PLoS One: Λιπαρών Οξέων συνθετάση είναι ένας βασικός στόχος σε πολλαπλές Βασικές λειτουργίες των όγκων του καρκίνου του προστάτη: Η πρόσληψη των Ραδιοσημασμένη Acetate ως Predictor της Στοχευμένη Θεραπεία Outcome

Σεπτέμβριος 16th, 2014 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

συνθάσης

λιπαρών οξέων (FASN) έκφραση είναι αυξημένη σε διάφορες μορφές καρκίνου, και αυτή η έκφραση υπερ-συνδέεται με κακή πρόγνωση. Αναστολείς FASN, όπως ορλιστάτη, δείχνουν φέρεται αντικαρκινική δράση έναντι των καρκίνων που υπερεκφράζουν FASN, καθιστώντας FASN ένα υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο. Ωστόσο, οι μεγάλες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης FASN σε επιμέρους όγκους έχουν παρατηρηθεί, και οι μέθοδοι για την πρόβλεψη FASN στόχευση έκβαση της θεραπείας πριν απαιτούμενη επεξεργασία για την αποφυγή περιττών θεραπεία. Επιπλέον, το πώς η αναστολή FASN επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου παραμένει ασαφής. Εδώ, δείξαμε τη μέθοδο για την πρόβλεψη FASN στόχευση έκβαση θεραπείας χρησιμοποιώντας πρόσληψη ραδιοεπισημασμένου οξικού και παρουσιάζονται μηχανισμούς FASN αναστολής με ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές του προστάτη, για την παροχή της θεραπευτικής στρατηγικής της θεραπείας FASN στόχευσης. Εμείς αποκάλυψε ότι η πρόσληψη όγκου του ραδιοσημασμένου οξικού αντανακλούσε τα επίπεδα έκφρασης FASN και της ευαισθησίας στη θεραπεία FASN στόχευση με ορλιστάτη

in vitro

και

in vivo

. FASN-στοχευμένη θεραπεία ήταν αισθητά αποτελεσματικές ενάντια στους όγκους με υψηλή έκφραση FASN, το οποίο υποδεικνύεται από την πρόσληψη υψηλών οξικό. Να εξετάζουν μηχανισμούς, ιδρύσαμε FASN νοκ ντάουν καρκινικά κύτταρα του προστάτη από μεταγωγή μικρής φουρκέτα RNA κατά FASN και διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά από τις αναλύσεις σχετικά με τη μορφολογία και τη συμπεριφορά των κυττάρων και μικροσυστοιχιών με βάση το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης. αναστολή FASN όχι μόνο κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά εμποδίζεται σχηματισμός ψευδοπόδια και κατέστειλε την κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση και εισβολή. αναστολή FASN κατέστειλε επίσης γονίδια που εμπλέκονται στην παραγωγή ενδοκυτταρικής οξέος και ανδρογόνων ορμονών αραχιδονικό δεύτερου αγγελιοφόρου, δύο από τα οποία προάγουν την εξέλιξη του όγκου. Συλλογικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η πρόσληψη ραδιοεπισημασμένης οξικό είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό του FASN στόχευσης έκβαση της θεραπείας. Αυτό υποδηλώνει ότι η [1-

11C] τομογραφία εκπομπής οξικό ποζιτρονίων (ΡΕΤ), θα μπορούσε να είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την επίτευξη εξατομικευμένη θεραπεία FASN-στόχο μη επεμβατική απεικόνιση της πρόσληψης οξικού όγκου και την επιλογή της απόκρισης όγκων. θεραπεία FASN στοχευμένες θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για την καταστολή πολλά βήματα που σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου σε καρκίνους του προστάτη που επιλέγονται από [1-

11C] οξικό PET

Παράθεση:. Yoshii Υ, Furukawa Τ, Oyama Ν, Hasegawa Υ, Kiyono Υ, ΝίδΙιϋ R, et al. (2013) Λιπαρών Οξέων συνθετάση είναι ένας βασικός στόχος σε πολλαπλές Βασικές λειτουργίες των όγκων του καρκίνου του προστάτη: Η πρόσληψη των Ραδιοσημασμένη Acetate ως Predictor της Στοχευμένη Θεραπεία αποτέλεσμα. PLoS ONE 8 (5): e64570. doi: 10.1371 /journal.pone.0064570

Επιμέλεια: Juri Γ Gelovani, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φεβ 2013? Αποδεκτές: 15 του Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2013

Copyright: © 2013 Yoshii et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης, της Ιαπωνίας (JSPs) (έως ΥΥ). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συνθάσης οξύ

λιπαρά (FASN) είναι ένα ένζυμο κλειδί στη σύνθεση των λιπαρών οξέων από ακετυλ CoA, το οποίο εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στο ήπαρ και στο λιπώδη ιστό, αλλά σε χαμηλά επίπεδα σε άλλους ιστούς στον άνθρωπο [1]. FASN υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, του μαστού, του πνεύμονα, των ωοθηκών, της ουροδόχου κύστης, του στομάχου, της στοματικής κοιλότητας και του μελανώματος, και ο υπερ-έκφραση συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [2], [3]. FASN έχει αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση, προστατεύοντας τα κύτταρα από την απόπτωση [2].

