Αφηρημένο

Εισαγωγή

κυτοκίνης που προκαλείται από τα κύτταρα φονείς (CIK κύτταρα) είναι μια ετερογενής υποσύνολο των ex-vivo επεκταθεί Τ λεμφοκύτταρα τα οποία χαρακτηρίζονται με ένα MHC-ανεξέλεγκτης δραστηριότητας του όγκου θανάτωση και ένα μικτό φαινότυπο Τ-ΝΚ. Η θετή μεταφορά CIK κύτταρα, μία από τις υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία αντιπροσωπεύει μία πολλά υποσχόμενη μη τοξικό αντικαρκινική θεραπεία. Ωστόσο, στις κλινικές μελέτες, η θεραπευτική δράση της θετής μεταφοράς CIK κύτταρα δεν είναι τόσο αποτελεσματική όσο αναμενόταν. Πιθανές εξηγήσεις είναι ότι η ανώμαλη αγγείωση του όγκου και υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να εμποδίσει τη διείσδυση και την αποτελεσματικότητα των λεμφοκυττάρων. Υποθέσαμε ότι η θεραπεία της αγγειογένεσης θα μπορούσε να βελτιώσει την αντικαρκινική δράση των κυττάρων CIK από την ομαλοποίηση αγγείωση του όγκου και τη διαμόρφωση υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου.

Μέθοδοι

Είμαστε σε συνδυασμό ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ενδοστατίνης (rh-ενδοστατίνη) και τα κύτταρα CIK σε η θεραπεία των μοντέλων ποντικού πνευμονικού καρκινώματος. Έμβια μικροσκοπία, δυναμική αντίθεση ενισχυμένη απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού, ανοσοϊστοχημεία, και κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η αγγείωση του όγκου και υποξικές μικροπεριβάλλον, καθώς και την διείσδυση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος.

Αποτελέσματα

αποτελέσματά μας έδειξαν ότι rh-ενδοστατίνη synergized με θετή μεταφορά CIK κύτταρα να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκινώματος του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι rh-ενδοστατίνη κανονικοποιημένη αγγειακού συστήματος του όγκου και μειωμένη υποξική περιοχή στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Η υποξία ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, κυτταροτοξικότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων CIK in vitro και εμπόδιζε την homing των CIK κυττάρων σε παρέγχυμα του όγκου ex vivo. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η θεραπεία με rh-ενδοστατίνη αύξησε σημαντικά την homing των CIK κυττάρων και μείωσε τη συσσώρευση των κυττάρων του ανοσοποιητικού κατασταλτικής στον ιστό του όγκου. Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού που παράγεται υψηλότερο επίπεδο όγκου-διήθηση λεμφοκυττάρων σε σύγκριση με άλλες θεραπείες.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι rh-ενδοστατίνη βελτιώνει το θεραπευτικό αποτέλεσμα της θετής κυττάρων θεραπείας CIK ενάντια καρκινώματα του πνεύμονα και αποκαλύπτει τους μηχανισμούς της συνεργιστική αντικαρκινική αποτελεσματικότητα, παρέχοντας μια νέα λογική για το συνδυασμό θεραπείας αντιαγγειογένεση με ανοσοθεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Shi S, Wang Ε, Chen Υ, Τραγούδι η, Chen L, Huang G (2013) Συνδυάζοντας Αντιαγγειογενής θεραπεία με θετή κυττάρων ανοσοθεραπεία ασκεί Καλύτερα Αποτελέσματα κατά του όγκου στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μοντέλα. PLoS ONE 8 (6): e65757. doi: 10.1371 /journal.pone.0065757

Επιμέλεια: Juri Γ Gelovani, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 29 Απρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμός Grant: 81101739) και China International Medical Foundation (αριθμός Grant: CIMF-F-H001-023). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια (III ή IV) και διάφορες θεραπείες έχουν προκύψει συμπεριλαμβανομένων χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, θεραπεία με στόχο και ανοσοθεραπεία. Τα CIK κύτταρα είναι ετερογενείς πληθυσμοί κυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινο περιφερικό αίμα ή σπλήνα ποντικών μετά από in vitro επέκταση με ιντερφερόνη-γ, ιντερλευκίνη-2 και αντισώματα αντι-CD3 [2]. CIK κύτταρα διαμεσολαβούν ισχυρός MHC-απεριόριστη κυτταροτοξικότητα έναντι ποικιλίας κυττάρων όγκου και μπορεί να αναγνωρίσει και να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα χωρίς προηγούμενη έκθεση ή πλήρωσης. Υπάρχουν δύο κύριοι υποπληθυσμοί μπορούν να διακριθούν μέσα στο μεγαλύτερο μέρος του πολιτισμού της in vitro επεκτάθηκε κύτταρα CIK, ένα συν-εκφράζουν τα μόρια CD3 και CD56 (CD3

+ CD56

+), ενώ η άλλη παρουσιάζει CD3

+ CD56

– φαινότυπο. Η αντικαρκινική δραστικότητα των CIK κυττάρων έχει αναφερθεί να περιορίζεται κυρίως στο CD3

