Αφηρημένο

Η ενεργοποίηση των σημάτων παράκαμψης, όπως η ΚΟΑ και AXL, έχει αναγνωριστεί ως πιθανός μηχανισμός της αντίστασης του EGFR ΤΚΙ. Επειδή διάφορα ογκοπρωτεΐνες εξαρτώνται HSP90 για την ωρίμανση και τη σταθερότητα, ερευνήσαμε την επίδραση του AUY922, μιας προσφάτως ανεπτυγμένα αναστολέα τάξη HSP90 γκελνταναμυκίνη μη, στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με ΜΕΤ- και αντίσταση AXL μεσολάβηση. Ιδρύσαμε ανθεκτικές κυτταρικές σειρές με HCC827 κύτταρα που φιλοξενούν ένα εξόνιο μετάλλαξη 19-διαγραφής στο του

EGFR

γονιδίου μέσω μακροχρόνιας έκθεσης σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib και erlotinib (HCC827 /GR και HCC827 /ER, αντίστοιχα). αντίσταση HCC827 /GR επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης ΚΟΑ, ενώ η ενεργοποίηση AXL προκαλείται αντίσταση σε κύτταρα /ER HCC827. επεξεργασία AUY922 κατέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό και προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε αμφότερες τις ανθεκτικές κυτταρικές σειρές. Κατά συνέπεια, η ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR, ΚΟΑ, και AXL οδήγησε σε μειωμένη Akt ενεργοποίηση. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα της AUY922 σε κάθε υποδοχέα επιβεβαιώθηκαν σε γονιδιακή-επιμολυσμένα κύτταρα LK2. AUY922 επίσης ελέγχεται αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού που περιέχει HCC827 /GR και κύτταρα /ER HCC827. Επιπλέον, AUY922 μειωμένη εισβολή και τη μετανάστευση και από τα δύο είδη των ανθεκτικών κυττάρων. ευρήματα της μελέτης μας δείχνουν έτσι ότι AUY922 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική επιλογή για ΜΕΤ- και AXL-μεσολάβηση αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ στον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Choi YJ, Kim SY, λοιπόν KS, Μπεκ IJ, Κιμ WS , Choi SH, et al. (2015) AUY922 αποτελεσματικά Προσπερνάει ΜΕΤ- και AXL-διαμεσολαβούμενη Αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (3): e0119832. doi: 10.1371 /journal.pone.0119832

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 26 του Αυγ 2014? Αποδεκτές: 16 Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Μαρτίου, 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Ι.Κ. Rho είχε λάβει επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF, 2013R1A1A2005112) και S.H. Choi είχε λάβει επιχορήγηση του Ασάν Ινστιτούτο Επιστημών Ζωής (2014 – 597). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα των υποδοχέων τυροσίνης κινάσης (EGFR-ΤΚΙ) είναι ένα από τα πιο επιτυχημένα παράγοντες στόχευσης που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, η ανάπτυξη της αντίστασης, παρά την καλή αρχική αποκρίσεις, σε ασθενείς με EGFR-μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα είναι αναπόφευκτη [1,2]. Παρά το γεγονός ότι σχεδόν το ήμισυ του συνόλου αντίστασης ΤΚΙ προκαλείται από μια μετάλλαξη δευτεροβάθμιας Τ790Μ [3,4], η ενεργοποίηση των σημάτων παράκαμψης όπως ΚΟΑ ή AXL θα μπορούσε επίσης να συμβάλει στην απόκτηση της αντίστασης [5,6].

MET γονιδιακή ενίσχυση προκαλεί HCC827 κύτταρα που έφεραν το ευαισθητοποιητικό μετάλλαξη EGFR να γίνει ανθεκτικός σε gefitinib μέσω ErbB3 εξαρτώμενη ενεργοποίηση του μονοπατιού φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάση /Akt (ΡΙ3Κ) [5]. Αρχικές μελέτες ανέφεραν ότι περίπου 20% των ασθενών με επίκτητη αντίσταση σε EGFR-TKIs έδειξε

MET

γονιδιακής ενίσχυσης με ή χωρίς Τ790Μ [5,7], ενώ μια πρόσφατη μελέτη για τη συχνότητα των μηχανισμών αντοχής αποκάλυψε ότι

MET

ενίσχυση αναπτυχθεί σε περίπου 5% των ασθενών μετά αντίστασης [8]. συνδυασμένες θεραπείες με αναστολείς ΚΟΑ και EGFR θα μπορούσε να καταργήσει την ενεργοποίηση των κατάντη σήματα, ξεπερνώντας έτσι επίκτητη αντοχή σε αναστολείς του EGFR [5,9]. Διάφοροι αναστολείς κινάσης τυροσίνης ΚΟΑ και MET-blocking μονοκλωνικά αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων SU11274, ARQ197 και onartuzumab, βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές [10].