Τα τελευταία χρόνια, οι αναστολείς της FASN δείχνουν φέρεται αντικαρκινική δραστικότητα [4]. Η ορλιστάτη, ένας εκλεκτικός αναστολέας της FASN, είναι ένας από αυτούς είναι έτοιμη για την κλινική χρήση, ιδιαίτερα αφού η ορλιστάτη ήδη χρησιμοποιηθεί ως over-the-counter φάρμακο για την παχυσαρκία στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρωπαϊκή Ένωση. Orlistat έχει αναφερθεί ότι εξασκεί αντικαρκινική δραστικότητα με την επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [3], [5]. Έτσι, η θεραπεία FASN στόχευση αναμένεται να είναι αποτελεσματική έναντι όγκων FASN εκφράζουν. Ωστόσο, οι μεγάλες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης FASN σε επιμέρους όγκους παρατηρήθηκε από παθολογική μελέτες [2], [6]. Ως εκ τούτου, κατά την εξέταση της εφαρμογής της θεραπείας FASN στοχευμένες, τις μεθόδους για την πρόβλεψη θεραπευτικό αποτέλεσμα σε επιμέρους όγκους πριν χρειάζονται θεραπεία για τη μείωση της περιττής θεραπείας.

Για να προσεγγίσουμε αυτή την απαίτηση, εστιάσαμε στην πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικό στα καρκινικά κύτταρα. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως πρόσληψη μηχανισμός ραδιοεπισημασμένης οξικού σε καρκινικά κύτταρα? κυτοσολικό ακετυλο-CoA συνθετάση, η οποία μετατρέπει οξικό σε ακετυλο-CoA, υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και παίζει ένα ρόλο στην ενσωμάτωση του ραδιοσημασμένου οξικό και το οξικό ενσωματώνονται σε καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιείται κυρίως για τη σύνθεση λιπαρών οξέων και όχι διάσπαση προς CO

2 μέσω σύνθεσης κύκλος οξύ ή αμινοξύ τρικαρβοξυλικό [7], [8]. Επιπλέον, Yun et al. 2009 έχουν επίσης δείξει ότι η ακετυλο CoA συνθετάση είναι σημαντική σε [1-

11C] οξικό πρόσληψη και να συνδέεται με την σύνθεση οξικό εξαρτώμενη λιπαρού οξέος [9]. Αυτές οι αποδείξεις σημαίνουν ότι οξικού πρόσληψη που προκαλείται από ακετυλο CoA συνθετάση σχετίζεται με τη σύνθεση των λιπαρών οξέων σε όγκους. Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί ότι οι αναστολείς του FASN, συμπεριλαμβανομένων ορλιστάτη, μπορεί να μειώσει την ενσωμάτωση οξικού ραδιοεπισημασμένα σε λιπαρά οξέα σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [5], [10]. Vāvere et al. έχουν δείξει ότι η πρόσληψη οξικό ραδιοεπισημασμένη συσχετίζεται με την έκφραση FASN και [1-

11C] οξικό τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ), το οποίο μπορεί να μη επεμβατικά απεικονίσει πρόσληψη οξικού, είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης FASN σε ξενομόσχευμα του κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη [10]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η πρόσληψη οξικό ραδιοσημασμένο είναι ένα καλό υποκατάστατο δείκτη της έκφρασης FASN σε όγκους. Ως εκ τούτου, η πρόσληψη οξικό ραδιοσημασμένο μπορεί να είναι ένας καλός προγνωστικός δείκτης της FASN στοχευμένες έκβαση της θεραπείας? Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν το αποτέλεσμα της θεραπείας FASN στόχευση μπορεί να προβλεφθεί από την πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικού. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αν η πρόσληψη οξικό ραδιοσημασμένου μπορεί να προβλέψει θεραπευτικό αποτέλεσμα της FASN στοχευμένη θεραπεία με τη χρήση ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη να αποδείξουν δυνατότητα εφαρμογής του [1-

11C] οξικό ΡΕΤ ως προγνωστικός δείκτης της FASN στοχευμένες έκβαση της θεραπείας. Μέχρι στιγμής, σε κλινικές μελέτες, [1-

11C] οξικό ΡΕΤ έχει εφαρμοστεί για την αξιολόγηση των διαφόρων τύπων κακοήθους όγκου [11] – [14]? ως εκ τούτου, αν η σχέση μεταξύ της πρόσληψης ραδιοσημασμένου οξικού και FASN στοχευμένες έκβαση της θεραπείας έχει αποδειχθεί, [1-

11C] οξικό PET θα μπορούσε να εφαρμοστεί άμεσα για να προβλέψει FASN στοχευμένες έκβαση της θεραπείας.

Επιπλέον, οι μηχανισμοί πώς αναστολή FASN επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου δεν έχει ακόμη εξεταστεί επαρκώς και, ως εκ τούτου διαλεύκανση των μηχανισμών που απαιτούνται για να κατανοήσουν τη σημασία της αναστολής FASN και να ενθαρρύνουν τη χρήση της θεραπείας FASN-στόχο. Σε αυτή τη μελέτη, για τη διερεύνηση των μηχανισμών, δημιουργήσαμε FASN καρκίνου του προστάτη knockdown κυττάρων με μεταγωγή βραχείας φουρκέτας RNA (shRNA) έναντι FASN, η οποία μπορεί να επάγει ειδική γονιδιακή σίγηση, και διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά από τις αναλύσεις στη μορφολογία και τη συμπεριφορά των κυττάρων και microarray- με βάση προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Μέσα από αυτές τις μελέτες, συζητήσαμε τη νέα στρατηγική αντιμετώπιση των FASN-στοχευμένης θεραπείας στον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρου Καλλιέργεια

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LNCaP ( CRL-1740), PC3 (CRL-1435), 22Rv1 (CRL-2505), και DU145 (ΗΤΒ-81) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C. RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό και αντιβιοτικά εμβρύου βοοειδών χρησιμοποιήθηκε για μέσο ανάπτυξης. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο κυανού χρωστική αποκλεισμού trypan.

