Αφηρημένο

Anti-mesothelin

Pseudomonas

εξωτοξίνη Α-που βασίζεται ανασυνδυασμένου ανοσοτοξίνες (Rits) παρουσιάζουν ένα δυναμικό τροπικότητα θεραπεία για παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC). Για τη μελέτη των μηχανισμών αντοχής, η ευαίσθητη κυτταρική γραμμή PDAC KLM-1 ήταν κατά διαστήματα εκτεθεί σε αντι-mesothelin SS1-LR-σε πρωτογενή ενέργεια RIT. Επιβιώσαντα κύτταρα ανθεκτικά σε διάφορες αντι-mesothelin RITS (IC

50s & gt? 1 μg /ml), συμπεριλαμβανομένου του νέου de-ανοσοποιημένα RG7787. Αυτά τα ανθεκτικά κύτταρα KLM-1-R ήταν εξίσου ευαίσθητα στην αντι-CD71 ΗΒ21 (Fv) -ΡΕ40 RIT ως KLM-1, που δείχνει την αντίσταση ήταν ειδικά για αντι-mesothelin Rits. γονιδιακή έκφραση Mesothelin μερικώς κάτω-ρυθμίζονται σε KLM-1-R, με αποτέλεσμα 5 φορές χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης επιφάνεια και μειωμένη κυτταρική πρόσληψη RG7787 σύγκριση με KLM-1. ανάλυση Bisulfite αλληλούχισης βρέθηκε ότι η περιοχή του υποκινητή mesothelin ήταν σημαντικά πιο μεθυλιωμένα σε KLM-1-R (59 ± 3,6%) σε σύγκριση με KLM-1 (41 ± 4,8%), υποδεικνύοντας υπερμεθυλίωση ως μηχανισμός mesothelin αρνητική ρύθμιση. Ο αναστολέας μεθυλοτρανσφεράσης DNA 5-αζακυτιδίνη αποκατασταθεί αρχική επιφανειακή έκφραση mesothelin σε περισσότερο από το ήμισυ σε KLM-1-R και αυξημένη ευαισθησία σε RG7787 (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml), αν και τα κύτταρα παρέμειναν σημαντικά λιγότερο ευαίσθητα σε σύγκριση με γονικών κυττάρων KLM-1 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). εισαγωγή mesothelin cDNA σε KLM-1-R οδήγησε σε 5 φορές υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης επιφάνεια και σημαντικά υψηλότερη πρόσληψη RG7887 σε σύγκριση με KLM-1. Ως αποτέλεσμα, το αρχικό ευαισθησία σε RG7787 αποκαταστάθηκε πλήρως (IC

50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). Ένα σημαντικά υψηλότερο πρόσληψη RG7787 ως εκ τούτου απαιτείται για την επίτευξη του αρχικού κυτταροτοξικότητα σε ανθεκτικά κύτταρα, υπονοώντας ότι η εμπορία ενδοκυτταρική RIT είναι επίσης ένας περιοριστικός παράγοντας. RNA βαθιά ανάλυση της αλληλουχίας των κυττάρων KLM-1 και KLM-1-R υποστηρίζονται πειραματικά ευρήματα μας? σε σύγκριση με KLM-1, ανθεκτικά κύτταρα εμφανίζονται διαφορική έκφραση των γονιδίων που συνδέονται με την ενδοκυτταρική μεταφορά και ένα πρότυπο έκφρασης που ταιριάζει μια πιο γενική κατάσταση υπερμεθυλίωση. Εν κατακλείδι, η αντίσταση σε αντι-mesothelin Rits στην KLM-1 συνδέεται με μεθυλίωση που σχετίζονται κάτω ρύθμιση των mesothelin, ενώ εκτροπές στη διακίνηση RIT θα μπορούσε επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο

Παράθεση:. Hollevoet K, Mason- Osann E, F Müller, Pastan I (2015) Η μεθυλίωση-Associated Μερική κάτω ρύθμιση των Mesothelin Προκαλεί Αντοχή σε αντι-Mesothelin ανοσοτοξίνες σε μια γραμμή κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10.1371 /journal.pone.0122462