+ CD56

+ κύτταρα [3]. Η θετή μεταφορά CIK κύτταρα, μία από τις υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία αντιπροσωπεύει μία πολλά υποσχόμενη μη τοξικό αντικαρκινική θεραπεία στη θεραπεία των συμπαγών όγκων πυρίμαχων στις συμβατικές θεραπείες. Ωστόσο, σε κλινικές μελέτες, η θεραπευτική δραστικότητα των CIK κυττάρων μεταφοράς δεν είναι τόσο αποτελεσματική όσο αναμενόταν [4]. Αποτελεσματική θετή μεταφορά κυττάρων αντιμετωπίζει πολλές προκλήσεις, όπως η συστημική ανοσολογική ανοχή και όγκου τοπική ανοσολογική διαφυγής. Η homing ανοσοκυττάρων στην θέση του όγκου μειώνεται και οι κατά του όγκου λειτουργίες του ανοσοποιητικού αναστέλλονται από μικροπεριβάλλον του όγκου και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των κυτταρικών πληθυσμών κατασταλτικής [5], [6]. Έτσι είναι επείγον να βρεθεί μια αποτελεσματική θεραπεία για την ενίσχυση της θετής αποτελεσματικότητα της μεταφοράς των κυττάρων, έτσι ώστε να βελτιωθεί η κλινική επίδραση των ασθενών με καρκίνο.

Έχει προταθεί ότι η αποτελεσματικότητα της ανοσοθεραπεία με βάση κύτταρα θα μπορούσαν να επηρεαστούν από την ακεραιότητα του αγγειακού συστήματος του όγκου και ανοσοκατασταλτικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου [7]. Η υποξία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των ανώμαλων μεταβολικών περιβάλλοντος σε συμπαγείς όγκους. Εκτός από εμπλεκόμενο στην μειωμένη ευαισθησία ακτινοβολίας και αντίσταση στη χημειοθεραπεία, υποξία έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό παράγοντα της ανοσολογικής ανοχής στο μικροπεριβάλλον του όγκου [8], [9], [10]. Πολλές γραμμές αποδείξεως πρότεινε ότι αντιαγγειογένεση παροδικά κανονικοποιημένη αγγειακό σύστημα του όγκου, μειωμένη υποξία ενδο-όγκου και αυξημένη διείσδυση λεμφοκυττάρων σε όγκο, η οποία παρείχε μια λογική για το συνδυασμό θεραπεία αντιαγγειογένεση με θετή ανοσοθεραπεία κύτταρο [11], [12]. θεραπεία αντιαγγειογένεση έχει αναφερθεί ότι αυξάνουν την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας, ακτινοθεραπείας και ανοσοθεραπεία τόσο σε μοντέλα ζώων και στον ανθρώπινο [13], [14], [15], [16]. Ενδοστατίνη είναι θραύσμα 20-kDa του κολλαγόνου τύπου XVIII, ικανή να μειώσει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή ενδοθηλιακών κυττάρων αλληλεπιδρώντας ανβ1, ανβ3, ανβ5 και intergrins στην επιφάνεια των ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVEC) [17]. Στη φάση Ι και κλινικές δοκιμές φάσης II στην Αμερική, ενδοστατίνη έδειξε ελάσσονα την ανταπόκριση καμία αντικαρκινική αν και δεν βρέθηκαν ανεπιθύμητες παρενέργειες. Rh-ενδοστατίνη που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη είναι μια τροποποιημένη μορφή του ενδοστατίνης με μία πρόσθετη αλληλουχία εννέα αμινοξέων η οποία σχηματίζεται μια άλλη δομή του-tag και έχει εγκριθεί για κλινική χρήση από το κράτος Food and Drug Administration στην Κίνα για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου, το 2005 [18]. Έχει αποδειχθεί ότι η rh-ενδοστατίνη θα μπορούσαν να βελτιώσουν την πρόοδο χωρίς την επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) με συνδυασμό χημειοθεραπείας σε τυχαιοποιημένες μελέτες. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι rh-ενδοστατίνη θα μπορούσε να βελτιώσει την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης στη θεραπεία του καρκινώματος του πνεύμονα [19]. Rh-ενδοστατίνη έχει αναφερθεί ότι ενισχύει την radioresponse για ανθρώπινη καρκινώματος με τη βελτίωση της υποξικών μικροπεριβάλλον του όγκου [8], [20]. Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα, δεν υπάρχουν πολλές πληροφορίες διαθέσιμες στην βιβλιογραφία σχετικά με την αντικαρκινική δράση του συνδυασμού rh-ενδοστατίνη με θετή κυτταρική ανοσοθεραπεία. Διενεργήσαμε αυτήν την έρευνα για να καθοριστεί κατά πόσον rh-ενδοστατίνη θα μπορούσε να βελτιώσει την αντικαρκινική δράση της θετής μεταφοράς CIK κύτταρα και να απεικονίσουν τις πιθανές μηχανισμοί με τους οποίους rh-ενδοστατίνη κυκλοφόρησε το πλήρες δυναμικό των υιοθετούμενη κυτταροθεραπεία. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι rh-ενδοστατίνη θα μπορούσε να βελτιώσει τα αποτελέσματα κατά του όγκου των CIK κυττάρων και πρότεινε ότι η συνδυαστική θεραπεία με rh-ενδοστατίνη και CIK κύτταρα που πραγματοποιήθηκε μεγάλη υπόσχεση για τη θεραπεία των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα σταδίου.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

μελέτη των ζώων πραγματοποιήθηκε αυστηρά σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου του Νοσοκομείου Jinling. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Jinling Νοσοκομείου (NO. 2010062412). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη υπό πεντοβαρβιτάλη νατρίου και αναισθησία κεταμίνης και τα ζώα θυσιάστηκαν με υπερβολική δόση των αναισθητικών. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. δείγματα ανθρώπινου αίματος συλλέχθηκαν από ενημέρωσε τους δωρητές και η διαδικασία διεξήχθη σε αυστηρή συμφωνία με τη διαδικασία που έχει εγκριθεί από την Ηθική Επιτροπή του Jinling Νοσοκομείου. δωρητές δείγμα αίματος έδωσαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη.