Κυττάρων Η πρόσληψη Μελέτη [1-

14C] Acetate

In Vitro

εξετάστηκε πρόσληψη κυττάρων οξικού [1-

14C] σε LNCaP, PC3, 22Rv1, και τα κύτταρα DU145. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 σε 1 ml μέσου ανάπτυξης ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων και προεπωάστηκαν για 24 ώρες πριν από την πρόσληψη της μελέτης. Μετά από προεπώαση, το μέσο απομακρύνθηκε και 500 μΙ μέσου ανάπτυξης που περιέχει 37 kBq του [1-

14C] οξικού αιθυλεστέρα (2,07 GBq /mmol) (GE Healthcare, κλαδεμένα δέντρα, UK) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Τα προκύπτοντα κύτταρα λύθηκαν με 500 μΙ 0.2 Ν NaOH για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και η ραδιενέργεια του προϊόντος λύσης και υγρό σπινθηριστή (ACSII? GE Healthcare) μίγμα μετρήθηκε με έναν μετρητή Tri-Carb υγρού σπινθηρισμού (PerkinElmer, Wallac, Turku, Φινλανδία). Τα κύτταρα κατεργάζονται με τον ίδιο τρόπο, πριν την λύση των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο κυανού χρωστική αποκλεισμού trypan.

Ανάλυση Western Blot

FASN επίπεδα έκφρασης εξετάστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Τα δείγματα λύθηκαν με ρυθμιστικό λύσης που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Sigma, Saint Louis, ΜΟ, USA) και οι συγκεντρώσεις πρωτείνης προσδιορίστηκαν με Bio-Rad κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου εκτελέστηκε με 20 μg πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας 4% -15% γέλες προκατασκευασμένων TGX mini-Protean (Bio-Rad). Rabbit anti-FASN πρωτογενές αντίσωμα (SC-20140? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντι-β-ακτίνης πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (IMG-5142A? Imgenex, San Diego, CA, USA), και κατσικίσιο αντι- κουνελιού IgG δευτερεύον αντίσωμα (G21234? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν με την ECL Plus Δυτική Σύστημα Ανίχνευσης Blotting (GE Healthcare) και η ένταση ήταν υπολογίζονται πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το λογισμικό J εικόνας (National Institutes of Health).

τηλέφωνα Βιωσιμότητας μετά ορλιστάτη Θεραπεία

Εφέ ορλιστάτης θεραπείας

in vitro

εξετάστηκε με LNCaP, PC3, 22Rv1, και τα κύτταρα DU145. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 σε 100 μΐ μέσου ανάπτυξης ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά την προεπώαση για 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0 μΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ, 50 μΜ, 250 μΜ ή 500 μΜ ορλιστάτη (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ, USA). Η συγκέντρωση της ορλιστάτης αποφασίστηκε με βάση τις προηγούμενες μελέτες [3], [5]. Η ορλιστάτη διαλύεται σε αιθανόλη και προστίθεται στο μέσο ανάπτυξης για να περιέχει λιγότερο από 0,02% αιθανόλη σε τελικό. Μετά από 48 ώρες επώαση με μέσο που περιέχει ορλιστάτη, η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με CellTiter-Glo δοκιμασία φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας (Promega, Fitchburg, WI, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. αντιδραστήριο CellTiter-Glo προστέθηκε απευθείας σε φρεάτια καλλιέργειας, και επωάστηκαν για 10 λεπτά με ανακίνηση. Η φωταύγεια καταγράφηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Κατά τη διάρκεια της 48-h επώαση με ορλιστάτη, το μέσο ανανεώθηκε στις 24 ώρες μετά την έναρξη της θεραπείας.

Η εμφύτευση ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου του Εθνικού Ινστιτούτου Ραδιολογικών Επιστημών (Ιαπωνία). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Εθνικού Ινστιτούτου Ραδιολογικών Επιστημών (Ιαπωνία) (Αριθμός Άδειας: M40-01). NOD.CB17-Prkdc scid /J αρσενικοί ποντικοί (ηλικίας 4 εβδομάδων) λήφθηκαν από Charles River Laboratories (Yokohama, Ιαπωνία). Πριν από τα πειράματα, οι ποντικοί κρατήθηκαν σε ηρεμία για τουλάχιστον 1 εβδομάδα. Για

in vivo

μελέτες, χρησιμοποιήσαμε τρεις αντιπροσωπευτικές κυτταρικές σειρές από την άποψη της έκφρασης FASN? LNCaP (υψηλή έκφραση FASN), PC3 (χαμηλή έκφραση FASN), ή DU145 (πολύ χαμηλή έκφραση FASN). Για να αποκτήσετε ξενομόσχευμα μοντέλα, τα καρκινικά κύτταρα σε 3 × 10

7 για LNCaP και 1 × 10

7 για PC3 και DU145 υποδόρια ένεση σε ποντίκι δεξί ώμο με matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA).

