Αφηρημένο

Ιστορικό

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια στις Ηνωμένες Πολιτείες. Δυστυχώς, δεν έχει ακόμη αναπτυχθεί μια επικυρωμένη δοκιμή βιοδείκτης-διαλογής πρωτεΐνη για την ανίχνευση της νόσου πρώιμο στάδιο από το περιφερικό αίμα. Η παρούσα έρευνα αξιολογεί την ικανότητα να εντοπίζει σχετικές πρωτεΐνες όγκου από καρκίνο των ωοθηκών εγγύς υγρά, συμπεριλαμβανομένων των ιστών διάμεσο υγρό (ΔΕΘ) και τα αντίστοιχα ασκίτη, από ασθενείς με θηλώδες ορώδες EOC και μεταφράζει αυτά τα ευρήματα σε στοχευμένες ανοσολογικές δοκιμασίες με βάση το αίμα.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Paired TIF και ασκίτης συλλέγεται από τέσσερα θηλώδες EOC ασθενείς ορώδες κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης υποβλήθηκαν σε ανοσοεξάντληση, ανάλυση με ηλεκτροφόρηση γέλης 1D και in-gel πέψη για ανάλυση με υγρή χρωματογραφία φασματομετρία μάζας-tandem, που είχε ως αποτέλεσμα ένα συνολικό προσδιορισμό των 569 και 171 πρωτεΐνες από TIF και ασκίτη, αντίστοιχα. Από αυτά, peroxiredoxin Ι (PRDX1) επιλέχθηκε για την επικύρωση στον ορό με ELISA και αποδείχθηκε ότι είναι παρόντες και σημαντικά αυξημένη (p = 0,0188) σε 20 ασθενείς ΕΓΚ με ένα μέσο επίπεδο του 26,0 ng /mL (± 9,27 SEM) σε σύγκριση με 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) από 16 ασθενείς με φυσιολογική /καλοήθη παθολογία των ωοθηκών.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε χρησιμοποιηθεί μια ροή εργασίας για τη συγκομιδή EOC-σχετικές εγγύς Biofluids, συμπεριλαμβανομένης της ΔΕΘ και ασκίτη, για την πρωτεομική ανάλυση. Μεταξύ των διαφορικά άφθονες πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν από αυτές τις εγγύς ρευστά, PRDX1 αποδείχθηκε να είναι παρούσα στον ορό και δείχνεται με ELISA να είναι αυξημένα κατά περίπου 6 φορές σε θηλώδεις EOC ασθενείς ορώδες σχέση με το φυσιολογικό /καλοήθη ασθενείς. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν την εύκολη δυνατότητα να ανακαλύψουν τις δυνατότητές EOC-σχετικών πρωτεϊνών στο εγγύς υγρά και να επιβεβαιώσει την παρουσία τους στον ορό του περιφερικού αίματος. Επιπλέον, το εύρημα μας αυξημένων επιπέδων PRDX1 στον ορό των ασθενών ΕΓΚ έναντι των φυσιολογικών /καλοήθη ασθενείς δικαιολογεί περαιτέρω αξιολόγηση ως ειδικό όγκο βιοδείκτη για ΕΓΚ

Παράθεση:. Hoskins ER, Hood, BL, Sun M, Krivak TC, Edwards RP, Conrads TP (2011) πρωτεομική ανάλυση του καρκίνου των ωοθηκών εγγύς Υγρά: Επικύρωση Αυξημένα Peroxiredoxin 1 ασθενής περιφερική κυκλοφορία. PLoS ONE 6 (9): e25056. doi: 10.1371 /journal.pone.0025056

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Ιουν, 2011? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Hoskins et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση προβλεπόταν από το πρόγραμμα του έργου Scaife Ίδρυμα Pilot. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου 22.220 γυναίκες διαγιγνώσκονται ετησίως με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) και πάνω από 13.000 υποκύπτουν στην ασθένεια αυτή [1]. Οι γυναίκες με ΕΓΚ έχουν ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 18-34%, όπου η κακή πρόγνωση είναι κατά κύριο λόγο οφείλεται στο γεγονός ότι η πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένο στάδιο της νόσου [2]. Ανίχνευση της ασθένειας σε πρώιμο στάδιο, με τη βέλτιστη διαγνωστική εξέταση θα έχει θετική επίδραση στη συνολική επιβίωση? Ωστόσο, δεν υπάρχουν διαθέσιμα βιοδείκτες που είναι επαρκώς ευαίσθητες ή ειδικές για την ανάπτυξη μιας κατάλληλης δοκιμής για να έχουν χρησιμότητα για τη διαλογή του γενικού πληθυσμού. Η βλεννίνη 16, επίσης γνωστή ως αντιγόνο καρκίνου (CA) -125, ανακαλύφθηκε από την παραγωγή αντισωμάτων του ξενομοσχευμάτων όγκου [3] και ανιχνεύεται εύκολα στον ορό. Ένα FDA-εγκριθεί CA-125 ανοσολογική δοκιμή είναι σήμερα σε χρήση για την παρακολούθηση της ανταπόκρισης της νόσου σε χημειοθεραπευτική αγωγή και την επανάληψη? Ωστόσο, η μέτρηση του CA-125 είναι αναποτελεσματική για τη διαλογή (μια χρήση off-label) για ΕΓΚ στο γενικό πληθυσμό [4]. Ενώ ανοσοανίχνευση αντιγόνων που σχετίζονται με όγκους έχει συμβάλει στην γνώση της φυσικής ιστορίας της νόσου, τα μέτρα τους δεν έχουν ακόμη προσδιορίσει με συνέπεια πρώιμο στάδιο EOC.