τηλέφωνα Γραμμές

καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα ποντικού Lewis, ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 και SPC-Α1 αγοράστηκαν από την Σαγκάη Ινστιτούτο βιοχημεία και κυτταρικής βιολογίας (Σαγκάη, Κίνα). HUVECs αγοράστηκαν από KeyGen Biotech (Nanjing, Κίνα). κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα ποντικού Lewis [19] διατηρήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Μέσο Eagle (Invitrogen, USA) συμπληρώνονται με 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνης και 10% βόειο εμβρυϊκό ορό. αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Ανθρώπινα κύτταρα Α549 [8] και SPC-Α1 [21] διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας και αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Gibaco, USA) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνης και 10% ορό εμβρύου μόσχου . HUVECs [22] αναπτύχθηκαν σε F12K (Mediatech) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 10% FBS, 0,1 mg /ml ηπαρίνη, 0,03 mg /ml συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων (Sigma Aldrich). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Ζωικά Μοντέλα

SPF C57BL /6 ποντίκια και BALB /C γυμνά ποντίκια (6-8 παλιά εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Ακαδημία Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης (Πεκίνο, Κίνα), φυλάσσονται στο Τμήμα Ιατρικής Συγκριτική της Jinling Νοσοκομείο και εκτρέφονται υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, και ένα 12-ώρες σκοτάδι, 12 ώρες κύκλο φωτός με αποστειρωμένο φαγητό και νερό κατά βούληση. Ιδρύσαμε τρία μοντέλα ζώων στην παρούσα μελέτη. Δύο μοντέλα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ξενομοσχεύματος καθορίστηκαν με υποδόριο εμβολιασμό των Α549 κυττάρων και κυττάρων SPC-A1 (1 × 10

6 /μl PBS) αντίστοιχα στο δεξί πλευρό του BALB /C γυμνούς ποντικούς. Για το τρίτο μοντέλο όγκου, C57BL /6 ποντικοί προκλήθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με 1 χ 10

6 Lewis κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα σε 100 μΙ PBS. Υποδόρια μεγέθη όγκων μετρήθηκαν καθημερινά με παχύμετρο και όγκων όγκοι υπολογίζεται από τον τύπο:. Ο όγκος του όγκου = 0,52 × μήκος × πλάτος

2

Δημιουργία και κυτταρικό φαινότυπο Ανάλυση της CIK κύτταρα

Τα ανθρώπινα κύτταρα CIK δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, δείγματα αίματος από συναινούντες δότες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση Ficoll-Hypaque φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας (Πεκίνο Chemical Company Αντιδραστήρια, Κίνα) για το διαχωρισμό μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος. Μετά από πλύσιμο στο μέσο, ​​τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (10% FCS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) σε μια πυκνότητα από 2-4 χ 10

6 κύτταρα /ml. Το 1000 U /ml ιντερφερόνης-γ (Peprotech, USA) προστέθηκε την πρώτη ημέρα της καλλιέργειας. Μετά από 24 ώρες, 500 U /ml ιντερλευκίνης-2 (Peprotech, USA) και 50 ng /ml αντι-CD3 αντίσωμα (eBioscience, USA) προστέθηκαν. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και υπο-καλλιεργήθηκαν κάθε 2-3 ημέρες με φρέσκο ​​πλήρες μέσο με 300 U /ml ιντερλευκίνης-2 (Peprotech, USA) για 2 εβδομάδες. Η γενιά των CIK κυττάρων ποντικού από κύτταρα σπλήνας λειτούργησε παρόμοια με εκείνη των ανθρώπινων κυττάρων CIK. Προκειμένου να χαρακτηρισθούν οι φαινότυποι των CIK κυττάρων, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7, 14 και 21 ημέρες συλλέχθηκαν και βάφτηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με τα ακόλουθα FITC ή ΡΕ-συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs): αντι-CD3 και αντι CD56. Με κυτταρομετρία ροής, η έκφραση δεικτών επιφανείας, CD3, CD56 εξετάστηκαν και καταγράφηκαν (Εικ. S2). Όλα τα αντισώματα ελήφθησαν από την (eBioscience, San Diego, CA) με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Συνολικά 100.000 κύτταρα ανά δείγμα αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν σε ένα FACS-Calibur και CellQuest λογισμικού (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Πρωτόκολλο Θεραπεία

BALB /C άτριχων ποντικών προκλήθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με 100 μΐ (1 χ 10

7 /ml) Α549 κύτταρα. Όταν οι όγκοι του όγκου ήταν περίπου 100 mm

3, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (η = 4-5 ανά κάθε ομάδα), και ξεκίνησαν θεραπείες. Η ημέρα κατά την έναρξη της θεραπείας ορίστηκε d0. Η θεραπεία αντιαγγειογένεση σε αυτή τη μελέτη ήταν υποδόρια ένεση των 5 mg /kg rh-ενδοστατίνη για 7 ημέρες και η θετή ανοσοθεραπεία αποτελούνταν από δύο ενδοφλέβιες μετάγγιση των CIK κυττάρων σε d6 και D9 (2 × 10

