Αφηρημένο

Η ακούσια απώλεια βάρους σε ασθενείς με καρκίνο είναι το σήμα κατατεθέν της καχεξίας καρκίνου. Η αιτιολογία της καχεξίας είναι πολυπαραγοντική συνεπάγονται απώλεια των σκελετικών μυών και λιπώδη ιστό που συνδέεται με υψηλά συστημικά επίπεδα πρωτεϊνών οξείας φάσης και φλεγμονωδών κυτοκινών. Ενώ μυϊκή σπατάλη φανερά επιπτώσεις για τον καρκίνο της ποιότητας ζωής των ασθενών, η απώλεια των λιπιδίων αποθήκες αντιπροσωπεύει μια σταθερή ενεργειακή ανισορροπία. Σε αυτή τη μελέτη εξάντληση λίπος εξετάστηκε σε Colon-26 μοντέλο της καχεξίας καρκίνου, το οποίο είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο τρωκτικού του συνδρόμου αυτού. Ερευνήσαμε ημερήσιων έκφραση του κιρκάδιου ρυθμού ρυθμιστικών αρχών καθώς και τα βασικά μεσολαβητές του μεταβολισμού της ενέργειας και της σηματοδότησης κυτοκίνης. Ποντικοί που φέρουν τον όγκο C26 παρουσίασαν μειωμένη μάζα λιπώδους, αυξημένη λιπόλυση του λιπώδους ιστού και ένα 5-φορές αύξηση στα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων στο πλάσμα. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν με ενεργοποιημένο IL-6 σηματοδότηση σε WAT μέσω ενός 3-πλάσια αύξηση στην φωσφορυλιωμένη STAT3 και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υψηλού SOCS3. Σε διαταραχές προσθήκη στην κιρκαδιανού ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων παρατηρήθηκαν επίσης. Λιπιδίων καταβολισμός δεν φάνηκε να επηρεάζεται με το κλασικό μονοπάτι PKA ενεργοποίηση της HSL λιπάσης. επίπεδα πρωτεΐνης ATGL ήταν αυξημένα κατά 2 φορές σε καχεκτικούς ποντίκια ενώ 4-πλάσια αύξηση φωσφορυλιωμένη ACC και ένα 2-φορές μείωση στη φωσφορυλιωμένη 4EBP1 παρατηρήθηκε υποδεικνύοντας ότι ο μεταβολισμός των λιπιδίων διαμορφώνεται από την ATGL Αυξάνεται κυτοκίνη λειτουργική σηματοδότηση κατά τη διάρκεια εξάντληση λιπώδη ιστό; Πώς είναι η ημερήσια έκφραση του πλοιάρχου ρυθμιστές του κιρκάδιου ρυθμού και του μεταβολισμού των λιπιδίων που επλήγησαν κατά τη διάρκεια καχεξία του καρκίνου; Είναι οι κανονικές ημερήσιες επίπεδα των βασικών αισθητήρων και μεσολαβητών της διατροφικής κατάστασης και του μεταβολισμού των λιπιδίων μεταβάλλεται σε WAT;

Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η επίδραση των καχεκτικών παχέος εντέρου-26 καρκινώματος σε λευκό λιποκυττάρων ημερήσια ρυθμικότητα και τη λειτουργία. Αυτό το μοντέλο ποντικού καχεξία του καρκίνου έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη της καχεξίας καθώς παρουσιάζει παρόμοιες λειτουργικές και μεταβολικές διαταραχές με την κλινική κατάσταση [30]. Εμείς χαρακτηριζόμενη ειδικά την ημερήσιων έκφραση γονιδίων σημαντικών για κιρκάδιου ρυθμού και τον έλεγχο του μεταβολισμού των λιπιδίων, καθώς και την κατάσταση ενεργοποίησης των βασικών ρυθμιστές της ομοιόστασης ενέργειας κατά δύο αντίθετες χρονικά σημεία στο ημερήσιο κύκλο. Δείχνουμε ενδείξεις για κυτοκίνη σηματοδότηση μέσω συστατικά του καταρράκτη σηματοδότησης IL-6 – STAT3 και SOCS3. Επιπλέον, αναφέρουμε ότι η διέγερση της λιπολυτικής πορείας WAT του καχεκτικούς ποντικών σχετίζεται με αυξημένη ATGL και perilipin παρά μέσω ΡΚΑ /HSL. Τα δεδομένα μας εντοπίζει πιθανούς cross-talk μεταξύ ΑΜΡΚ, mTOR και 4EBP1 ως σημαντικοί μεσολαβητές της αλλαγμένο μεταβολισμό των λιπιδίων στην καρκινική καχεξία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και μελέτες σε ζώα