In Vivo

βιοκατανομή

Για τη μελέτη βιοκατανομής, τα ποντίκια με όγκους ξενομοσχεύματος εγχύθηκαν ενδοφλεβίως με 37 kBq [1-

14C] οξικό σε 100 μΙ αλατούχου διαλύματος σε η φλέβα της ουράς και υποβλήθηκαν σε ευθανασία στα 10 λεπτά ή 30 λεπτά μετά την έγχυση (4 ποντίκια ανά ομάδα). Όργανα ενδιαφέροντος (όγκου, των μυών, του πνεύμονα, του ήπατος, του σπλήνα, το πάγκρεας, τα νεφρά και προστάτη) και αίματος συλλέχθηκαν και μετρήθηκε το βάρος του κάθε οργάνου. Τα όργανα υπέστησαν πέψη σε 1 ml Soluene 350 (PerkinElmer) στους 50 ° C για 2 ώρες. Κλάσματα του υπεροξειδίου του υδρογόνου (30% w /v), 2 χ 100 μL, προστέθηκαν διαδοχικά στα δείγματα για τη λεύκανση. μέσου σπινθηρισμού (Hionic-Fluor, PerkinElmer) προστέθηκε πριν από την μέτρηση της ραδιενέργειας σε ένα μετρητή υγρού σπινθηρισμού Tri-Carb (PerkinElmer). δεδομένα βιοκατανομής υπολογίστηκαν ως% ID /g (μέσο ± SD).

Μικρές-Animal PET απεικόνισης με [1-

11C] Οξικό

Για να επιβεβαιώσετε τη βιοκατανομή της πρόσληψης του ραδιοσημασμένου οξικό σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, έγινε μικρών ζώων PET απεικόνισης με [1-

11C] οξικό. [1-

11C] οξικό συντέθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15]. Ραδιοχημική καθαρότητα ήταν & gt? 99%. Δυναμική σαρώσεις PET διάρκειας 60 λεπτών (12 × 5 min) έγινε χρησιμοποιώντας ένα μικρό σύστημα PET ζώων (Inveon, η Siemens Medical Solutions, Malvern, ΡΑ, USA). Κάθε ποντικός εγχύθηκε ενδοφλεβίως με περίπου 18,5 MBq του [1-

11C] οξικού μέσω της φλέβας της ουράς κάτω από 1,5% αναισθησία με ισοφλουράνιο. Η θερμοκρασία του σώματος διατηρήθηκε από μια λάμπα και αντλία θερμότητας κατά τη διάρκεια της σάρωσης. Εικόνες ανακατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 3D μέγιστη εκ των υστέρων με τη χρήση του λογισμικού Inveon Απόκτηση Workplace (Siemens Medical Solutions).

In Vivo

ορλιστάτη Θεραπεία

Τα θεραπευτικά αποτελέσματα της ορλιστάτης ερευνήθηκαν επίσης με ποντικούς ξενομοσχεύματος όγκου. Τα ποντίκια με καθιερωμένες όγκους (0,6-0,9-cm μακρύτερη διάμετρος) τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ορλιστάτη-θεραπείας και ελέγχου (5 ζώα /ομάδα). Η ορλιστάτη (240 mg /kg /ημέρα) εγχύθηκε ί.ρ. ημερησίως για 2 εβδομάδες. Η δόση της θεραπείας προσδιορίστηκε με βάση προηγούμενες μελέτες [3], [5]. Η ορλιστάτη διαλύεται σε 33 μΐ αιθανόλης και αραιώνεται με 66 μΙ αλατούχου διαλύματος λίγο πριν την ένεση. Ως μάρτυρας, η ισοδύναμη ποσότητα του οχήματος ενέθηκε με τον ίδιο τρόπο. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν, και τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες ακρίβεια 3 φορές την εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση: Όγκος του όγκου = μήκος Χ πλάτος

2 × π /6

παρεμβολής RNA (RNAi) Πειράματα

Σε αυτή τη μελέτη, να διερευνήσει ακριβείς μηχανισμοί τρόπο. αναστολή FASN επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου, υιοθετήσαμε FASN νοκ ντάουν κύτταρα LNCaP συστάθηκε με μεταγωγή του shRNA έναντι FASN, η οποία μπορεί να φέρει σταθερή μακροπρόθεσμη ειδική γονιδιακή σίγηση [16]. FASN νοκ ντάουν κύτταρα LNCaP ιδρύθηκαν με μεταγωγή της αποστολής σωματίδια μεταγωγής λεντοϊού (SHCLNV-NM 00410? Sigma) που φέρουν κασέτες έκφρασης που κωδικοποιούν Τα siRNAs που παράγουν μικρό-παρεμβαλλόμενα RNA, κατά FASN, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πέντε κλώνοι Τα siRNAs κατά FASN (TRCN3125, 3126, 3127, 3128, και 3129) χρησιμοποιήθηκαν και κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με κάθε shRNA καθορίστηκαν (ορίζεται FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128. και 3129 κύτταρα, αντίστοιχα). Μη στόχευση shRNA (SHC002V, Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (κύτταρα ελέγχου-RNAi). Κύτταρα (1 χ 10