7 κύτταρα ανά δόση σε ένα συνολικό όγκο 100 μl). Οι λεπτομερείς ομάδων, ήταν ως εξής (Σχ S1.): (1) Ομάδα NS, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό (NS). (2) Ομάδα EN, αντιμετωπίζονται μόνο με Rh-ενδοστατίνη. (3) Ομάδα CIK, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κύτταρα CIK μόνο. (4) Ομάδα EN + CIK, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με rh-ενδοστατίνη ακολουθούμενη από μετάγγιση των CIK κυττάρων. Το σωματικό βάρος και ο όγκος του όγκου καταγράφηκαν καθημερινά. Η συνέργεια των δύο θεραπειών αξιολογήθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:. Q = Ε

Α + Β /[E

Α + (1-Ε

Α) Ε

B] [24]

E

Α + Β, το ποσοστό αναστολής της θεραπείας συνδυασμού.

E

Α, το ποσοστό αναστολής της rh-ενδοστατίνη αντιαγγειογενετικές θεραπεία.

E

Β, το ποσοστό αναστολής της θετής CIK κυττάρων ανοσοθεραπεία

q & lt?. 0.85 σημαίνει ότι οι δύο θεραπείες είναι ο ανταγωνισμός

q & gt?.. 1.15 σημαίνει ότι οι δύο θεραπείες είναι συνέργεια

0.85≤ q ≤1.15 σημαίνει ότι οι δύο θεραπείες είναι αθροιστικές.

Το πείραμα επαναλήφθηκε με τέσσερις ομάδες των C57B /6 ποντίκια που φέρουν καρκίνωμα του πνεύμονα Lewis και τέσσερις ομάδες BALB /C γυμνούς ποντικούς που φέρουν καρκίνωμα του πνεύμονα SPC-Α1.

Προϋποθέσεις Πολιτισμού

Υποξική κατάσταση επώαση πραγματοποιήθηκε σε μια υγροποιημένη, σταθμό αναερόβια έργο θερμοκοιτίδα (Bug Box? ALC International, Cologno Monzese, Μιλάνο, Ιταλία). Ένα αέριο μίγμα 1% O

2, 5% CO

2, και 94% Ν

2 συνεχώς εγχύθηκε σε ένα ρυθμό ροής 25 L /λεπτό μέσα στον επωαστήρα αναερόβια σταθμό εργασίας. Για την νορμοξικά κατάσταση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που αποτελείται από 20% O

2, 5% CO

2, και το 75% Ν

2. Όλα τα αντιδραστήρια περιλαμβανομένων των μεσαίων και πλαστικά υλικά που χρησιμοποιούνται για τα υποξικά αγωγές εξισορροπημένη στο αναερόβιο θάλαμο για να ελαχιστοποιηθεί η μόλυνση με τον αέρα.

καρβοξυφθορεσκεϊνη ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής εστέρας (CFSE) Επισήμανση

Σήμανση των CIK κυττάρων με CFSE διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, ανθρώπινα κύτταρα CIK σημάνθηκαν με CFSE (Molecular Probes Biotec., Τελική συγκέντρωση 5 μmol /L σε PBS) και επωάστηκαν σε 37 ° C για 6 λεπτά. Η αντίδραση σήμανσης σβήστηκε με προσθήκη ψυχρού RPMI-1640 με 10% FCS, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS με 2% FCS για να απομακρυνθεί η περίσσεια CFSE.

καταστολή του πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

CIK κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (10% FCS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) σε πλάκες των 96 φρεατίων κάτω από νορμοξία ή υποξία. Αντι-CD3 αντίσωμα και ιντερλευκίνη-2 προστέθηκαν στο μέσο, ​​προκειμένου να τονωθεί η διαίρεση των κυττάρων CIK. Σαράντα ώρες αργότερα, τα κύτταρα CIK μετρήθηκαν με αιμοκυτταρομετρία υπό μικροσκόπιο φωτός.

κυτταροτοξικότητα in vitro Δοκιμασία

Τα κυτταροτοξικότητες των CIK κυττάρων έναντι κυττάρων-στόχων σε νορμοξικές και υποξικές συνθήκες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CytoTox 96 ® μη ραδιενεργά κυτταροτοξικότητας δοκιμασία-Γαλακτικό δοκιμασία αφυδρογονάσης απελευθέρωσης (Promega, Madison, WI, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 τοποθετήθηκαν σε δύο πλάκες 96 φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν για 48 ώρες με κύτταρα CIK σε 20:01, 40:1 τελεστή-προς-στόχο (Ε-to-T ) αναλογίες. Ένας όγκος 30 μΐ υπερκειμένου κυτταρικής καλλιέργειας μεταφέρθηκε σε διαφανή επίπεδου πυθμένα πλάκες των 96 φρεατίων που ακολουθείται από προσθήκη 30 μΐ υποστρώματος. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου, η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη διαλύματος διακοπής 30 μλ. Στη συνέχεια, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm. Η μέγιστη απελευθέρωση της LDH διεξήχθη με εντελώς λύση κυττάρων-στόχων. Τα κύτταρα στόχοι ή κύτταρα τελεστή μόνη χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι (αυθόρμητη απελευθέρωση). Ο ρυθμός δολοφονία προσδιορίζεται σύμφωνα με τον τύπο: σκοτώνοντας ποσοστό (%) = [(πειραματική μετρήσεις – μετρήσεις ελέγχου τελεστή -target αριθμό αυθόρμητων) /(στόχος μέγιστη μετράει – στόχο έναν αριθμό αυθόρμητων)] × 100

