Αφηρημένο

Εξελίξεις στους τομείς του καρκίνου κύτταρα έναρξης και υψηλής απόδοσης

in vivo

shRNA οθόνες έχουν τονίσει την ανάγκη να παρατηρηθεί η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε μοντέλα του καρκίνου σε κλωνική επίπεδο. Ενώ

in vivo

καρκίνο ετερογένεια της κυτταρικής ανάπτυξης σε ξενομοσχεύματα έχει περιγραφεί, έχει ακόμη να μετρηθεί. Εδώ, ελέγξαμε μια προσέγγιση για την ποσοτικοποίηση της κλωνική ανάπτυξη ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων σε υποδόρια μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. Χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αλληλούχισης υψηλής απόδοσης, ακολουθήσαμε την τύχη

in vitro

και

στο viv

o δέκα χιλιάδες κύτταρα HCT-116 μεμονωμένα ετικέτα με ένα μοναδικό barcode που παραδίδονται από λεντοϊού μεταγωγή. Ενώ η αύξηση

in vitro

ήταν λιγότερο ομοιογενής από ό, τι αναμενόταν, έχουμε βρει ακόμα ότι το 95% των τελικών κυττάρων που προέρχονται από το 80% των αρχικών κυττάρων. Σε ξενομοσχεύματα, ωστόσο, το 95% των ανακτημένων γραμμωτό κωδικό κύτταρα προήλθαν από μόνο το 6% των αρχικά ένεση κύτταρα, ένα έχουμε όρος αποτέλεσμα «κλωνική κυριαρχία». Παρατηρήσαμε αυτήν την κλωνική κυριαρχία σε δύο επιπλέον μοντέλα ξένου μοσχεύματος (MDA-MB-468 και Α2780

cis) και σε δύο διαφορετικά στελέχη υποδοχής (NSG και Γυμνό). Με ακριβώς και επαναλήψιμα ποσοτικοποίηση κλωνική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vivo

, διαπιστώνουμε ότι ένα μικρό υποσύνολο των κλώνων αντιπροσωπεύει τη μεγάλη πλειονότητα των κυττάρων απόγονος, ακόμη και με HCT-116, μία κυτταρική σειρά που αναφέρθηκαν να στερούνται έναν όγκο -initiating διαμέρισμα. Η στοχαστική

in vivo

διαδικασία επιλογής που περιγράφουμε έχει σημαντικές συνέπειες για τους τομείς της

in vivo

shRNA ελέγχου και καρκινικά κύτταρα έναρξης

Παράθεση:. Nolan-Stevaux O, Tedesco D, Ragan S, M Makhanov, Chenchik Α, Ruefli-Brasse A, et al. (2013) Μέτρηση της ετερογένεια ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω λεντοϊών Σήμανση Προσδιορίζει Κλονική Κυριαρχία ως χαρακτηριστικό του

In Vivo

όγκων εμφύτευση. PLoS ONE 8 (6): e67316. doi: 10.1371 /journal.pone.0067316

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 16η του Μάη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιούνη του 2013

Copyright: © 2013 Nolan-Stevaux et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Cellecta, Inc. ήταν ένας πάροχος λεντοικής βιβλιοθήκες shRNA για αυτή τη μελέτη και είναι ο εργοδότης του Donato Tedesco, Μιχαήλ Makhanov και Alex Chenchik. Olivier Nolan-Stevaux, Seamus Ragan, Astrid Ruefli-Brasse, Kim Quon και Paul D. Kassner απασχολούνται από την Amgen. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Amgen Inc. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Τα τελευταία χρόνια, τα μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού της καρκίνου έχουν χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει τα θεμελιώδη ερωτήματα στη βιολογία του όγκου τόσο διαφορετικές όσο η ύπαρξη των καρκινικών κυττάρων ή την έναρξη της σκοπιμότητας εντοπισμό γονιδίων μυθιστόρημα στόχο τον καρκίνο του χρησιμοποιώντας το

in vivo

shRNA drop-out προσεγγίσεις διαλογής. Σε δύο πεδία, όμως, η σχετικά φτωχή κατανόηση της αναπτυξιακής δυναμικής των μοντέλων ξενομοσχεύματος προκαλείται σύγχυση.

Κατ ‘αρχάς, τα αποτελέσματα από τα πειράματα σειριακής αραίωσης, στην οποία οι πολύ χαμηλούς αριθμούς των καρκινικών κυττάρων εγχύθηκε υποδορίως σε ποντικούς έχουν χρησιμοποιηθεί να υποστηρίξει [1], [2] ή αντικρούσει [3] η ύπαρξη σπάνια μορφή καρκίνου κύτταρα έναρξης μέσα ετερογενής ομάδες των καρκινικών κυττάρων σε στερεούς όγκους [4]. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα σε όγκους δεν υπάρχουν από μόνες τους, αλλά περιβάλλονται από άλλα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, αν είναι μερικά καρκινικά κύτταρα εγχέονται σε ένα ποντίκι και αποτυγχάνουν να αναπτυχθούν, μπορεί να αντικατοπτρίζει την έλλειψη του καρκίνου έναρξη δυναμικού? ή πιο πεζά, το γεγονός ότι δεν ήταν σε ένα βέλτιστο περιβάλλον, που περιβάλλεται από άλλα καρκινικά κύτταρα (κίνησης όγκου ή όχι). Παρακολούθηση της συμπεριφοράς των θεωρούμενων καρκίνου έναρξη κύτταρα περιβάλλονται από υποτιθέμενη μη καρκινικά κύτταρα έναρξης θα παρέχει τόσο αναγκαία σαφήνεια.