Τα 26 κύτταρα καχεξία επαγωγής Colon (C26) είναι μια ποντικού αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου και είχαν ευγενώς σαν δώρο από την Amgen (ΗΠΑ) [31]. κύτταρα C26 αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI (Invitrogen) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen) και 100 μg /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) σε ένα 5% CO

2 περιβάλλον. Παθογόνων-free, 10-12 εβδομάδων αρσενικά BALB /c * DBA2 (F1 Hybrid) ποντίκια αγοράστηκαν από ARC, Perth (Αυστραλία), και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 22 ° C υπό κύκλο 12 ωρών φωτός (τα φώτα άναβαν 6:00 π.μ. – 18 μ.μ.). Colon 26 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε 1 × 10

6 κύτταρα /100 μL στο δεξί πλευρό των ποντικών. Τα ποντίκια ελέγχου ενέθηκαν με 100 μL RPMI μέσο που περιέχει αντιβιοτικά. Σε διάστημα 14 ημερών μετά τον εμβολιασμό, το σωματικό βάρος, την πρόσληψη τροφής και του όγκου διαστάσεις καταγράφηκαν καθημερινά. Όγκου που φέρουν και δωρεάν τρέφονται με ποντίκια ελέγχου είχαν

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή. Μία ομάδα ποντικών ελέγχου ήταν ζεύγος τρέφονται για να ταιριάζει με την ημερήσια πρόσληψη τροφής των καχεκτικών ομάδα C26-ρουλεμάν. Ζεύγος-σίτιση επιτεύχθηκε δίνοντας μη φέρουν όγκο ποντικών ελέγχου της πρόσληψης τροφής του αντίστοιχου C26-ζώων με όγκους. Οι ποντικοί euthanazed με αυχενική εξάρθρωση πριν ιστούς συγκομιδή επιδιδυμίδας λιπώδους που καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο. πειραμάτων σε ζώα πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την αυστραλιανή κώδικα ορθής πρακτικής για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων για επιστημονικούς σκοπούς βάσει του κανονισμού ζώο Ερευνών (2005) της Νέας Νότιας Ουαλίας. Ο αντίκτυπος της ανάπτυξης και της ανάπτυξης της καχεξίας για την καλή διαβίωση των ζώων όγκου θεωρήθηκαν, με τα κατάλληλα μέτρα για να παρακολουθούν και να απαλύνει τον πόνο που εφαρμόζονται, δυνάμει του πρωτοκόλλου # 2007/006 εγκρίθηκε από την επιτροπή Μέριμνας Ζώων του Σίδνεϊ South-West Area Υπηρεσία Υγείας.

Αξιολόγηση της καχεξίας και βιοχημική ανάλυση

Δεκατέσσερις ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων του όγκου, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη /ξυλαζίνη και euthanazed μετά τη συλλογή του αίματος με καρδιακή παρακέντηση. Το καθαρό βάρος των σφαγίων μετρήθηκε. Επιδιδυμικού λίπους συλλέχθηκε, ζυγίστηκε και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κλάσματα του πλάσματος που λαμβάνονται από το αίμα του κάθε ποντικού διατηρήθηκαν κατεψυγμένα μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Η περιεκτικότητα σε μη-εστεροποιημένο λιπαρό οξύ στο πλάσμα των καχεκτικών ζώων προσδιορίσθηκε ενζυματικά χρησιμοποιώντας το κιτ NEFA C (Wako Pure Chemicals /NovaChem, Collingwood, VIC, Αυστραλία). Η περιεκτικότητα των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα της καχεξίας επαγωγής C26 ζώα που φέρουν προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή κλινικής automater (Roche Modular Ε170) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche).

λιπώδη ιστό Ιστολογίας και Μικροσκοπία

δείγματα WAT σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος (Sigma-Aldrich), ενσωματωμένο σε παραφίνη, και 5 μm τομές κόβονται και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Μετά την αφυδάτωση, οι τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η /Ε) για ιστολογική εξέταση με μικροσκοπία φωτός και του λογισμικού CAST πλέγμα (Olympus Corp., Albertslund, Δανία). Μορφολογική ανάλυση διεξήχθη ιστός ελήφθη από 4 ζώα ανά ομάδα (έλεγχος, C26-ποντικών που φέρουν και ζεύγος-FED). επιφάνειας και περιμέτρου εκτιμήθηκαν από περίπου 5-8 διαφορετικών πεδίων ορατότητας ανά εικόνα δίνοντας ένα σύνολο δίνει 250 ανά ζώο, δηλαδή 1000 λιποκύτταρα ανά πειραματική ομάδα.

