Abstract

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι ένας αγγειογόνος μιτογόνο που εμπλέκονται στην προώθηση αγγειογένεση όγκου στο εσωτερικό του σώματος. Ο VEGF είναι μία βασική πρωτεΐνη που απαιτείται για την εξέλιξη του όγκου από καλοήθη σε κακοήθη φαινότυπο. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συγγένεια δέσμευσης ενός προηγουμένως επιλεγμένη ακολουθία απταμερούς DNA 26-mer (SL

2-Β) κατά περιοχή πρόσδεσης ηπαρίνης (HBD) του VEGF

165 πρωτεΐνη. Το SL

2-Β πρώτα χημικώς τροποποιημένη με εισαγωγή δεσμούς φωσφοροθειοϊκού (PS-δεσμούς). Στη συνέχεια, συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) φασματοσκοπία και κυκλικού διχρωισμού (CD) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συγγένεια δέσμευσης, την ειδικότητα και να συναγάγει την διαμόρφωση της PS-τροποποιημένων SL

αλληλουχία 2-Β. Τέλος, αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα του τροποποιημένου SL

αλληλουχία 2-B στο Hep G2 κύτταρα του καρκίνου διερευνήθηκε. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν μια σημαντική βελτίωση όσον αφορά την βιοσταθερότητα της SL

ακολουθία 2-Β μετά την τροποποίηση PS. Το τροποποιημένο

σειρά SL 2-Β παρουσιάζει επίσης ενισχυμένη ανασταλτική δράση κατά του καρκίνου Hep G2 κύτταρα σε συνθήκες υποξίας. Επιπλέον, τροποποιημένες SL

αλληλουχία 2-Β αναστέλλει την έκφραση Jagged-1 πρωτεΐνη, η οποία είναι μία από τις συνδετήρων προς VEGF συνδέεται οδό σηματοδότησης δέλτα /ακανόνιστα-notch

Παράθεση:. Kaur Η, Li JJ, Bay BH, Yung L-YL (2013) Διερεύνηση της αντιπολλαπλασιαστικής δραστικότητας της υψηλής συγγένειας DNA απταμερές σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (1): e50964. doi: 10.1371 /journal.pone.0050964

Επιμέλεια: Antonio Facchiano, IDI, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Ιταλία

Ελήφθη: 2η του Μάη 2012? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Kaur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση της έρευνας από το Υπουργείο Παιδείας Ακαδημαϊκών Ταμείου έρευνας Tier 2 επιχορήγηση MOE2008-T2-1-046 Σιγκαπούρη και Tier 1 επιχορήγηση R279000282112. Οι συγγραφείς εκτίμησαν επίσης την διδακτορική υποτροφία (για Η.Κ.) από NUS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου παγκοσμίως και αντιπροσώπευαν το 7,6 εκατομμύρια θανάτους το 2008 [1], [2]. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, περίπου 1 στους 4 ανθρώπους να πεθάνουν λόγω καρκίνου [3]. Επί του παρόντος, τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι μια από τις πιο προηγμένες θεραπευτικούς παράγοντες για τη θεραπεία του καρκίνου στην αγορά. Αρκετές FDA ενέκρινε μονοκλωνικό φάρμακα αντίσωμα, όπως bevacizumab (εμπορική ονομασία: Avastin) έναντι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) σε ορθοκολικό, πνεύμονα, και τη θεραπεία του καρκίνου του νεφρού, η τραστουζουμάμπη (εμπορική ονομασία: Herceptin) έναντι υποδοχέα HER2 /neu στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού και cetuximab (εμπορική ονομασία: Erbitux) έναντι υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σε μεταστατικούς καρκίνους του παχέος εντέρου, της κεφαλής και του τραχήλου, έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται είτε ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα και ακτινοβολία για τη θεραπεία του καρκίνου [4 ] – [12]

το 1990, ένας

in vitro

διαδικασία επιλογής που ονομάζεται συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού (SELEX) αναπτύχθηκε για τη διαλογή μονόκλωνα μόρια νουκλεϊκών οξέων από τυχαία ομάδα. βιβλιοθήκη έναντι του συνδετήρα στόχου [13], [14]. Αυτές οι κατηγορίες μονόκλωνα μόρια αναφέρεται ως «απταμερή». Κατέχουν υψηλή συγγένεια σύνδεσης και ειδικότητα που είναι συγκρίσιμες με μονοκλωνικά αντισώματα. Επιπλέον, το μικρό μέγεθος, μη ανοσογονικότητα και την ευκολία της τροποποίησης σε σχέση με τα συμβατικά μονοκλωνικό αντίσωμα καθιστά απταμερή ελκυστική για θεραπευτική εφαρμογή [15]. Με βάση τα πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε προκλινικές μελέτες, δύο στόχευσης καρκίνος απταμερή, ACT-GRO-777 (ή AS1411) – ένα G-πλούσιο DNA απταμερούς στόχευσης νουκλεολίνης για τη θεραπεία της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) και NOx-A12 L-RNA απταμερές στόχευσης CXCL12 για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος και του λεμφώματος είναι ήδη σε κλινικές δοκιμές [16], [17].