4) επιστρώθηκαν σε 100 μΙ μέσου ανάπτυξης ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Το μέσο στη συνέχεια άλλαξε σε μέσο ανάπτυξης που περιείχε βρωμιούχο εξαδιμεθρίνης (Sigma) σε τελική συγκέντρωση 8 μg /ml για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητα μεταγωγής. Προστέθηκαν λεντοϊών σωματίδια (5-50 μΐ, 0,5-5 πολλαπλότητα μόλυνσης) και οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, έχουμε επιλέξει σταθερά μεταχθέντα εκφράζουν τις Τα siRNAs με πουρομυκίνη. επίπεδα έκφρασης του mRNA FASN εξετάστηκαν από qRT-PCR για να ελέγξει την αποτελεσματικότητα των νοκ ντάουν. Για qRT-PCR, κυτταρική λύση, απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή, και σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ TaqMan Gene Expression Κύτταρα-to-CT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Expression TaqMan Gene Master Mix (Applied Biosystems) για β-ακτίνη (Hs99999903) και FASN (Hs00188012) με StepOne Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems). FASN mRNA ποσοτικά με τη συγκριτική C

μέθοδο Τ με τη χρήση β-ακτίνης έκφρασης ως ενός ενδογενούς ελέγχου [17].

κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Μορφολογία, μετανάστευση, και εισβολή

κυττάρων συμπεριφορές ήταν εξετάστηκαν με FASN-RNAi 3128 και 3129 και τα κύτταρα ελέγχου RNAi LNCaP. Για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 5 × 10

3 κύτταρα /100 μΐ μέσου ανάπτυξης. Μετά την επώαση πορεία του χρόνου, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασίες φωταύγειας CellTiter-Glo. κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (MDI 4000B? Leica, Solms, Germany). εικόνες time-lapse αποκτήθηκαν κάθε 2 ώρες σε μεγέθυνση 10x για 5 ημέρες χρησιμοποιώντας ένα μηχανοκίνητο ανεστραμμένο μικροσκόπιο (IX 81? Ολύμπου, Tokyo, Japan) εφοδιασμένο με ένα στάδιο κορυφαία θερμοκοιτίδα (Tokai Hit, Fujinomiya, Ιαπωνία) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με Fluoview λογισμικού (Όλυμπος). Για τη μετανάστευση και εισβολή προσδιορισμούς, κυτταρική μετανάστευση CytoSelect 96 φρεατίων και προσδιορισμούς εισβολής (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σε 4 × 10

4 κύτταρα /100 μΐ σε μέσα ελεύθερα ορού τοποθετήθηκαν στην κορυφή καλά και 150 μΙ μέσου που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό τοποθετήθηκε στον πυθμένα καλά, και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν ή να εισβάλει για 24 ώρες πριν την ανάλυση. Top (μη μεταναστεύει ή μη εισβάλλοντα) κύτταρα απομακρύνθηκαν, κάτω (ή μεταναστεύουν εισβολής) κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα χρωστικής και ο φθορισμός καταγράφηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός στα 480 nm /520 nm.

Ανάλυση DNA Microarray

προφίλ γονιδιακής έκφρασης εξετάστηκε με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA με FASN-RNAi 3128 και τα κύτταρα ελέγχου RNAi LNCaP. Ολικά RNAs απομονώθηκαν από κύτταρα με ένα συνολικό σύστημα καθαρισμού RNA Micro-to-Midi (Invitrogen). Η ακεραιότητα του συνόλου των RNAs αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Χαμηλή Input Quick Amp Labeling Kit, ένα χρώμα (Agilent Technologies) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή Cy3-επισημασμένο cRNA στόχου, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επισημαίνονται cRNAs υβριδοποιήθηκαν με SurePrint G3 Ανθρωπίνων GE 8 × 60K μικροσυστοιχίες (Agilent Technologies). Δύο ξεχωριστές υβριδοποιήσεις εκτελέστηκαν για κάθε δείγμα. εικόνες Array συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA σαρωτή (Agilent Technologies), και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση λογισμικού Feature Extraction (Agilent Technologies) για να ληφθεί φόντο διορθωμένη ένταση σήματος. Τα δεδομένα αναλύθηκαν περαιτέρω με GeneSpring GX λογισμικού (έκδοση 11.0, Agilent Technologies). Μετά φιλτράρισμα δεδομένων, mRNAs εκφράζονται διαφορικά στα κύτταρα-στόχους έναντι των μαρτύρων αξιολογήθηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher, που ακολουθείται από πολλαπλές διορθώσεις χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini και Hochberg ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). σύνολα γονίδιο με FDR

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. δεδομένων των μικροσυστοιχιών DNA μπορεί να βρεθεί στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Omnibus υπό τον αριθμό πρόσβασης (GSE39183).

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD.

P τιμές

υπολογίσθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για σύγκριση μεταξύ πολλαπλών ομάδων θεραπείας. Η στατιστική ανάλυση των όγκων του όγκου διεξήχθη με επανειλημμένη ANOVA, ακολουθούμενη από δοκιμή post-hoc κατά Tukey.

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

In Vitro

Μελέτες

Εξετάσαμε τις σχέσεις μεταξύ πρόσληψη ραδιοεπισημασμένου οξικό, έκφραση FASN, και την ευαισθησία στην ορλιστάτη θεραπεία

in vitro

με LNCaP, PC3, 22Rv1, και κυτταρικές γραμμές DU145 (Εικ. 1). [1-

14C] οξικό πρόσληψης μετά από 1 ώρα φαίνεται στο Σχ. 1Α, ανώτερο. Υψηλή πρόσληψη της [1-

14C] οξικό παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP, ενώ ότι σε PC3 και 22Rv1 ήταν χαμηλότερη, και ότι σε DU145 ήταν πολύ χαμηλή (

& lt? 0,05). έκφραση FASN έδειξε μια τάση που συμπληρώνει αυτήν που παρατηρήθηκε στην πρόσληψη της [1-

14C] οξικό (Σχήμα 1Α, κατώτερο.): LNCaP κύτταρα έδειξαν υψηλότερη έκφραση FASN σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές (

& lt ? 0,01). Επιβεβαιώσαμε ότι υπήρχε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της πρόσληψης του [1-

14C] οξικό και την έκφραση FASN (

= 0.93,

& lt? 0,05) (Εικ. 1 C, άνω).