Μετενσάρκωσης. δοκιμασία

δοκιμασία Μετενσάρκωσης έγινε με ένθετα Transwell ™ (Costa, USA) που περιέχει HUVECs πολιτισμό. HUVECs προστέθηκαν στον άνω θάλαμο και επωάστηκαν υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 24 ώρες, αντίστοιχα. Ένα σύνολο 1 × 10

6 CIK κύτταρα σε 200 μΐ RPMI-1640 προστέθηκαν στη συνέχεια επί του στρώματος HUVECs με υπερκείμενο κυττάρων Α549 καλλιέργειας προστίθεται στον κάτω θάλαμο και στη συνέχεια επωάστηκαν κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες για 48 ώρες, αντίστοιχα . Τα CIK κύτταρα που μετανάστευσαν στο κατώτερο θάλαμο συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με αιμοκυτταρομετρία.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Μετά από επώαση σε υποξικές ή νορμοξικά προϋπόθεση καλλιέργεια για 48 ώρες, HUVECs στερεώθηκαν με 70% αιθανόλη για 10 λεπτά και διαπερατά κατά 0,1% TritonX-100 για 5 λεπτά. 5% BSA σε PBS χρησιμοποιήθηκε για να δεσμεύουν τη σύνδεση αντισωμάτων μη ειδικών. Αντι-ΙΟΑΜ-1 αντισώματος (Abcam, Cambridge, ΜΑ) και αντι-VCAM-1 αντισώματος (Abcam, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης της ενδοκυτταρικής συγκολλήσεως μόριο κυτταρικής-1 (ICAM-1) και προσφύσεως αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων μόριο-1 (VCAM-1) με HUVECs. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση της Olympus ΒΧ-60 μικροσκόπιο στα 400 χ μεγέθυνση.

CIK Κύτταρα Πρόσφυση με ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro

Υποσυρρέουσες μονοστιβάδες HUVECs σε πλάκες 6 φρεατίων προεπωάζονται σε υποξικές ή νορμοξικά προϋπόθεση καλλιέργεια για 48 ώρες. Μετά προεπώαση, CIK κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) μεταφέρθηκαν στις καλλιέργειες HUVECs και επωάστηκαν για 24 ώρες κάτω από τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας, όπως το HUVECs. Πωλείται κύτταρα απομακρύνθηκαν με δύο πλύσεις προσεκτική χρήση PBS και τα υπόλοιπα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-ποντικού κουνελιού CD3 αντισώματα (Abcam, Cambridge, ΜΑ) για την ανίχνευση CIK κύτταρα. Εικόνες των προσκολλημένων κυττάρων αποκτήθηκαν με τη χρήση της Olympus ΒΧ-60 μικροσκόπιο σε 200 × μεγέθυνση.

όγκων υποξία Μέτρηση

Η hypoxyprobe ™ -1 σετ (Φυσικό Pharmacia International, Inc, Burlington, ΜΑ, ΗΠΑ, που αποτελείται από 100 mg στερεού πιμονιδαζόλη HCl (hypoxyprobe ™ -1) και μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1. 1.0 ml (Mab1)) χρησιμοποιήθηκαν για να μελετήσει περαιτέρω το φαινόμενο της rh-ενδοστατίνη σε υποξία του όγκου. Η βάση αυτής της μέτρησης είναι ότι πιμονιδαζόλη αναγωγικώς ενεργοποιείται όταν ο ιστός pO

2 είναι κάτω από 10 mmHg και το ενεργοποιημένο ενδιάμεσο μορφές σταθερό ομοιοπολικό προϊόντα προσθήκης με ομάδες θειόλης σε πρωτεΐνες, πεπτίδια και αμινοξέα. Αυτά τα προϊόντα προσθήκης μπορούν να ανιχνευθούν με ανοσοχημική μέσα όταν συνδυάζονται με το Mab1 αντιδραστήριο αντισώματος. Για την ανίχνευση όγκων υποξία, τα ποντίκια επιβαρυνθεί με καρκίνωμα Α549 πνεύμονα δόθηκαν 60 mg /kg σωματικού βάρους πιμονιδαζόλη HCl (hypoxyprobe ™ -1) ενδοπεριτοναϊκώς 4 ώρες πριν θυσιαστούν σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία (ημέρα 3, 6, 9). Οι όγκοι ανατμήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα ποντίκι IgG

1 αντίσωμα. Εικόνες από τις τομές που αποκτώνται με τη χρήση της Olympus ΒΧ-60 μικροσκόπιο στους 100 × μεγέθυνση και υποξικές περιοχές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακή εικόνα λογισμικό ανάλυσης εικόνας J (ΝΙΗ, Maryland, USA).