λιπόλυση των Πολιτισμών Οργάνου Απομονωμένα WAT

γονάδων επιθέματα λίπος αφαιρέθηκαν χειρουργικά και πλύθηκε αρκετές φορές με PBS. τεμάχια ιστού (~ 15 mg) προ-επωάστηκαν για 2 ώρες σε ϋΜΕΜ με την παρουσία ή απουσία 25 μΜ Hi-76-0079 (Νονο Nordisk) σε C37 ° C, 5% CO

2, 95% υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει 2% BSA (χωρίς λιπαρά οξέα) είτε με την παρουσία ή απουσία 10 μΜ φορσκολίνης και 25 μΜ Hi-76-0079 και επωάστηκαν για άλλα 60 λεπτά στους 37 ° C. Κλάσματα του μέσου απομακρύνθηκαν και αναλύθηκαν για FFA και το περιεχόμενο γλυκερόλης χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ (HR Series NEFA-HR (2), WAKO Diagnostics). Για προσδιορισμούς πρωτεϊνών, λίπους επιθέματα πλύθηκαν εκτεταμένα με PBS και λύθηκαν σε 0.3 Ν ΝαΟΗ /0,1% SDS. μετρήσεις πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του αντιδραστηρίου BCA (Pierce).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας SuperScript III με τυχαίους εκκινητές (Invitrogen) και ολίγο (dT) 12-14 (Invitrogen). Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών καταραμένος με τη βάση δεδομένων NCBI γονιδιωματική αλληλουχία ποντικού για να εξασφαλιστεί ειδικότητα για το αντίστοιχο γονίδιο. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρέχονται στον Πίνακα S1. qPCR αντιδράσεις περιείχαν 1,25 ng cDNA, 300 ηΜ γονίδιο-ειδικούς εκκινητές και 12 μι SybrGreen (Invitrogen). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science). Σχετικά επίπεδα mRNA υπολογίστηκαν με τη μέθοδο συγκριτικής κύκλου όριο χρησιμοποιώντας

36Β4

,

TFRC

και

Hmbs

γονίδια, όπως οι έλεγχοι καθαριότητας.

Δυτική Blotting

ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα από λιπώδεις ιστούς ελήφθησαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche) χρησιμοποιώντας ένα γυάλινο ομογενοποιητή και συμπυκνώθηκε με φυγοκεντρική μονάδες φίλτρου σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Cell Signaling Technologies, Millipore) και στη συνέχεια ποσοτικά με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτείνης οξύ (Pierce). Πρωτεΐνες (20 μα) αναλύθηκαν σε 10% Tris-HCl πηκτώματα (Bio-Rad), και στυπώθηκαν (iBlot, Invitrogen), όπως περιγράφεται από τους κατασκευαστές. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-φωσφο-ρ44 κουνελιού /42-ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) -Thr202 /Tyr204, αντι-ρ44 κουνελιού /42-ΜΑΡΚ, αντι-φωσφο-ρ38 κουνελιού ΜΑΡΚ-Thr180 /Tyr182, αντι-p38 κουνελιού ΜΑΡΚ, μετατροπέα αντι-σήμα κουνελιού και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3), αντι-φωσφο-STAT3-Ser727, αντι-ATGL αντι-ορμόνες sensitive- λιπάσης (HSL), αντι-κουνελιού -φωσφο-HSL-Ser563, αντι-ακετυλο-coA-καρβοξυλάσης (ACC), κουνελιού αντι-perilipin, κουνέλι-AMP-ενεργοποιημένη αντι α πρωτεϊνική κινάση (AMPKα), αντι-φωσφο-AMPKα-Thr172, αντι-Raptor κουνέλι , κουνελιού αντι-στόχο θηλαστικού της ραπαμυκίνης (mTOR), κουνελιού αντι-φωσφο-mTOR-Ser2481, παράγοντας έναρξης μετάφρασης κουνελιού αντι-ευκαρυωτικά 4Ε-πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (4EBP1), κουνελιού αντι-φωσφο-4EBP1-Thr37 /46, αντι-κουνελιού -φωσφο-4EBP1-Thr70, κουνελιού αντι-φωσφο-4EBP1-Ser65, κουνελιού αντι-3-υδροξυακυλο CoA αφυδρογονάση (EHHADH /ΡΒΕ) και αντι-βήτα ακτίνης κουνέλι. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα αντι-φωσφο αραιώθηκαν 1:500 ενώ τα υπόλοιπα αντισώματα αραιώθηκαν 1:1000. Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση της αντι-κουνελιού HRP δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας (1:2000) και δυτικά-femto κιτ (Pierce). Εκτός από EHHADH (Abcam) το υπόλοιπο των αντισωμάτων ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με t-tests unpaired Student. Ανάλυση μεταξύ 3 ομάδες (ελέγχου, του παχέος εντέρου-26 και ζεύγος-Fed) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της δοκιμασίας one-way Anova post hoc Τουρκία. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε Ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις του C26 Καρκίνωμα για επιδιδυμικού λευκό λιπώδη ιστό