Δεύτερον, οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούν κοινές βιβλιοθήκες λεντοικής φορέων που κωδικοποιούν εκατοντάδες shRNA ωθήσεις έχουν πρωτοπορήσει για τον εντοπισμό πιθανών νέων γονίδια του καρκίνου που προάγουν

in vivo

[5], [6]. Ωστόσο, ενώ η

in vitro

συγκεντρώνονται shRNA οθόνες πτώση-out (για ένα πρόσφατο παράδειγμα, δείτε [7]), και

in vivo

ομαδοποιούνται οθόνες εμπλουτισμό shRNA με στόχο τον προσδιορισμό του όγκου-καταστολείς ή την ανάπτυξη ανασταλτική μηχανισμοί υπήρξαν επιτυχείς [8], [9],

in vivo

shRNA οθόνες εγκατάλειψης δεν έχουν γίνει ευρέως αναπαραχθεί. Εδώ επίσης, μια καλύτερη κατανόηση της ετερογένειας ανάπτυξης σε μοντέλα ξενομοσχεύματος θα βοηθήσει να ερμηνεύσει και να προβλέψει τα αποτελέσματα από τέτοιες προσεγγίσεις διαλογής. Είναι αξιοσημείωτο ότι, ενώ χωρική φαινοτυπική ετερογένεια έχει τεκμηριωθεί σε μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου [10], [11], κλωνική ετερογένεια ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος δεν έχει ποτέ μετρηθεί.

Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει μία μέθοδο λεντοϊού barcode tagging για την ακριβή και ταυτόχρονη μέτρηση των χαρακτηριστικών ανάπτυξης χιλιάδων μεμονωμένων καρκινικών κυττάρων μέσα σε μια δεξαμενή χωρίς tag καρκινικών κυττάρων αναπτύσσονται

in vitro

ή ενίεται υποδορίως

in vivo

σε σοβαρά ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν την αξιοσημείωτη ετερογενής ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε διάφορα μοντέλα ξενομοσχεύματος, σύμφωνα με την οποία μικροί αριθμοί των μεμονωμένων κλώνων των καρκινικών κυττάρων να αναλάβει ένα αρχικά ομοιόμορφα κατανεμημένη και ετερογενή πληθυσμό κυττάρων, ένα αποτέλεσμα έχουμε ονομάζονται «κλωνική κυριαρχία». Ως αποτέλεσμα των παρατηρήσεων μας, προτείνουμε μια νέα μέθοδο κλωνική παρακολούθησης των κυττάρων για να παρακάμψει την σύγχυση επίδραση της κλωνική κυριαρχίας στο πλαίσιο των συγκεντρωμένων

in vivo

shRNA οθόνες drop-out. Σας προτείνουμε επίσης και η χρήση αυτής της μεθόδου για τη μέτρηση της συμβολής του καρκίνου του υποθετικού έναρξη κύτταρα υπο-πληθυσμούς, όχι μεμονωμένα, αλλά μέσα σε ένα ετερογενή πληθυσμό καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής και στέλεχος του ποντικιού

τα ποντίκια φροντίζονται σύμφωνα με το

Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, 8

ου

έκδοση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Τα ζώα στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση διεθνώς αναγνωρισμένο από την Ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC), σε αεριζόμενο στέγαση μικρο-απομονωτή. Τα ζώα είχαν

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό μέσω του αυτόματου συστήματος ποτίσματος. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε 12 hr: 12 ωρών φωτός: σκότους, σε δωμάτια στους 22 ° C και 45% υγρασία. ερευνητικό πρωτόκολλο και τη στέγαση ζώων σχέδιό μας εγκρίθηκαν από την Amgen South San Francisco Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (Amgen South San Francisco IACUC, πρωτόκολλο # 2.011 έως 01.108). Οκτώ εβδομάδων θηλυκούς NOD /SCID IL2rg ποντίκια (NSG) (Jackson Laboratories στέλεχος # 5557) και δέκα εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών (Charles River στέλεχος # 490) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

λεντοϊών Βιβλιοθήκη Ο τίτλος Προσδιορισμός με FACS

Ο τίτλος του ομαδοποιημένου λεντοϊού βιβλιοθήκη προσδιορίστηκε άμεσα σε HCT-116 κύτταρα με μέτρηση FACS του ποσοστού των θετικών κυττάρων mCherry από μια σειριακή αραίωση της πισίνας βραδέος ιού. Εν συντομία, τιτλοδοτήσεις του λεντοϊού πισίνα προστέθηκαν σε 1,5 × 10

5 HCT-116 κύτταρα σε μέσο ανάπτυξης (McCoy 5Α, 10% FBS) που περιείχε ϋΕΑΕ Dextran (ΜΡ Biomedicals, Catalog # 195133) στα 10 μg /mL. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στον ιό για 16 ώρες και μόλυνση μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο ανάπτυξης χωρίς DEAE Δεξτράνη. Κύτταρα παρέμειναν σε καλλιέργεια για άλλες 48-72 ώρες και θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS Dulbeco, καθώς και σταθερές σε ένα διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 2%. Σταθερή κύτταρα αναλύθηκαν για το ποσοστό των θετικών κυττάρων mCherry με FACS (Becton Dickinson LSRII). Η πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) και ο τίτλος, αναφέρεται ως μονάδες μεταγωγής ανά ml (TU /ml), προσδιορίστηκαν από το ποσοστό των κυττάρων που έχουν υποστεί μεταγωγή και ο όγκος του υλικού που χρησιμοποιείται βραδέος ιού. Το ΜΟΙ αρχικά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση% μετατραπέντα κύτταρα = 100 * (1- e

– (ΜΟΙ)) και η τιμή τίτλος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση Titer = [ΜΟΙ × # κυττάρων σε μόλυνση] /όγκο (ml του ιός) = TU /ml [12] – [15]. Για αυτό το ιικό πισίνα, 10 μL του ιού είχε ως αποτέλεσμα 12.9% mCherry θετικά κύτταρα και το υπολογιζόμενο τίτλο 2 × 10

6 TU /mL χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του κατάλληλου όγκου ιού για μεταγενέστερα πειράματα σε επιλεγμένα ΜΟΙ.