In vivo Παρακολούθηση των CIK Κυττάρων

Επτά ημέρες μετά τη χορήγηση της rh-ενδοστατίνη, Α549 όγκους ποντίκια που έφεραν μετάγγιση iv με CFSE-επισημασμένα κύτταρα CIK (2 × 10

7 κυττάρων σε ένα συνολικό όγκο 100 ul). Φυσιολογικός ορός χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικό μάρτυρα (η = 4 ζώα ανά ομάδα). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την CIK κύτταρα μετάγγιση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και αιωρήματα απλών κυττάρων σπλήνας και του όγκου του ιστού παρασκευάστηκαν από δύο ομάδες. Ανάλυση του ποσοστού των CFSE-επισημασμένα κύτταρα CIK διεξήχθη σε FACS-Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Δέκα χιλιάδες περιφραγμένη γεγονότα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

κυτταρομετρίας ροής

Επτά ημέρες μετά τη θεραπεία της rh-ενδοστατίνη, που φέρει όγκο C57BL /6 ποντίκια θυσιάστηκαν. Οι όγκοι και οι σπλήνες συλλέχθηκαν και εναιωρήματα μονών κυττάρων παρασκευάστηκαν. Τα ερυθροκύτταρα απομακρύνθηκαν μετά από επώαση σε ρυθμιστικό erylysis [155 mmol /L NH4Cl, 10 mmol /L KHCO3, και 0,1 mmol /L EDTA (ρΗ 7.4)] σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με τα ακόλουθα FITC ή ΡΕ-συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs): αντι-CD11b και Gr-1 για μυελογενή προερχόμενα κατασταλτικών κυττάρων (MDSCs), αντι-F4 /80 και MHC /II για τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ). Όλα τα αντισώματα ελήφθησαν από την (eBioscience, San Diego, CA) με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Συνολικά 100.000 κύτταρα ανά δείγμα αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν σε ένα FACS-Calibur και CellQuest λογισμικού (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

έμβια Μικροσκοπίας και Δοκιμασία αγγειακή διαπερατότητα

Α549 ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με rh-ενδοστατίνη (5 mg /kg, sc) για διαδοχικές 7 ημέρες με φυσιολογικό αλατούχο ως έλεγχο. Τις ημέρες 3, 6 και 9, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση πεντοβαρβιτάλης νατρίου (40 mg /kg σωματικού βάρους) και κεταμίνη (20 mg /kg σωματικού βάρους). Εν συντομία, οι ποντικοί διατηρούνται ζεστά χρησιμοποιώντας μαξιλάρια θέρμανσης σε όλη τη χειρουργική διαδικασία. Ένα στρώμα του δέρματος (12 mm) γύρω από τον όγκο αφαιρέθηκε χειρουργικά να δημιουργήσει ένα παράθυρο παρατήρησης. Μετά την προσθήκη του στείρου PBS, ένα λεπτό αποστειρωμένο φακό επαφής χρησιμοποιήθηκε για την κάλυψη της χειρουργικής θέσης και να παρέχει οπτική πρόσβαση στο αγγειακό δίκτυο του όγκου (Σχ. S3A). Μετά την εγχείρηση, ο ποντικός σταθερό κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού και παρατηρήθηκε η ενδιαφέρει αγγείωση. Μετά την ε.φ. ένεση 20 mg /kg χρωστική Evans Blue (Sigma-Aldrich, USA), η πορεία της διανομής του Evans blue καταγράφηκε για περίπου 10 λεπτά. Η εξαγγείωση του Evans Blue αναλύθηκε στο εγγεγραμμένο βίντεο. Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώθηκαν από δοκιμή εκχύλισης Evans Blue μετά τη λήξη της έμβια εξέταση στο μικροσκόπιο.

Η ανοσοϊστοχημεία

C57BL /6 ποντικοί προκλήθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Lewis. Όταν οι όγκοι του όγκου ήταν περίπου 100 mm

3, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες, ανάλογα με το πρωτόκολλο θεραπείας, και θεραπείες ξεκίνησαν την ημέρα 0. Την ημέρα 14, οι όγκοι από όλες τις ομάδες του πειράματος αφαιρέθηκαν και δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για μελέτες ανοσοϊστοχημείας. Δίπλα τμήματα 3-μm έγιναν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Αντι-ποντικού κουνελιού CD3 αντισώματα (Abcam, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση Τ λεμφοκύτταρα. Εικόνες των τμημάτων αποκτήθηκαν με τη χρήση της Olympus ΒΧ-60 μικροσκόπιο σε 200 × 400 × μεγέθυνση. Ο αριθμός των CD3

+ Τ λεμφοκύτταρα ελήφθη μετρώντας τα CD3-θετικά χρωματισμένα κύτταρα. Τουλάχιστον δέκα τυχαία πεδία αξιολογήθηκαν για κάθε τμήμα με δύο παρατηρητές ανεξάρτητα. αποτελέσματα Συναίνεση χρησιμοποιήθηκαν για τις τελικές τους αριθμούς των Τ λεμφοκυττάρων.