Το καρκίνωμα Colon26 είναι ένα καλά καθιερωμένο μοντέλο της καχεξίας καρκίνου σε ποντίκια που παρουσιάζουν σημαντική απώλεια βάρους, απώλεια μυϊκής μάζας, μείωση του λίπους και σταδιακή μείωση της πρόσληψης τροφής 14 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις, η μάζα της επιδιδυμίδας WAT ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με το ελεύθερο τρέφονται και του ζεύγους που τρέφονται ελέγχους (Εικόνα 1Α). Εξετάσαμε εάν αυτό δραματική μείωση στο λιπώδη μάζα ιστού ήταν εμφανής στο μικροσκοπικό επίπεδο. χρώση αιματοξυλίνη /ηωσίνη έδειξε σημαντικές μορφολογικές αλλοιώσεις. Λευκό λιποκύτταρα από ποντικούς ελέγχου εμφανίζεται ενιαία εξαγωνικού σχήματος κενοτόπια των λιπιδίων που ήταν μικρότερες στα ζώα ζεύγους-σίτισης και εμφανίστηκε πιο σφαιρική σε καχεκτικούς ποντικούς (Σχήμα 1Β-D). Μορφομετρική ανάλυση έδειξε περαιτέρω σημαντική μείωση σε διατομή και την περίμετρο του λευκού λιποκύτταρα από C26 ποντίκια καχεκτικά σε σύγκριση με το

ad lib

και ζεύγος τρέφονται μη-όγκου που φέρουν τα ποντίκια ελέγχου (Σχήμα 1Ε-1F). Η μείωση του βάρους WAT συνοδεύτηκε από αύξηση στο πλάσμα μη-εστεροποιημένα λιπαρά οξέα (NEFA) σε καχεκτικούς ποντικούς (Σχήμα 1 G) και μια μείωση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα (Εικόνα 1). Για να εξεταστεί η συμβολή του λιπάσες στην κινητοποίηση των τριγλυκεριδίων από το λιπώδη ιστό, προσδιορίσαμε το λιπίδιο δραστηριότητα κινητοποίηση των εκφύτων WAT. Το ποσοστό ελεύθερων λιπαρών οξέων απελευθέρωσης (FFA) ήταν 5 φορές υψηλότερη σε WAT του C26 ποντίκια καχεκτικούς σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου που φέρουν μη-όγκου (Σχήμα 1Θ) με αντίστοιχη αύξηση στην απελευθέρωση γλυκερόλης (Σχήμα 1J). Η προσθήκη του αναστολέα HSL-ειδική (Hi 76-0079) μόνο μειωμένη οριακή απελευθέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων υποδεικνύοντας ότι ATGL είναι το κυρίαρχο λιπάση υπεύθυνη για λιπώδη ιστό λιπόλυση (Σχήμα 1Θ). Να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της καχεξίας επί του συνόλου των λιπιδίων υδρολυτική ικανότητα μετά την ορμονική διέγερση, WAT ιστός υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φορσκολίνη. Μια περαιτέρω αύξηση στην απελευθέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων ήταν εμφανής για τους δύο ποντικούς ελέγχου και C26 καχεκτικά, με καχεκτικά ποντίκια επίτευξη μέγιστος ρυθμός παραγωγής FFA 250 nmol /hr * mg πρωτεΐνης σε σύγκριση με 100 nmol /hr * mg σε ποντίκια ελέγχου (Σχ. 1K) . απελευθέρωση γλυκερόλης έδειξε επίσης ένα υψηλότερο μέγιστο ποσοστό στο C26 έναντι ποντικών ελέγχου μετά από διέγερση των μοσχευμάτων WAT με φορσκολίνη (Εικόνα 1 λίτρο) δείχνει υψηλότερη λιπολυτική ικανότητα των WAT μοσχεύματα από ποντίκια καχεκτικά C26.