Ελήφθη: 23 Δεκέμβρη 2014? Αποδεκτές: 17, Φεβρουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 24, Μάρ του 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό Ερευνητικό Πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, καθώς και από μια συμφωνία συνεργασίας στην έρευνα και ανάπτυξη (# 2791) μεταξύ του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο και τη Roche Pharmaceuticals. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Κ.Η. υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ταμείο Επιστημονικής Έρευνας Φλάνδρα (FWO, Βέλγιο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η έρευνα αυτή υποστηρίχθηκε εν μέρει από τη Roche Pharmaceuticals. Ι.Ρ. είναι ένας εφευρέτης σε διάφορα διπλώματα ευρεσιτεχνίας για ανοσοτοξίνες που όλα έχουν εκχωρηθεί σε ΝΙΗ (συμπεριλαμβανομένων των ΗΠΑ 8,357,783 «Ανθρώπινο αντι-mesothelin μονοκλωνικά αντισώματα», US 20120263674 «Pseudomonas εξωτοξίνη Α με μειωμένη ανοσογονικότητα» και US 20140094417 «Pseudomonas εξωτοξίνη Α με λιγότερο ανοσογόνα Τ κύτταρο και /ή Β επιτόπων κυττάρων «). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το εργαστήριο μας αναπτύσσει ανασυνδυασμένου ανοσοτοξίνες (Rits) για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι τρέχουσες Rits σε κλινικές δοκιμές αποτελείται από ένα Fv δέσμευσης αντιγόνου συγχωνευμένο με ένα τμήμα 38-kDa του

Pseudomonas

εξωτοξίνη Α (ΡΕ) [1]. Μετά ενδοκύτωσης με υποδοχέα, Rits πρωτεολυτικά επεξεργασία, και ΡΕ προτείνεται στην κυκλοφορία στο δίκτυο trans-Golgi και κίνηση με ανάδρομη πορεία προς ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου υφίσταται μετατόπιση στο κυτταρόπλασμα [2]. Κατά την άφιξη στο κυτταροδιάλυμα, ΡΕ στοχεύει παράγοντα επιμήκυνσης-2 (EF-2). Ώριμη EF-2 παράγεται από μετα-μεταφραστική τροποποίηση της ιστιδίνης 715 από τις πρωτεΐνες Diphthamide Βιοσύνθεση (DPH) 1-5 και 7 [3, 4]. Αυτή η τροποποιημένη ιστιδίνη ( «diphthamide ‘) είναι ADP-ριβοσυλιωμένων από ΡΕ, που αδρανοποιεί EF-2 και σταματά την πρωτεϊνική σύνθεση, που τελικά οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [2].

προηγουμένως απομονωθεί και χαρακτηριστεί διάφοροι λευχαιμικών κυτταρικών σειρών ανθεκτικό σε

