIF-1α. Στην πραγματικότητα, μερικοί συγγραφείς ορίζουν ROS ως θετικοί ρυθμιστές του HIF-1α [20]. Η παρατήρηση ότι άλλες αντιοξειδωτικές ουσίες μπορούν να επηρεάσουν το επίπεδο της πρωτεΐνης HIF-1α μας οδήγησε να αξιολογήσουν την αντιοξειδωτική δράση των δύο πρωτότυπων δις-diaminotriazole ενώσεις (1 και 2) (Σχήμα 5Α), σε σύγκριση με εκείνη του L-σαρκοσίνης, με DPPH χημική δοκιμή. Πρώτα, μετρήθηκε το ποσοστό της DPPH αδρανοποίησης χρησιμοποιώντας ένα mM συγκέντρωση 1 για όλες τις ενώσεις, και αποδείξαμε ότι οι ενώσεις 1 και 2 έχουν μια σημαντική δραστηριότητα ως ROS καθαριστές σύγκριση με το L-σαρκοσίνης (βλέπε πίνακα του Σχήματος 5Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS που επάγεται από την L-σαρκοσίνης (100 mM) σε HCT-116 κύτταρα και σε σύγκριση με το ποσό των ROS που δημιουργούνται με κατεργασία ίδια κυτταρική γραμμή με διαφορετικές συγκεντρώσεις (από 0,05 έως 0,5 mM) των ενώσεων 1 και 2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, η αγωγή με, 0,1 και 0,5 mM από 1 και 2 μείωσε το ενδοκυτταρική παραγωγή ROS σε HCT-116 κατά περίπου 40-50%, παρόμοια με 50-100 mM L-σαρκοσίνης. Τέλος, αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση των διαφορετικών συγκεντρώσεων 1 και 2 (από 0,05 έως 0,5 mM) επί της εκφράσεως HIF1-α και η κυτταρική βιωσιμότητα. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 6Α και 6Β, η προσθήκη 1 και 2 δεν επηρέασε τα HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης ούτε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επιπλέον, αξιολογήθηκε με δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση την ικανότητα του HCT-116 κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίσουν μια μεγάλη αποικία ή ένας κλώνος με την παρουσία L-σαρκοσίνης ή 1 ή 2 (Σχήμα 6C). 50 mM L-σαρκοσίνης μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών σε σχέση με το δείγμα ελέγχου χωρίς θεραπεία, ενώ οι ενώσεις 1 και 2 δεν επηρέασε την ικανότητα των κυττάρων να σχηματίσουν αποικίες στην δοκιμασμένη συγκέντρωση. Ένα κυτταρομετρίας ροής δοκιμασίας (FACS) επιβεβαίωσε ότι 1 και 2 δεν επηρέασε τον κυτταρικό κύκλο και δεν διεγείρει απόπτωση σε HCT-116 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η πρώιμη αποπτωτική ποσοστό θανάτου σε HCT-116 κύτταρα κατεργασμένα με τις δύο ενώσεις δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από το δείγμα ελέγχου

(Α) Χημικές δομές των ενώσεων 1 και 2.? (Β) Αντιοξειδωτική δράση της L-καρνοσίνη, 1 και 2 μετράται με τη μέθοδο DPPH όπως περιγράφεται στην Ενότητα 1.2.4? (Γ) ROS παραγωγή αξιολογήθηκε 24 ώρες μετά την προσθήκη της L-καρνοσίνη, 1 και 2 σε HCT-116 κύτταρα με τον ανιχνευτή 2 ‘, 7’-διχλωρο-διοξεικό (H2DCF-DA). Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως ποσοστό σε σύγκριση με το 100% των κυττάρων ελέγχου. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ ** & lt? 0.001, *** ρ & lt?. 0.0001

Η

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση του συνόλου των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από κύτταρα HCT-116 μετά από θεραπεία με τις ενώσεις 1 και 2 ανιχνεύθηκαν με HIF-1α και β-ακτίνη αντισώματα. Ιστογράμματα αναφέρουν τα πυκνομετρική τιμές του HIF-1α αναλογία /β-ακτίνης. Οι πυκνομετρικές τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? (Β) ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε HCT-116 κύτταρα 24 ώρες μετά την αγωγή με τις ενώσεις 1 και 2. Ολες οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SDs τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και εκφράζονται ως ποσοστό σε σύγκριση με το 100% των κυττάρων ελέγχου ? (C) Δοκιμασία κλωνογονιδιακή επιβίωση σε HCT-116 μετά από αγωγή με L-σαρκοσίνης (50 mM) ή ενώσεις 1 και 2 (0,5 mM) σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την επίδραση της L-σαρκοσίνης μεταχείριση δραστηριότητα HIF-1α σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. [28].