Υψηλή ανάλυση γονιδιακής έκφρασης throughput του φυσιολογικού ιστού των ωοθηκών σε σχέση με EOC έχει αποκάλυψε μοναδικές υπογραφές γονίδιο εκφράζεται σε ΕΓΚ. Αν και αυτές οι υπογραφές έχουν παράσχει περαιτέρω κατανόηση της μοριακής βιολογίας του ΕΓΚ, η έκφραση γονιδίου δεν με συνέπεια συσχετίζεται με πρωτεΐνη αφθονία [5], ιδίως στο περιφερικό αίμα, η οποία αντιπροσωπεύει την πλέον κλινικά σχετική πηγή δείγμα για τη συνήθη ανάπτυξη δοκιμασίας και μέτρησης [6]. Ενώ πρωτεομική προφίλ του ορού αποτελεί μια ελκυστική προσέγγιση για βιοδεικτών ανακάλυψη, η στρατηγική αυτή είναι αναλυτικά πρόκληση λόγω της υψηλό δυναμικό εύρος της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε αυτό το δείγμα, το οποίο παρεμποδίζει την ανακάλυψη του κατώτερου αφθονίας, πρωτεΐνες όγκου που σχετίζονται. Που προκύπτουν από τις εγγενείς αναλυτικά τις προκλήσεις που σχετίζονται με την πρωτεομική ορού, εγγύς υγρά έχουν αποκτήσει αυξανόμενη προσοχή για τη διεξαγωγή των υποψηφίων πρωτεϊνικών βιοδεικτών ανακάλυψη [7]. Στην περίπτωση της EOC, ασκίτης αντιπροσωπεύει μια ελκυστική πηγή δείγματος για υποψήφιες ανακάλυψη, δεδομένου ότι λούζει τα μη προσκολλημένα κύτταρα καρκίνου και παρακείμενα μεσοθηλιακών κυττάρων και περιέχει άφθονες πληροφορίες καθώς και στην ανάπτυξη, την επιβίωση και τη μετάσταση σηματοδότηση παράγοντες [8]. Ενώ ασκίτη είναι ένα σημαντικό μέσο για τη διεξαγωγή ερευνών ανακάλυψη της πρωτεΐνης βιοδεικτών, μοιάζει πολύ με ορό, περιέχει επίσης πρωτεΐνες που υπάρχουν σε ένα υψηλό δυναμικό εύρος της συγκέντρωσης που απαιτούν διάφορες τεχνικές κλασματοποίησης για να για να προσδιορίσει κάτω άφθονες πρωτεΐνες [9].

ιστών διάμεσο υγρό (TIF) είναι ένα άλλο δείγμα που έχει αποκτήσει αυξανόμενη προσοχή ως ένα υπόστρωμα από το οποίο μπορεί να διεξαχθεί υποψήφια πρωτεΐνη βιοδεικτών ανακάλυψη από τον ιστό του όγκου. Tissue διάμεσο υγρό είναι μία πλούσια πηγή δείγμα πρωτεΐνη που υποτίθεται ότι περιέχουν εκκρίνεται, υπόστεγο ή /και effluxed πρωτεΐνες από τον όγκο και τις γειτονικές στρώμα. Celis et al. ήταν οι πρώτοι για να διερευνήσει τις πρωτεΐνες από καρκίνο του μαστού και φυσιολογικά TIF [10], όπου δείχθηκε ότι οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από πρωτεομική MS-based μπορούσε να επικυρώνονται εξωτερικά με μικροσυστοιχία ιστό που περιέχει πάνω από 70 δείγματα ιστού καρκινώματος μαστού [11]. Σε μια πιο πρόσφατη έρευνα, ένας MS-based πρωτεομική ροής εργασίας για την ταυτοποίηση διαφορικά άφθονες πρωτεΐνες στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) έδειξαν αυξημένα επίπεδα ενολάσης 2 (ΕΝΟ2) και θρομβοσπονδίνη-1 (TSP1) σε TIF όγκου. Αυτές επίσης επαληθευτεί ως παρόν και σε αυξημένη αφθονία σε RCC δείγματα ορού ασθενούς, σε σύγκριση με τον έλεγχο του ορού [12]. Αυτή η έρευνα έδειξε ότι οι πρωτεΐνες που ανακαλύφθηκε στην ΔΕΘ έχουν μια υψηλή τάση για τη μετάφραση σε δοκιμασίες ορού βάση.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια πρωτεομική ροή εργασίας MS-βάση για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων πρωτεϊνών όγκου από TIF και ασκίτη από την EOC ασθενείς. Μεταξύ των διαφορικά άφθονες πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν από αυτές τις εγγύς ρευστά, peroxiredoxin 1 (PRDX1) αποδείχθηκε να είναι παρούσα στον ορό και δείχνεται με ELISA να είναι αυξημένα κατά περίπου 6 φορές σε θηλώδεις EOC ασθενείς ορώδες σχέση με το φυσιολογικό /καλοήθη ασθενείς. Η μελέτη μας προσθέτει περαιτέρω υποστήριξη στην υπόθεση ότι ΔΕΘ αντιπροσωπεύει ένα ελκυστικό εγγύς Βιορευστομηχανική για τη διεξαγωγή υποψήφιο βιοδείκτη ανακάλυψη για την ενδεχόμενη πρόωρη ανίχνευση του ΕΓΚ.