Moxetumomab pasudotox

[5-7], ένα αντι-CD22 RIT σήμερα ΙΙΙ κλινική δοκιμή φάσης (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01829711). Αυτές οι ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές δείχνουν διάφορες εκτροπές στην έκφραση DPH, οι οποίες εμποδίζουν EF-2 ΑϋΡ-ριβοζυλίωσης και προστατεύουν τα κύτταρα από την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), ένα άλλο RIT σε κλινικές δοκιμές, στοχεύει mesothelin, ένα 40-kDa κυτταρική επιφάνεια γλυκοφωσφατιδυλινοσι- (GPI) πρωτεΐνη -anchored [8] που εκφράζεται υψηλά σε αρκετές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου μεσοθηλιώματος και πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος ( PDAC) [9-11]. SS1P έχει περιορισμένη κλινική δράση ως μονός παράγοντας, κυρίως λόγω της δοσοπεριοριστική ανοσογονικότητα ΡΕ σε ασθενείς [12, 13]. Σε απάντηση, SS1P έχει συνδυαστεί με ανοσο-καταστρέφουν χημειοθεραπευτικά, με αποτέλεσμα την πρωτοφανή αποκρίσεις σε ασθενείς με ανθεκτική προχωρημένο μεσοθηλίωμα [14], και χαμηλή ανοσογόνο Rits έχουν κατασκευαστεί στην οποία πολλά Β- ή Τ-κυττάρων επίτοπους και πρωτεάση ευαίσθητες περιοχές της ΡΕ38 αφαιρούνται. Ο τελευταίος είχε ως αποτέλεσμα μια κολοβωμένη και απο-ανοσοποιημένα μονάδα της τοξίνης 24 kDa (PE24), που έχει μικρότερη αντιδραστικότητα με ανθρώπινο αντι-ορούς, είναι ανθεκτική σε αποικοδόμηση λυσοσωματική, και εμφανίζει μία μειωμένη μη ειδική τοξικότητα σε μοντέλα τρωκτικών

in vivo

[15-18]. Σε συνεργασία με τη Roche Κέντρο Καινοτομίας Penzberg, Γερμανία, αυτή η ραχοκοκαλιά PE24 έχει ενσωματωθεί σε ένα νέο αντι-mesothelin RIT, που ονομάζεται RG7787, συνδέοντάς την με ένα εξανθρωπισμένο αντι-mesothelin Fab, αυξάνοντας έτσι το μέγεθος και το κυκλοφοριακό χρόνο ημίσειας ζωής [19].

Εμείς πρόσφατα έδειξε ότι RG7787 έχει σημαντική δραστηριότητα σε ένα PDAC μοντέλο ξενομοσχεύματος, η οποία ιδρύθηκε με εμβολιασμό κυττάρων KLM-1 σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια. RG7787 ήταν επίσης κυτταροτοξική έναντι αρκετών άλλων κυτταρικών σειρών PDAC, αν και

in vitro

κυττάρων δεν ήταν απόλυτη [19]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι μια ανισορροπία μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των PDAC, από τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από ΡΕ-[20-22]. Να αποκτήσουν γνώσεις σε άλλους μηχανισμούς αντοχής, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να απομονώσουν και να χαρακτηρίσουν τα κύτταρα από την KLM-1 που ήταν ανθεκτικά σε αντι-mesothelin Rits.

Υλικό και Μέθοδοι

Η ανασυνδυασμένη ανοσοτοξίνες και αντιδραστήρια

Κλινική ποιότητας αντι-mesothelin SS1P και αντι-CD25 LMB-2 [αντι-Tac (Fv) -PE38] είχαν κατασκευαστεί και παρέχονται από την Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) παρασχέθηκαν από την Roche Κέντρο Καινοτομίας Penzberg, Γερμανία, βάσει συμφωνίας συνεργασίας Έρευνας και Ανάπτυξης (# 2791). Anti-mesothelin SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-σε πρωτογενή ενέργεια) και η ανοσοτοξίνη αντι-CD71 ΗΒ21 (Fv) -ΡΕ40 παρήχθησαν στο εργαστήριο μας, σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο [23]. Τόσο SS1-LR-GGS και RG7787 επανα-μηχανικής χαμηλή ανοσογόνο εκδόσεις του SS1P που αποτελούνται από ένα θραύσμα PE24. Συγκεκριμένες τροποποιήσεις περιλαμβάνουν απομάκρυνση τον κύριο όγκο της περιοχής ΡΕ II, αφήνοντας μια θέση διάσπασης φουρίνης, και προσθέτοντας Gly-Gly-Ser (GGS) -με βάση συνδετικό πεπτίδιο μετά την φουρίνης θέση διάσπασης. RG7787 βελτιστοποιείται περαιτέρω για κλινική χρήση με αντικατάσταση του ποντικού αντι-mesothelin Fv (SS1) με ένα ανθρωποποιημένο Fab (huSS1), για να αυξηθεί το μέγεθος και ως εκ τούτου της κυκλοφοριακής ημιζωής, και με την εισαγωγή επτά μεταλλάξεις (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, R538A και) στην καταλυτική περιοχή III του ΡΕ να σιγήσει επιτόπων Β-κυττάρων [19]. 5-αζακυτιδίνη (ΑΖΑ) (Sigma) είναι ένας αναστολέας μεθυλοτρανσφεράσης DNA, και διαλύθηκε σε RPMI-1640.