(Α) Επιδιδυμιδικού βάρη λιπώδη ιστό από καχεκτικά ζώα κατά την 14η ημέρα μετά τον εμβολιασμό του όγκου (

*** P & lt? 0.001,

¥¥¥ P & lt? 0,001 vs ζευγάρι που τρέφονται)? (Ο-Ε) χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης και (Β-Ρ) ποσοτικοποίηση του μεγέθους των λιποκυττάρων από καχεκτικά και ποντικούς ζεύγους-σίτισης. (G) κυκλοφορούντα επίπεδα μη εστεροποιημένων ελεύθερων λιπαρών οξέων στο πλάσμα του καχεκτικών ζώων (* Ρ & lt? 0,05? Vs ελέγχου)? (Η, Ι) σε ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) και την απελευθέρωση γλυκερόλης από εκφυτεύματα WAT λαμβάνονται από ποντικούς που φέρουν όγκο ελέγχου και C26 υπό βασικές συνθήκες με την παρουσία και απουσία του αναστολέα HSL Hi 76-0079? (J, K) ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) και την απελευθέρωση γλυκερόλης από μοσχεύματα WAT υπό φορσκολίνη διεγείρεται συνθήκες με την παρουσία ή απουσία του Hi-76-0079. Για ένα, οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση ± s.e.m. για 8-10 ζώα ανά ομάδα. Για Β, Γ και Δ εκπρόσωπος εικόνες που παρουσιάζονται από την H & amp? Ε εικόνες που λαμβάνονται από 4 ζώα ανά ομάδα. Για τα Ε και F τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± ως s.e.m. για 4 ζώα ανά ομάδα. Περίπου 250 λιποκύτταρα μετρήθηκαν ανά ζώο δίνοντας συνολικά 1000 λιποκύτταρα από κάθε ομάδα. Τα G και Η τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. για 4 ζώα ανά ομάδα. Για Οι τιμές Ι-Κ που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. για 5 ζώα ανά ομάδα.

Η

Ενεργοποίηση της IL-6 μονοπάτι σηματοδότησης σε C26 καχεξία

Οι κυτοκίνες όπως η IL-6 φαίνεται να είναι βασικοί παράγοντες της διαδικασίας της σπατάλης σε αυτή την καχεξία του καρκίνου μοντέλο [12]. Για να καθοριστεί εάν ενεργή σηματοδότηση κυτοκίνης είναι παρούσα στα λιποκύτταρα από καχεκτικά ποντίκια ερευνήσαμε την ημερήσιων έκφραση mRNA του SOCS3, και φωσφορυλίωση του STAT3 (σχήμα 2). επίπεδα μεταγραφή SOCS3 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλα τα χρονικά σημεία σε καχεκτικά ποντίκια. Υπάρχει επίσης αυξημένη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 (Ser727) παρουσία του όγκου C26. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ενεργό σηματοδότησης καθοδικά του υποδοχέα της IL-6 σε WAT του καχεκτικούς ποντίκια που μπορεί να επηρεάσουν λιπίδιο μεταβολικές οδούς σε καχεκτικούς ποντικούς.

Ημερήσια έκφραση του mRNA του SOCS3 mRNA σε λευκό λιπώδη ιστό από ποντίκια ελέγχου (λευκό κύκλο) και καχεκτικά ποντίκια (μαύρο τετράγωνο) (

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0,01,

*** P & lt? 0.001 έναντι ελέγχου). Οι 6 αξίες π.μ. αναπαραχθεί στο γράφημα για να τονίσει ημερήσιων ρυθμικότητα. τιμές έκφρασης του mRNA είναι μέσες ± s.e.m. σχέση με τους ελέγχους για 4-6 ζώα ανά ομάδα. κηλίδα Western και πυκνομετρική ανάλυση της πρωτεΐνης STAT3 και φωσφο-STAT3 (Ser727), στο λευκό λιπώδη ιστό από καχεκτικά και τον έλεγχο των ζώων.

Η

Επίδραση του Καρκίνου καχεξία στην Ημερήσια πρότυπο έκφρασης της λιπογένεσης Pathway

για να εξετάσει τον αντίκτυπο της καχεξίας καρκίνου στο

de novo

σύνθεση των λιπαρών οξέων στο WAT ερευνήσαμε την ημερήσια προφίλ έκφρασης των μεταβολικών γονιδίων και παραγόντων πυρηνικής μεταγραφής εμπλέκονται στη λιπογένεση. Λιποπρωτεΐνης λιπάσης (LPL) είναι ένα ένζυμο κλειδί που εμπλέκονται στην υδρόλυση TG λιποπρωτεϊνών να απελευθερώσει τα λιπαρά οξέα για πρόσληψη σε κύτταρα. Στα ποντίκια ελέγχου τα επίπεδα μεταγραφής του δεν επέδειξαν κανένα ημερήσιο ρυθμό, ενώ σε καχεκτικούς ποντίκια επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά βρεγμένο στα περισσότερα χρονικά σημεία (Σχήμα 3). Μαζί με

LPL

, η έκφραση του

ap2

μειώθηκε, ενώ

CD36

δεν είχε μεταβληθεί σε WAT των καχεκτικών ποντίκια υποδεικνύει κάποιο βαθμό καταστολής στην πρόσληψη ή ενδοκυτταρική διακίνηση των λιπαρών οξέα (Σχήμα S1). PPAR είναι ο κυρίαρχος παράγοντας της πυρηνικής μεταγραφής που ρυθμίζουν το μεταβολισμό των λιπιδίων στα λιποκύτταρα. Στα ποντίκια ελέγχου,

PPAR

και συνδέονται στόχος γονίδια

Fas

και

Dgat2

κορυφώθηκε κατά τη διάρκεια του κύκλου φωτός, ενώ στον φέροντα όγκο ζώα καχεκτικό ρυθμικότητα χάθηκε και τα επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά μειωμένη στα περισσότερα χρονικά σημεία. Ομοίως

SCD 1

παρουσίασαν μειωμένη έκφραση mRNA σε καχεκτικά ποντίκια. C /EBPα είναι σημαντική για αδιπογένεσης και τη φυσιολογική λειτουργία των λιποκυττάρων. Κατά τον έλεγχο ποντίκια

C /ebpα

δεν επιδεικνύουν μία ημερήσια πρότυπο έκφρασης, ενώ σε καχεκτικούς ποντίκια επίπεδα μεταγραφής ήταν σημαντικά μειωμένα όλη την ημέρα. Ενδιαφέρον άμεσες συγκρίσεις στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου για

Fas

και

C /ebpα

μεταξύ ποντικών ζευγάρι που τρέφονται και καχεκτικά ποντίκια στατιστικά σημαντικές διαφορές στις δύο χρονικό σημείο που υποδεικνύει ότι η σύνθεση των λιπιδίων μπορεί να επηρεάζεται κυρίως κατά τη διάρκεια της καχεξίας και όχι τόσο πολύ κατά τη διάρκεια του θερμιδικού περιορισμού.

ανάλυση του mRNA της

Pparγ

,

C /ebpα

,

LPL

,

Fas

,

SCD 1

,

Dgat2

, απομονωμένη από WAT ελέγχου (λευκό κύκλο), και C26-φέρουν τα ποντίκια (μαύρο τετράγωνο)? Οι τιμές είναι μέσες ± s.e.m. παρουσιάζονται ως ποσοστά σε σχέση με τους ελέγχους για 4-5 ζώα ανά ομάδα (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001 C26 vs ελέγχου). Οι 6 αξίες π.μ. αναπαραχθεί σε κάθε γράφημα για να απεικονίζουν έναν πλήρη κύκλο 24-h.

Η

PKA-επαγόμενη Λιπολυτικές δρόμος δεν Ενισχυμένη στον καρκίνο καχεξία

Η διέγερση της απελευθέρωσης ελεύθερων λιπαρών οξέων από τριγλυκερίδια ήταν πιστεύεται ότι διαμεσολαβείται κυρίως μέσω πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ), η οποία φωσφορυλιώνει άμεσα perilipin και ορμόνη ευαίσθητη λιπάση (HSL) και επίσης επηρεάζει την λιπώδη λιπάση τριγλυκεριδίων (ATGL), έστω και εμμέσως. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν προσδιορίσει ΑΜΡΚ μεσολάβηση φωσφορυλίωση ATGL και αλληλεπιδράσεις με CGI-58 ως καθοριστικό για μέγιστη δραστικότητα ATGL υδρολάσης [27]. Εκτιμήσαμε αν λιπόλυση επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση της οδού ΡΚΑ κατά τη διάρκεια της εξάντλησης των WAT στην καρκινική καχεξία. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Α, παρατηρήσαμε μια μικρή μείωση στη φωσφορυλιωμένη PKA και τα συνολικά επίπεδα PKA στις 2 το πρωί, ενώ στις 14:00 παρατηρήθηκαν εμφανείς μεταβολές μεταξύ ελέγχου και καχεκτικά ζώα (Εικόνα S2). τα επίπεδα έκφρασης του mRNA εμφανίστηκε μειωμένη, ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης συνολική και φωσφο-HSL ήταν αμετάβλητες είτε σε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της καχεξίας καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον ότι σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές μεταξύ του ελέγχου και οι ποντικοί ζεύγους-σίτισης (Εικόνα S3), ενώ στο επίπεδο πρωτεΐνης, παρατηρήσαμε αυξημένη φωσφορυλίωση τόσο ΡΚΑ και HSL στις 2 π.μ. (Σχήμα S3). Perilipin είναι μια βασική πρωτεΐνη επίχρισμα λιπιδίων για το σχηματισμό του λίπους σταγονιδίων και επηρεάζεται άμεσα από την PKA. Ερευνήσαμε αν καρκινική καχεξία επηρέασε τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του perilipin και βρέθηκε καμία εμφανή ημερήσιο ρυθμό στα επίπεδα μεταγραφής του perilipin στα ποντίκια ελέγχου, ενώ η έκφραση ήταν μειωμένη σε καχεκτικούς ζώα (Σχήμα 4Β). Ωστόσο Western ανάλυση έδειξε αυξημένα επίπεδα perilipin πρωτεΐνης στα δύο χρονικά σημεία (Σχήμα 4C, το Σχήμα S2). ATGL είναι η κρίσιμη λιπάση που εκκινεί το πρώτο βήμα στην τριγλυκεριδίων αποικοδόμηση. Εμείς δεν τήρησε κιρκαδικό ρυθμικότητα στην έκφραση του γονιδίου αυτού και δεν υπήρχε καμία επίπτωση στην ATGL mRNA κατά τη διάρκεια καρκινική καχεξία. Ωστόσο, ανάλυση Western αποκάλυψε αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης ATGL για τα δύο χρονικά σημεία σε WAT από C26 που φέρουν όγκο ζώα (Σχήμα 4, Σχήμα S2). Παρόμοια με την προφανή ασυμφωνία σε perilipin πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA, φαίνεται ότι ATGL κατά κύριο λόγο ρυθμίζεται σε μια μετα-μεταγραφικό επίπεδο σε καχεξία. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι κατά τη διάρκεια όψιμο στάδιο της καχεξίας, κινητοποίηση λίπους από WAT του C26 ποντίκια δεν προκαλείται από την οδό ΡΚΑ να διεγείρουν HSL μεσολάβηση λιπόλυση, αλλά συνδέεται με αυξημένη πρωτεΐνη ATGL.

(Α) ανάλυση mRNA του

Hsl

γονιδιακή έκφραση και ανάλυση Western blot της φωσφο-PKA (Thr197), συνολικής PKA, φωσφο-HSL και των ολικών πρωτεϊνών HSL στις 2 το πρωί και 14:00? (Β) ανάλυση του mRNA της

Atgl

και

Perilipin

γονιδιακής έκφρασης από WAT ελέγχου (λευκό κύκλο), και C26 ποντίκια που φέρουν όγκο (μαύρο τετράγωνο)? Οι τιμές είναι μέσες ± s.e.m. παρουσιάζονται ως ποσοστά σε σχέση με τους ελέγχους για 4-5 ζώα ανά ομάδα (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001, C26 vs ελέγχου). Οι 6 αξίες π.μ. αναπαραχθεί σε κάθε γράφημα για να απεικονίζουν έναν πλήρη κύκλο 24-h? (C) ανάλυση Western blot των ATGL και PERILIPIN πρωτεϊνών στις 2 μ.μ. και δύο.

Η

ενόχλησή της ημερήσιας έκφραση της χρησιμοποίησης των λιπαρών οξέων μονοπάτι στο καχεκτικός ποντίκια.

Μια σημαντική λειτουργία του WAT είναι η κατανάλωση των λιπιδίων μέσω της ενεργοποίησης του β-οξείδωση των λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια και υπεροξυσωμάτων. Για να κατανοήσουμε τον ρόλο του WAT στην παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων ως πηγή καυσίμου κατά τη διάρκεια της καρκινικής καχεξίας, ερευνήσαμε την έκφραση ημερήσιων παραγόντων μεταγραφής που εμπλέκονται στη ρύθμιση του καταβολισμού των λιπαρών οξέων και αντίστοιχα γονίδια στόχου (Σχήμα 5Α). Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις,

ΡΡΑΚα

εκτίθενται κιρκαδικό ταλάντωσης, ενώ

ΡΡΑΚδ

δεν παρουσιάζουν ρυθμικότητα σε ποντίκια ελέγχου. Δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή εμφανής είτε για

PPARα

ή

ΡΡΑΚδ

μεταξύ ελέγχου και καχεκτικά ποντίκια. Ομοίως

Pgc1α

είχε μια χαρακτηριστική ημερήσια μοτίβο της έκφρασης, αλλά ήταν αμετάβλητη στο WAT της καχεκτικά ποντίκια.

Nrf1

, ένας ρυθμιστής κλειδί της μεταβολικής γονίδια που εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή αναπνοή, δεν έδειξε κιρκαδικού ταλάντωσης, ωστόσο ήταν σημαντικά αυξημένη σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές στη διάρκεια της περιόδου 24 ωρών. Tfam είναι ένας κύριος ρυθμιστής της μιτοχονδριακής βιογένεσης. επίπεδα μεταγραφής του δεν εμφανίζει ρυθμικότητα και σημαντικές αλλαγές δεν ήταν εμφανής κατά τη διάρκεια της καχεξίας καρκίνου. Ομοίως με

Tfam

, η έκφραση της καρνιτίνης παλμιτοϋλο τρανσφεράσης 1α (

Cpt1α)

που απαιτούνται για την πρόσληψη των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας στα μιτοχόνδρια διατηρήθηκε σε C26 ζώα που φέρουν όγκο. Το γονίδιο στόχος PPAR, peroxisomal διλειτουργικό ένζυμο (

ΡΒΕ

) που συμμετέχουν στην peroxisomal λιπαρού οξέος β-οξείδωση, παρουσιάζει μια ημερήσια αιχμή στις 10 μ.μ. στο σκοτάδι κύκλο σε υγιή ποντίκια. WAT από καχεκτικά ποντίκια έδειξαν υψηλότερη αφθονία

PBE

mRNA σε περισσότερες φορές, καθώς και μια σημαντική πρόοδο φάση των 12 ωρών, και κορυφώθηκε σε δέκα (Σχήμα 6Α). Επιπλέον παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές μεταξύ καχεκτικά ποντίκια και ποντίκια ζευγάρι που τρέφονται στις 14:00 (Σχήμα S4). Περαιτέρω απόδειξη της ενισχυμένης peroxisomal β-οξείδωσης είναι το υψηλότερο επίπεδο πρωτεΐνης του ΡΒΕ σε καχεκτικούς ζώα τόσο σε 2 π.μ. και 2 μ.μ. (Σχήμα 5Β, Εικόνα S4). Ωστόσο, φαίνεται ότι άλλα στοιχεία της χρησιμοποίησης των λιπαρών οξέων, όπως ΑΟΧ, Hadha και HADHB είναι αναλλοίωτα (Σχήμα S5).

(Α) ανάλυση του mRNA της

ΡΡΑΚα, Pgc1α, ΡΡΑΚδ

,

Nrf1, Tfam, Cpt1α

και

PBE

από WAT ελέγχου (λευκό κύκλο) και C26 ποντίκια όγκου οποία φέρουν το (μαύρο τετράγωνο)? Οι τιμές είναι μέσες ± s.e.m. παρουσιάζονται ως ποσοστά σε σχέση με τους ελέγχους για 4-5 ζώα ανά ομάδα (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? C26 vs ελέγχου). Οι 6 αξίες π.μ. αναπαραχθεί σε κάθε γράφημα για να απεικονίζουν έναν πλήρη κύκλο 24-h? (Β) ανάλυση Western blot των PBE πρωτεΐνης στις 2 μ.μ. και δύο χρονικά σημεία.

Η

(Α) ανάλυση του mRNA της

Ampkα1, Ampkα2

και

Acc

από WAT ελέγχου (λευκό κύκλο), και C26-φέρουν τα ποντίκια (μαύρο τετράγωνο)? (Β) ανάλυση Western blot της φωσφο-ΑΜΡΚ (Thr192) και το συνολικό ΑΜΡΚ στις 14:00 και δύο? ανάλυση ανοσοκηλίδος της φωσφο-ACC και το συνολικό ACC για τα δείγματα WAT 14:00. (C) ανάλυση του mRNA της

mTOR

και

4Ebp1?

Από WAT ελέγχου (λευκό κύκλο), και C26-φέρουν τα ποντίκια (μαύρο τετράγωνο)? (Δ) ανάλυση Western blot της φωσφο-mTOR (Ser2448) συνολικού mTOR, φωσφο-4EBP1 (Ser65), φωσφο-4EBP1 (Thr37 /46) και το συνολικό 4EBP1 στις 14:00 και δύο. Οι τιμές είναι μέσες ± s.e.m. παρουσιάζονται ως ποσοστά σε σχέση με τους ελέγχους για 4-5 ζώα ανά ομάδα (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? C26 vs ελέγχου). Οι 6 αξίες π.μ. αναπαραχθεί σε κάθε γράφημα για να απεικονίζουν έναν πλήρη κύκλο 24-h.

Η

Ενεργοποίηση της AMPK Pathway σε C26-φέρουν Ζώα

AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της ενεργειακής ομοιόστασης, ανταποκρινόμενη στις αυξημένες AMP: αναλογίες ATP με την τόνωση οξείδωση των λιπαρών οξέων και την αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης [32]. Ένας από τους πρωταρχικούς ρόλους των ΑΜΡΚ είναι η φωσφορυλίωση και την επακόλουθη αναστολή της ακετυλο CoA καρβοξυλάσης (ACC), το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στη σύνθεση των λιπαρών οξέων.