Αποτελέσματα

Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη που ανακτάται από ΔΕΘ και ασκίτη ορατά με ανάλυση σε πηκτή 1D-PAGE (Εικόνα 1). Μία σημαντική ποσότητα ανθρώπινης λευκωματίνης ορού (HSA) ήταν παρούσα και στα δύο δείγματα, αν και σε χαμηλότερα επίπεδα σε TIF από ασκίτη. Αυτή η μεγαλύτερη επίπεδο HSA σε ασκίτη είναι σημαντική, καθώς αυξάνει αποτελεσματικά το συνολικό δυναμικό εύρος πρωτεϊνικής συγκέντρωσης μεταξύ της υψηλότερης (π.χ. HSA) και το χαμηλότερο άφθονες πρωτεΐνες σε αυτό τον τύπο δείγματος. Μια μεγαλύτερη αντιπροσώπευση του πρωτεώματος προκύπτει στο δείγμα TIF λόγω της χαμηλότερης συνολική συμβολή της HSA με τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες. Δεδομένης της διαφορετικό συμβολή της HSA σε αυτά τα δύο δείγματα, η έρευνά μας χρησιμοποίησε ένα πρωτόκολλο ανοσοεξάντληση συγγένεια με βάση για να απομακρυνθούν οι κλασικές πολύ άφθονες πρωτεΐνες ορού υπάρχει σε κάθε δείγμα. Η μεθοδολογία αυτή είχε ως αποτέλεσμα μια αποτελεσματική απομάκρυνση ενός αριθμού πολύ άφθονες πρωτεΐνες όπως φαίνεται για ένα δείγμα TIF (Σχήμα 1), επιτρέποντας μια πιο ολοκληρωμένη σύγκριση της πρωτεομικής περιεχόμενο του ασκίτη και TIF παρακάτω ανάλυση LC-MS /MS.

(Α) Εκπρόσωπος ασκίτη και τα δείγματα ΔΕΘ που απεικονίζει την παρουσία άφθονων ειδών πρωτεΐνης στα δύο δείγματα, καθώς και την πολυπλοκότητα της συγκομίζονται δείγματος ΔΕΘ. (Β) Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα της ΔΕΘ πριν και μετά ανοσοεξάντληση με τη στήλη Agilent MARS Hu-14 ανοσοσυγγένειας.

Η

Αξιόπιστες ασκίτη και ΔΕΘ συλλέχθηκαν από τέσσερις ασθενείς (Πίνακας 1), ανοσολογικά και ισοδύναμες πρωτεΐνες ποσότητες κάθε επιλύονται με 1D-PAGE. Κάθε λωρίδα γέλη κόπηκε σε πέντε ισοδύναμα φέτες, in-gel πέψη και τα προϊόντα της πέψης πεπτιδίου αναλύθηκαν με LC-MS /MS σε δύο αντίτυπα, με αποτέλεσμα 10.274 πρωτεΐνες εντοπίστηκαν σε όλη όλα τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προσδιορίζονται από ένα και μόνο πεπτίδιο. Εμείς επιλέξαμε να επιβάλει κριτήριο αποκλεισμού, έτσι ώστε μόνο οι πρωτεΐνες που εκπροσωπείται από δύο φασματικές μετρήσεις ή περισσότερο σε όλους τους τέσσερα δείγματα ασθενών είτε από TIF ή ασκίτη επελέγησαν για τη συγκριτική πρωτεομική ανάλυση των δεδομένων, η οποία κατέληξε σε ένα σύνολο δεδομένων αποτελείται από 569 και 171 πρωτεΐνες εντοπίζονται σε όλες τις τέσσερις ΔΕΘ και τον ασθενή ασκίτη δείγματα, αντίστοιχα (Πίνακας S1? οι πρώτες αρχεία δεδομένων LC-MS /MS είναι διαθέσιμο για λήψη από το Repository Tranche δεδομένων σε https://proteomecommons.org/tranche/). Ingenuity Pathway Ανάλυση σχολιασμό της κυτταρικής εντοπισμό των πρωτεϊνών προσδιορίζονται αποκάλυψε ένα μεγάλο εμπλουτισμό σε cytoplasmic- και πυρηνικών προερχόμενων πρωτεϊνών σε TIF σε σχέση με ασκίτη (Σχήμα 2). Δεν αποτελεί έκπληξη, ένα υψηλό ποσοστό των πρωτεϊνών εξωκυτταρικής υπήρχαν σε ασκίτη σε σύγκριση με TIF. Εξωκυτταρικών πρωτεϊνών κυριάρχησε τις κοινές πρωτεΐνες εντοπίζονται, με τη συντριπτική πλειοψηφία προέρχεται από ασκίτη. Υποκυτταρικών πρωτεΐνες γενικά προέρχεται από την ΔΕΘ? Αυτές οι πρωτεΐνες σε υψηλότερη συγκέντρωση σε TIF με μειωμένα επίπεδα σε ασκίτη. Αυτό έρχεται σε αντίθεση διαφορά στην προέλευση του κυτταρικού εντοπισμού υποδηλώνει ότι TIF περιέχει πρωτεΐνες υψηλής αντανάκλασης της κυτταρικής σύνθεσης του μικροπεριβάλλοντος ιστού.

ιστών διάμεσο υγρό και πρωτεΐνες ασκίτη που εντοπίστηκαν από δύο ή περισσότερες φασματικές μετρήσεις σε κάθε Βιορευστομηχανική, σεβασμό, αναλύθηκαν για την κυτταρική διαμερισματοποίηση με Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA). Σχεδόν το 85% των πρωτεϊνών TIF προέρχονταν κυτταρόπλασμα ή /και τον πυρήνα. Ασκίτης είχε ένα προφίλ πρωτεΐνη ορού-όπως και με το 66% των πρωτεϊνών είναι εξωκυττάριο στην προέλευση.

Η

Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών προσδιορίζονται, peroxiredoxin 1 (PRDX1) αναγνωρίστηκε σε μεγαλύτερη αφθονία (κατά μέσο όρο 13 φορές σε μεγαλύτερη φασματική μέτρηση) σε δείγματα ΔΕΘ, σε σύγκριση με ασκίτη. Επιβεβαιώσαμε την παρουσία και τη διαφορική αφθονία PRDX1 στις δύο biospecimens με κηλίδα western (Σχήμα 3). Ενώ PDRX1 είναι συνήθως εντοπίζονται και να μελετηθεί σε ιστό, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η αφθονία των PRDX1 ήταν αυξημένα στον ορό από έναν αφελή ομάδα (π.χ. δεν είναι μέρος της αρχικής σειράς ανακάλυψή μας) από 20 ασθενείς με σταδίου ΙΙ ή υψηλότερο EOC (Πίνακας 2) σε σύγκριση με ασθενείς με καλοήθη παθολογία των ωοθηκών (Πίνακας 3). Η μέση στάθμη του PRDX1 από αυτούς τους 20 EOC ασθενείς καθορίστηκε να είναι 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) και 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) από τις /πληθυσμούς καλοήθων ωοθηκών 16 ελέγχου, όπως μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο PDRX1 ELISA. Αυτό κατά προσέγγιση 6 φορές μεγαλύτερη αφθονία PDRX1 στον ορό των ασθενών EOC βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντική (Σχήμα 4, ρ = 0.0188).

Peroxiredoxin 1 επαλήθευση μέσω ανάλυσης κηλίδος western σε ασκίτη (Α) και TIF ( Β) ανακεφαλαιώνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη φασματική μέτρηση (SC) τιμές που μετρώνται από τη χρωματογραφία-διαδοχική ανάλυση υγρών φασματομετρία μάζας αυτών των δειγμάτων.

η

Ορός από 20 ασθενείς με διάγνωση Στάδιο IIC ή μεγαλύτερο του καρκίνου των ωοθηκών ( περιπτώσεις) και ορό από 20 ασθενείς με καλοήθη ωοθηκών παθολογία (μάρτυρες) αξιολογήθηκε για την παρουσία και την ποσότητα PDRX1 με ELISA. Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων μέση PDRX1 (p = 0,0188) και στις δύο ομάδες.

Η

Η

Συζήτηση

Παρουσίαση με κοιλιακή πληρότητα, νωρίς κορεσμού , μια πυελική μάζα και ασκίτη είναι χαρακτηριστική για τις γυναίκες με EOC, δυστυχώς όμως, αυτά τα συμπτώματα συχνά εμφανίζονται μόνο όταν η νόσος έχει προχωρήσει σε στάδιο. Μια δοκιμασία διαλογής για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών πρώιμο στάδιο, όταν η 5-ετή επιβίωση είναι σχεδόν 70-90% [13], δεν έχει ακόμη αναπτυχθεί. Η χαμηλή συχνότητα εμφάνισης της πρόωρης ΕΓΚ στάδιο αποκλείει την εκτενή μελέτη της παθογένειας της νόσου, έτσι οι περισσότερες έρευνες παρατηρείται στη νόσο προχωρημένο στάδιο. Εντοπίσαμε γυναίκες με προχωρημένο EOC και συλλέγονται σε συνδυασμό ασκίτη και ΔΕΘ από όγκους του καρκίνου των ωοθηκών από τον κάθε ασθενή για την πρωτεομική ανάλυση. Ασκίτης και ΔΕΘ ήταν ανοσολογικά εξαιρετικά άφθονες πρωτεΐνες πριν από την ανάλυση LC-MS /MS. Τα στοιχεία μας αποκάλυψε ότι ο ασκίτης και το λιμάνι της ΔΕΘ πολύ διαφορετικά προφίλ πρωτεΐνης. Ασκίτης κατέχει πρωτεομική χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνη του ορού, που αποτελείται κυρίως από πρωτεΐνες που προέρχονται από το εξωκυτταρικό διαμέρισμα. Αντιστρόφως, TIF αποτελείται από πρωτεΐνες περισσότερο αντιπροσωπευτική ενός μικροπεριβάλλοντος ιστού, με πολλά προέρχονται από διάφορα διαμερίσματα από τα κύτταρα.

Στην ανάλυσή μας, 569 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε κοινά μεταξύ όλων των δειγμάτων ασθενούς TIF, σε σύγκριση με 171 πρωτεΐνες κοινώς προσδιορίζονται στο αντίστοιχο ρευστό ασκίτη. Μεταξύ αυτών, PRDX1 ταυτοποιήθηκε σε μεγαλύτερη αφθονία σε δείγματα TIF σε σύγκριση με ασκίτη. TIF υποτίθεται ότι περιέχουν υψηλότερη σχετική συγκέντρωση των πρωτεϊνών που προέρχονται μέσω του παθητικού /ενζυματικής απόπτωση, την έκκριση, την εκροή και την απόπτωση. Κατά παρόμοιο τρόπο, αυτά τα ίδια διεργασίες πιθανό να οδηγήσει σε «διαρροή» ορισμένων ή όλων αυτών των ίδιων των πρωτεϊνών μέσα στο αγγειακό σύστημα και την περιφερική κυκλοφορία. Η παρατηρούμενη μεγαλύτερο επίπεδο PRDX1 στη ΔΕΘ σε σχέση με ασκίτη δεν είναι απροσδόκητο για πολλαπλή biologically- και αναλυτικά σχετίζονται λόγους. Από βιολογικής πλευράς, TIF είναι σε μεγάλο βαθμό προέρχεται από το μικροπεριβάλλον του όγκου και ως εκ τούτου πιθανόν να περιέχουν υψηλότερες σχετικές συγκεντρώσεις του /πρωτεΐνες στρώματος προερχόμενα όγκου σε σύγκριση με άλλα υγρά περιφερικού σώματος, όπως ασκίτης και ορό. Η συνέπεια αυτής της διαφοράς σε δυναμικό εύρος πρωτεϊνικής συγκέντρωσης μεταξύ αυτών των υγρών του σώματος μειώνει αποτελεσματικά το δυναμικό εύρος της συγκέντρωσης πρωτεΐνης σε ασκίτη και /ή στον ορό, σε σύγκριση με TIF. Για τους λόγους αυτούς, η συμπερίληψη του εγγύς ρευστών όπως TIF σε πρωτεομική με βάση τις έρευνες που βιοδεικτών ανακάλυψη αντιπροσωπεύει μία νέα στρατηγική για τη συγκομιδή υπόστεγο και εκκρινόμενες πρωτεΐνες πλησίον μικροπεριβάλλον καρκινικό ιστό των οποίων η παρουσία είναι πιθανό να αντανακλάται στον ορό από τους ίδιους ασθενείς.

PRDX1 είναι ένα πανταχού παρόν ιστός που προέρχεται από πρωτεΐνη με γνωστή λειτουργία ως αντιοξειδωτικό. PRDX1 προστατεύει κυρίως τα κύτταρα από βλάβη του DNA και το δυναμικό μεταλλαξιγένεσης με σχηματισμό αλκοολών ακόλουθη ενζυμική αντίδραση με αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζες υδροξυλίου [14]. PRDX1 έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των γνωστών αυξημένο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης σε πολυάριθμες καρκίνους [15], [16]. παρουσία PRDX1 σε καρκινώματα σχετίζεται με την αναστολή της απόπτωσης, που ισοδυναμεί με αυξημένη επιβίωση του όγκου [16], [17], [18]. Ενώ υπάρχει περιορισμένα δεδομένα σε σχέση με PRDX1 και τις επιπτώσεις της στην EOC παθογένεια και τα κλινικά αποτελέσματα, Chung et al. έχουν προτείνει ότι η έκφραση PRDX1 σε EOC είναι ένας προγνωστικός δείκτης της μειωμένης επιβίωσης [19]. Επιπλέον, διάφορα άλλα peroxiredoxin μέλη της οικογένειας (PRDX2-6) πιστεύεται ότι συνδέονται με την ωοθηκική καρκινογένεση, όπου αυτές έχουν αναφερθεί να είναι υψηλά σε οριακά όγκους των ωοθηκών σε σχέση με καλοήθεις βλάβες των ωοθηκών [20]. Maxwell et al. πρόσφατα πραγματοποίησε μια μεγάλης κλίμακας πρωτεομική ανάλυση του λέιζερ μικροτομή ενδομήτριου ιστού καρκίνου και σημείωσε ότι ακόμη και το στάδιο Ι του ενδομητρίου είχαν αυξημένα επίπεδα των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε οξειδωτικό στρες και φλεγμονής σε σύγκριση με το φυσιολογικό ενδομήτριο. PRDX1 ήταν μεταξύ των οξειδωτικό στρες πρωτεΐνες που είχε επικυρωθεί να είναι σημαντικά αυξημένα στο στάδιο Ι του ενδομητρίου καρκινικού ιστού [21]. Στην παρούσα μελέτη, η παρουσία PRDX1 σε TIF και ασκίτη από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών ελέγχθηκε με στύπωμα western να είναι αυξημένα σε αφθονία στην TIF σε σύγκριση με ασκίτη. Με βάση την υπόθεση ότι ένα υποσύνολο πρωτεϊνών TIF αντιπροσωπεύουν υπόστεγο /εκκρινόμενες πρωτεΐνες από την μικροπεριβάλλον και, ως εκ τούτου μπορεί να είναι ανταλλάξιμο και επομένως ανιχνεύσιμο, εντός του περιφερικού αίματος, επιχειρήσαμε να προσδιοριστούν τα επίπεδα των PRDX1 στον ορό του αίματος χρησιμοποιώντας ένα άκρως επικυρωμένη, εμπορικώς διαθέσιμα ELISA. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι οι ασθενείς με προχωρημένο ΕΓΚ είχε μια 6-πλάσια αυξημένο επίπεδο PRDX1 στον ορό τους σε σύγκριση με τους ασθενείς με φυσιολογική /καλοήθη ωοθήκες (p = 0,0188).