(Α) Η πρόσληψη [1-

14C] οξικό (άνω) και τα επίπεδα έκφρασης FASN (κατώτερο) σε LNCaP, PC3, 22Rv1, και τα κύτταρα DU145. Οι ομάδες με διαφορετικά αλφάβητα είναι σημαντικά διαφορετικές (

& lt? 0,05). (Β) Ποσοστό κυττάρων βιωσιμότητας μετά ορλιστάτη θεραπεία σε LNCaP, PC3, 22Rv1, και τα κύτταρα DU145. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υποδεικνύεται ως ποσοστό του ότι με 0 μΜ ορλιστάτη θεραπεία. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα έναντι της θεραπείας με 0 μΜ για κάθε κυτταρική σειρά (*

& lt? 0,05). (Γ) τη σχέση μεταξύ της πρόσληψης του [1-

14C] οξικό και την έκφραση FASN (άνω), η σχέση μεταξύ της βιωσιμότητας% των κυττάρων μετά από ορλιστάτη θεραπεία σε 12,5 μΜ και η πρόσληψη του [1-

14C] οξικό (μέση), και η σχέση μεταξύ της βιωσιμότητας% των κυττάρων μετά από ορλιστάτη θεραπεία σε 12.5 μΜ και έκφραση FASN (κατώτερο). Οι τιμές από έξι ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD.

Το Σχ. 1Β δείχνει βιωσιμότητα% των κυττάρων μετά από ορλιστάτη θεραπεία

in vitro

. Σύμφωνα με χαμηλή δόση της ορλιστάτης θεραπεία στα 12,5 μΜ, κύτταρα LNCaP, η οποία είχε δείξει την υψηλότερη πρόσληψη της [1-

14C] οξικό και έκφραση FASN, έδειξαν μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων% (

& lt ? 0,05), αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές μειώσεις στην βιωσιμότητα κυττάρου σε% PC3, 22Rv1, και τα κύτταρα DU145. Με 25 μΜ ορλιστάτη θεραπεία, εκτός LNCaP κύτταρα, PC3 και 22Rv1 κύτταρα, τα οποία είχαν δείξει σχετικά χαμηλή πρόσληψη του [1-

14C] οξικό και έκφραση FASN, έδειξαν μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων%, ενώ τα κύτταρα DU145, η οποία είχε δείξει τη χαμηλότερη πρόσληψη [1-

14C] έκφραση οξικό και FASN, δεν έδειξε μείωση στη βιωσιμότητα. Με πάνω από 50 μΜ ορλιστάτη επεξεργασία, όλες οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν έδειξαν μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων%, αλλά οι αλλαγές στα κύτταρα DU145 ήταν μέτρια. Υπήρξε μια σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της βιωσιμότητας% των κυττάρων, και η πρόσληψη του [1-

14C] οξικό και την έκφραση FASN, αντίστοιχα (

= 0.92,

& lt? 0,05?

= 0.97,

& lt? 0.05), σύμφωνα με χαμηλή δόση ορλιστάτη θεραπεία στο 12,5 μΜ (σχήμα 1Γ, μέση και κάτω).. Ότι, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ βιωσιμότητα% των κυττάρων, και η πρόσληψη του [1-

14C] οξικό και έκφραση FASN, αντίστοιχα, κάτω από υψηλή δόση ορλιστάτης θεραπεία. Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν υψηλότερη ευαισθησία στην ορλιστάτη θεραπεία στα κύτταρα με την υψηλότερη έκφραση FASN και η πρόσληψη του οξικού.

Βιοκατανομή και [1-

11C] οξικό αιθυλεστέρα ΡΕΤ Μελέτη με ποντίκια που φέρουν όγκους

για

in vivo

μελέτες, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια που φέρουν LNCaP (υψηλή έκφραση FASN), PC3 (χαμηλή έκφραση FASN), ή DU145 (πολύ χαμηλή έκφραση FASN) όγκους. Επίπεδα FASN έκφραση κάθε ξενομοσχεύματος όγκου επιβεβαιώθηκε πριν από το πείραμα, η οποία έδειξε παρόμοια τάση με το

in vitro

μελέτης (Εικ. S1). Πρώτον, να διερευνήσει την απόλυτη πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικού σε αυτές τις ξενομοσχεύματος όγκους, πραγματοποιήθηκε μελέτη βιοκατανομής. δεδομένα βιοκατανομής ελήφθησαν σε 10 λεπτά και 30 λεπτά μετά την ένεση του [1-

14C] οξικό αιθυλεστέρα (Σχ. 2Α). σημεία χρόνο για τη δειγματοληψία αποφασίστηκαν βασίζεται σε προηγούμενη μελέτη [10]. Βιοκατανομή στο αίμα και φυσιολογικά όργανα έδειξαν ένα παρόμοιο μοτίβο όπως και σε προηγούμενες εκθέσεις [18]. [1-

14C] οξικό καθαρίστηκε από το αίμα στα 30 λεπτά, σε σύγκριση με 10 λεπτά (Σχ. 2Α, αριστερά). Στα 30 λεπτά, LNCaP όγκων (0,27 ± 0,05% ID /g) έδειξε 2,2 φορές υψηλότερη πρόσληψη της [1-

14C] οξικό από τους όγκους PC3 (0.13 ± 0.01% ID /g?