ανοσοφθορισμού

δείγματα όγκου Α549 σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και παρακείμενες 3-μm τομές έγιναν για μελέτες ανοσοφθορισμού. Διαφάνειες ήταν αποπαραφινωμένα σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλες και ξεπλένονται με dH

2O. Τα πλακίδια έβρασαν για 2 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού (Zymed), ψύχθηκε για 15 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται σε PBS για 5 λεπτά. Τα δείγματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε ένα διάλυμα μπλοκαρίσματος, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Αρουραίου αντι-ποντικού CD31 αντισώματα (1:50? Abcam, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για τη χρώση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων, άλφα αντι-ποντικού κουνελιού λείου μυός ακτίνη (α-SMA) αντισώματα (1:200? Abcam, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για να βάψουν περικύτταρα. ιστοί όγκου υπέστησαν διπλή χρώση με αντισώματα αντι-CD31 και αντι-α-SMA. Τα πλακίδια στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν σε δευτερεύοντα αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας συζευγμένο με FITC αντισώματα αντι-αρουραίου και αντισώματα TRITC αντι-κουνελιού κατσίκας. Τα πλακίδια στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS. Εικόνες από τα τμήματα συνελήφθησαν. πυκνότητα μικροαγγειακή (MVD) εκτιμήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από δύο παρατηρητές ανεξάρτητα [26]. Εν συντομία, οι τομές προβληθεί σε χαμηλότερες μεγεθύνσεις (100 ×) για τον προσδιορισμό των δέκα περιοχές που περιέχουν το μεγαλύτερο αριθμό των τριχοειδών αγγείων και μικρά φλεβίδια. Μέσα στην επιλεγμένη περιοχή, CD31-θετικά λεκιασμένα ενδοθηλιακά κύτταρα (MVD) και CD31 /α-SMA διπλό βάφονται τα πλοία μετρήθηκαν σε μεγέθυνση × 400.

Dynamic Contrast Ενισχυμένη Απεικόνιση Μαγνητικού Συντονισμού (DCE-MRI)

ποντίκια που φέρουν όγκο Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με rh-ενδοστατίνη (5 mg /kg, sc) για διαδοχικές 7 ημέρες με φυσιολογικό αλατούχο ως έλεγχο. Τις ημέρες 3, 6 και 9, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και DCE-MRI διεξήχθη. DCE-MRI πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 3 tesla ολόκληρο το σώμα MR-scanner (Siemens Symphony) σε συνδυασμό με ένα μικρό πηνίο ζώο για διέγερση και λήψη σήματος. Μορφολογικά MR-απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ακολουθία εγκάρσια Τ2-turbo-spin echo (επανάληψη του χρόνου, TR 650 ms, χρόνος ηχούς, TE 24 ms, οπτικό πεδίο, FOV 70 × 70 mm2, πάχος τομής 2 mm). Τ1 χάρτη του τμήματος όγκου επιτεύχθηκε με 3 γωνίες Flip (5 μοιρών, 15 μοιρών και 30 μοιρών), και οι τιμές Τ1 υπολογίστηκαν με την εκτίμηση της καμπύλης. Κινητική του παράγοντα αντίθεσης σε όγκους καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα Τ1 ακολουθία αντιστροφής-ανάκτησης FLASH (TR 5 ms, ΤΕ 2 ms, πάχος φέτας 5 χιλιοστών, FOV 55 × 70 mm2). Μετά την έναρξη της μέτρησης DCE-MRI, 0,1 ml (0,1 mmol /kg) του παραμαγνητικού παράγοντα αντίθεσης γαδολίνιο διαιθυλενο-τριαμινο-πεντα-οξικό οξύ (Gd-DTPA) (Bayer-Schering Pharma) εγχύθηκε με το χέρι μέσα σε 5 s στην ουραία φλέβα , 70 δυναμικές σαρώσεις αποκτήθηκαν από ένα τμήμα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το φαρμακοκινητικό μοντέλο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως και παραμετρική εικόνες του Κ

trans (η σταθερά μεταφορά όγκος του παράγοντα αντίθεσης) παρήχθησαν με φαρμακοκινητική ανάλυση της σειράς DCE-MRI [27].

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι διαφορές μεταξύ των τεσσάρων ομάδων συγκρίθηκαν με ANOVA και LSD εφαρμόστηκε για πολλαπλές συγκρίσεις μέσων. Οι συγκρίσεις απλής μέτρηση μεταξύ δύο ομάδες ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας unpaired t-tests. ανάλυση συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ ενδονεοπλαστική υποξία και τη συσσώρευση MDSC. Οι τιμές των p & lt? 0,05 ελήφθησαν ως σημαντική. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS 16.0 (Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Μορφολογία Παρατήρηση και κυτταρικό φαινότυπο της CIK κύτταρα

Σύμφωνα με το μικροσκόπιο, τα κύτταρα CIK έδειξε cluster-όπως ανάπτυξη. Μάζες των κυττάρων CIK σταδιακά πολλαπλασιάζονται και έγινε μεγαλύτερο μετά από 4 ημέρες επώασης. Υπάρχουν δύο κύριοι υποπληθυσμοί των κυττάρων CIK, ένας εκφράζουν τόσο CD3 και CD56 μορίων (CD3

+ CD56

+) και η άλλη παρουσιάζει ένα CD3

+ CD56

– φαινότυπο. Μετά από επώαση για 7, 14 και 21 ημέρες, ανιχνεύθηκαν φαινοτύπους των CIK κυττάρων. Τα ποσοστά των CD3

+ CD56

+ CIK κύτταρα ήταν 8,93%, 23,66% και 17,17% κατά την ημέρα 7, 14 και 21, αντίστοιχα (Εικ. S2).