Κυτταροκαλλιέργεια

PDAC κυτταρική γραμμή KLM-1 [24] διατηρήθηκε σε RPMI-1640 και με την προϋπόθεση το 2011 από τον Δρ Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), που λαμβάνεται αρχικά την κυτταρική γραμμή από την Τράπεζα κυττάρων RIKEN. Επιδερμικού κυτταρική σειρά καρκίνου του Α431 διατηρήθηκε σε DMEM και δώρισε το 1982 από τον Δρ Γιώργο Todaro (NCI, Bethesda, MD), ο οποίος απομονώθηκε αρχικά την κυτταρική γραμμή [25]. Μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Για την απομόνωση ανθεκτικών κυττάρων, 3 χ 10

5 KLM-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων και επωάστηκαν με 1 μg /ml SS1-LR-πρωτογενή ενέργεια για 72 ώρες, στις οποίες σκοτώθηκαν πάνω από το 90% των κυττάρων (S1 Σύκο.). Υπολειμματική κύτταρα επεκτάθηκαν για 5 εβδομάδες σε RIT μέσο άνευ κυττάρου, μετά την οποία ένας δεύτερος γύρος επιλογής πραγματοποιήθηκε όμοια με 1 μg /ml SS1-LR-GGS, με αποτέλεσμα KLM-1-R. Αυτά τα κύτταρα επεκτάθηκαν σε RIT-ελεύθερο μέσο και αποθηκεύονται βιώσιμη κατεψυγμένα σε Ν

2 για περαιτέρω μελέτες. ταυτότητες γραμμή κυττάρων επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας σύντομο διαδοχική επανάληψη ανάλυση (NCI, Frederick, MD). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, κυτταρικό θάνατο και την πρωτεϊνική σύνθεση δοκιμασίες αναστολής

KLM-1 και KLM-1 -R ανάπτυξη των κυττάρων συγκρίθηκε με μέτρηση βιώσιμων κυττάρων με Cellometer Vision (Nexcelom). Τα νεκρά κύτταρα εξαιρέθηκαν με χρήση μπλε χρώση Trypan, και κάθε χρονικό σημείο μετρήθηκε εις τριπλούν. Για την αξιολόγηση της επίδρασης της θεραπείας, Rits προστέθηκαν περίπου 16 ώρες μετά την σπορά των κυττάρων σε μια πλάκα 6- ή 96-φρεατίων. Η αναστολή της ανάπτυξης αξιολογήθηκε με μέτρηση των επιπέδων ΑΤΡ με τον τίτλο-Glo φθορισμού δοκιμασία Κυττάρων Η βιωσιμότητα των κυττάρων (Promega). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν μεταξύ των ελέγχων του 1 μΜ σταυροσπορίνη (Sigma-Aldrich) και ρυθμιστικό (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ϋυΐββοοο χωρίς Ca και Mg (D-PBS), Quality Biological, Inc.) που περιέχει 0.2% αλβουμίνη ανθρώπινου ορού (Τομέας Κτηνιατρικής Πόρων, ΝΙΗ , Bethesda, MD) ή μέσο. εικόνες φωτεινού πεδίου ελήφθησαν σε ένα μικροσκόπιο Zeiss με έναν αντικειμενικό φακό 10X ΕΚ Σχέδιο Neofluar χρησιμοποιώντας την κάμερα AxioCam MRC και το λογισμικό απόκτησης AxioVision 4.7.2. Ο κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε με τη χρήση της Annexin V-ΡΕ Apoptosis Detection Kit Ι (BD Pharmingen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποπτωτικά κύτταρα θεωρήθηκαν αννεξίνης V-θετικά, όπως προσδιορίζεται με gating τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. η αναστολή της σύνθεσης πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση [

3Η] λευκίνη (Perkin Elmer) την ενσωμάτωση που έγινε προηγουμένως [22]. Οι τιμές παρουσιάζονται σε σχέση με τους ελέγχους της D-PBS 0,2% αλβουμίνη ανθρώπινου ορού και των ελέγχων 100 μg /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) σε επεξεργασία.