Υπολογισμοί της μεταγωγής Αποδοτικότητα και Αριθμός λεντοικής Ένθετα ανά κύτταρο

τα σωματίδια του ιού αναμένεται να διανείμει τυχαία σε μεμονωμένα κύτταρα και το ποσοστό των μολυσμένων κυττάρων σε μία δεδομένη ΜΟΙ (όπου ΜΟΙ = μονάδες μεταγωγής /κύτταρο) μπορεί να εκτιμηθεί από μια κατανομή Poisson όπου το ποσοστό των μολυσμένων κυττάρων είναι ίσο με 100 * (1- e

– (ΜΟΙ)) (Πίνακας 1). Η πιθανότητα οποιουδήποτε αριθμού σωματιδίων ιού σε ένα δεδομένο κύτταρο, έτσι, δίνεται από την εξίσωση Poisson p (v) = (Μ

ve

-v) /ν !, όπου M = ΜΟΙ και ν είναι η αριθμός βίρια μόλυνση του κυττάρου. Αυτοί οι τύποι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό του τίτλου ενός ιικού πισίνα σε μία δεδομένη κυτταρική γραμμή και την εκτίμηση του ποσοστού των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με οποιοδήποτε αριθμό βίρια (Πίνακας 2).

Η

λεντοϊών Λοίμωξη Διαδικασία για KE-U6-ΤΕΤ Βιβλιοθήκη στο HCT-116

HCT-116 κύτταρα (Colon Cancer Cell Line – ATCC # CCL-247) με χρόνο διπλασιασμού 21 ώρες. καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο ανάπτυξης [μέσο McCoy 5Α (Life Technologies # 16600-082), το 10% Tet Σύστημα Εγκρίθηκε FBS (Clontech # 631101), 0,1 mg /ml Normocin (Invivogen # μυρμήγκι-NR-1)]. KE-U6-ΤΕΤ, ένα λεντοϊού βιβλιοθήκη που περιέχει 27.500 μεμονωμένα Tet-διεγέρσιμο γραμμωτό κωδικό αλληλουχίες shRNA με τίτλο 2 χ 10

6 Μεταγωγή Μονάδες (TU) /ml χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με 10 μg /ml ϋΕΑΕ Dextran (ΜΡ Biomedicals # 195133) για την επίτευξη ενός (ΜΟΙ) 0,1, για την οποία υπολογίζεται η πιθανότητα μόλυνσης ενός κυττάρου με περισσότερα από ένα σωματίδιο λεντοϊού να είναι μικρότερη από 5% (Πίνακας 2) [15]. Εν συντομία, 3 χ 10

6 ΗΟΤ-116 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 8,5 ml πλήρους μέσου ανάπτυξης συμπληρωμένο με ϋΕΑΕ Dextran (10 μg /ml) και μεταγωγή με 150 μΐ βιβλιοθήκης KE-U6-ΤΕΤ, και επωάστηκαν για 16 ώρες, με αποτέλεσμα ένα πληθυσμό κυττάρων του 3 × 10

6 κύτταρα τα οποία περιέχουν ~ 3 × 10

5 κύτταρα μολυσμένα με ένα μόνο φακοϊό και που φέρει ένα άτομο barcode.

λεντοϊών Διαδικασία μόλυνσης για βιβλιοθήκη λουσιφεράσης σε HCT-116, MDA-MB-468 και A2870

cis

Ένα λεντοϊού βιβλιοθήκη περιέχει 27 ουδέτερη ΚβηϊΙΙθ

λουσιφεράσης

τα siRNAs ακολουθίες που σχετίζονται με το 2% των barcodes υπάρχουν στη βιβλιοθήκη ήταν χρησιμοποιούνται σε ΜΟΙ 0,18, 0,17 και 0,15, αντίστοιχα σε HCT-116, MDA-MB-468 (μαστού Cancer Cell Line – ATCC # ΗΤΒ-132) και Α2780

cis

(Cisplatin Resistant ωοθηκών Cancer Cell Line – Sigma-Aldrich # 93112517) κύτταρα. Η προβλεπόμενη ποσοστό των μολυσμένων κυττάρων με περισσότερα από ένα σωματίδιο λεντοϊού υπολογίζεται ότι είναι λιγότερο από 10% σε αυτά τα ΜΟΙ (Πίνακας 2). Εν συντομία, 3 χ 10

6 κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε 8,5 ml μέσων ανάπτυξης συμπληρωμένο με πολυβρένιο (5 μg /ml), σε μεταγωγή με τον λεντοϊού βιβλιοθήκη, και επωάστηκαν για 16 ώρες, με αποτέλεσμα ένα πληθυσμό κυττάρων του 3 × 10

6 κύτταρα που περιέχουν ~ 5 × 10

5 μεταγωγή κύτταρα, ~ 90% των οποίων προβλέπεται να μολυνθεί με ένα μόνο φακοϊό και μεταφέρουν ένα ενιαίο γραμμικό κώδικα (Πίνακας 2).

In vitro

Πείραμα

16 ώρες μετά την μεταγωγή με τη βιβλιοθήκη KE-U6-ΤΕΤ, δείγματα των 10

5 HCT-116 κύτταρα που περιέχουν ~ 10

4 ξεχωριστά tagged κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας Τ175 και αναπτύχθηκαν συνεχώς για 8 ημέρες σε πλήρες μέσο ανάπτυξης, με αναπλήρωση μέσων κάθε 2-3 ημέρες. Για κάθε

in vitro

αναπαράγουν, όλα τα κύτταρα από κάθε φιάλη Τ175 χρησιμοποιήθηκαν κατά τη συγκομιδή κατά την ημέρα 8 για γονιδιωματικό απομόνωση DNA.

NSG Ξενομοσχεύματος Πείραμα

16 ώρες μετά μεταγωγή με τη βιβλιοθήκη KE-U6-ΤΕΤ, δείγματα των 10

5 HCT-116 κύτταρα που περιέχουν ~ 10

4 ξεχωριστά tagged κύτταρα αναμιγνύονται με 3 × 10

6 μη-μεταχθέντα HCT-116 κύτταρα και επαναιωρήθηκαν σε 200 μλ 1:01 PBS: διάλυμα Matrigel (BD Bioscience # 356235) πριν από την υποδόρια ένεση σε 8-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια NSG (stock # 005557, εργαστήρια Jackson). Κάθε ξενομόσχευμα αφέθηκε να αναπτυχθεί για 12 ημέρες έως ότου η προκύπτουσα υποδόρια όγκου έφτασε ένα μέγεθος -500 mm

3. Σε αυτό το σημείο, οι όγκοι συλλέχθηκαν για γονιδιωματικό απομόνωση DNA.