Πρόσφατα, τρεις ανεξάρτητες ομάδες μελέτης ανέφεραν ότι AXL, η οποία περιλαμβάνεται στην ΤΑΜ ( Τυρό-Axl-Mer) της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα (RTK), θα μπορούσε να είναι μια αιτία της αντίστασης EGFR-ΤΚΙ σε προκλινικά μοντέλα [6]. Παρά το γεγονός ότι περίπου 20% των ασθενών παρουσίασε AXL υπερ-έκφραση μετά την ανάπτυξη αντοχής στην εν λόγω μελέτη, η ακριβής αναλογία μεταξύ των ασθενών με επίκτητη αντοχή και τις θεραπείες που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση των επιπτώσεων της στόχευσης AXL σε κλινικό περιβάλλον παραμένουν να προσδιοριστεί [11] .

θερμικού σοκ πρωτεΐνη 90 (HSP90) διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρικής πρωτεΐνης επηρεάζοντας ωρίμανσης της πρωτεΐνης και της σταθερότητας [12]. Επειδή διάφορα ογκοπρωτεΐνες εξαρτάται από τη σωστή λειτουργία του, HSP90 έχει αναγνωριστεί ως ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο [13]. Οι κλινικές δοκιμές που στοχεύουν μετάλλαγμα EGFR, συμπεριλαμβανομένης της μεταλλαγμένης Τ790Μ με αναστολείς της HSP90, βρίσκονται σε εξέλιξη. Ορισμένες προκλινικές μελέτες έχουν αναφερθεί ελπιδοφόρα αποτελέσματα [14-16]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία σχετικά με το πώς ΜΕΤ- ή AXL-μεσολάβηση αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ στον καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να ξεπεραστεί μέσω της αναστολής της HSP90. Στην παρούσα μελέτη μας, ερευνούμε την αποτελεσματικότητα των AUY922, μη γελδαναμυκίνης αναστολέας κατηγορία HSP90 του ΜΕΤ και AXL-μεσολάβηση ανθεκτικές κυτταρικές σειρές και ζωικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και αντιδραστήρια

HCC827 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Gefitinib- και erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές σειρές (HCC827 /GR και HCC827 /ER, αντίστοιχα) ιδρύθηκαν ως μέρος μιας προηγούμενης μελέτης [17]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. AUY922 αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX).

δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης συλλέχθηκαν, σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις AUY922 σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Μετά από 72 ώρες, η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως περιγράφεται από τους Carmichael et al. [18]. Για την επικύρωση των αντικαρκινικών αποτελεσμάτων του AUY922, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις AUY922 για 72 ώρες και τα προσκολλημένα κύτταρα υπέστησαν χρώση με μπλε διάλυμα trypan 0,2% που περιέχει 50% μεθανόλη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ADAM-MC αυτόματο απαριθμητή κυττάρων (NanoEnTek, Σεούλ, Κορέα) σε accordiance με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση (SD).

Western ανάλυση κηλίδος

για την κηλίδωση Western, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Bedford, ΜΑ). Αντισώματα ειδικά για ρ-EGFR (Tyr1173), EGFR, AXL, ΚΟΑ, Akt, π-Erk, Erk, myc, και β-ακτίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και αντισώματα για την π-ΚΟΑ ( Tyr1234 /1235), ρ-AXL (Tyr702), ρ-Akt, PARP και κασπάσης-3were λαμβάνεται από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια κηλίδωση Western kit (Amersham Biosciences, NJ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

παροδική επιμόλυνση

pcDNA3 /EGFR (WT) και pcDNA3 /EGFR (delE746- A750) δόθηκαν από τον Dr. TY Kim (College of Medicine Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ, Σεούλ, Νότια Κορέα). pCMV6-Entry /MET αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD). pcDNA3.1 /AXL (WT) κατασκευάστηκε ως μέρος μιας προηγούμενης μελέτης [6]. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για τους υποδεικνυόμενους χρόνους με 1 mmol /L AUY922. Τόσο προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% παγωμένης αιθανόλης για 1 ώρα και επωάστηκαν σε 50 μg /mL RNase Α και /mL ιωδιούχου προπιδίου 25 μg (PI) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Ποσοτική ανάλυση της κατανομής κύκλου κυττάρου διεξήχθη χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής FASCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

In vivo μελέτη

Θηλυκά σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID ) ποντικοί (18-20 g? 5 εβδομάδες ηλικίας? 5 ποντικοί /ομάδα) αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες διεξήχθησαν ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των Ασάν Ινστιτούτο Επιστημών Ζωής (2013-01-066). Οι όγκοι αναπτύχθηκαν από την εμφύτευση κυττάρων (1 × 10

6 HCC827 κύτταρα /GR ή 5 × 10

6 κύτταρα HCC827 /ER) στο Matrigel (BD Biosciences) και στη συνέχεια στα πλευρά του ποντικιού. Η θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος άρχισε όταν οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο 50-100 mm

3 (20 mg /kg AUY922 μέσω ενδο-περιτοναϊκή ένεση? 5 ημέρες /εβδομάδα). Η θεραπεία διεκόπη με την ενδεικνυόμενη ημέρα, και τα ποντίκια έλαβαν εξετάσεις παρακολούθησης για την τεκμηρίωση επανεμφάνιση του όγκου. Για να μετρηθεί το μέγεθος του όγκου, το μήκος (

L

) και το πλάτος (

W

) του κάθε όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δαγκάνες, και ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε ως TV = (

L

×

W

2) /2. Ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός ειδικού πρωτογενές αντίσωμα (Ki-67? DakoCytomation, Los Angeles, CA), το EnVision Plus kit χρώσης (DakoCytomation), και το APO-Direct τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση τέλος επισήμανση dUTP nick κιτ δοκιμασίας (TUNEL) (Millipore) όπως κατευθύνεται από τις οδηγίες του προμηθευτή. Ποσοτική ανάλυση της κάθε χρώση τμήματος εκτελέστηκε με καταμέτρηση όλων των ανοσοθετικών κυττάρων σε 5 αυθαίρετα επιλεγμένα πεδία (Χ 400 μεγέθυνση).

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασίες

Όλες οι δοκιμασίες μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής διεξήχθησαν σύμφωνα με μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [19]. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SDS.

Αποτελέσματα

AUY922 αναστέλλει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων gefitinib /erlotinib ανθεκτικά

Gefitinib /erlotinib ανθεκτικά sublines προέρχεται από το πατρικό, ευαίσθητη HCC827 κυτταρική σειρά καθιερώθηκαν ως μέρος μιας προηγούμενης μελέτης [17]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AUY922 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο για να προσδιοριστεί εάν αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε gefitinib κύτταρα /erlotinib ανθεκτικά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, και οι δύο ανθεκτικές κυτταρικές σειρές αποδειχθεί διασταυρούμενη αντοχή στο gefitinib ή erlotinib, αντίστοιχα, και ήταν επίσης ανθεκτικά σε afatinib. Παρ ‘όλα αυτά, η θεραπεία AUY922 κατέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό της γονικής γραμμής και τις δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (Σχ. 1D). Οι επιδράσεις αναστολής της ανάπτυξης των AUY922 παρατηρήθηκαν ακόμη και όταν η συγκέντρωση του φαρμάκου ήταν χαμηλή (Σχ. 2Α).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις gefitinib, erlotinib, afatinib, ή AUY922 για 72 ώρες σε μέσο που περιέχει 1% FBS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

Α, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις AUY922 για 72 ώρες σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Επισυνάπτεται κύτταρα χρωματίστηκαν με μπλε τρυπάνης διάλυμα (κορυφή). Η βιωσιμότητα των κυττάρων με βάση την καταμέτρηση των κυττάρων φαίνεται επίσης (κάτω). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τρία φρεάτια. Β, κύτταρα κατεργασμένα με AUY922, παρόμοια με πάνελ Α Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μόρια σηματοδότησης EGFR που σχετίζονται αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. C, τα κύτταρα LK2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φορέα που περιέχουν φυσικού τύπου EGFR, del Ε746-Ε750, ΚΟΑ, ή AXL και οι ενδεικνυόμενες δόσεις των AUY922 για 12 ώρες.

Η

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι η αντίσταση της HCC827 /GR και κύτταρα HCC827 /ER διαμεσολαβείται από ΚΟΑ ή ενεργοποίηση AXL, αντίστοιχα [6,17]. Προηγούμενες αναφορές έχουν επίσης υποδείξει ότι ένας μεγάλος αριθμός των πρωτεϊνών πελατών της HSP90 έχουν κρίσιμους ρόλους στην εξέλιξη του καρκίνου, και ότι η αναστολή της HSP90 αποδομεί πρωτεΐνες πελάτης [13,20,21]. Έτσι, ερευνήσαμε αν AUY922 επηρεάζει την σταθερότητα του ΚΟΑ ή AXL. Η αναστολή της HSP90 με AUY922 βρέθηκε να οδηγεί στη σημαντική αποικοδόμηση του EGFR, ΜΕΤ, και AXL σε δοσο (Εικ. 2Β) και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (S1 Εικ.). Σε συμφωνία με αυτό, η θεραπεία AUY922 μείωσε επίσης το επίπεδο τεχνητή πρωτεϊνών σε κύτταρα LK2 που επιμολύνθηκαν με γονίδια όπως

EGFR

(WT),

EGFR

(Del Ε746-Ε750),

ΚΟΑ

, και

AXL

(Σχ. 2C).

Πολλοί αναστολείς της HSP90 προκληθεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε διάφορα καρκινικά κύτταρα [22-26]. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των επιπτώσεων της AUY922, εξετάσαμε τις αλλαγές του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ΡΙ-χρώση χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, θεραπεία AUY922 αύξησε τον αριθμό των κυττάρων σε G2 /M φάση και προκαλούμενη υπο-G1 (δηλαδή, θάνατος κυττάρων) μετά από 48 ώρες. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, εξαρτώμενη από τον χρόνο και PARP διάσπαση της κασπάσης-3 παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα αποτελέσματα κατά του όγκου της AUY922 για τη γονική και ανθεκτικά κύτταρα μπορούν να προκύψουν από την διέγερση διακοπής του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο.

Α και Β, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με 0,1 μmol /L AUY922 για 24-72 ώρες. Για την ανάλυση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, τα μαζεμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. C, Προϊόντα λύσης κυττάρου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα υποδεικνυόμενα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Η

AUY922 υπερνικά αποκτήσει αντοχή σε gefitinib /erlotinib σε μοντέλα ξενομοσχεύματος

HCC827GRand HCC827 /ξενομοσχεύματα όγκου ER δημιουργήθηκαν σε ποντίκια SCID την περαιτέρω αξιολογηθεί η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του AUY922. Ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου των HCC827 κύτταρα /ER ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων HCC827 /GR. θεραπεία AUY922 είχε ως αποτέλεσμα την ουσιαστική αναστολή της ανάπτυξης σε δύο κύτταρα (Σχ. 4Α). Κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου διατηρήθηκε σε HCC827 ξενομοσχεύματα /ER έως 2 εβδομάδες μετά τη διακοπή του φαρμάκου, ενώ οι όγκοι στην HCC827 /GR ξενομόσχευμα σιγά-σιγά μεγάλωσε και πάλι μετά τη διακοπή του φαρμάκου. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ιστών όγκων αποκάλυψε ότι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είχε μειωθεί και η απόπτωση προκλήθηκε σε δύο όγκους με αγωγή AUY922 (Σχ. 4Β-C).

Α, SCID ποντίκια με καθιερωμένες HCC827 /GR και των καρκινικών κυττάρων HCC827 /ER ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AUY922. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε στις υποδεικνυόμενες ημέρες, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε. Τα βέλη σημαίνουν τελευταία ημέρα της θεραπείας από τα ναρκωτικά (κόκκινο βέλος, HCC827 /GR? Μωβ βέλος, HCC827 /ER). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο μέγεθος όγκου ± SD. Β και C, ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki-67 και TUNEL που ακολουθείται από ποσοτική ανάλυση του πολλαπλασιασμού και απόπτωσης σε (Β) Ki-67

+ κυττάρων και (Γ) TUNEL

+ κύτταρα.

* ρ

& lt? 0,01 και

** ρ

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

AUY922 μειώνει την κυτταρική

κινητικότητα

Η επαγωγή της AXL ή ΚΟΑ συνδέεται με αυξημένη κυτταρική κινητικότητα σε καρκίνους [6,10,27-29]. Ως εκ τούτου, διερευνώνται οι αλλαγές στην κυτταρική κινητικότητα τόσο των γονικών και gefitinib /κύτταρα erlotinib ανθεκτικά. Όπως αναμενόταν, οι μεταναστευτικές και επεμβατικές ικανότητες και στους δύο τύπους κυττάρων ανθεκτικών αυξηθεί δραματικά σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (Εικ. 5). επεξεργασία AUY922 οδήγησε σε μείωση των μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες και στα δύο ανθεκτικά και γονικών κυττάρων.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω είτε κολλαγόνο ή επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα πολυανθρακικό για τον προσδιορισμό των μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες τους, αντίστοιχα. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε τροποποιημένο Boyden θαλάμους με ή χωρίς τις υποδεικνυόμενες δόσεις AUY922 για 24 ώρες, και τα κύτταρα που διείσδυσαν το φίλτρο χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τρία φρεάτια.

* ρ

& lt? 0,01 και

** ρ

& lt? 0,001 σε σύγκριση με HCC827 κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Από μεταλλαγμένο παραλλαγές EGFR, συμπεριλαμβανομένων των Τ790Μ, πρώτα φαίνεται να σχετίζεται με τις πρωτεΐνες HSP90 συνοδού [16], πολλαπλές παρόμοιες γραμμές αποδείξεων έχουν συσσωρευτεί. κύτταρα που εκφράζουν Τ790Μ που είναι ανθεκτικά ακόμη και σε μη αναστρέψιμη EGFR-ΤΚΙδ είναι ευαίσθητοι στην αναστολή της HSP90. αναστολή της HSP90 οδηγεί στην υποχώρηση του EGFR

L858R

καθοδηγούμενου ποντικού αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα, ανεξάρτητα από την παρουσία του Τ790Μ [15]. Bao et al. ανέφεραν επίσης ότι η στόχευση HSP90 με CUDC-305, έναν αναστολέα της HSP90, μπορούν να ξεπεράσουν erlotinib αντοχή σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [30]. Επιπλέον, 17-DMAG μειώνει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με μεταλλαγμένο EGFR, ανεξάρτητα από την παρουσία μιας μετάλλαξης Τ790Μ σε ποντικούς ξενομοσχεύματος μοντέλα [14]. Σήμερα, πάνω από μια δωδεκάδα οι αναστολείς της HSP90 εγγράφονται σε κλινικές δοκιμές, μερικά από τα οποία διερευνούν Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση σε EGFR-TKIs [20].

Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το ΚΟΑ είναι μια πρωτεΐνη πελάτης HSP90 και είναι υπόκεινται σε αποικοδόμηση κατά την αναστολή της HSP90. SNX-2112, μία νέα μικρή αναστολέας μόριο του HSP90, μειώνει EGF cross-talk και ενεργοποίηση του υποδοχέα c-Met μέσω αποικοδόμησης c-Met σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [31]. Ueno et al. έχουν δείξει ότι η AUY922 είναι αποτελεσματικό έναντι των περισσότερων κυτταρικών σειρών NSCLC, ανεξαρτήτως του γνωστού μοριακού αλλοιώσεις. θεραπεία AUY922 βρέθηκε να επάγει την σημαντική εξάντληση των πρωτεϊνών πελάτη, όπως EGFR, ΜΕΤ, και Akt, αυξάνοντας έτσι την απόπτωση [32]. Αν και αυτές οι μελέτες έχουν καταδείξει την ικανότητα των αναστολέων της HSP90 να μειορυθμίζουν ΜΕΤ, δεν αξιολογούν MET-μεσολαβούμενη αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙ στον καρκίνο του πνεύμονα. Κατά συνέπεια, Koizumi et al. απέδειξαν για πρώτη φορά την αποτελεσματικότητα των αναστολέων της HSP90 να ξεπεράσει την αντίσταση που προκαλείται από ΚΟΑ σηματοδότηση [33]. Στην εν λόγω μελέτη, HGF γονίδιο επιμολυσμένα Ma-1 κύτταρα με EGFR

L858R

(Ma-1 /HGF) δεν ανταποκρίνεται στην erlotinib, ενώ 17-DMAG ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται με μείωση της έκφρασης του EGFR και ΚΟΑ, ακόμα και κάτω από HGF ερεθίσματα. Πρόσθετες κλινικά σχετική μοντέλα μελετήθηκαν από τον Xu et al. [34]. Αυτοί οι συγγραφείς δημιουργούνται διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών που εκφράζουν μεταλλαγμένη Del19-T790M ή L858R-T790M EGFR (το καθένα με ταυτόχρονη ΚΟΑ υπερ-έκφραση). Συνδυασμός EGFR και την αναστολή αναγνώρισης ΚΟΑ με WZ4002 (τρίτης γενιάς EGFR-ΤΚΙ) και crizotinib αποδειχθεί ιδιαίτερα αποτελεσματικό έλεγχο σε αυτά τα μοντέλα καρκίνου, αλλά ούτε και μόνο αυτών των φαρμάκων θα μπορούσε να προκαλέσει μια κατασταλτική αντίδραση. Αυτοί οι συγγραφείς διαπίστωσαν επιπλέον ότι τα αποτελέσματα της 17-DMAG είναι συγκρίσιμα με crizotinib όταν συνδυάζεται με WZ4002, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή ΚΟΑ είναι δυνατή μέσω της HSP90. Επιπλέον, ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σε άλλο μοντέλο ποντικού που φέρει gefitinib ανθεκτικά MET-ενισχυμένο HCC827 ξενομοσχευμάτων. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σχεδόν σε συμφωνία με την τρέχουσα ευρήματά μας σε ένα GR μοντέλο /HCC827. Ωστόσο, το παρόν τα αποτελέσματά μας εκπροσωπεί καλύτερα ένα κλινικό περιβάλλον, διότι HCC827 κύτταρα /GR μας ιδρύθηκαν με συνεχή μακροχρόνια έκθεση στο φάρμακο.

Σε σύγκριση με το ΚΟΑ, υπάρχουν λίγα στοιχεία σχετικά με το πώς AXL εξαρτάται από την HSP90 για την σταθερότητα. Πρόσφατα, Krishnamoorthy et al. ανέφεραν ότι 17-AAG επάγει την καθοδική ρύθμιση του ενδογενούς ή εκτοπικά εκφραζόμενη AXL πρωτεΐνη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς και σε κύτταρα HeLa σε έναν χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με αποτέλεσμα την αναστολή της AXL μεσολάβηση σηματοδότηση και τη βιολογική δραστηριότητα [35 ]. Για τις γνώσεις μας, η τρέχουσα μελέτη μας είναι η πρώτη που αποδεικνύει ότι HSP90 αναστολή από AUY922 μπορούν να ξεπεράσουν AXL μεσολάβηση αντίσταση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και ζωικά μοντέλα. Στο σύνολό τους, ως εκ τούτου, τα στοιχεία δείχνουν ότι, επειδή η αναστολή της HSP90 μπορεί να ξεπεραστεί η επίκτητη αντοχή σε EGFR-TKIs που προκαλείται από τους τρεις κύριους μηχανισμούς ανθεκτικότητας (Τ790Μ, ΚΟΑ, και AXL), η αναστολή της HSP90 θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη επιλογή για την αντιμετώπιση της αντίστασης του EGFR ΤΚΙ.

παρούσες μελέτες, δείξαμε ότι AUY922 κατέστειλε πλήρως την ανάπτυξη του όγκου και στα δύο κύτταρα. Ωστόσο, και οι δύο ανθεκτικά κύτταρα έδειξε το διαφορετικό μοτίβο σε ρυθμό ανάπτυξης και regrowth μετά τη διακοπή του φαρμάκου. κύτταρα HCC827 /GR αυξηθεί με ταχύτερους ρυθμούς από ό, τι HCC827 κύτταρα /ER υπό τον όρο της χωρίς ναρκωτικά και έδειξαν regrowth μετά την απόσυρση του φαρμάκου. Ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων /ER HCC827 ήταν βραδύτερη από ό, τι τα κύτταρα HCC827 /GR

in vitro

(S2 Εικ.). Παρά το γεγονός ότι διάφοροι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, οι διαφορές του ρυθμού ανάπτυξης μπορεί να επηρεάσουν την ανάπτυξη του όγκου. Στην πραγματικότητα, τα κύτταρα HCC827 /ER είχαν χαμηλότερα EGFR καθώς δραστικότητα Akt από κύτταρα HCC827 /GR σε βασικό επίπεδο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν υπήρχαν διαφορές στην απόπτωση, νέκρωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου (G2 /M σύλληψης, S3 Εικ.) και ο πολλαπλασιασμός μεταξύ αυτών των δύο όγκων. Έτσι, η διαφορετική απόκριση στην απόσυρση του φαρμάκου παρέμεινε ασαφές.

Η μετάσταση εξαρτάται από πολλές διεργασίες, όπως είναι η αποκόλληση των κυττάρων όγκου από τον πρωτογενή όγκο, τη μετανάστευση, εισβολή των γύρω στρώμα και τα αιμοφόρα αγγεία, και η επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό σε απομακρυσμένες περιοχές. αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) είναι η μόνη γνωστή συνδέτη του ΚΟΑ και αναγνωρίζεται ως παράγοντας ινοβλαστών προερχόμενο που προωθεί επιθηλιακών κυττάρων αποκόλληση και διεγείρει εισβολή [36,37]. ΜΕΤ επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση, η ανάπτυξη στην εμβρυογένεση, και ελέγχει την ανάπτυξη και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [38]. Κατά συνέπεια, Wu et al. έχουν αποδείξει ότι LY2801653 (ένας αναστολέας ΜΕΤ) αναστέλλει σημαντικά τόσο την πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και μετάσταση στους λεμφαδένες και το τοίχωμα του θώρακα σε Η441 ορθοτοπική μοντέλα [39]. AXL συνδέεται επίσης με κύτταρο όγκου εισβολή και τη μετάσταση και προωθεί την ανάπτυξη του όγκου σε διάφορα είδη καρκίνου. Αναγκαστική έκτοπη έκφραση AXL προκαλεί τα ιδιαίτερα επεμβατική χαρακτηριστικά δει σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού από την αρχική ασθενώς επεμβατική φαινοτύπους, ενώ με τη χρήση θεραπείας shRNA να προκαλέσει AXL νοκ ντάουν μειώνει τις επεμβατικές και μεταναστευτικές δυνατότητες υψηλής επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα [29]. Επιπλέον, AXL χρειάζεται για MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού σε μετάσταση στους πνεύμονες με ορθοτοπική μοντέλα [27]. Στην τρέχουσα αναλύσεις μας, AUY922 μείωσε σημαντικά τις επεμβατικές και μεταναστευτικές δυνατότητες και των δύο καρκινικών κυττάρων με ΚΟΑ ή ενεργοποίηση AXL. Περαιτέρω έρευνες του ρόλου της HSP90 αναστολέων σε μετάσταση καρκίνου χρειάζεται.

Εν περιλήψει, AUY922 ασκεί αποτελεσματικό έλεγχο επί κακοήθεις φαινοτύπους που οδηγούνται από ΚΟΑ και AXL, συμπεριλαμβανομένης της αντίστασης φαρμάκου, στον καρκίνο του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1 mmol /L AUY922 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

Τα πειράματα εκτελέστηκαν όπως περιγράφεται στο σχ. 2Α και Β

doi: 10.1371 /journal.pone.0119832.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Τα κύτταρα (5 Χ 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων με συμπληρωμένο μέσο που περιέχει 10% FBS

αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με απαριθμητή αυτόματο κύτταρο ADAM-MC

doi:.. 10.1371 /περιοδικό. pone.0119832.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. ιστοί όγκου από κάθε ομάδα ομογενοποιήθηκαν για την παρασκευή λύματος και αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αξιολογημένες G2 /M σύλληψης.

Κυκλίνης Β1, ρ21 και cdc2 αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και ρ-cdc2 ( Tyr15) ελήφθη από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0119832.s003

(ΔΕΘ)