Συνδυασμός rh-ενδοστατίνη με θετοί CIK κύτταρα Μεταφέρετε σημαντικά αναστέλλει την ανάπτυξη του πνεύμονα in vivo

για να προσδιορίσετε αν η προσθήκη Rh-ενδοστατίνη έχει καμία συνεργιστική επίδραση στην αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της CIK κυττάρων, δημιουργήθηκαν τρία αντιπροσωπευτικά μοντέλα όγκων. Στο μοντέλο καρκινώματος πνεύμονα Α549, βρήκαμε ότι rh-ενδοστατίνη ανάπτυξη ελαφρώς περιορισμένο όγκο σε σχέση με τον έλεγχο του NS, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (929,46 ± 471,70 έναντι 1.251,8 ± 531,75, p = 0,324). CIK κύτταρα θετή θεραπεία μόνη της δεν είχε καμία δραστηριότητα κατά του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο NS (1192,1 ± 621,68 έναντι 1.251,8 ± 531,75, p = 0,852). Αντίθετα, σημαντική (ρ & lt? 0,05) κατά του όγκου δραστικότητα παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με την μονοθεραπεία ή τον έλεγχο NS (Σχήμα 1Α).. E

Α = 1.35, E

B = 1.05, E

ΑΒ = 2,08 και q = 2,71, το οποίο επιβεβαιώνει την αξιολόγηση της συνέργειας. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε καθιερωμένα μοντέλα καρκίνωμα πνεύμονος Lewis και SPC-Α1. Σε SPC-Α1 μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα, σε σύγκριση με τον έλεγχο NS, rh-ενδοστατίνη (1152,8 ± 181,4 έναντι 1.284,7 ± 229,2, p = 0.527) και CIK (1204,1 ± 536,2 έναντι 1.284,7 ± 229,2, p = 0,698) μονοθεραπεία δεν έδειξε κάποια σημαντική αντικαρκινική δράση. Ωστόσο, σημαντική αντικαρκινική επίδραση επιτεύχθηκε σε συνδυαστική θεραπεία (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1Β).. Σε καρκίνωμα πνεύμονα Lewis, ούτε rh-ενδοστατίνη (3394,7 ± 668,4 έναντι 3.866,5 ± 490,62, p = 0,176), ούτε CIK θεραπεία κύτταρα (3429,6 ± 579,12 έναντι 3.866,5 ± 490,62, p = 0,208) και μόνο παρουσίασαν προφανή αναστολή στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με το NS έλεγχος. Ωστόσο, σημαντική συνεργιστική αντικαρκινική δράση δείχθηκε όταν rh-ενδοστατίνη προστέθηκε σε θεραπεία CIK (2037,0 ± 294,6 έναντι 3866,5 ± 490,62, p = 0,000) (Εικ. 1 C). In vivo πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Και παρόμοια αποτελέσματα ήρθαν σε τρία διαφορετικά μοντέλα καρκίνωμα του πνεύμονα τα οποία πρότεινε ότι συνεργικά αποτελέσματα κατά των όγκων ελήφθησαν με συνδυασμό του rh-ενδοστατίνη αντιαγγειογόνο θεραπεία και τα κύτταρα CIK θετή θεραπεία.

BALB /C γυμνά ποντίκια ενέθηκαν s.c. με Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα και όταν οι όγκοι του όγκου έφθασε 100 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες τυχαία και έλαβαν αντίστοιχα πρωτόκολλα σύμφωνα με το σχήμα θεραπείας. ξενομοσχεύματα καρκινώματος πνεύμονα Lewis SPC-Α1 και ιδρύθηκαν και δεδομένου παρόμοιες θεραπείες. Α, συνεργιστική δράση κατά του όγκου φάνηκε όταν rh-ενδοστατίνη συνδυάστηκε με CIK θετή θεραπεία στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου Α549 (ρ & lt? 0,05). Rh-ενδοστατίνη ή θεραπεία CIK μόνα τους δεν καταστέλλουν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Β, rh-ενδοστατίνη παρουσίασαν σημαντική αντικαρκινική δράση όταν χορηγείται σε συνδυασμό με κύτταρα CIK στην αναστολή καρκίνωμα πνεύμονα SPC-A1 (ρ & lt? 0,05). C, συνεργιστική δράση κατά του όγκου φάνηκε όταν rh-ενδοστατίνη συνδυάστηκε με CIK θετή θεραπεία στην καταστολή της ανάπτυξης καρκινώματος πνεύμονα Lewis (ρ & lt? 0,05). Σημεία, μέσα όγκων του όγκου των ποντικών ανά ομάδα? Μπαρ, SE. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Rh-ενδοστατίνη Μειώνει μικροαγγειακή πυκνότητα και προάγει Όγκων του σκάφους Κανονικοποίηση

Σε προηγούμενη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι η πυκνότητα μικροαγγειακή μειώθηκε και η κάλυψη του κολλαγόνου αυξήθηκε κατά rh-ενδοστατίνη στο καρκίνωμα πνεύμονος ποντικού Lewis φέρουν C57BL /6 ποντικούς [19]. Στην παρούσα μελέτη, η πυκνότητα μικροαγγειακή (MVD) αξιολογήθηκε σε ποντίκια που φέρουν Α549 όγκους. Την ημέρα 3, 6 και 9, οι ποντικοί από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν και δείγματα όγκου προετοιμάστηκαν για χρώση ανοσοφθορισμού. Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει? Στήλες, σημαίνει?