& lt? 0,01) και 5,5 φορές υψηλότερη πρόσληψη από DU145 όγκων (0,06 ± 0,01% ID /g?

& lt?. 0.001) (Σχήμα 2Α, δεξιά). Όγκου-προς-αίμα και ογκο-προς-μυ αναλογίες στα 30 λεπτά ήταν επίσης υψηλότερη σε όγκους LNCaP σε σύγκριση με τους PC3 και DU145 όγκων (Σχ. S2). Στη συνέχεια, μικρό ζώο συντροφιάς με [1-

11C] οξικό διεξήχθη για να επιβεβαιώσει και να συμπληρώσει τα αποτελέσματα της μελέτης βιοκατανομής. Καθώς οι εικόνες αποδεικνύεται, [1-

11C] οξικό έδειξε σαφή συσσώρευση όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος LNCaP, ενώ παρατηρήθηκε μέτρια ή χαμηλή συσσώρευση [1-

11C] οξικό στα PC3 και το μοντέλο ξενομοσχεύματος DU145 (Εικ. 2Β ). Ως εκ τούτου, βιοκατανομή και [1-

11C] οξικό μελέτες ΡΕΤ έδειξαν ότι η πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικού αντανακλά τα επίπεδα έκφρασης FASN και μπορεί να διακρίνει όγκους με υψηλή έκφραση FASN από όγκους με χαμηλή έκφραση FASN.

(Α) Βιοκατανομή σε 10 λεπτά και 30 λεπτά σε όργανα (αριστερά) και κάθε όγκου (δεξιά). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν% ID /g, εκφράζονται ως μέσοι ± SD. Οι ομάδες με διαφορετικά αλφάβητα είναι σημαντικά διαφορετικές (

& lt? 0,05). (Β) εικόνες PET Μικρά-ζώο [1-

11C] οξικό σε 30 λεπτά μετά την ένεση. Κίτρινα βέλη δείχνουν τους όγκους. S = το στομάχι? L = το συκώτι.

FASN-Στοχευμένες Θεραπεία

In Vivo

Εξετάσαμε περαιτέρω την ευαισθησία του FASN-στοχευμένης θεραπείας με ορλιστάτη σε κάθε ξενομόσχευμα όγκου

στο vivo

(Εικ. 3). Σύκο. 3Α δείχνει μέτρηση του όγκου του όγκου. Την ημέρα 14, ο όγκος του όγκου σε LNCaP όγκων αγωγή με ορλιστάτη είχε μειωθεί σημαντικά? 22,0 ± 6,2% του αρχικού όγκου του όγκου. Σε αντίθεση, PC3 και DU145 όγκων αγωγή με ορλιστάτη έδειξε προοδευτική αύξηση του όγκου του όγκου? 238,8 ± 46,6% και 367,1 ± 99,5% του αρχικού όγκου του όγκου, αντίστοιχα. Σύκο. 3Β δείχνει τον όγκο του όγκου σε LNCaP, PC3 και DU145 όγκων αγωγή με ορλιστάτη, που φαίνεται από την άποψη του σχετικού όγκου του όγκου έναντι αρχικό μέγεθος του όγκου κανονικοποιημένη έναντι κάθε μη επεξεργασμένο όγκο στο ίδιο χρονικό σημείο? υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη του όγκου μεταξύ LNCaP, PC3, και όγκους DU145 (

& lt? 0,05). Οι επιδράσεις της θεραπείας ορλιστάτης στο σωματικό βάρος φαίνεται στο Σχ. 3C. η απώλεια βάρους σώματος ήταν λιγότερο από 5% την ημέρα 14. Δεν υπήρξαν εμφανείς αλλαγές στην φυσική κατάσταση (χωρίς ένδειξη βρώμικος παλτό ή διάρροια) κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικού αντικατοπτρίζει την ευαισθησία της θεραπείας FASN στόχευση με ορλιστάτη

in vivo

και FASN στοχευμένη θεραπεία με ορλιστάτη είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική ενάντια στους όγκους με υψηλή έκφραση FASN υποδεικνύεται από υψηλή πρόσληψη του ραδιοσημασμένου οξικού.

(Α) Η ανάπτυξη των όγκων που έλαβαν θεραπεία με ορλιστάτη (240 mg /kg /ημέρα) ή φορέα μόνο καθημερινά για 2 εβδομάδες (αριστερά) σε όγκο ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα. Δεδομένων αντιπροσωπεύει τον όγκο του όγκου (mm

3). Αντιπροσωπευτικές εικόνες αγωγή όγκων κατά την ημέρα 14 (δεξιά). (Β) Σχετική όγκου του όγκου έναντι αρχικό μέγεθος του όγκου κανονικοποιήθηκαν έναντι κάθε μη επεξεργασμένο όγκο στο ίδιο χρονικό σημείο. Οι ομάδες με διαφορετικά αλφάβητα είναι σημαντικά διαφορετικές (

& lt? 0,05). (Γ) Αποτελέσματα της ορλιστάτη θεραπεία στο σωματικό βάρος.

FASN Αναστολή από RNAi

Στη συνέχεια, για να εξετάσει τους μηχανισμούς πώς αναστολή FASN επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου, υιοθετήσαμε FASN νοκ ντάουν LNCaP κύτταρα που λαμβάνονται από shRNA μεταγωγή. Σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε πέντε κυτταρικές σειρές FASN-RNAi, FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128, και 3129 κύτταρα, και qRT-PCR έδειξε μια αξιοσημείωτη μείωση στην έκφραση του mRNA FASN σε FASN-RNAi 3128 κύτταρα και μια μέτρια μείωση σε FASN-RNAi 3129 κύτταρα, σε σύγκριση με τον έλεγχο-RNAi κύτταρα (Σχ. S3). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε την ίδια τάση σε FASN-RNAi 3128 και 3129 κύτταρα σε έκφραση FASN, αντίστοιχα (Σχ. 4Α, αριστερά). Νοκ ντάουν της FASN από RNAi σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε αντίστοιχη μείωση στην ενσωμάτωση οξικό (Εικ. 4Α, δεξιά).

FASN-RNAi 3128 και 3129 κύτταρα και ελέγχου-RNAi κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν. (Α) σχετική έκφραση FASN, αναλύθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση (αριστερά) και την πρόσληψη της [1-

14C] οξικό αιθυλεστέρα (δεξιά). (Β) Cell πολλαπλασιασμός επί 7 ημέρες (άνω, αριστερά). εικόνες οπτικό μικροσκόπιο (επάνω δεξιά). Σχετική μετανάστευση και το δυναμικό εισβολής σε κύτταρα FASN-RNAi, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου-RNAi (κάτω, αριστερά και δεξιά, αντίστοιχα). Οι τιμές από έξι ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. Οι ομάδες με διαφορετικά αλφάβητα είναι σημαντικά διαφορετικές (

& lt? 0,05)..

Είναι ενδιαφέρον, το νοκ ντάουν της FASN προκαλεί παρατηρήσιμες μεταβολές στα βιολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων LNCaP (Σχήμα 4Β ). Εξόντωση FASN ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό που αντιστοιχεί σε μια μείωση στην έκφραση FASN (Σχήμα 4Β, πάνω αριστερά).? υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε FASN-RNAi 3128 και 3129 κύτταρα, σε σύγκριση με τον έλεγχο-RNAi κύτταρα (

& lt? 0,05). Επιπλέον, μικροσκοπική παρατήρηση έδειξε ότι τα κύτταρα ελέγχου-RNAi ήταν ατρακτοειδή με ψευδοπόδια σε τρυβλία καλλιέργειας, ενώ FASN-RNAi 3128 κύτταρα γύρο με ανεπαρκή σχηματισμό ψευδοπόδια και FASN-RNAi 3129 κύτταρα έδειξαν ενδιάμεση μορφολογία (Εικ. 4Β, πάνω δεξιά) . Η κίνηση των κυττάρων σε τρυβλία καλλιέργειας παρατηρήθηκε περαιτέρω με τη χρήση μικροσκοπίου time-lapse (Εικ. 5, βίντεο S1, S2 Βίντεο). Οι ελέγχου-RNAi κύτταρα που συνδέονται με το κάτω μέρος σχηματίζεται ψευδοπόδια πλάκα, έγινε ατράκτου σε σχήμα, και ενεργά μετανάστευσε με την κυτταρική διαίρεση και επιμήκυνση των ψευδοπόδια τους. Ενώ, FASN-RNAi 3128 κύτταρα έδειξαν σχηματισμό ανεπαρκή ψευδοπόδια, έγινε γύρο, και τα κύτταρα διαιρούνται, αλλά έδειξε λιγότερη μετανάστευση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου RNAi. FASN-RNAi 3129 κύτταρα έδειξαν ενδιάμεσο συμπεριφορές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα στοιχεία δείχνουν εικόνες σε κύτταρα ελέγχου-RNAi (Α) και FASN-RNAi 3128 κύτταρα (Β). Εικόνες ελήφθησαν κάθε 6 ώρες για 5 ημέρες. Λευκή αιχμές βελών δείχνουν ένα παράδειγμα του σχηματισμού ψευδοπόδια, ατρακτοειδών μορφολογία, και ενεργό κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα ελέγχου RNAi. Μαύρα βέλη δείχνουν ένα παράδειγμα της ανεπαρκή σχηματισμό ψευδοπόδια, στρογγυλά μορφολογία, και η χαμηλή δραστηριότητα της κυτταρικής μετανάστευσης στα κύτταρα FASN-RNAi 3128.

Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, υποθέτουμε ότι η αναστολή FASN επηρεάζει το μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων. Για να εξεταστεί αυτό, πραγματοποιήθηκε μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή με την FASN-RNAi και κύτταρα ελέγχου-RNAi LNCaP. Βρήκαμε ότι οι FASN-RNAi κύτταρα έδειξαν λιγότερο μετανάστευση και εισβολή αντιστοιχούν σε μειώσεις στην έκφραση του FASN (Σχ. 4Β, κάτω αριστερά και δεξιά). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η αναστολή FASN όχι μόνο κατέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά και μειωμένη κυτταρική προσκόλληση, τη μετανάστευση και την εισβολή.

Gene Expression Προφίλ στο FASN Νοκ ντάουν κύτταρα

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω συνέπειες της αναστολής FASN,

Χρόνιες ασθένειες