Αν και PRDX1 δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως να παρευρίσκονται στον ορό, με βάση την υπόθεση ότι κάποιοι (αν όχι όλες) τις πρωτεΐνες ΔΕΘ είναι ανταλλάξιμες με περιφερική κυκλοφορία, χρησιμοποιήσαμε μια στοχευμένη προσέγγιση που βασίζεται σε ELISA για να επαληθεύσετε για πρώτη φορά αυτή την υπόθεση και δευτερευόντως για να τεθεί το ερώτημα αν αυτή η πρωτεΐνη είναι διαφορικά άφθονη σε ορό από ασθενείς με EOC, σε σύγκριση με τα άτομα με καλοήθη παθολογίες της ωοθήκης. Έχουμε περιορισμένη αυτή εξωτερική επικύρωση της PRDX1 σε ορό λόγω των αυξημένων επιπέδων της PRDX1 έχουν ήδη αποδειχθεί σε ιστό καρκίνου των ωοθηκών από την κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία [19]. Στην ιδανική περίπτωση, τα πάνελ των επιλεγμένων βιοδεικτών είναι πιθανόν απαραίτητη προκειμένου να αναπτυχθεί μια επικυρωμένη δοκιμασία προσυμπτωματικού ελέγχου για την έγκαιρη διάγνωση του ΕΓΚ [22], μοναδικός στόχος μας ήταν να αποδειχθεί η σκοπιμότητα της μετάφρασης πρωτεομική ανακαλύψεις MS-βάση από την ΔΕΘ σε στοχευμένες αναλύσεις ορού που βασίζεται στην η υπόθεση αυτή PRDX1. Αναγνωρίζουμε ότι δεν μπορούμε να συμπεράνουμε ότι PRDX1 είναι αρκετά ευαίσθητη και ειδική για να θεωρηθεί ως βιοδείκτη διαλογής για ΕΓΚ με βάση την ομάδα δείγμα περιορισμένη επικύρωσης μας, ωστόσο, ότι είναι ανιχνεύσιμη και αυξημένα στον ορό ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών σε σύγκριση ταιριάζουν καλοήθεις ελέγχους παρέχει περαιτέρω στήριξη αποδεικτικά στοιχεία στην υπόθεση ότι οι υποψήφιοι πρωτεΐνη που ανακαλύφθηκε στην ΔΕΘ είναι πιθανό να είναι παρόντες στην περιφερική κυκλοφορία.

Υλικά και Μέθοδοι

Επιλογή ασθενών

η έρευνα διεξήχθη στο πλαίσιο του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε το πρωτόκολλο # IRB0406147. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν μετά από επανεξέταση των γραπτή συγκατάθεση και ήταν de-εντοπίστηκαν κατά τη συλλογή και να αναλυθούν ανώνυμα. Intra-operative συλλογή του όγκου, ασκίτης και ορού ήταν από ασθενείς με υποψία καρκίνο των ωοθηκών κατά τη στιγμή της αρχικής τους χειρουργικής και εμφανίστηκε μέσα σε 30 λεπτά από τη χειρουργική αφαίρεση. Όλοι οι ασθενείς ήταν η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία αφελής. επιλέχθηκαν ασθενείς με προχωρημένη EOC (στάδιο IIC ή μεγαλύτερο) και θηλώδες ορώδες υποτύπου καρκίνωμα ωοθηκών παθολογία-αποδεδειγμένη για την επεξεργασία και ανάλυση των δειγμάτων. Ορός που χρησιμοποιείται για την επικύρωση της PRDX1 προήλθε από μια εσωτερική βάση δεδομένων των ασθενών αποχαρακτηριστούν ταξινομούνται ως έχοντες EOC ή καλοήθη παθολογία των ωοθηκών. Κλινικοπαθολογοανατομικών λεπτομέρειες αυτών των ασθενών ήταν περιορισμένες στην ιστορία γυναικολογικό τους.

Επεξεργασία δείγματος

Για την επεξεργασία της ΔΕΘ, περίπου 0,25-0,50 γραμμάριο υγρού βάρους του ιστού που ελήφθη κατά τη χειρουργική επέμβαση αμέσως πλένονται δύο φορές για 5 λεπτά με 5 ml ρυθμισμένου με φωσφορικό άλας αλατούχο ορό (PBS). Οι ιστοί στη συνέχεια επωάστηκαν σε 1 mL PBS για 1 ώρα στους 37 ° C. Μετά την επώαση, ο ιστός αφαιρέθηκε και το υπερκείμενο διαυγάστηκε TIF των κυτταρικών υπολειμμάτων με φυγοκέντρηση στις 1000

χ g

για 2 λεπτά και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. δείγματα ασκίτη ήταν δειγματίζεται σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρου, διευκρινιστεί στα 1000

χ g

για 2 λεπτά και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Η συνολική πρωτεΐνη στα δείγματα TIF και ασκίτη ποσοτικοποιήθηκε με την δικινχονινικού (BCA) δοκιμασία (Pierce, Rockville, IL). Τα δείγματα συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Microcon-3 φυγοκεντρικές συσκευές φίλτρου (Millipore, Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και υποβλήθηκαν σε ανοσοεξάντληση από τα 14 πιο άφθονες πρωτεΐνες του ορού με τη χρήση του πολλαπλών σύστημα αφαίρεσης συγγένεια (Hu-14, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, με την υποκατάσταση του ενός ρυθμιστικού αραίωσης δείγματος 4 × αντί του 1 × ρυθμιστικό διάλυμα για την αποτροπή πιθανών απώλεια δείγματος λόγω της εκτεταμένης συγκέντρωση του TIF και ασκίτη. Τα εξαντλημένο δείγματα TIF και ασκίτη ανταλλάχθηκαν μέσα σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου και πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασία BCA. Αντίστοιχα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωληνάρια συλλογής vacutainer φλεβικής κόκκινο-top (Becton, Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ), επιτρέπεται να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στα 2200

Χ g

για 10 λεπτά για τη συλλογή του ορού και σε κλάσματα και αποθηκεύεται στους -80 ° C.

In-γέλη πρωτοκόλλου Πέψη

Δέκα μικρογραμμάρια καθένα από ασκίτη ή TIF επιλύθηκαν με 1D-PAGE και η γέλη ζώνες έγιναν ορατές με Coomassie μπλε. Πέντε ζώνες γέλης αποκόπηκαν ομοιόμορφα σε όλα τα δείγματα και αποχρωματίζονται σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου, 50% ACN. φέτες Gel μειώθηκαν με 10 mM DTT στους 56 ° C για 1 ώρα που ακολουθείται από αλκυλίωση με 55 ηιΜ ιωδοακεταμιδίου για 45 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο σκοτάδι. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη για όλη τη νύχτα και τα πεπτίδια εκχυλίστηκαν από μπάντες γέλη με 70% ACN /5% μυρμηκικό οξύ. Όλα τα δείγματα λυοφιλοποιήθηκαν μέχρι ξηρού και επαναιωρήθηκε σε 0.1% τριφθοροξεικό οξύ πριν από την ανάλυση με υγρή χρωματογραφία (LC) -tandem φασματομετρία μάζας (MS /MS).

Φασματομετρίας Μάζας και Bioinformatic Αναλύσεις

Η πεπτίδιο αποσπάσματα από κάθε μπάντα τζελ δείγμα αναλύθηκαν εις διπλούν σε ένα Dionex Ultimate 3000 σύστημα υγρής χρωματογραφίας (Dionex, Sunnyvale, CA) σε συνδυασμό online μέσω ηλεκτρονίων ιονισμού σε γραμμική παγίδα ιόντων (LTQ) MS (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Διαχωρισμοί διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 75 μm id × 360 od μm × 20 cm μήκος τριχοειδή διοξειδίου του πυριτίου στήλες (Polymicro Technologies, Phoenix, ΑΖ) πολτός συσκευάζεται σε σπίτι με 5 μm, 300 Α μέγεθος πόρων C-18 σίλικα-πλεγμένα στατική φάση (Jupiter, Phenomenex, Torrance, CA). Μετά την έγχυση του δείγματος επάνω σε μια C-18 προ-στήλη (Dionex), η στήλη πλύθηκε επί 3 λεπτά με κινητή φάση Α (2% ακετονιτρίλιο, 0.1% μυρμηκικό οξύ) με ρυθμό ροής 30 μL /min. Τα πεπτίδια εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση από 0,33% κινητή φάση Β (0.1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο) /λεπτό για 130 λεπτά, μετά σε 95% Β σε επιπλέον 15 λεπτά, όλα σε ένα σταθερό ρυθμό ροής 200 ΝΙ /min. Στήλη πλύση πραγματοποιήθηκε σε 95% Β για 15 λεπτά για όλες τις αναλύσεις, μετά την οποία η στήλη εξισορροπήθηκε ξανά στην κινητή φάση Α πριν από την μετέπειτα ενέσεις. Η MS λειτουργούσε σε λειτουργία MS /MS δεδομένα που εξαρτώνται στην οποία κάθε πλήρη MS σάρωση ακολουθήθηκε από επτά MS /MS σαρώσεις που εκτελούνται στην παγίδα γραμμική ιόντων (LIT), όπου επιλέχθηκαν οι επτά μοριακά ιόντα πιο άφθονο πεπτίδιο για σύγκρουση που προκαλείται διαστάσεως (CID) χρησιμοποιώντας ένα κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης του 35%. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν πάνω από μια ευρεία επιλογή πρόδρομου ιόντος εύρος σάρωσης (

m /z

375 – 1800) και της δυναμικής του αποκλεισμού ήταν σε θέση να ελαχιστοποιηθεί η περιττή επιλογή των πεπτιδίων που είχε επιλεγεί προηγουμένως για CID.