Nude Ξενομοσχεύματος Πειράματα

16 ώρες μετά την μεταγωγή με τη βιβλιοθήκη Λουσιφεράσης, 3 × 10

6 κύτταρα (HCT-116, MDA-MB-468 ή Α2780

cis) επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ PBS 1:01: Matrigel διάλυμα (BD Bioscience # 356235) πριν από την υποδόρια ένεση σε ηλικίας 10 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών (stock # 490, Charles River Laboratories). HCT-116 και Α2780

cis ξενομοσχεύματος αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες και MDA-MB-468 για 24 ημέρες έως ότου η προκύπτουσα υποδόρια όγκου έφτασε ένα μέγεθος -500 mm

3. Σε αυτό το σημείο, οι όγκοι συλλέχθηκαν για γονιδιωματικό απομόνωση DNA.

Tet Καταστολή shRNA έκφραση απουσία του δοξυκυκλίνη και επαγωγής με δοξυκυκλίνη

Εκτιμήθηκε η αποτελεσματικότητα του στοιχείου καταστολέα tet στο φορέα πάνω από ένα πείραμα 15 ημερών. Τρεις ανεξάρτητες μολύνσεις από 9 × 10

7 HCT116 κύτταρα σε μέσο ανάπτυξης (McCoy 5Α, 10% FBS) που περιείχε ϋΕΑΕ Dextran (ΜΡ Biomedicals, κατάλογος # 195133) στα 10 μg /mL διεξήχθησαν με τη βιβλιοθήκη shRNA 27,5 Κ σε ένα ΜΟΙ = 0.3 σε Corning συστοιχία κυψελών 10 σκάφη (κατάλογος # 3271). Για τη μεγιστοποίηση της εκπροσώπησης της βιβλιοθήκης, κάθε shRNA εισήχθη σε περίπου 1000 ανεξάρτητοι κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, μόλυνση μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο ανάπτυξης με 2 μg /mL πουρομυκίνη (InvivoGen, κατάλογος # μυρμήγκι-pr-5) για να ξεκινήσει η επιλογή για τα μολυσμένα κύτταρα. 72 ώρες μετά την μεταγωγή, ένα σφαιρίδιο κυττάρου του ~ 9 × 10

7 κύτταρα συλλέχθηκε για αναφορά για κάθε εις τριπλούν μόλυνση (ημέρα 0 δείγματος). 9 × 10

7 κύτταρα επανα-seeded και διατηρούνται σε καλλιέργεια με πλήρες μέσο με 2 μg /mL πουρομυκίνης. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν σε διαστήματα 3 ημερών με 15 ημέρες, επανασπορά 9 × 10

7 κύτταρα και τη διατήρηση επιλεκτικής πιέσεως με πουρομυκίνη για τη διάρκεια του πειράματος. Οι σβώλοι κυττάρων για δείγματα εις τριπλούν από την ημέρα 0 και 15 υποβλήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας των barcodes DNA με αλληλούχιση υψηλής απόδοσης. Τα κύτταρα στα οποία προκλήθηκε υποβλήθηκαν σε αγωγή μετά την εκ νέου σπορά 9 × 10

7 κύτταρα την Ημέρα 0 με δοξυκυκλίνη (Sigma-Aldrich, κατάλογος # D-9891) στα 0,5 μg /mL για 15 ημέρες.

Ανάκτηση και Ποσοτικοποίηση των Barcodes

οι ανιχνευτές προετοιμασμένοι για αλληλούχιση υψηλής απόδοσης για Illumina HiSeq2000 ακολουθώντας το πρωτόκολλο Cellecta του (https://www.cellecta.com/resources/protocols). Το σύνολο των barcodes που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή της βιβλιοθήκης αποτελείται από 27.500 18-νουκλεοτιδίων ατομική καιρό barcodes, τέλεια ισορροπημένο στο AT /GC και πουρινών /πυριμιδίνης, σχεδιασμένο χρησιμοποιώντας ένα ιδιόκτητο αλγόριθμο Cellecta. Ελάχιστη απόσταση Hamming μεταξύ barcodes στο σύνολο είναι 4, οπότε μέχρι 3 μεταλλάξεις σε μια σειρά 18-νουκλεοτιδίων μπορεί να ανιχνευθεί και τα κατεστραμμένα barcodes απορριφθεί, παρέχοντας το κατάλληλο επίπεδο προστασίας για την τρέχουσα ακρίβεια της τεχνολογίας αλληλουχίας Illumina. αριθμούς ταυτότητας Barcode κωδικοποιήθηκαν στην αλληλουχία barcode χρησιμοποιώντας τεταρτοταγούς αριθμητικό σύστημα (Α-0, Τ-1, G-2, C-3), δεν ήταν απαραίτητη έτσι την ευθυγράμμιση των διαδικασιών barcode αποσυνέλιξης. Χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο μετατροπής Cellecta του, αριθμούς ταυτότητας barcode εξήχθησαν από κάθε σωστή barcode και την αφθονία του κάθε barcode στην αλληλουχία του δείγματος μετρήθηκε. Με τη διαδικασία αυτή, η πολυπλοκότητα του υπολογισμού δεν εξαρτάται από την πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης. Η πολυπλοκότητα είναι O (n) ήταν n είναι ο αριθμός των διαβάζει στα αλληλουχία ανιχνευτές. FASTQ και qseq αρχεία από το μηχάνημα Illumina HiSeq2000 χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση.

Clone Μέγεθος Εκτίμηση

Για κάθε δείγμα, ο αριθμός των μετράει barcode που ισοδυναμεί με ένα ενιαίο μεταγωγή κυττάρων υπολογίστηκε με βάση τη συνολική αριθμός των μετρήσεων barcode στο δείγμα και ο συνολικός αριθμός των μετατραπέντων κυττάρων στο δείγμα (η τελευταία που εκτιμάται σύμφωνα με γονιδιωματικό DNA ανάκτηση και μεταγωγή ΜΟΙ, και επιβεβαιώθηκε με απόδοση ιχνηλάτη PCR). Για την εκτίμηση του μεγέθους του κάθε κλώνου στην υποστεί μεταγωγή πληθυσμό κυττάρων (αριθμός των κυττάρων που φέρουν το ίδιο barcode), μετρήσεις barcode στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν προς την υπολογισμένη μέτρηση barcode μονοκύτταροι.

Αποτελέσματα

Μέτρηση το ποσοστό αυτό Clone

in vivo

η

για να εντοπίσουμε κλώνους που προέρχονται από μεμονωμένα κύτταρα μέσα σε ένα πληθυσμό καρκινικών κυττάρων, που έχουν μολυνθεί HCT-116 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα με λεντοϊού βιβλιοθήκη περιείχε 27.500 ανεξάρτητη επαγώγιμων shRNA αλληλουχίες, κάθε συνδεδεμένη με ένα άτομο 18 νουκλεοτιδίων barcode. Εμείς μολυσμένα 3 × 10

6 HCT-116 κύτταρα σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 0.1. Υπό αυτές τις συνθήκες μολύνσεως, ανάλυση κατανομής Poisson προβλέψει έναν ελάχιστο αριθμό διπλής γεγονότων μόλυνσης (& lt? 5% των μεταγόμενων κυττάρων) [15] (Πίνακας 2). Η μεταγωγή απέδωσε ~ 3 × 10

5 ξεχωριστά γραμμικό κώδικα κύτταρα (Πίνακας 1). Τρία σετ των 10

4 HCT-116 γραμμικό κώδικα κύτταρα (10

5 συνολικά κύτταρα δοθεί μια ΜΟΙ 0.1) αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια

in vitro

για 8 ημέρες ή περίπου 9 διπλασιασμούς πληθυσμού. Γονιδιωματικό DNA από τα τρία σύνολα κυττάρων που αναπτύσσονται

in vitro

υποβλήθηκε σε barcode αλληλούχιση υψηλής απόδοσης και το μέγεθος (αριθμός κυττάρων) του κάθε κλώνου ανιχνεύονται στον μετατραπέντα πληθυσμό υπολογίστηκε με βάση τον αριθμό των φορών που κάθε ράβδος -κώδικα ανακτήθηκε (Εικ. 1).

ένα λεντοϊού βιβλιοθήκη περιείχε 27.500 μοναδικά barcodes χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή HCT-116 κυττάρων σε μια ΜΟΙ 0,1. Πισίνες από 10

5 κύτταρα, που αντιστοιχεί σε 10

4 ξεχωριστά ετικέτα κύτταρα είτε αναμειγνύεται με 3 × 10

6 κύτταρα και εμφυτεύεται υποδορίως σε NSG ποντικούς ή αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια

in vitro

. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 9 ημέρες και όγκου απομακρύνθηκαν μετά από 12 ημέρες, και η συνολική παρασκευάσματα DNA από κύτταρα ή όγκοι υποβλήθηκαν στη διαδικασία ανάκτησης barcode.

Η

Παράλληλα, τρία σετ των 10

4 γραμμωτό κωδικό ΗΟΤ-116 κύτταρα (10

5 συνολικών κυττάρων δοθεί μια ΜΟΙ 0.1) από το ίδιο αρχικό γεγονός ιική μεταγωγή συλλέχθηκαν 16 ώρες μετά την μεταγωγή και ατομικά αναμιχθεί με 3 × 10

6 μη μολυσμένα HCT-116 κύτταρα και αραιώνονται σε 50% Matrigel, πριν από την υποδόρια ένεση στο πλευρό του τρία σοβαρά άνοσο-ανεπάρκεια θηλυκά NSG ποντικούς. Κάθε ξενομόσχευμα αφέθηκε να αναπτυχθεί για 12 ημέρες έως ότου η προκύπτουσα υποδόρια όγκου έφτασε ένα μέγεθος -500 mm

3. Γονιδιωματικό DNA από τα τρία ξενομοσχεύματος όγκους υποβλήθηκε στις ίδιες διαδικασίες εκτίμησης ανάκτησης barcode και το μέγεθος του κλώνου ως

in vitro

δείγματα (Εικ. 1).

in vivo

ρυθμός ανάκτησης κλώνος υπολογίστηκε ως ο λόγος μεταξύ του μέσου αριθμού των γραμμωτό κωδικό κλώνους που ταυτοποιήθηκαν στις τρεις ξενομοσχεύματος όγκων και ο μέσος αριθμός γραμμικό κώδικα-κλώνους που ταυτοποιήθηκαν στις τρεις κυτταρικούς πληθυσμούς που καλλιεργούνται

in vitro

, ανεξαρτήτως του κλώνου μέγεθος (Εικ. 1). Όπως παρουσιάζεται στον Πίνακα 3, η παρατηρηθείσα συχνότητα κλώνος ανάκτηση ήταν σχεδόν 60% και ο αριθμός των κλώνων που εντοπίζονται στην

in vitro

ρύθμιση σε κάθε επανάληψη ήταν πολύ κοντά στην προβλεπόμενη τιμή των 10

4 κλώνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν ένα κύτταρο εναιώρημα που περιέχει Matrigel ενίεται υποδορίως, μία μικρή ποσότητα (~ 10%) του εγχεόμενου υγρού διαρρέει έξω από το σημείο της ένεσης, αντιπροσωπεύοντας ένα κλάσμα των χαμένων barcodes στο

in vivo

ρύθμιση.