Ένα πρόβλημα που προκύπτει επικεφαλής στην θεραπευτική εφαρμογή των απταμερών είναι η αστάθεια τους κάτω από το

in vitro

και

in vivo

συνθήκες [18]. Αυτοί είναι ευαίσθητα σε ενζυματική προσβολή νουκλεάσης στα κυτταρικά και του ορού υγρά. Για να παρακαμφθεί αυτό το πρόβλημα, έχουν αρκετές στρατηγικές χημική τροποποίηση έχουν χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση της αντοχής τους έναντι νουκλεασών και να παρατείνουν την κυκλοφορία ημίσειας ζωής τους στα βιολογικά υγρά. Τέτοιες χημικές τροποποιήσεις περιλαμβάνουν την ενσωμάτωση δεσμούς φωσφοροθειοϊκού (PS-δεσμούς) ή κλειδωμένα νουκλεϊνικά οξέα (LNAs), προσθήκη λειτουργικών ομάδων, όπως αμινο (-ΝΗ

2), φθόριο (F),

O

-μεθυλ (-OCH

3) σε 2′-θέση του σακχάρου ριβόζη, και σύζευξη με υψηλή μάζα πολυαιθυλενογλυκόλη μοριακού (PEG) ή χοληστερίνη [19] – [25]. Μελέτες έχουν δείξει ότι, σε σύγκριση με το μη τροποποιημένο εκδοχή, τα χημικώς τροποποιημένα απταμερή επιδεικνύουν όχι μόνο μεγαλύτερη διάρκεια ζωής στο βιολογικό περιβάλλον αλλά μερικές φορές επίσης καλύτερη συγγένεια σύνδεσης και ειδικότητα προς τους στόχους τους [21], [26].

VEGF είναι ένα κρίσιμο αγγειογόνος μιτογόνο υπερεκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα και επάγει τη μετανάστευση, τον υπερβολικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και ο μεταβολισμός τους στο εσωτερικό του σώματος. VEGF θεωρείται ότι είναι το σήμα κατατεθέν πρωτεΐνη για την αγγειογένεση όγκων και έχει συσχετιστεί με νεοπλαστικό μετασχηματισμό των κυττάρων στο εσωτερικό του σώματος [27]. Πιστεύεται γενικά να εκκρίνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση τους. Προηγούμενες εκθέσεις, ωστόσο, δείχνουν ότι διαφορετικές κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος καρκίνωμα και κακοήθη εκκρίνουν επίσης αυτήν την πρωτεΐνη [28] – [31]. VEGF

165 είναι η προ-κυρίαρχη ισομορφή του VEGF-A πρωτεΐνη, ένα από τα μέλη της οικογένειας VEGF, και κατά κύριο λόγο συνδέεται με δύο τυροσίνης-κινάσης των υποδοχέων του VEGFR-1 /Flt-1 και VEGFR-2 /KDR /Flk -1 με πολύ υψηλή συγγένεια και για συγκεκριμένες neuropilins συν-υποδοχέα [27]. Η μιτογόνος σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα επάγεται από την έκφραση του VEGFR-2 [32], [33]. Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση του VEGFR-1 έχει ως αποτέλεσμα κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων, αλλά όχι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [34] – [36].

Στην προηγούμενη μελέτη μας, ένα 26-μερές DNA απταμερές έναντι περιοχής δέσμευσης ηπαρίνης (HBD ) του VEGF

165 πρωτεΐνη (που αναφέρεται ως ελήφθη SL

2-Β) με τη χρήση της στρατηγικής κολόβωση stem-loop [37]. Σε σύγκριση με την αρχική μη κολοβωμένο απταμερές, το SL

2-Β απταμερές εμφάνισε περισσότερο από 200-πλάσια αύξηση στην συγγένεια δέσμευσης με VEGF

165 πρωτεΐνη. Στο παρόν, έχουμε τροποποιήσει το SL

απταμερούς 2-Β με την ενσωμάτωση φωσφοροθειοϊκού (PS) συνδέσεων, δοκιμάστηκαν συγγένεια πρόσδεσης, ειδικότητα, βιοσταθερότητα, δευτερεύουσα δομή της και το δυναμικό σκοπιμότητα της PS-τροποποιημένο SL

2-Β απταμερές ως ανταγωνιστή σχετικά με τη δραστηριότητα του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Δείξαμε ότι, σε σύγκριση με μη τροποποιημένο SL

2-Β απταμερές, το PS-τροποποιημένο SL

2-Β απταμερές είναι μια βελτιωμένη αλληλουχία από την άποψη της σταθερότητας του ορού και αντιπολλαπλασιαστική δράση χωρίς να θυσιάζεται η συγγένεια δέσμευσης και ειδικότητα για VEGF

165 πρωτεΐνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά