Αφηρημένο

Ο ψευδάργυρος πρωτεΐνης δακτύλου 217 (ZNF217) είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση. Ωστόσο, η έκφραση και ακριβείς ρόλους της στον καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ZNF217 έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά παρεκκλίνοντα σε ιστούς CRC και σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση των ασθενών CRC. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ZNF217 ήταν ένα υποθετικό στόχος του microRNA (MIR) -203 χρησιμοποιώντας ανάλυση βιοπληροφορικής και επιβεβαίωσε ότι η χρησιμοποίηση δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή. Επιπλέον, in vitro νοκ ντάουν της ZNF217 ή εκτελεστεί έκφραση του miR-203 πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξασθενεί CRC, την εισβολή και τη μετανάστευση. Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία της ZNF217 siRNA και miR-203 παρουσίασαν συνεργιστική ανασταλτική δράση. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας παρέχουν νέες αποδείξεις ότι ZNF217 έχει ογκογόνο ρόλο στη CRC και ρυθμίζεται από το miR-203, και να ανοίξει τη δυνατότητα ZNF217- και miR-203-στοχευμένη θεραπεία για CRC

Αιτιολογική αναφορά.: Li Ζ, Du L, Dong Ζ, Yang Υ, Ζανγκ Χ, Wang L, et al. (2015) MiR-203 Καταστέλλει ZNF217 Η αναβάθμιση σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ογκογένεσης του. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10.1371 /journal.pone.0116170

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, την Κίνα

Ελήφθη: 25 του Σεπτέμβρη 2014? Αποδεκτές: 3 Δεκεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Ιανουαρίου 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίζεται από τις China National Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα έργων (Grant Νο 81072406, 81271916, 31270971 και 81301506), Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας ( Grant Νο 20120131110055), και το Ίδρυμα επαρχία Shandong Φυσικών Επιστημών (Grant Νο ZR2010HZ004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη και η τρίτη πιο συχνή κακοήθης όγκος σε γυναίκες και άνδρες, αντίστοιχα, σε όλο τον κόσμο, με πάνω από 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και κατ ‘εκτίμηση 608.700 θανάτους μόνο το 2008 [1]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία του CRC, η συνολική πρόγνωση για τους ασθενείς CRC παραμένει φτωχή [2]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για CRC. Για να επιτευχθεί αυτό, μια βαθύτερη κατανόηση των μοριακών και γενετικών δικτύων που ελέγχουν την κίνηση και την εξέλιξη της CRC είναι επιτακτική ανάγκη.

ZNF217 γονίδιο είναι ένα ογκογονίδιο πρόσφατα κλωνοποιηθεί στο 20

ου. Εντοπίζει στο 20q13.2 χρωμόσωμα και κώδικες ένα Kruppel-σαν παράγοντας μεταγραφής ψευδαργύρου οικογένεια πρωτεϊνών δακτύλου [3]. ZNF217 πρωτεΐνη περιέχει 8 προβλεπόμενη Kruppel-όπως C2H2 μοτίβα δακτύλου ψευδαργύρου και ένα πλούσια σε προλίνη περιοχή [4]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τα μέλη της οικογένειας του ψευδαργύρου πρωτεΐνης δακτύλου παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη μιας ποικιλίας καρκίνων [5]. Πολλές έρευνες έχουν αποδείξει ότι ο αριθμός αντιτύπων αύξηση του χρωμοσώματος 20q13.2 σχετίζεται με μετάσταση CRC [6] και ZNF217 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου, όπως μετράται με λέιζερ τμήμα microdis σύλληψη και πολυπλεξίας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR [7].

τα microRNAs (miRNAs) είναι μη-κωδικοποίησης, 18 έως 24 νουκλεοτιδίων μακρύ, μονόκλωνο RNA που έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, μετανάστευση, εισβολή, και αντίδραση στο στρες [8, 9, 10, 11, 12]. Έχει αποδειχθεί ότι η ανώμαλη πρότυπα έκφρασης miRNA υπάρχουν σε πολλά ανθρώπινα καρκινώματα [13] και σχετίζεται με την παθογένεση, εξέλιξη, και φυσική ιστορία αρκετών καρκίνων [11, 14]. Οι αναδυόμενες δεδομένα υποδηλώνουν ότι miRNAs μπορεί να λειτουργούν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων και παίζουν κρίσιμους ρόλους στον καρκίνο ανάπτυξη [15]. Μια μελέτη παρουσιάζει αποδείξεις ότι οι ZNFs ρυθμίζονται σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο στον καρκίνο του μαστού από το miR-181, το οποίο στοχεύει άμεσα τις περιοχές κωδικοποίησης ZNFs [4].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική αλγορίθμων και προσδιορισμού λουσιφεράσης , βρήκαμε ότι ZNF217 είναι ένας στόχος του miR-203, ένα ογκοκατασταλτικό miRNA. Να διερευνήσει τις πιθανές ρόλους των ZNF217 ως νέο προγνωστικό βιοδείκτη για CRC και η ρύθμιση της από miR-203 miRNA σε ιστούς CRC και σε συνδυασμό κανονική του παχέος ιστούς, εκτελέσαμε πειράματα in vitro και επιβεβαίωσε ότι 1) ZNF217 μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και την μετανάστευση κυτταρικές σειρές CRC και 2) ZNF217 καθώς και τα αποτελέσματά της σε κυτταρικές σειρές CRC είναι μειωτικά από miR-203, ελπίζοντας να διευκρινιστεί περαιτέρω ο μηχανισμός της ανάπτυξης CRC και παρέχει νέα ευρήματα για στοχευμένη θεραπεία της CRC.

Υλικά και μέθοδοι

δείγματα ιστών

Ένα σύνολο των 82 ασθενών CRC που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή των όγκων για CRC μεταξύ Ιουλίου 2004 και Μαρτίου 2009 στο Τμήμα Γενικής χειρουργικής, Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong, Τζινάν, Κίνα, είχαν προσληφθεί για τη μελέτη αυτή. δεδομένα όλων των ασθενών ελήφθησαν από κλινικές και παθολογικές καταστάσεις, που περιλαμβάνουν την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, τη διαφοροποίηση, τη θέση, το βάθος εισβολή και μετάσταση, καθώς επίσης και όγκο-κόμβος-μετάσταση (TNM) στάδιο. Η μετεγχειρητική παθολογική σταδιοποίηση του κάθε θέματος προσδιορίστηκε σύμφωνα με την 7η έκδοση της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC) σύστημα όγκου-node-μετάσταση (TNM) στάσης για CRC. Οι εκτομή καρκινικούς ιστούς και αντιστοιχισμένο παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς (τουλάχιστον 5 cm μακριά από το περιθώριο του όγκου) αμέσως συλλέχθηκαν, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Δεν ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong και γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν.

χρώση ανοσοϊστοχημείας και αξιολόγησης για ZNF217

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύουν ZNF217 έκφραση σε ιστούς παραφίνης CRC. Εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς HCC κόπηκαν ως 5 μm τομές ψήνεται στους 65 ° C για 2 ώρες, και απαλλάχθηκαν από την παραφίνη με χρήση τυπικών διαδικασιών. Μετά ανάκτηση αντιγόνου και πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα Tris, ZNF217 πρωτογενές αντίσωμα (Βιοσύνθεση Biotechnology Co, LTD, Πεκίνο Κίνα) εφαρμόστηκε σε διαφάνειες και έκφραση του ZNF217 εξετάστηκε με επώαση με ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing , Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ZNF217 χρώσης αξιολογήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός από δύο ανεξάρτητους ερευνητές οι οποίοι δεν γνώριζαν τα κλινικά αποτελέσματα. Χρώση θεωρήθηκε θετική για ZNF217 όταν ένας ισχυρός συσχετισμός ήταν εμφανής στο κυτταρόπλασμα. Οι ιστοί βαθμολογήθηκαν ημι-ποσοτικά μετρώντας τη θετική κυτταρόπλασμα των 10 ξεχωριστά πεδία στα 400 Χ μεγέθυνση στις περιοχές με την υψηλότερη πυκνότητα των θετικών κυτταρόπλασμα. Η κατάλληλη βαθμολογία αποκοπής λήφθηκε με χρήση της ανάλυσης του λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) καμπύλη χαράσσεται από το ποσοστό βαθμολογίες των όγκων ή δίπλα μη καρκινικό ιστό ως ανεξάρτητες μεταβλητές. Η βαθμολογία που βρίσκεται πλησιέστερα προς δύο μέγιστη ευαισθησία και ειδικότητα, [δηλαδή, το σημείο (0.0,1.0) στην καμπύλη] επιλέχθηκε ως το cut-off βαθμολογία. Δείγματα με βαθμολογία χρώση πάνω ή κάτω από το σκορ αποκοπής είχε χαρακτηριστεί ως θετική ή αρνητική, αντίστοιχα.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

κυτταρικές σειρές CRC (ΗΤ-29, SW480 και SW620) και της ανθρώπινης εμβρυϊκού νεφρού (ΗΕΚ) 293Τ κυτταρική γραμμή αγοράστηκαν από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), και HCT116 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και κυτταρικής Βιολογίας (Κίνα). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ? Υαλώδη, UT) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα που έχει συμπληρωθεί με 5% CO

2.

η επιμόλυνση διεξήχθη με αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση 50 nM miRNA, 100 nM (siRNA) και τις αντίστοιχες αρνητικές τους ελέγχους τους χρησιμοποιήθηκαν για κάθε επιμόλυνση.

Πρόβλεψη των υποψηφίων miRNAs και αναφοράς της λουσιφεράσης δοκιμασία

Οι δύο πιο διαδεδομένες και διαδίκτυο με έδρα βιοπληροφορικής αλγορίθμους (TargetScan και micrornaorg) έχουν χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει τις υποψήφιες miRNAs στοχεύουν στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων του 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA ZNF217. Για να εξακριβωθεί η αποτελεσματικότητά τους, μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα διανύσματα pmiR-REPORTTM (RiboBio, Guangzhou, Κίνα) που περιέχει άγριου τύπου (WT) -ZNF217 3′-UTR αλληλουχία ή μεταλλαγμένο (MUT) – ακολουθία ZNF217 3′-UTR . κύτταρα ΗΕΚ293Τ συνδιαμολύνθηκαν παροδικά με miR-203 μιμείται /miR-αρνητικό έλεγχο και WT-ZNF217 φορέα 3′-UTR /MUT ZNF217 3′-UTR. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την Dual-Luciferase κιτ δοκιμασίας (Promega, Madison, WI) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και κηλίδος Western

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα χειρισμούς του RNA διεξήχθησαν υπό συνθήκες RNase-free. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας BioPhotometer συν (Eppendorf, Hamburg, Germany) στα 260 nm, και το απομονωμένο RNA φυλάχθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Για την ανάλυση της έκφρασης ZNF217 mRNA. Ένα σύνολο 1 μg RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το SuperScript kit (Toyobo, Osaka, Japan) και qRT-PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan) και ένα ΑΒΙ PRISM 7500 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems , Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. επίπεδο ZNF217 mRNA κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνη και οι φορές αλλαγές στην έκφραση του mRNA ZNF217 προσδιορίσθηκαν ποσοτικά με τη χρήση του

-ΔΔCT σχετική μέθοδος 2 ποσοτικοποίηση. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για RT-qPCR του ZNF217 ήταν προς τα εμπρός, 5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 ‘και Reverse, 5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3’. Όλες οι παραπάνω εκκινητές ήταν από BioSune, Shanghai, Κίνα.

Για την έκφραση miR-203, το cDNA συνετέθη χρησιμοποιώντας γονίδιο-ειδικούς εκκινητές (Ribobio, Guangzhou, Κίνα) και το κιτ M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σε μια 20-μΙ αντίδραση. Τα αντιδραστήρια της αντίδρασης RT περιείχε 1 μg εκμαγείο RNA, 1 μΙ 10 mM dNTP mix, 2 μΐ 0.1 Μ DTT, 4 μΐ 5 χ πρώτου κλώνου ρυθμιστικό, και 1 μL 40 αναστολέα U /μl RNase. Ο όγκος ρυθμίστηκε με RNA χωρίς H2O. Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής διεξήχθη εις τριπλούν για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε ακραίες τιμές. MiR-203 έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR και μία ΑΒΙ PRISM 7500 Sequence Detection System πτυχής αλλαγές στην έκφραση miRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCT μέθοδος? η έκφραση κανονικοποιήθηκε στο μικρό επίπεδο έκφρασης πυρηνικού RNA U6. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για RT-qPCR του miR-203 ήταν miR-203 προς τα εμπρός 5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 ‘, U6 εμπρός 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ και η καθολική αντίστροφο εκκινητή 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ‘.

Σύνολο πρωτεΐνες που προέρχονται από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ που περιέχει PMSF και ποσοτικά χρησιμοποιώντας BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών (Beyotime, Haimen, Κίνα). Ένα σύνολο 30 μg πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό, η μεμβράνη επωάστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ZNF217 (Abcam, Southampton, UK) ή μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένο με HRP δευτερογενούς αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Σήματα προσδιορίστηκαν με ένα κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με ένα μεθυλ-thiazolyltetrazolium (ΜΤΤ). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10 πλάκες

3 /φρεάτιο σε 96 φρεατίων. Μετά από καλλιέργεια για 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μι ΜΤΤ (5 mg /mL) για 4 ώρες στους 37 ° C. Οι σχηματισθέντες κρύσταλλοι στα κύτταρα εξαχνώνονται με επώαση με 150 μλ διμεθυλοσουλφοξείδιο για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ποσοτικοποιείται με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 490 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (Tecan, Ελβετία).

κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασία

Οι επεμβατικές και μεταναστευτικά δυναμικά των κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Transwell ένθετα με πόρους 8 μm (Corning). Για την ανίχνευση εισβολής, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, 3.0 × 10

5 κύτταρα σε μέσο άνευ ορού προστέθηκαν στο άνω ένθετο προ-επικαλυμμένα με μήτρα matrigel. 500 μL 10% μέσου FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από επώαση για 48 ώρες, μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης transwell με μια μπατονέτα, και τα εισέβαλαν κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες, φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν . δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας παρόμοιες διαδικασίες εκτός από το ότι 2 × 10

5 κυττάρων προστέθηκαν σε μη επικαλυμμένα ενθέματα. Κύτταρα σε έξι τυχαία πεδία στα 200 Χ μεγέθυνση για κάθε ένθετο μετρήθηκαν. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Στατιστικές αναλύσεις

t test του Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι διαφορές στην έκφραση ZNF217 μεταξύ του όγκου και φυσιολογικών ιστών. Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης ZNF217 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά αναλύθηκαν από ένα μη παραμετρικό τεστ: Mann-Whitney U test ανάμεσα σε δυο ομάδες και τεστ Kruskal-Wallis για τρεις ή περισσότερες ομάδες. Το χ2 και ακριβές τεστ του Fisher διεξήχθησαν για τον προσδιορισμό των συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης ZNF217 και κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Συνολικά καμπύλη επιβίωσης υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και οι διαφορές επιβίωση των υποομάδων ασθενών συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Cox πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης διεξήχθη για να εκτιμηθούν οι ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την πρόβλεψη της επιβίωσης. Η συσχέτιση μεταξύ ZNF217 και miR-203 προσδιορίστηκε από την ανάλυση συσχέτισης του Pearson. Στατιστικές αναλύσεις και γραφικά διεξήχθησαν με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0, Microsoft Excel και το λογισμικό GraphPad Prism. P & lt? 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική διαφορά.

Αποτελέσματα

ZNF217 έκφραση συσχετίζεται με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά της CRC

IHC ανάλυση 82 περιπτώσεων του CRC και τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς τους έδειξαν ότι η θετική χρώση για ZNF217 παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων CRC και αντίστοιχα μη καρκινικά κύτταρα του βλεννογόνου (Σχ. 1Α). Τα μέσα ποσοστά των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά για ZNF217 σε καρκινικά και τα αντίστοιχα μη-καρκινικές βλεννογόνο ήταν 76,3% και 38,9%, αντίστοιχα. Συγκρίνοντας το ποσοστό των θετικών κυττάρων, προσδιορίστηκε ότι ZNF217 έκφραση σε ορθοκολικό καρκίνωμα ήταν στατιστικά υψηλότερη από εκείνη στην παρακείμενη μη καρκινική βλεννογόνου (Ρ & lt? 0,001? Εικ. 1Β).

(Α-αριστερά ) χρώση κυτταρόπλασμα των ZNF217 σε κύτταρα CRC. (Α-δεξιά) Έλλειψη έκφραση ZNF217 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του κόλου. (Β) Το ποσοστό των θετικά χρωσμένων κυττάρων σε καρκινικά και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (* Ρ & lt? 0,05, ** & lt? 0,01). ανάλυση (C) κατά Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με CRC σύμφωνα με ZNF217 επίπεδο έκφρασης. Η ZNF217 θετική ομάδα (n = 55) έδειξε σημαντικά μικρότερη επιβίωση συγκριτικά με την αρνητική ομάδα (n = 27? P = 0.0405: δοκιμασία log-rank).

Η

ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε ότι ZNF217 έκφραση ήταν θετικά συσχετίζεται με το μέγεθος του όγκου, το βάθος της εισβολής, και λεμφαδένα, (Ρ & lt? 0,05), αλλά όχι με την ηλικία του ασθενούς, το φύλο, το βαθμό ιστολογίας, και απομακρυσμένες μεταστάσεις (Ρ & gt? 0,05? Πίνακας 1). Επιπλέον, τεστ Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με θετική χρώση ZNF217 είχαν μικρότερη επιβίωση από αυτούς με αρνητική χρώση ZNF217 (P = 0,028? Εικ. 1Γ).

Η

Μείωση των ZNF217 έκφρασης καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, μετανάστευση και την εισβολή

Για να μετρηθούν οι βιολογικές ιδιότητες των ZNF217 στα κύτταρα CRC, ελέγξαμε τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των κυττάρων CRC υπό την προϋπόθεση της siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν της ZNF217 γονιδίου. Πρώτον, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης του ZNF217 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC, συμπεριλαμβανομένων HCT-116, ΗΤ-29, SW620 και SW480. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ZNF217 επίπεδο έκφρασης ήταν η υψηλότερη σε SW480 κύτταρα και η χαμηλότερη στα κύτταρα ΗΤ29 μεταξύ όλων δοκιμάστηκαν κυτταρικές γραμμές (Σχ. 2Α). Με βάση αυτό το πρότυπο έκφρασης, εμείς, ως εκ τούτου chosed SW480 για περαιτέρω μελέτες. Εμείς παροδικά ρυθμισμένης έκφρασης ZNF217 με επιμόλυνση siRNA σε κύτταρα SW480 και διαπίστωσε ότι siRNA μεσολάβηση ZNF217 αποσιώπηση μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 2Β) και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ικανότητες (Σχ. 2C). Στο σύνολό τους, οι παρατηρήσεις μας έδειξαν ότι θα μπορούσε να προωθήσει ZNF217 πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC

(Β) Μείωση του ZNF217 έκφρασης με επιμόλυνση siRNA-ZNF217 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό (* Ρ & lt? 0,05). Και (C ) τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SW480 (200 × μεγέθυνση, * P & lt? 0,05) σε σύγκριση με τη γονική και αρνητικούς μάρτυρες

η

ZNF217 άμεσα στόχαστρο miR-203

Χρήση. απευθείας miRNA βάσεις δεδομένων πρόβλεψη στόχου (microrna.org και Targetscan), διαπιστώσαμε ότι ZNF217 ήταν ένας πιθανός στόχος του miR-203 (Σχ. 3Α). Για να επαληθεύσετε αυτό το εύρημα, κατασκευάσαμε δημοσιογράφους λουσιφεράσης της WT και Mut 3′-UTR της ZNF217 και εκτελείται δοκιμασία δραστηριότητας λουσιφεράσης στα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επιμόλυνση του miR-203 μιμείται ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του WT αλλά όχι Mut 3′-UTR του ZNF217 σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Σχ. 3Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, η επιμόλυνση του miR-203 μιμείται μείωσε την ενδογενή έκφραση του ZNF217 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα SW480 (Εικ. 3C και 3D). Επιπλέον, στην αναλύθηκε πάνελ 30 ασθενείς CRC, παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ZNF217 και miR-203 έκφραση σε ιστούς CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους (Σχ 4Ε, r = 0,792, Ρ & lt?. 0,01? Σχ. 3Ε). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι το miR-203 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση ZNF217 μέσω απευθείας στόχευση ακολουθία του 3′-UTR.

(Α) Οι υποθετικές miR-203 ακολουθίες δεσμευτικός ως προς όλα ZNF217 3′-UTR. δοκιμασία (Β) δραστηριότητα λουσιφεράσης εκτελέστηκε για τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ συνεπιμολύνθηκαν με φορείς pmiR-REPORTTM περιέχουν WT-ZNF217 3′-UTR ή MUT-ZNF217 3′-UTR αλληλουχίες και miR-203 μιμείται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως κανονικοποιημένη μεταβολή φορές σε δραστικότητα λουσιφεράσης. (C, D) ZNF217 mRNA και πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν σε κύτταρα SW480 επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται ή miR-αρνητικό έλεγχο με qRT-PCR και στυπώματος Western, αντιστοίχως. (Ε) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ZNF217 mRNA και miR-203 επίπεδα σε ιστούς CRC αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης του Pearson.

Η

(Α) έκτοπη έκφραση του miR-203 με επιμόλυνση miR-203 μιμείται μειωθεί σημαντικά πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480, σε σύγκριση με τη γονική και αρνητικούς μάρτυρες (* Ρ & lt? 0,05). (Γ) Η έκτοπη έκφραση του miR-203 κυρίως ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου και διείσδυση των κυττάρων SW480 (200 × μεγέθυνση, * Ρ & lt? 0,05). Αντιστρόφως, η αναστολή της έκφρασης miR-203 με επιμόλυνση αναστολείς miR-203 συγχρόνως (Β) προωθείται πολλαπλασιασμό (* Ρ & lt? 0,05) και (Δ) μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων SW480, σε σύγκριση με τη γονική και αρνητικούς μάρτυρες (200 × μεγέθυνση, * P & lt? 0,05). Το σχήμα είναι ένα αντιπροσωπευτικό από 3 πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Επίδραση του miR-203 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, τη μετανάστευση και την εισβολή

Για να επικυρώσετε το αν miR-203 θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC , πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε κύτταρα SW480 επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται ή αρνητικό μάρτυρα του, και βρήκε ότι η αυξημένη έκφραση του miR-203 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό (Εικ. 4Α), την κινητικότητα (Εικ. 4Β), όπως επίσης και εισβολή των SW480 κυττάρων. Αντιστρόφως, ρύθμιση προς τα κάτω του miR-203 σε κύτταρα SW480 αναστολείς επιμολυσμένα προφανώς προωθείται πολλαπλασιασμό, κινητικότητα και διείσδυση των κυττάρων SW480 (Εικ. 4C).

Η υπερέκφραση του miR-203 ενισχύει μερικώς ZNF217-επαγόμενο πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή της CRC κυττάρων

Για να διερευνήσουν περαιτέρω ZNF217 μεσολάβηση-ογκογόνο επιδράσεις ρυθμίζονται από miR-203, που συν-επιμολυσμένα SW480 κύτταρα με ZNF217 siRNA σε συνδυασμό με miR-203 μιμείται. Παρατηρήσαμε συνεργιστικές ανασταλτικές επιδράσεις στην ZNF217 έκφρασης (Εικ. 5Α), καθώς και τον πολλαπλασιασμό, (Εικ. 5Β), τη μετανάστευση και εισβολή (Εικ. 5C) κυττάρων SW480 συν-επιμολύνθηκαν με ZNF217 siRNA και miR-203 μιμείται σε σύγκριση με SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε ZNF217 siRNA ή miR-203 μιμείται μόνο. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι λειτουργίες του ZNF217 ως ένα ισχυρό ογκογονίδιο ρυθμίζονται από miR-203.

(Α) Η αποτελεσματική καταστολή της ZNF217 έκφραση της πρωτεΐνης από ZNF217 siRNA και miR-203 μιμείται αντίστοιχα και συνδυαστικά. Σημειώστε ότι η έκφραση ZNF217 είναι πιο αποτελεσματικά καταστέλλεται από συνδυασμένη θεραπεία. Καταστολή της ZNF217 ταυτόχρονα κατέληξε σε (Β) σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και (Γ) τη μετανάστευση και εισβολή (200 × μεγέθυνση) του SW480 κυττάρων σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες. Σημειώστε τη συνεργιστική ανασταλτική επίδραση του συνδυασμού ZNF217 siRNA και miR-203 μιμείται, σε σχέση με οποιοδήποτε από αυτά μόνο (* P & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

ZNF217 είναι ένα πρόσφατα. ταυτοποιημένο μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου. Είναι κυρίως λειτουργεί ως μεταγραφικός ρυθμιστικού παράγοντα που περιλαμβάνει στη ρύθμιση της εμφάνισης του όγκου και την ανάπτυξη [16]. ZNF217 διαθέτει αρκετά διαφορετικές δομικές περιοχές των οποίων οκτώ C2H2 μοτίβα δακτύλου ψευδαργύρου δέσμευσης DNA, καθώς και έναν τομέα πλούσιο σε προλίνη (16-20%) που βρίσκεται στα υπολείμματα 757-1,005. Οι Prolinerich domains δειχθεί ότι λειτουργεί ως μεταγραφικοί ενεργοποιητές σε πολλά γονίδια όπως CTF /NF-1 [3]. ZNF217 γονίδιο έχει μελετηθεί εκτεταμένα στον καρκίνο του μαστού [4, 17], τον καρκίνο των ωοθηκών [18, 19, 20], καρκίνωμα του οισοφάγου πλακωδών κυττάρων [21], γαστρικό καρκίνο [22, 23, 24] και του καρκίνου του προστάτη [25, 26] , αλλά όχι σε CRC. Επιπλέον, αυξημένο αριθμό αντιγράφων του χρωμοσώματος 20q13.2 έχει βρεθεί ότι συνδέεται με τη μετάσταση του CRC. Έτσι, είναι ιδιαίτερα αξίζει τον κόπο να διερευνήσει τις δυνατότητες τους ρόλους της στην ανάπτυξη CRC.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ZNF217 έκφραση τόσο σε επίπεδο mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερη σε παχέος ιστούς όγκων σε σχέση με συμφωνημένα μη της ιστούς όγκων και υπερέκφραση του συνδέθηκε με κακοήθη κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και μικρή επιβίωση των ασθενών με CRC, υποδεικνύοντας ότι ZNF217 λειτουργεί ως ογκογονίδιο το CRC.

οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο πέθανε από επιπλοκές που προκύπτουν από μετάσταση. Ως εκ τούτου, η στόχευση μεταστατικές ασθένειες είναι ένα κεντρικό στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου. Πολλές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου που παίζουν κρίσιμους ρόλους στις διεργασίες της εισβολής των όγκων και της μετάστασης, συμπεριλαμβανομένων ZNF217 μπορεί να ρυθμίζεται από μία ποικιλία γονιδίων [27, 28]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι knockdown του ZNF217 με siRNA οδήγησε σε μειωμένη πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων in vitro CRC. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν τα ογκογόνο χαρακτηριστικά των ZNF217 στο CRC. Πράγματι, έχει αναφερθεί ότι καρκινικά κύτταρα HO-8910, LNCaP, και DU145 [26], καθώς και οι ιστοί του καρκίνου του μαστού [4] εποικοδομητικά εκφράζουν υψηλό επίπεδο ZNF217. Krig et al ανέφεραν ότι mis-ρύθμιση της Ε-καδερίνης και ως μη χαρακτηρισμένα γονίδια στόχους ZNF217 [29] θα μπορούσε να εξηγήσει τις μεταβολές στην κυτταρική αθανατοποίηση, αντίσταση απόπτωσης, αντίσταση στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, και η φωσφορυλίωση της Akt σε κύτταρα με υψηλό επίπεδο έκφρασης του ZNF217 . Παρά το γεγονός ότι εκατοντάδες γονίδια είναι πιθανοί στόχοι της ZNF217 και θέσεις πρόσδεσης συναίνεση έχουν προταθεί, τα ειδικά γονίδια που ρυθμίζουν ZNF217 έκφραση είναι ελάχιστα γνωστή.

Συσσωρευμένα αποδείξεις δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs συνδέεται με την ανάπτυξη του CRC [ ,,,0],30, 31, 32]. Εξελιγμένες προσεγγίσεις που βασίζονται σε υπολογιστή για την ταυτοποίηση των miRNAs και την πρόβλεψη-στόχο, καθώς και τεχνικές επικύρωσης για να επιβεβαιώσει αυτές τις προβλέψεις συνέβαλαν τα μέγιστα στην ανακάλυψη νέων miRNAs και λειτουργικό χαρακτηρισμό τους. Κατά συνέπεια, μικρό μόριο που προκαλείται απορύθμιση της miRNA αναδύεται ως μια πιθανή νέα θεραπευτική προσέγγιση για ασθένειες του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου [33]. Μεταξύ των ανθρωπίνων miRNAs σχετίζονται με τον καρκίνο, miR-203 έχει προσελκύσει σημαντική προσοχή, διότι εκφράζεται έκτροπα σε μια ποικιλία καρκίνων. Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε γι ‘αυτό το miR-203 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο CRC και την αποκατάσταση της έκφρασης miR-203 θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων SW480. Αντιθέτως, η επιμόλυνση του αναστολέα miR-203 διεγερμένου πολλαπλασιασμού, εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων SW480. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το miR-203 εμπλέκεται στις διαδικασίες μετάσταση του CRC και είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι το miR-203 εκφράστηκαν σε χαμηλότερο από το κανονικό επίπεδο σε ορισμένους καρκίνους [34, 35, 36, 37]. Ωστόσο, miR-203 έχουν αναφερθεί να εξασκούν μία ογκογονίδιο λειτουργία στο νεφρό και την ουροδόχο κύστη καρκίνους [38] και του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα [39]. Οι διαφορές στην miR-203 λειτουργεί σε διάφορους τύπους καρκίνου μπορεί να αντικατοπτρίζει τις διαφορές των κυτταρικών πλαίσιο ή εναλλακτικά στοχευμένες γονίδια.

Η παρούσα μελέτη παρέχει αρκετές γραμμές ενδείξεις ότι ZNF217 είναι ένας νέος στόχος του miR-203 και τους ανταγωνιστική αλληλεπίδραση παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του CRC. Πρώτον, η δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξαν ότι λουσιφεράσης δραστηριότητα υπό τον έλεγχο του ZNF217 3’UTR μπορούσε να ρυθμίζεται από miR-203. Δεύτερον, μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ZNF217 και των επιπέδων του miR-203 παρατηρήθηκε σε ιστούς CRC. Τρίτον, η υπερέκφραση του miR-203 κατέστειλε ZNF217 επίπεδα και οδήγησαν σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή σε κυτταρικές σειρές CRC.

Εν περιλήψει, σε αυτή τη μελέτη δείξαμε ότι ZNF217 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε CRC και μια πιθανή ογκογονίδιο για την ανάπτυξη CRC. Εν τω μεταξύ, η έρευνα μας περιγράφεται ZNF217 /miR-203 σύνδεση και παρείχε ένα πιθανό μηχανισμό για ZNF217 απορρύθμισης και συμβολή στην εισβολή των κυττάρων CRC. Τα ευρήματα αυτά ανοίγουν τη δυνατότητα εφαρμογής miR-203 προς την κλινική CRC θεραπείες.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Shao-Feng Yan (Τμήμα Νευροχειρουργικής, Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong, Τζινάν , Κίνα) για την παροχή της siRNA-ZNF217 Οι συγγραφείς επιθυμούν επίσης να ευχαριστήσω Chao Wang για την τεχνική καθοδήγηση της από Shandong Επαρχιακό Νοσοκομείο.