η

In vivo

«Κλονική Κυριαρχία» Inside ξενομοσχεύματα HCT-116

Για να εκτιμούν και να συγκρίνουν το πώς χωρίζονται οι γραμμωτό κωδικό κύτταρα

in vitro

και

in vivo

, αναλύσαμε την κατανομή των barcodes τους ανάλογα με το πόσο συχνά ανακτήθηκαν με HTS. Το πλήρες σύνολο δεδομένων των κλώνων και μετράει barcode είναι διαθέσιμο (Πίνακας S1)

Σε ένα πρώτο διάγραμμα, αναλύσαμε την κλωνική κατανομή των κυττάρων που αναπτύσσονται

in vitro

:. Θα καταγράφεται ο αριθμός των ανεξάρτητων κλώνοι (Σχ. 2Α – μπλε μπάρες) ή τη συνολική συνολικός αριθμός των κυττάρων (Σχ. 2Α – πορτοκαλί μπάρες) για κάθε κατηγορία μεγέθους κλώνο απέναντι από τον άξονα Χ. Για παράδειγμα,

in vitro

, υπήρχαν 2.649 ανεξάρτητους κλώνους ενός μεγέθους που κυμαίνεται μεταξύ 512 – 1.023 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι κλώνοι στην κατηγορία κυττάρων 512-1023 »πρέπει να έχουν υποβληθεί κατά μέσο όρο 8 διπλασιασμούς πληθυσμού ( Σχήμα 2Α -. μπλε αξία γραμμή για την κατηγορία Χ-άξονα ‘512 με 1023 »). Αυτές 2649 κλώνοι συνεισφέρει συνολικά 1.017.216 απόγονος γραμμικό κώδικα κύτταρα κατόπιν

in vitro

καλλιέργεια για 8 ημέρες (Σχήμα 2Α -. Πορτοκαλί αξία γραμμή για την κατηγορία Χ-άξονα »512-1023»). Ως απόδειξη ότι

in vitro

κλωνική ανάπτυξη είναι ως επί το πλείστον ομοιογενή, το 95% των απόγονος γραμμικό κώδικα κύτταρα που βρέθηκαν μετά από 8 ημέρες

in vitro

πολιτισμό προήλθαν από 80% από την αρχική ετικέτα κλώνους και ήταν που περιέχονται εντός των κατηγοριών κλώνος ‘128-4095’ που υποδεικνύει τουλάχιστον 7 τμήματα του πληθυσμού.

για κάθε γράφημα, ο αριθμός των ανεξάρτητων κλώνων (μπλε μπάρες) ή τη συνολική συνολικός αριθμός των κυττάρων (πορτοκαλί bars) σχεδιάζεται για κάθε κλώνος κατηγορία μεγέθους σε όλη την άξονα Χ. (Α) Κατανομή των HCT-116 barcodes

in vitro

: το 80% των barcodes (κλώνοι) ταυτοποιήθηκαν στις κατηγορίες «128-255» στο «2048 έως 4095», που δείχνει ότι το 80% των κυττάρων διαιρούνται μεταξύ 7 και 12 φορές? 95% των κυττάρων ταυτοποιήθηκαν στις κατηγορίες «128-255» στο «2.048 έως 4095», που δείχνει ότι το 95% των κυττάρων ανήκουν σε κλώνους που προέρχονται από το 80% των αρχικά σε μεταγωγή κύτταρα, τα οποία χωρίζονται μεταξύ 7 και 12 φορές. Κλίμακα για τον αριθμό των κυττάρων προσαρμόστηκε 500 φορές για να επιτρέψει στο πλευρό συγκρίσεις των αριθμών κλώνο και των αριθμών των κυττάρων. (Β) Κατανομή των HCT-116 barcodes

στο

vivo

: 75% των barcodes βρίσκονται στις κατηγορίες «λείπει» σε «2-3», υποδεικνύοντας ότι είτε δεν επιβιώσει σε όλα, δεν χωρίζουν, ή να διαιρεθεί όχι περισσότερο από μία φορά και αντιπροσώπευαν μόνο το 1% των ανακτημένων ετικέτα κύτταρα. Ωστόσο, μόνο το 6% των bar-codes βρίσκονταν στις κατηγορίες «64-127» σε «16.384 έως 32.767», αναφέροντας ότι χωρίζονται μεταξύ 6 και 14 φορές? 95% των κυττάρων δεδουλευμένων στις κατηγορίες «64-127» στο «16384 – 32767», που δείχνει ότι το 95% των κυττάρων με επισύναψη προέρχονται από το 6% των αρχικά γραμμικό κώδικα κλώνους που χωρίζονται περισσότερο. Κλίμακα για τον αριθμό των κυττάρων προσαρμόστηκε 25 φορές για να επιτρέψει στο πλευρό συγκρίσεις των αριθμών κλώνο και των αριθμών των κυττάρων.

Η

Σε ένα δεύτερο διάγραμμα, αναλύσαμε την κατανομή των κλωνικών κυττάρων που αναπτύσσονται

in vivo

: εμείς απεικονίζονται πάλι τον αριθμό των ανεξάρτητων κλώνων (Εικόνα 2Β – μπλε μπάρες.) ή τη συνολική συνολικός αριθμός των κυττάρων (Σχήμα 2Β – πορτοκαλί bars.) για κάθε κατηγορία μεγέθους κλώνο απέναντι από τον άξονα Χ. Οι

in vivo

κατανομές φαίνονται δραματικά διαφορετική από τις

in vitro

διανομές.

In vivo

, το 75% των κλώνων συγκεντρωμένα σε κατηγορίες της «Αγνοουμένων-3 ‘, που δείχνει ότι το 75% των κυττάρων αρχικά ένεση

in vivo

υποβλήθηκε σε λιγότερες από δύο κυτταρικές διαιρέσεις (Εικ. 2B – μπλε γραμμές – «Missing» ή «1» ή «2-3» κατηγορίες). Επιβεβαιώνοντας ότι αυτοί οι κλώνοι δεν μεγαλώνουν

in vivo

, αυτοί οι κλώνοι αντιπροσώπευαν μόνο το 1% του συνολικού συνολικό αριθμό των κυττάρων εντός του πληθυσμού κυττάρων tagged προσδιορίζονται από HTS στο προκύπτον όγκου. Από την άλλη πλευρά, το 6% των εγχέονται κύτταρα ήταν σε θέση να διαιρέσει περισσότερο από πέντε φορές για να δημιουργήσει κλώνους με τουλάχιστον 64 κύτταρα (Σχ 2Β -. Μπλε γραμμές που σημειώνονται 6%). Είναι αξιοσημείωτο ότι, αυτοί οι κλώνοι αντιπροσώπευαν το 95% του συνολικού συνολικό αριθμό των κυττάρων εντός του κυτταρικού πληθυσμού με ετικέτα (Σχήμα 2Β -. Πορτοκαλί μπάρες σημειώνονται 95%), επιδεικνύοντας πολύ σημαντική ετερογένεια ανάπτυξη

in vivo

, όπου οι δύο πιο άφθονα ανακτηθεί κλώνοι μόνο (από ένα εκτιμώμενο 10.000) υποβλήθηκαν σε 14 διπλασιασμούς πληθυσμού και δημιούργησε μια εκπληκτική 7,5% του συνόλου των ετικετών των κυττάρων ανακτήθηκαν από HTS σε ξενομοσχεύματα. (Σχήμα 2Β -. κλώνων και τα κύτταρα στην κατηγορία «16.384 – 32.767)

Εμείς ονομάζουμε αυτό το φαινόμενο «κλωνική κυριαρχία», σύμφωνα με την οποία ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων εμφυτεύονται

in vivo

χωρίζουν πολύ περισσότερο από τη συντριπτική πλειοψηφία των άλλων κλώνων και να συμβάλει με συντριπτική πλειοψηφία στον πληθυσμό απόγονος των κυττάρων. Σημειώστε ότι οι προηγούμενες μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η κυτταρική γραμμή HCT-116 δεν περιέχει βλαστικών κυττάρων ή όγκο έναρξη υπο-πληθυσμό (βλέπε συζήτηση).

Εξαιρουμένων Επίδραση του κωδικοποιημένου shRNA

in vitro

και

in vivo

Η

Ο shRNA κωδικοποιούνται στις φακοϊών κλωνοποιούνται καθοδικά του υποκινητή U6-ΤΕΤ και ρυθμίζονται από μία Tet-καταστολέα που κωδικοποιείται στο φακοϊό, για να εξασφαλιστεί η καταστολή του έκφραση φουρκέτα shRNA απουσία δοξυκυκλίνη. Έτσι, για τους σκοπούς αυτού του πειράματος, το περιεχόμενο των φορέων λεντοϊού ήταν καθαρά χρησιμοποιείται ως σύστημα bar-κωδικοποίησης των μολυσμένων κυττάρων και δεν είχε προβλεφθεί να παρεμβαίνει με την ανάπτυξη των κυττάρων. Για να εξασφαλιστεί ότι η κωδικοποιημένη shRNA δεν επηρεάζουν την κυτταρική ανάπτυξη, μεγαλώσαμε τα κύτταρα σε ένα μέσο που περιέχει Tet-εγκεκριμένο σύστημα FBS, που αποσκοπούν στην ελαχιστοποίηση de-καταστολή των προαγωγών απουσία δοξυκυκλίνη. Ωστόσο, για να επιβεβαιωθεί πειραματικά ότι απρόβλεπτες επαγωγή shRNA δεν επηρεάζει την κατανομή barcode απουσία δοξυκυκλίνη, συγκρίναμε επίσης τη διανομή των barcodes που περιέχονται στη βιβλιοθήκη KE-U6-ΤΕΤ εξής HCT-116 μεταγωγή την Ημέρα 0 και την Ημέρα 15 μετά τη μόλυνση. Για αυτό το πείραμα, θα μετάγονται HCT-116 κυττάρων με το KE-U6-ΤΕΤ βραδέος βιβλιοθήκη σε ΜΟΙ 0,3 και συλλέχθηκαν τα κύτταρα αμέσως μετά τη μόλυνση (ημέρα 0) ή μετά από 15 ημέρες από

in vitro

ανάπτυξης στην απουσία δοξυκυκλίνη (Ημέρα 15) (Σχ. 3Α). Παρατηρήσαμε μια πολύ σφιχτή συσχέτιση (R = 0,99) μεταξύ του αριθμού των αναγνώσεις που λαμβάνονται για κάθε barcode shRNA την Ημέρα 0 και την Ημέρα 15 (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια αξιολογείται εάν οι δύο κατανομές shRNA την Ημέρα 0 (Εικ. S1 Α), και την Ημέρα 15 (Σχ. S1B) ήταν σημαντικά διαφορετικά το ένα από το άλλο χρησιμοποιώντας ένα μη-παραμετρική Kruskal-Wallis Rank Sum Test και λαμβάνεται μία τιμή Ρ 0.972, υποδεικνύοντας καμία στατιστική διαφορά μεταξύ της σειρά κατάταξης των διαφόρων shRNA στον πληθυσμό shRNA την Ημέρα 0 και την Ημέρα 15 (Σχ. S1D). Ομοίως δεν υπήρξε καμία αλλαγή στη συνολική κατανομή των shRNA μεταξύ των δύο χρονικά σημεία, όπως καθορίστηκε από μια τιμή ρ t-test του 0,99 (Εικ. S1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι εν απουσία δοξυκυκλίνη, οι U6-ΤΕΤ-καθοδηγείται φουρκέτες shRNA δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη και την κατανομή των barcodes στη υποστεί μεταγωγή πληθυσμό κυττάρων HCT-116

in vitro

, και ήταν επομένως απίθανο να επηρεάζει κατανομή τους στα ξενομοσχεύματα, υπό την προϋπόθεση ότι οι φουρκέτες παρέμειναν χωρίς επαγωγή

in vivo

.

(α) ένα λεντοϊού βιβλιοθήκη περιείχε 27.500 μοναδικά barcodes χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή HCT-116 κύτταρα σε ΜΟΙ 0.3 . Μετά από 72 ώρες, πουρομυκίνης επιλογή, τα κύτταρα συνεχώς περάστηκαν για 15 ημέρες εν απουσία δοξυκυκλίνη. Ημέρα 0 και την Ημέρα 15 κυττάρων υποπολλαπλάσια ελήφθησαν και ολικού DNA από τις δύο χρονικά σημεία υποβλήθηκαν σε υψηλής απόδοσης διαδικασία ανάκτησης αλληλούχιση barcode. (Β) οικόπεδο συσχέτισης για την Ημέρα 15 μέτρησης κατά την Ημέρα 0. shRNA barcode διαβάζει για όλα τα δείγματα από όλα τα χρονικά σημεία για πρώτη φορά ρυθμίζεται σύμφωνα με 2 × 10

7 διαβάζει. Οι τιμές για τα δείγματα εις τριπλούν υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο. Την Ημέρα 15, ισχυρή καταστολή της έκφρασης shRNA απουσία δοξυκυκλίνης είναι προφανής στις συσχετίσεις με την Ημέρα 0 αναφοράς. Οικόπεδο log10 σημαίνει κανονικοποιημένη διαβάζει για την Ημέρα 0 κατά την Ημέρα 15 (Pearson συσχέτιση: R = 0,99).

Η

Για να μοντελοποιήσουμε το τι θα συνέβαινε αν οι φουρκέτες ήταν απο-καταστέλλεται σε ένα πληθυσμό καρκινικών κυττάρων, μπορούμε επίσης να σύγκριση της κατανομής barcode shRNA σε μεταχθέντα HCT-116 κύτταρα την Ημέρα 0 και την Ημέρα 15 παρακάτω

in vitro

ανάπτυξη παρουσία του δοξυκυκλίνη (Ημέρα 15 – Dox – Εικ. S1c). Υπό αυτές τις συνθήκες, ενώ η συνολική κατανομή του πληθυσμού shRNA δεν επηρεάστηκε σημαντικά (p-value ενός t-τεστ μεταξύ των δύο πληθυσμών ήταν 0,99), η τάξη-σειρά των διαφορετικών barcodes shRNA επηρεάστηκε βαθύτατα (p-value ενός μη -parametric τεστ rank-order Kruskal-Wallis ήταν 1,75 × 10

-8 – Εικ. S1D). Στη συνέχεια αναλύσαμε την κατανομή των barcodes πιο άφθονα προσδιορίζονται στα τρία

in vivo

ξενομοσχεύματος επαναλήψεις (ταυτοποιείται ως μέρος της κορυφής 6% των κλώνων που συμβάλλουν στο 95% των ανακτημένων ετικετών – βλ. Σχήμα 2) για να διαλύσει δύο πιθανές, αλλά ασήμαντο εξηγήσεις για την κλωνική κυριαρχία παρατηρήσαμε: (i) ότι από μια αρχική προκατάληψη εκπροσώπηση barcode και (ii) τις πιθανές επιπτώσεις της διαρροής φουρκέτες που θα έχουν επωφεληθεί κάποια κλώνους σε σχέση με άλλους

in vivo

. Πρώτον, εμείς δεν παρατηρούμε μια προκατάληψη διανομής barcode που θα ευνοούσε τους κλώνους που ανακτήθηκαν

in vivo

. Οι 4.109 πιο άφθονη barcodes shRNA ανακτώνται στις τρεις

in vivo

επαναλήψεις διανεμήθηκαν σε ολόκληρη την κατανομή του πληθυσμού shRNA και δεν μπορούν να εξηγήσουν την κλωνική δράση κυριαρχία παρατηρούμε (Σχ. 4Α). Δεύτερον, αν η διαρροή έκφραση shRNA φουρκέτες

in vivo

ήταν ένας παράγοντας στην κλωνική κυριαρχία, θα περίμενε κανείς ότι οι κλώνοι που επιλέχθηκαν

in vivo

θα κωδικοποιήσει shRNA φουρκέτες που ευνοούν την HCT-116 ανάπτυξη, ή τουλάχιστον, δεν είναι τοξικά για HCT-116. Αυτή δεν ήταν η περίπτωση: ένας μεγάλος αριθμός από τα πιο άφθονα barcodes που ανακτήθηκαν

in vivo

(χρωματισμένο με κόκκινο χρώμα στην εικόνα 4Β) στην πραγματικότητα κωδικοποιούν shRNA φουρκέτες που είναι τοξικά για HCT-116

in vitro

, καθώς στην πραγματικότητα συγκεντρώνονται στην αριστερή πλευρά της καμπύλης κατανομής shRNA, υποδεικνύοντας μία επίδραση αναστολής αύξησης, μετά

in vitro

επαγωγή με δοξυκυκλίνη για 15 ημέρες (Εικ. 4Β), γεγονός που δείχνει ότι αυτά shRNA φουρκέτες δεν απο-καταστέλλεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του μεταμοσχευμένων όγκων. Αν αυτά τα τοξικά φουρκέτες shRNA ήταν διαρροή ή απο-καταστέλλεται, θα έχουν εμποδίσει την ανάπτυξη των κλώνων που τα κωδικοποιημένα και barcode τους δεν θα μπορούσε πιθανώς να είναι μεταξύ των πιο άφθονο barcodes shRNA ανακτηθεί

in vivo

.

(Α) κατανομή των 4.109 μοναδική barcodes ανακτηθεί πιο άφθονα από τις τρεις ξενομοσχεύματος όγκους (που σημειώνονται με κόκκινο κάθετες γραμμές) σε ολόκληρη την κατανομή του πληθυσμού shRNA στη βιβλιοθήκη shRNA. (Β) Ανίχνευση ενός μεγάλου κλάσματος από τα πιο άφθονα barcodes από τις τρεις ξενομοσχεύματος όγκους (σημειώνονται με κόκκινο χρώμα) στον πληθυσμό shRNA πιο τοξικές για HCT-116 μετά την επαγωγή δοξυκυκλίνη

in vitro

για 15 ημέρες (μετρούμενη με μια αρνητική αναλογία Log2 της μέσης διαβάσετε μετράει για μεμονωμένες shRNA την Ημέρα 15 μετά από δοξυκυκλίνη να σημαίνει διαβάσετε μετράει την Ημέρα 0).

η

Κλονική Κυριαρχία παρατηρείται σε άλλες Μοντέλα ξενομοσχεύματος και σε άλλο ποντίκι υποδοχής

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τις παρατηρήσεις μας με επιπλέον κυτταρικές σειρές και με διαφορετικό στέλεχος υποδοχής, θα μετάγονται 3 × 10

6 HCT-116, MDA-MB-468 και Α2780

cis κύτταρα εις διπλούν σε ΜΟΙ