Φάσματα μάζας

Tandem αναζητήθηκαν στη βάση δεδομένων UniProt ανθρώπινη πρωτεΐνη (11/09 απελευθέρωση) από το Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (https://www.ebi.ac.uk/integr8), χρησιμοποιώντας SEQUEST (Bioworks 3.3.1, ThermoFisher Scientific). κριτήρια ορίστηκαν ως εξής: πεπτίδια ερευνήθηκαν πλήρως θρυπτικών με έως και δύο αναπάντητες θέσεις διάσπασης, δυναμικές τροποποιήσεις της οξείδωσης μεθειονίνης (15.9949 Da) και καρβοξυαμιδομεθυλίωση κυστεΐνη (57.0215 Da), πρόδρομος μάζα ανοχή 1.4 Da και ιόντων θραύσμα ανοχή 0,5 Da . Τα πεπτίδια θεωρήθηκαν νόμιμα εντοπιστεί αν πληρούνται συγκεκριμένες κατάσταση φόρτισης και πρωτεολυτική σταυρό βαθμολογίες συσχέτιση διάσπασης που εξαρτώνται από 1,9 για το [Μ + Η]

1+, 2,2 για το [Μ + 2Η]

2+ και 3,5 για το [Μ + 3Η]

3+, και μια ελάχιστη συσχέτιση δέλτα 0,08. Μια ψεύτικη ρυθμό πεπτίδιο ανακάλυψη λιγότερο από το 2% καθορίστηκε με την αναζήτηση των πρωτογενών παράλληλα δεδομένων MS χρησιμοποιώντας τα ίδια κριτήρια σε μια βάση δεδομένων δόλωμα όπου οι πρωτεϊνικές ακολουθίες αντιστραφεί [5]. Τα αποτελέσματα περαιτέρω φιλτράρεται χρησιμοποιώντας το λογισμικό που αναπτύχθηκε στο εσωτερικό, και οι διαφορές στην αφθονία πρωτεΐνης μεταξύ δειγμάτων που προέρχονται από την άθροιση των συνολικών CID γεγονότα που οδήγησαν σε θετικά προσδιορίζονται πεπτίδιο για μια δεδομένη πρωτεΐνη ένταξη σε όλες δείγματα (φασματική καταμέτρηση) [23].

Ανάλυση Western Blot

Δέκα μα ολικής πρωτείνης από κάθε δείγμα αναλύθηκε με 1D-PAGE χρησιμοποιώντας 4-12% Bis-Tris ή 7% τρις-οξικό πηκτώματα NuPAGE (Invitrogen Carlsbad, CA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF Immobilon-PSQ (Millipore) με χρήση της μονάδας Blot Invitrogen Xcell II σύμφωνα πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το πρώτο αντίσωμα ήταν μονοκλωνικό αρουραίου αντι-ανθρώπινο PRDX1 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) και δευτερεύον αντίσωμα ήταν συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου γαϊδάρου αντι-αρουραίου (Abcam Cambridge, ΜΑ), προ-απορροφήθηκε με ορό. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 0.5% σκόνη γάλακτος με TBS με 0,1% Tween-20 (TBST) ως αραιωτικό. Πρωτογενή αντισώματα εφαρμόστηκαν σε 1:1000 σε TBST και μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα (1:75,000 αραίωση) για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν με Pico σήμα υπέρ ECL (ThermoFisher) για 5 λεπτά πριν από την έκθεση χημειοφωταύγειας.

μετρήθηκαν Peroxiredoxin 1 ELISA

Τα επίπεδα αφθονίας του PRDX1 σε ορούς ασθενούς χρησιμοποιώντας ο peroxiredoxin 1 κιτ Human ELISA (BioVendor, Candler, NC) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και καλοήθης παθολογία αραιώθηκαν 1:03 πριν από τη μέτρηση και αναλύθηκαν συγχρόνως και εις διπλούν. Διαδοχικές αραιώσεις του προτύπου PRDX1 προσδιορίστηκαν παράλληλα με τα δείγματα ορού. Η οπτική πυκνότητα σχεδιάστηκε έναντι πρότυπων συγκεντρώσεων PRDX1 για τη δημιουργία της πρότυπης καμπύλης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μια μη παραμετρική δοκιμή Wilcoxon rank-sum χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία της διαφοράς μεταξύ του διάμεσου ποσοτήτων PDRX1 σε ορούς ασθενών με καλοήθεις ωοθηκών παθολογία έναντι των ασθενών με προχωρημένο EOC. Η μηδενική υπόθεση ήταν ότι τα δεδομένα στις δύο ομάδες παρατήρησης είναι ανεξάρτητα δείγματα από πανομοιότυπες συνεχείς κατανομές με ίσες διαμέσους έναντι της εναλλακτικής υπόθεσης, ότι οι ομάδες δεν έχουν ίσες διαμέσους. Η σημαντικότητα έγινε δεκτή σε μια δίπλευρη τιμή p & lt?. 0.05

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Πρωτεΐνες προσδιορίζονται από τέσσερις επιθηλιακά ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών συμφωνημένα ασκίτη και ιστών διάμεσο υγρό (ΔΕΘ). Ο κατάλογος των πρωτεϊνών ταυτοποιήσεις (σειρές) αντιπροσωπεύουν τις αθροίζονται φασματικές μετρήσεις (τιμές) από αναλύσεις του ασκίτη και TIF, καθένα από τα οποία αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα μετουσίωσης από την οποία πέντε ζώνες γέλη ήταν σε γέλη πέψη και αναλύθηκαν εις διπλούν με υγρή χρωματογραφία-tandem φασματομετρία μάζας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0025056.s001

(XLS)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Christopher Vanselow, Μαρία VANDAMME και Agilent Technologies για 4 × ρυθμιστικό Α σκεύασμα που χρησιμοποιείται στο πρωτόκολλο εξάντληση MARS. Οι συγγραφείς θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την πολύτιμη συμβολή τους ανώνυμους κριτές σε όλη την επιστημονική επανεξέταση του παρόντος άρθρου.