Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη οδός αποδόμησης της πρωτεΐνης. Ένα ελάττωμα στην αυτοφαγία μπορεί να συμβάλει στην ογκογένεση. επαγωγείς αυτοφαγία θα μπορούσε να έχει μια πιθανή λειτουργία στην πρόληψη και τη θεραπεία των όγκων.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι Rhabdastrellic οξύ-Α, ένα isomalabaricane τριτερπενοειδείς απομονώνονται από το σφουγγάρι Rhabdastrella globostellata, ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών Hep3B και Α549 και επάγεται κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι Rhabdastrellic οξύ-Α προκαλείται από αυτοφαγία των καρκινικών κυττάρων καθορίζεται από YFP-LC3 punctation και αυξημένη LC3-II. Η προ-επεξεργασία με αναστολέα αυτοφαγία 3-MA ανέστειλε Rhabdastrellic οξύ-Α-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Εξόντωση autophagy σχετίζονται γονίδιο Atg5 ανέστειλε Rhabdastrellic οξύ-Α-επαγόμενη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α549. Επίσης, φωσφο-Ακί και κατάντη των στόχων της μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή με Rhabdastrellic οξύ-Α σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Επιμόλυνση της συστατικής ενεργού Akt πλασμίδιο καταργηθεί αυτοφαγία και τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από Rhabdastrellic οξύ-Α.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να προκαλέσει την αυτοφαγία που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο μέσω αποκλεισμού Akt μονοπάτι σε καρκινικά κύτταρα. Παρέχει επίσης την απόδειξη ότι Rhabdastrellic οξύ-A αξίζει περαιτέρω έρευνα ως πιθανή αντικαρκινική ή καρκίνο προληπτικό παράγοντα

Παράθεση:. Li DD, Guo JF, Huang JJ, Wang LL, Ντενγκ R, Liu JN, κ.ά. . (2010) Rhabdastrellic Acid-Α Induced Autophagy-Associated κυτταρικού θανάτου μέσω Μπλόκο AKT οδό σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 5 (8): e12176. doi: 10.1371 /journal.pone.0012176

Επιμέλεια: Gian Maria Fimia, INMI, Ιταλία

Ελήφθη: 19 Φεβρουαρίου 2010? Αποδεκτές: 21 Ιουλ 2010? Δημοσιεύθηκε: 17 Αυγούστου, 2010

Copyright: © 2010 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (30873085, 30972882) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή έχουν

οι θαλάσσιοι σπόγγοι έχουν αποδειχθεί ότι είναι μια ιδιαίτερα γόνιμη πηγή ασυνήθιστο τερπενοειδή [1], [2]. Rhabdastrellic οξύ-Α (Εικ. 1), ένα isomalabaricane τριτερπενοειδείς, απομονώθηκε από το κίτρινο σφουγγάρι Rhabdastrella globostellata (Carter) που συλλέγονται από την Θάλασσα της Νότιας Κίνας κοντά στο νησί Hainan, Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Η δομή του καθορίστηκε με βάση τις UV, IR, MS,

1Η-NMR,

13C-NMR, και φασματοσκοπία 2D NMR [3], [4]. Οι σχετικές και απόλυτες στερεοχημικές επιλύθηκαν από μελέτες NOESY και CD, αντίστοιχα. Έχει αναφερθεί ότι Rhabdastrellic οξύ-Α μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων γραμμής HCT-116. Tasdemir et al. διαπίστωσε ότι stellettin Β και Ε, δύο τερπενοειδή από Rhabdastrella globostellata με δομή παρόμοια με Rhabdastrellic οξύ-Α, κατά προτίμηση αναστέλλουν ρ21 – /- την ανάπτυξη των κυττάρων HCT-116 [5]. Άλλες isomalabaricane τριτερπενοειδή βρέθηκαν να επάγουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), να μειώσει το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, αυξάνουν τα επίπεδα του Βαχ και κυτόχρωμα c, μειώνουν τα επίπεδα του Bcl-2 και μεσολαβούν μία κασπασών-3 αποπτωτικό μονοπάτι, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για τριτερπενοειδή κυτταρικό θάνατο που επάγεται δεν έχουν διασαφηνιστεί ακόμη [5]. Επίσης, η έρευνά μας έδειξε ότι Rhabdastrellic οξύ-Α επαγόμενη απόπτωση σε HL-60 κύτταρα [4], αλλά δεν παρατηρήθηκε η ανάπτυξη των αποπτωτικών χαρακτηριστικών σε Hep3B και τα κύτταρα Α549 μετά από έκθεση σε οξύ Rhabdastrellic-A.

Η

Autophagy είναι μια λυσοσωμική οδός αποδόμησης που είναι απαραίτητη για την επιβίωση, την ανάπτυξη, και την ομοιόσταση [6]. Autophagy εξυπηρετεί κυρίως ένα προσαρμοστικό ρόλο για την προστασία των οργανισμών από διαφορετικές παθολογίες, συμπεριλαμβανομένων των λοιμώξεων, του καρκίνου [7], νευροεκφυλισμός [8], η γήρανση, και οι καρδιοπάθειες. Αυτοφαγικά κυτταρικός θάνατος έχει μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά που το διακρίνουν από τα δύο απόπτωσης και νέκρωσης. Στο αρχικό στάδιο της ανάπτυξης του όγκου, λειτουργεί αυτοφαγία ως καταστολέας των όγκων

39. Ελαττώματα στην αυτοφαγία να οδηγήσει σε γενωμική αστάθεια και ογκογένεση. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στην κεντρική περιοχή της μάζας του όγκου υφίστανται αυτοφαγία να επιβιώσουν υπό συνθήκες χαμηλού οξυγόνου και χαμηλή σε θρεπτικά. Έχει αναφερθεί ότι autophagy προστατεύεται κάποια καρκινικά κύτταρα έναντι αντικαρκινικές θεραπείες μπλοκάροντας το αποπτωτικό μονοπάτι. Αντιθέτως, άλλα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να υποστούν αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου μετά τον καρκίνο θεραπείες [9].

Ο ρόλος της αυτοφαγία στην μεσολάβηση της κυτταρικής απόκρισης σε στρες έχει εξετασθεί από interferencing την έκφραση ορθόλογα θηλαστικού του ATG του γονιδίου [ ,,,0],10]. Για παράδειγμα, Beclin 1 (BECN1? Επίσης γνωστή ως Atg6) είναι ένα συστατικό ενός σύνθετου συμπεριλαμβανομένης της κατηγορίας III φωσφοτιδυλινοσιτόλης-3-κινάσης η οποία είναι διεγερτική για autophagy. Beclin 1 (ATG6) είναι επίσης γνωστό ότι αλληλεπιδρά με τα μέλη οικογένειας Bcl-2, Bcl-2 και Bcl-xL [11], [12]. Η επαγωγή Beclin 1 έκφραση μπορεί να βρεθεί κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία σε διάφορους τύπους κυττάρων [13]? και ATG5 απαιτείται για autophagy αλλά μπορεί επίσης να επάγει τον κυτταρικό θάνατο μέσω της αλληλεπίδρασής της με Fas πρωτεΐνη που συνδέεται μέσω περιοχή θανάτου [14]? Επομένως, τα αποτελέσματα αυτών των σημαντικών πειραμάτων μπορεί να μην τη στιγμή πρέπει να ληφθούν ως τελική απόδειξη για το ρόλο της autophagy είτε ως δράστης ή έναν παράγοντα βλάβης-ανακούφιση κατά την διάρκεια στρες, αλλά περισσότερο ως επίδειξη των σημαντικών ρόλων παίζουν ρυθμιστές του στην κυτταρική ομοιόσταση και ογκογένεση [15].

Μια σειρά από μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Ένα από τα κεντρικά ρυθμιστές της αυτοφαγία είναι ο στόχος της ραπαμυκίνης, TOR κινάσης, η οποία είναι ο κύριος ανασταλτικός σήμα που καταστέλλει αυτοφαγία παρουσία αυξητικών παραγόντων και άφθονα θρεπτικά συστατικά. Η τάξη Ι ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότησης μόρια συνδέουν κινάσες τυροσίνης υποδοχέα σε ενεργοποίηση TOR και έτσι να καταστέλλουν αυτοφαγία σε απόκριση σε ινσουλίνη, όπως και άλλα σήματα παράγοντα ανάπτυξης [16]. Μερικά από τα άλλα ρυθμιστικών μορίων που ελέγχουν autophagy περιλαμβάνουν 5′-ΑΜΡ-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης (AMPK), η οποία ανταποκρίνεται σε χαμηλής ενέργειας? ο παράγοντας 2α ευκαρυωτικό έναρξης (eIF2α), η οποία ανταποκρίνεται σε θρεπτικά συστατικά πείνα, δίκλωνο RNA, και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) του στρες [17], [18]. Η καταστολή των αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου με κασπάση-8 σε κύτταρα θηλαστικών έδειξε ότι caspases μπορεί να ρυθμίσει τόσο αποπτωτικών και μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [19].

Για αρκετές δεκαετίες, οι ερευνητές έχουν επικεντρωθεί στον κεντρικό ρόλο του Akt σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Akt μονοπάτι σηματοδότησης έχει αναδειχθεί ως κεντρικό διαδρομή για τη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό πολλών τύπων κυττάρων. Μέχρι σήμερα, πολλούς ανθρώπινους καρκίνους δείχνουν υπερενεργοποίηση του Akt κινασών, έτσι η αναστολή της Akt μονοπάτι θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32].

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε ότι η πιθανότητα ότι Rhabdastrellic οξύ-Α σκότωσε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μέσω της επαγωγής αυτοφαγία. Βρήκαμε ότι Hep3B και Α549 κύτταρα επεξεργασμένα με οξύ Rhabdastrellic-Α υποβλήθηκαν σε μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές που συμφωνούν με την επαγωγή αυτοφαγία και κυτταρικού θανάτου. Ο μηχανισμός της επαγωγής αυτοφαγία από Rhabdastrellic οξύ-Α συνδέεται με την αναστολή της Akt μονοπατιού.

Αποτελέσματα

1. Rhabdastrellic οξύ-Α που προκαλείται από κασπάση-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου σε Hep3B και Α549 κύτταρα

Η επεξεργασία των Hep3B και Α549 κύτταρα για 3 ημέρες με διάφορες συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-Α είχε σαν αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε ένα εξαρτώμενο από την δόση τρόπος. IC

50 τιμή ήταν 0,42 μg /mL και 2,50 μg /mL (Εικ. 2Α). Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης θα μπορούσε να είναι τα αποτελέσματα της επαγωγής της απόπτωσης, αυτοφαγία ή /και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Hep3B και Α549 κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-A για 48 ώρες και αναλύθηκαν για τον κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής. Σύκο. 2Β έδειξαν ότι Rhabdastrellic οξύ-Α δεν προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε Hep3B και τα κύτταρα Α549 εντός αυτών των ευρών συγκέντρωσης στις 48 ώρες. Με αυτόν τον τρόπο, ερευνήσαμε αν Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση ή αυτοφαγία που σχετίζεται με κυτταρικό θάνατο σε Hep3B και τα κύτταρα Α549.

Α. Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 8000 κυττάρων /φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων. Το απόθεμα των Rhabdastrellic οξύ-Α προστέθηκε στα φρεάτια. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες. ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη. Β Hep3B και τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-A για 48 ώρες και αναλύθηκαν για την περιεκτικότητα του DNA με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά 3 πειραμάτων.

Η

Πολλά είδη αντικαρκινικών παραγόντων λειτουργούν για να επάγουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων η οποία χαρακτηρίζεται από κασπάση-3 και διάσπαση PARP. Για να καθοριστεί εάν ο κυτταρικός θάνατος κασπάσης-εξαρτώμενη, ανιχνεύσαμε πρώτα τη διάσπαση της κασπάσης-3. Χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδωσης, η διάσπαση της κασπάσης-3 σε αμφότερες τις καρκινικά κύτταρα δεν παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία με Rhabdastrellic οξύ-A. Η διάσπαση της PARP ήταν επίσης ανιχνεύσιμη (Εικ. 2Α). Η διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP ανιχνεύθηκε επίσης στις δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με αδριαμυκίνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προ-κασπάση-3 διασπάστηκε για να δώσει ένα 17 KDa κατακερματισμό και PARP διασπάστηκε σε 89 KDa κατακερματισμό εξής αδριαμυκίνη θεραπεία (Εικ. 3Α). Επιπλέον, ο αναστολέας παν-κασπάσης, z-VAD-fmk, δεν ανέστειλε Rhabdastrellic οξύ-Α που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο (Σχ. 3Β). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι Rhabdastrellic οξύ-Α κυρίως προκαλούμενη μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, Hep3B και Α549 κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-Α αναλύθηκαν σε διαστήματα 48 ώρες με την δοκιμασία χρώσης /ΡΙ αννεξίνης V-FITC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, τα υψηλότερα ποσοστά ήταν αποπτωτικά 4,4% σε κύτταρα Hep3B και 0,2% σε κύτταρα Α549 μετά την επεξεργασία. Αυτά τα αποτελέσματα υπέδειξαν έντονα ότι Rhabdastrellic οξύ-Α προκάλεσε μια κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου σε Hep3B και τα κύτταρα Α549.

A. σε Hep3B και τα κύτταρα Α549, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν από 0.1% DMSO, 1 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α ή 4 μΜ αδριαμυκίνη για 24 ώρες και 48 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε με κασπάση-3 και PARP αντισώματα. Β κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-Α παρουσία ή απουσία 20 μΜ Ζ-VAD-fmk για 3 ημέρες. ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη. Αποτελέσματα (μέση ± S.E.) Αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών πειραμάτων. C. Hep3B και τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 έως 4 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-A για 48 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν διαδοχικά και χρωματίστηκαν με Annexin V και ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας.

Η

2. Autophagy σχετιζόμενη κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Rhabdastrellic οξύ-Α σε καρκινικά κύτταρα

Rhabdastrellic οξύ-Α επάγει τον σχηματισμό αυτοφαγοσώματα.

Η μεμβράνη που συνδέεται ελαφρά αλυσίδα 3 πρωτεΐνη, ΜΑΡ LC3 (Atg8) , εντοπίζεται στη μεμβράνη επιμήκυνση και παραμένει στη μεμβράνη μέχρι autophagosome ωρίμανση. Είναι ένας βασικός δείκτης για την αυτοφαγία. Μετά την επαγωγή της αυτοφαγία, LC3-Ι μετατρέπεται σε LC3-ΙΙ, η οποία είναι πιο πιθανό συζευγμένο με φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (ΡΕ) και στενά συνδεδεμένη με τις μεμβράνες που σχηματίζουν autophagosomal σχήματος δακτυλίου δομές στο κυτταρόπλασμα. Για τη μέτρηση αυτοφαγία, Hep3B και Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή έκφρασης για LC3 συγχωνευμένο με κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP-LC3). Στα κύτταρα ελέγχου DMSO-αγωγή YFP-LC3 ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα σε ολόκληρο το κυτταρόπλασμα. Μετά Rhabdastrellic οξύ-A θεραπεία, σε σχήμα δακτυλίου δομές ήταν ανιχνεύσιμα στο κυτταρόπλασμα, υποδεικνύοντας την ένωση του YFP-LC3 με μεμβράνες autophagosomal μετά από επαγωγή αυτοφαγία (Σχήμα 4Α). Υπερδομική ανάλυση Rhabdastrellic οξύ-Α-αγωγή Α549 κυττάρων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξε μεγάλο κενοτόπια αυτοφαγικά σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου όπου δεν υπάρχουν τέτοιοι κενοτόπια μπορούσε να ανιχνευθεί (σχ. 4Β).

A. Hep3B και Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή έκφρασης για LC3 συγχωνευμένο με κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP-LC3) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 μg /mL ή 4 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-A για 36 ώρες, και οπτικοποιήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. B. ηλεκτρονικό μικροσκόπιο που δείχνει αυτοφαγικά κενοτόπιο των κυττάρων Α549 ακόλουθες 4 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-A θεραπεία. Γ Rhabdastrellic οξύ-Ένας χρόνος-εξαρτώμενο τρόπο που προκαλείται από το σχηματισμό της LC3-II, ένα δείκτη για αυτοφαγία. Hep3B και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα LC3.

Η

έκφραση LC3-II που προκαλείται από Rhabdastrellic οξύ-Α σε καρκινικά κύτταρα.

Η ποσότητα του ΡΕ-συζευγμένα μορφή LC3 (LC3- II) συσχετίζεται καλά με τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα. Μετά Rhabdastrellic οξύ-μία θεραπεία για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, LC3 ανιχνεύτηκε με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της LC3-ΙΙ σταδιακά ρυθμίζεται αυξητικά (Σχήμα 4C). Αυτό επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της επιμόλυνσης YFP-LC3 και ανέφερε ότι Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να προκαλέσει την αυτοφαγία στην Hep3B και Α549 κύτταρα.

κυτταρικό θάνατο Autophagy που σχετίζονται προκαλείται από Rhabdastrellic οξύ-Α σε καρκινικά κύτταρα.

για να επιβεβαιωθεί ότι Rhabdastrellic οξύ-Α που προκαλείται από αυτοφαγία σχετιζόμενη κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα Hep3B υπέστησαν κατεργασία με Rhabdastrellic οξύ-Α και /ή 3-μεθυλαδενίνη (ένας αναστολέας του ΡΙ3Κ-C3 χρησιμοποιούνται συνήθως για ειδική αναστολή της αυτοφαγία). Σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου, μετά Rhabdastrellic οξύ-A θεραπεία, τα περισσότερα κύτταρα Hep3B εμφανίστηκε γύρο, μερικά αποκολλήθηκαν από την επιφάνεια των πηγαδιών και ο αριθμός των κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, τα αποτελέσματα από Rhabdastrellic οξύ-Α αγωγή αντιστράφηκαν με 3-ΜΑ (Σχήμα 5Α). Προτάθηκε ότι η επαγωγή κυτταρικού θανάτου από Rhabdastrellic οξύ-Α αγωγή ήταν αποκλεισμένη όταν τα κύτταρα ήταν παράλληλα αγωγή με αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ.

Α. κύτταρα Hep3B υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α και /ή 10 mM 3-ΜΑ για 36 ώρες και στη συνέχεια εξετάστηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο. *, P & lt? 0,05 έναντι Rhabdastrellic οξύ-Α- /3-Μάστερ. **, P & lt? 0,05 έναντι Rhabdastrellic οξύ-A + /3-Μάστερ. B. Κυτταρολύματα από Α549-διάνυσμα και τα κύτταρα Α549-shAtg5 αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με Atg5 και αντισώματα LC3. Γ διάνυσμα Α549 κύτταρα και κύτταρα Α549-shAtg5 καλλιεργήθηκαν στα 6000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων, που εκτίθενται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Rhabdastrellic οξύ-Α από 0,05 έως 3,2 μg /mL για 72 ώρες. Η αναστολή της ανάπτυξης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Οι αναφερόμενες τιμές είναι μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από αντιπροσωπευτικό πείραμα. * P-vlaue & lt? 0,05, σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται με τον ίδιο τρόπο, αλλά χωρίς επιμολυσμένα shRNA. Δ Α549 κύτταρα επωάστηκαν με 4 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α και /ή 10 mM 3-ΜΑ για 24 ώρες. Ο κυτταρικός θάνατος υπολογίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής ως δοκιμασία χρώσης ΡΙ. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές.

Η

shRNA που βασίζεται εξάντληση ενός ουσιώδους αυτοφαγία πρωτεΐνη Atg5, μπλοκάρει αποτελεσματικά Rhabdastrellic οξύ-Α-επαγόμενη συσσώρευση LC3-ΙΙ (σχήμα 5Β). Και η αναστολή της αυτοφαγία με εξάντληση της Atg5 ανέστειλε Rhabdastrellic οξύ-Α-επαγόμενη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α549 μέσα στις κλίμακες συγκεντρώσεων από 0,05 έως 3,2 μg /mL (Σχήμα 5C).

Α549 κύτταρα εκτέθηκαν σε 4 μΜ Rhabdastrellic οξύ-Α και /ή 3-MA αναλύθηκαν για κυτταρικό θάνατο στις 24 ώρες με κυτταρομετρία ροής. Ιωδιούχου προπιδίου (PI) θετική μετρήθηκαν ως «νεκρό» κύτταρα. Ο θάνατος των κυττάρων που προκαλείται από Rhabdastrellic οξύ-Α κατεστάλη όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε συνδυασμό με 3-ΜΑ (Σχ. 5D).

3. Rhabdastrellic οξύ-Α ανέστειλε Akt μονοπατιού σε Hep3B και Α549 κύτταρα

Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να αναστείλει μονοπάτι Akt σε κύτταρα HL-60 [4]. Ως εκ τούτου, ήταν ενδιαφέρον να δοκιμαστεί αν ήταν το ίδιο σε άλλα καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α, Μετά Rhabdastrellic οξύ-μία θεραπεία για τους υποδεικνυόμενους χρόνους ή διάφορες συγκεντρώσεις, Rhabdastrellic οξύ-Α ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt σε Hep3B και τα κύτταρα Α549.

Hep3B και τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οξύ Rhabdastrellic -Α στις ενδεδειγμένες συγκεντρώσεις για 36 ώρες ή επεξεργασία με 1 μg /mL ή 4 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. A. Τα κύτταρα διαδοχικά συλλέγονται και λύονται. κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με φωσφο-Ακί ή Akt αντισώματα. Β mTOR, φωσφο-mTOR, FKHR, φωσφο-FKHR, STAT3 και φωσφο-STAT3 αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Το πείραμα διεξήχθη 3 φορές.

Η

mTOR, FKHR και STAT3 είναι τρία σημαντικά προς τα κάτω τους στόχους της Akt μονοπατιού και διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη αυτοφαγία και την απόπτωση [33]. Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα (Σχήμα 6Β), η φωσφορυλίωση της mTOR, FKHR και STAT3 είχε δραματική μείωση μετά Rhabdastrellic οξύ-θεραπεία σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΑΚΤ οδός ανεστάλη από Rhabdastrellic AICD-Α σε Hep3B και Α549 κύτταρα.

4. Η επαγωγή της αυτοφαγία από Rhabdastrellic οξύ-Α καταργήθηκε από συστατική ενεργό έκτοπη έκφραση Akt

Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να αναστείλει Akt μονοπατιού και να προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα Hep3B. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω μια εγγενή ρόλο της Akt σε autophagy επάγεται από Rhabdastrellic οξύ-Α, επιμολύναμε κύτταρα Hep3B τα με myr-Akt1 πλασμίδια (ενεργοποιημένη) και επιλέγεται το θετικό κλώνο χρησιμοποιώντας G418. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (κύτταρα Hep3B διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο φορέα), το εξωγενές Akt έκφραση αυξήθηκε σημαντικά σε Hep3B /MYR-Akt1 κύτταρα (Σχ. 7Α). Επιπλέον, ο δείκτης της autophagy προσδιορίστηκε ενώ συστατική δραστική Akt έκφραση σε κύτταρα Hep3B. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, μαζική επαγωγή αυτοφαγία παρατηρήθηκε σε κύτταρα Hep3B, που υποδεικνύεται από την αύξηση του LC3-ΙΙ. Ωστόσο, εκφράζουν συστατική δραστική Akt μπλοκαριστεί αύξηση του LC3-ΙΙ (Εικόνα 7Β). Σε συμφωνία με την έννοια ότι κάποια πληθυσμό LC3-ΙΙ αποικοδομείται σε λυσοσώματα [34], η θεραπεία με αναστολείς λυσοσωμικού ενζύμου πεπστατίνη Α είχε ως αποτέλεσμα την συσσώρευση του LC3-ΙΙ σε καρκινικά κύτταρα (Σχ 7C), το φαινόμενο αυτό επίσης μειωμένη ενώ συστατική δραστική Akt έκτοπη έκφραση. Επιπλέον, συστατική δραστική Akt έκφραση θα μπορούσε να διασώσει τα κύτταρα Hep3B από Rhabdasterllic οξύ-Α-μεσολαβούμενη αναστολή της ανάπτυξης υπό θεραπεία του Rhabdastrellic οξύ-Α (Σχ. 7D). Αυτά τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 7 έδειξαν ότι συστατική δραστική Akt έκφραση θα μπορούσε να αναστείλει Rhabdastrellic οξύ-Α-μεσολάβηση αυτοφαγία.

A. A. ο θετικός κλώνος εκφράστηκε σταθερά myr-Akt1 αναλύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα Akt. κύτταρα Β Hep3B υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-A για 36 ώρες απουσία ή παρουσία συστατική δραστική έκτοπη έκφραση Akt. Στη συνέχεια, η έκφραση LC3 πρωτεΐνη αναλύθηκε. κύτταρα C. Cancer υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μg /mL Rhabdastrellic οξύ-Α και /ή 10 μg /mL πεπστατίνη Α (pepA) για 36 ώρες, στη συνέχεια η έκφραση της πρωτεΐνης LC3 αναλύθηκε. D. Μετά την κατεργασία, μετρήθηκαν βιώσιμα κύτταρα σε δύο κυτταρικές σειρές. *, P & lt?. 0,05 έναντι Rhabdastrellic οξέος-Α (vector)

Η

Για να διερευνηθεί κατά πόσο οι άλλες οδοί που εμπλέκονται στην αυτοφαγία που προκαλείται από Rhabdastrellic οξύ-Α, αναλύσαμε τα επίπεδα Μπιπ, CHOP, φωσφο -EIF2α και φωσφο-AMPK σε κύτταρα Hep3B παρακάτω Rhabdastrellic οξύ-Μια θεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του ΑΜΡΚ, EIF2a και CHOP αυξήθηκε μετά Rhabdastrellic οξύ-A θεραπεία με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα Hep3B. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε αύξηση Bip (φαίνεται στο Σχ. S1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πολλαπλά μονοπάτια μπορεί να εμπλέκεται σε Rhabdastrellic οξύ-Α-επαγόμενη αυτοφαγία.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα που περιγράφονται εδώ καταδεικνύουν ότι Rhabdastrellic οξύ-A θα μπορούσε να προκαλέσει αυτοφαγία στα καρκινικά ανθρώπινες κυτταρικές σειρές . Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να εμποδίσει Akt μονοπατιού σε Hep3B και Α549 κύτταρα, και συστατική ενεργό Akt έκφραση θα μπορούσε να αναστείλει Rhabdastrellic οξύ-Α-μεσολάβηση αυτοφαγία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή της Akt μονοπατιού /mTOR συμμετέχει στον Rhabdastrellic οξύ-Α προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο.

Autophagy έχει αναφερθεί ότι είναι μια διαδικασία κατά την οποία διπλή κενοτόπια μεμβράνη ονομάζεται μορφή αυτοφαγοσώματα γύρω, καταβροχθίσει, κυτταρόπλασμα και οργανίδια. Αν και αυτοφαγία αναφέρθηκε για να πραγματοποιηθεί ως prosurvival απόκριση, σε κάποια περίπτωση, η κυτταροτοξικότητα της τριοξείδιο αρσενικού, imatinib, ιονίζουσα ακτινοβολία κλπ σε ορισμένους τύπους κυττάρων διαμεσολαβείται από την επαγωγή της αυτοφαγία. Υπό τις συνθήκες αυτές, αυτοφαγία αποτελεί nonapoptotic μονοπάτι για προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι τριτερπενοειδή έχουν τη δυνατότητα να κυτταροτοξικότητα καρκινικών κυτταρικών γραμμών [35], [36]. Rhabdastrellic οξύ-A είναι ένα από τα τριτερπενοειδή που επάγονται μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε Hep3B και τα κύτταρα Α549. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε εάν η επαγωγή της autophagy απαιτήθηκε για Rhabdastrellic οξύ-A μεσολάβηση κυτταρικού θανάτου σε αυτές τις δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Αυτοφαγικά κύτταρα μεγέθυνση χωρίς διαπερατότητα της μεμβράνης του πλάσματος, μετατρέπουν LC3-Ι LC-II, δείχνουν στικτή κυτταροπλασματική LC3 μετατόπιση και την ανάπτυξη autophagosome. Σε αυτή τη μελέτη, Hep3B και Α549 κύτταρα εμφάνισαν μορφολογικές και βιοχημικές λειτουργίες που είναι χαρακτηριστικές κυττάρων που υφίστανται αυτοφαγία, δεν απόπτωση μετά Rhadastrellic οξύ-A θεραπεία. Επίσης, αναστολή ανάπτυξης του Rhabdasterllic οξύ-Α σε κύτταρα Α549 ήταν ασθενέστερη από ότι σε κύτταρα Hep3B. Αλλά Rhabdasterllic οξύ-Α αυξήθηκε περισσότερο LC3-ΙΙ έκφραση. Μετατροπή της LC3-Ι LC3-II μπορεί να παρατηρηθεί σε αυτοφαγία έναρξη. Αλλά μερική LC3-ΙΙ μπορεί να αποικοδομείται όταν ωρίμανση αυτοφαγία. Μόνο έκφραση LC3-II δεν θα μπορούσε να δείξει την ευαισθησία στην αυτοφαγία.

Προηγούμενες μελέτες για το μηχανισμό που διέπουν τη ρύθμιση των αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα έδειξαν ότι η αυτοφαγία ρυθμιζόταν από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης τόσο διαφορετικά όπως η κατηγορία ΙΙΙ ΡΙ 3-κινάση , και ο πρωτεϊνικών κινασών mTOR, ERK, και ρ38. Η ανώμαλη ενεργοποίηση του Akt /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης ενεπλάκη σε μια ποικιλία ανθρώπινων malignances [20], [21], [22], [23], [24], [25], [37]. Η φωσφορυλιωμένη Akt διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε ορισμένες θεμελιώδεις διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, του κυτταρικού θανάτου, κυτταρικής κινητικότητας /προσκόλλησης, ο μετασχηματισμός κυττάρων, και νεοαγγείωση. Όταν ενεργοποιηθεί, Akt δρα ως παράγοντας επιβίωσης, αποτρέποντας την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και αδρανοποίηση FKHR το οποίο είναι γνωστό ότι επάγει την έκφραση των προ-αποπτωτικών παραγόντων όπως συνδέτη Fas [38]. Η αναστολή της mTOR προκαλεί απόπτωση σε ορισμένους τύπους κυττάρων όγκου, ενώ αυτοί ενεργοποιούν αυτοφαγία σε άλλες ρυθμίσεις. Η ραπαμυκίνη, ένας αναστολέας της mTOR, αναφέρθηκε ότι επάγει την κλασική αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε επίσης ότι Rhabdastrellic οξύ-Α ανέστειλε ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι και επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινη λευχαιμία HL-60 κύτταρα [4]. Έτσι, η αναστολή της Akt μπορεί να ενεργοποιήσει κάποιες αυτοφαγία που σχετίζονται με πρωτεΐνες και να προκαλέσει αυτοφαγία. Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, παρατηρήσαμε ότι Rhabdastrellic οξύ-Α θα μπορούσε να αναστείλει την φωσφορυλίωση της Akt σε Hep3B και τα κύτταρα Α549. Η φωσφορυλίωση της mTOR, FKHR και STAT3 επίσης μειωθεί δραματικά μετά Rhabdastrellic οξύ-A θεραπείας. Επιπλέον, έκτοπη συστατική ενεργό Akt έκφραση θα μπορούσε να εμποδίσει την αυτοφαγία που προκαλείται από Rhadastrellic οξύ-A. Στο σύνολό τους, Rhadastrellic οξύ-Α προκαλείται από αυτοφαγία μέσω της αναστολής της Akt μονοπατιού /mTOR.

Εν ολίγοις, οι τρέχουσες μελέτες δείχνουν ότι Rhabdastrellic οξύ-Α σκοτώνει Hep3B και τα κύτταρα Α549 μέσω της επαγωγής της αυτοφαγία. Η αναστολή του μονοπατιού Akt /mTOR παίζει βασικό ρόλο στην Rhabdastrellic οξύ-Α-μεσολάβηση αυτοφαγία. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν συχνά ελαττώματα αυτοφαγία σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα, φαρμακολογική ενεργοποίηση αυτοφαγία μέσω της αναστολής της Akt μονοπατιού /mTOR μπορεί να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα και το όριο ογκογένεση, ειδικά σε καρκίνους με ελαττώματα στην απόπτωση. Η μελέτη μας παρέχει επίσης την απόδειξη ότι Rhabdastrellic οξύ-A αξίζει περαιτέρω έρευνα ως πιθανή αντικαρκινικός παράγοντας ή ο καρκίνος προληπτικό παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ναρκωτικών και αντιδραστήρια

Rhabdastrellic οξύ -Α απομονώθηκε από τον σπόγγο Rhabdastrella globostellata και αρχικά διαλύθηκε σε 100% διμεθυλσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύονται στους -20 ° C. βρωμιούχο Methylthiazolyldiphenyl-τετραζολίου (ΜΤΤ) και 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) αγοράστηκαν από την Sigma Co. (Sigma Aldrich, Μ2128). μέσο RPMI 1640 αγοράστηκαν από την Invitrogen (Invitrogen, 11875).

Οι κυτταρικές σειρές και καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο κύτταρο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα γραμμή Hep3B [39] και το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 επιθηλιακά κυτταρική γραμμή [40] καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμοαπενεργοποιημένο βοοειδούς, πενικιλίνη (50 U /mL), και στρεπτομυκίνη (50 μg /mL). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο 5% CO2.

ΜΤΤ

δοκιμασία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Το απόθεμα των Rhabdastrellic οξύ-Α αραιώθηκε, προστέθηκε στα φρεάτια για την επιθυμητή τελική συγκέντρωση του προσδιορισμού. Μετά από 3 ημέρες έκθεση σε Rhabdastrellic οξύ-Α, 10 μL ΜΤΤ (5 mg /L) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για τέσσερις ακόμη ώρες, έπειτα το υγρό εντός των φρεάτων εξατμίστηκε. 100 μι DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση ανιχνεύθηκε στο 550 μοντέλο αναγνώστη μικροπλάκας με 565 nm μήκος κύματος (Bio-Rad Co., 17024). αναστολή της ανάπτυξης υπολογίστηκε και IC

50 αξία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Bliss.

Annexin V-FITC /PI δοκιμασία χρώσης

Τα κύτταρα με διαφορετικές θεραπείες συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν με 10% 1640 μέσο, ​​ρυθμίζεται η συγκέντρωση κυτταρικού εναιωρήματος σε περίπου 1 × 10

6 κύτταρα /ml, και μεταφέρθηκαν 0,5 ml κυτταρικού εναιωρήματος σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου. Μετά προστέθηκαν 10 μΐ μέσων πρόσδεσης αντιδραστηρίου και 1,25 μΙ αννεξίνης V-FITC, τα κύτταρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και απομακρύνθηκαν μέσα ενημέρωσης. δείγματα Οταν επαναιωρούνται σε 0,5 ml ψυχρού 1 × δεσμευτικό ρυθμιστικό (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20% BSA ρΗ 7,4), τα κύτταρα προστέθηκαν 10 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (30 μg /ml), τοποθετώντας στον πάγο και μακριά από το φως. Η απόπτωση αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) στο μήκος κύματος των 488 nm αμέσως.

κυτταρικού κύκλου

ανίχνευση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν με 1 ml προψυχθέντος αιθανόλης 70% , και μονιμοποιήθηκαν σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά απομακρύνεται η αιθανόλη και προστέθηκαν 0,5 ml διαλύματος χρώσης (50 μg /ml ΡΙ, 100 μg /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), τα κύτταρα επωάστηκαν σε 37 ° C για 30 λεπτά σε ο σκοτάδι. η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) στο μήκος κύματος των 488 nm αμέσως.

χρώση ΡΙ δοκιμασία

τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν με 0.5 ml 0.25% θρυψίνη για 3 λεπτά, συλλέχθηκε και επαναιωρήθηκε με 1 ml προψυχθέντος PBS. Μετά την προσθήκη 0,5 ml διαλύματος χρώσης (50 μg /ml ΡΙ, 100 μg /ml RNaseA, 0,2% Triton-100), τα κύτταρα επωάστηκαν σε 37 ° C για 30 λεπτά στο σκοτάδι. ο κυτταρικός θάνατος ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής ((Beckman Coulter, Fullerton, CA).

συνεστιακή μικροσκοπία και έμμεσο ανοσοφθορισμό

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με pYFP-LC3 για Hep3B και τα κύτταρα Α549. 36 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οξύ Rhabdastrellic-Α και αναλύθηκαν μετά από επιπλέον 36 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα πλακίδια στερεώθηκαν σε αντι-ξεθώριασμα διάλυμα και αποθηκεύτηκε στους 4 ° C. Οι καλυπτρίδες προβολές με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ σάρωσης (Olympus, FV-1000).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με βύθιση σε ένα μίγμα 2,5% γλουταραλδεΰδη, 2,5% παραφορμαλδεΰδη και 0,05% πικρικό οξύ σε ρυθμιστικό 0,067 Μ κακοδυλικού (ρΗ 7.4). Μεταμονιμοποίηση διεξήχθη σε 1% τετροξείδιο του οσμίου ακολουθούμενο από ολονύκτια εμβάπτιση με 0,3% ουρανυλίου διαλύθηκε σε 50 mM ρυθμιστικού μηλεϊνικής (ρΗ 5.0). χρησιμοποιήθηκαν τυπικές διαδικασίες για την αφυδάτωση και την ενσωμάτωση σε Εροη. Λεπτές τομές περαιτέρω χρωματίζονται με κιτρικό μόλυβδο, και εξετάστηκαν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Philip, CN10).

Δυτική

ανάλυση κηλίδος

Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από 4 × 10

5 κύτταρα διάλυση κυτταρικά σφαιρίδια σε 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM Na

2 ΡΟ

4 (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% απροτινίνη, 1 mM phenymethysulfonyl φθορίδιο, 10 mg /mL λευπεπτίνη, 100 mM NaF, 2 mM και Na

3νο

4). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτείνης Bio-Rad. ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE (10 mM Tris-HCl, ρΗ 6.8, 2% SDS, 10% γλυκερίνη, 0,2 Μ DTT) προστέθηκε σε προϊόντα λύσης. Τα προϊόντα λύσης θερμάνθηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά, και 40 μg πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 4-20% SDS-PAGE πηκτή. Αποφασισμένοι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικώς σε νιτροκυτταρίνη και επωάστηκαν διαδοχικά με πρωτογενές αντίσωμα και συζευγμένη με ραφανιδική υπεροξειδάση κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz, sc-2005) ή κατσίκας αντι-κουνελιού-IgG (Santa Cruz, sc-2004). Μετά την πλύση, το σύμπλεγμα δεσμευμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο LumiGLO (Cell Signaling Technology, # 7003) και φιλμ XAR (Kodak, XBT-1) όπως περιγράφεται από τους κατασκευαστές. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: κασπάσης-3 αντίσωμα (Santa Cruz, sc-7272), αντίσωμα PARP (Santa Cruz, sc-7150), αφυδρογονάση αντίσωμα αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (Santa Cruz, sc-47724), αντίσωμα LC3 (Novus βιολογικά, NB100-2220), Atg5 αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου, # 2630), φωσφο-Akt1 /2/3 (Ser473) αντισώματος (Santa Cruz, sc-7985-R), Akt1 αντίσωμα (Santa Cruz, sc-1618) , φωσφο-mTOR (ser2448) αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου, # 2971), mTOR αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου, # 2972), φωσφο-FKHR (ser256) αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου, # 9461), FKHR αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου , # 9462), φωσφο-STAT3 (ser727) αντίσωμα (Santa Cruz, sc-8001-R), STAT3 αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου, # 9132).

πλασμίδια και επιμόλυνση

MYR -Akt1 (ενεργοποιημένη # 21 – 151) ή κενό πλασμίδιο (pUSEamp (+) # 21-147) αγοράστηκαν από την Upstate κύτταρα Hep3B Co. σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Οι επιμολύνσεις των MYR-Akt1 (ενεργοποιημένη) ή κενό πλασμίδιο (vector) διεξήχθησαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτείνεται από τον κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα θετικοί κλώνοι επιλέγονται σύμφωνα με το G418 (1000 μg /mL).

κατασκευάσματα ρετροϊικού Λοίμωξη, και παρεμβολή RNA

Για σταθερή έκφραση ATG5 siRNA, ο ρετροϊικός φορέας ( pSUPER. puro, ένα δώρο του καθηγητή Musheng Zeng, Κέντρο Καρκίνου, η Sun Yat-sen University, Guangzhou, Κίνα) αλληλουχίες RNA που κωδικοποιούν φουρκέτα κατασκευάστηκε. Μια ξεχωριστή μικρή φουρκέτα RN (shRNA) αλληλουχίες κατά ATG5 (shATG5) δημιουργήθηκαν και κλωνοποιήθηκε στο φορέα έκφρασης.