σε πραγματικό χρόνο RT-qPCR

RNA ήταν απομονώνεται και καθαρίζεται από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen), αντίστροφη μεταγραφή έγινε με το κιτ QuantiTect Αντίστροφη μεταγραφή (Qiagen) και ενίσχυση με την Πράσινη PCR kit QuantiFast SYBR (Qiagen). Οι αλληλουχίες για Primer DPH1-5, DPH7, mesothelin, και β-ακτίνης παρουσιάζεται στον Πίνακα S1. Real-time RT-qPCR διεξήχθη σε μια HT ΑΒΙ 7900 μηχάνημα RT-PCR, αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συγκριτικό C

μέθοδο Τ (ΔΔ

C

T) μέθοδο με SDS διαχειριστή (Applied Biosystems) . και κανονικοποιημένο για το ενδογενές β-ακτίνης

πρωτεΐνη επιφανειακή έκφραση με κυτταρομετρία ροής

ποντικού αντι-ανθρώπινης mesothelin (MN? Rockland Immunochemicals, Inc.) και R-PE CD71 αντι-ανθρώπου ( Biolegend) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η έκφραση πρωτεΐνης επιφάνειας. Ένα IgG-R-ΡΕ ελέγχου ισοτύπου ποντικού (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για χρώση mesothelin. Αντι-mesothelin και ο έλεγχος ισοτύπου βάφτηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG-R-PE (αραίωση 1: 250, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ένα FACSCalibur. χάντρες QuantiBRITE R-PE (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των θέσεων mesothelin δέσμευσης ανά κύτταρο.

Σπιτάκι επίπεδα mesothelin στο κελί μέσο

Διαλυτό επίπεδα mesothelin σε μέσο κυτταρικής σειράς μετρήθηκαν εις διπλούν με mesothelin Δοκιμασία Meso Scale (Morphotek, Inc.), χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ηλεκτροχημειοφωταύγειας του Meso Scale Discovery. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κανονικό μέσο κυτταρικής καλλιέργειας σε μια πλάκα 12 φρεατίων. Μετά από 20 ώρες, μέσο συλλέχθηκε, ο όγκος μετρήθηκε και ο αριθμός των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν. Μετά από φυγοκέντρηση του μέσου, υπερκείμενα φυλάχθηκε στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Το υπερκείμενο υγρό κυττάρων αραιώνεται 50 φορές και προστέθηκαν σε φρεάτια μιας πλάκας 96 φρεατίων προηγουμένως επικαλυμμένα με αντίσωμα σύλληψης. Η διαδικασία εκτελείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], και τα σήματα μετρήθηκαν σε ένα MSD Discovery Πάγκος εργασίας (Meso Scale Discovery). Το ποσό των mesothelin ρίξει από την KLM-1 και KLM-1-R υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας το λαμβανόμενο συγκέντρωση mesothelin με καλά τον όγκο, και τυποποιημένα για τον αριθμό των καταμετρηθέντων κυττάρων ανά φρεάτιο.

RG7787 κυτταρική πρόσληψη

Rits σημάνθηκαν με την Alexa Fluor 647 Labeling Kit (Invitrogen) για 3,5 ώρες και καθαρίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα συλλεγμένα κύτταρα επωάστηκαν για 30, 75 και 150 λεπτά στους 37 ° C με κορεσμό 2 μg /ml του SS1P-Alexa647 ή RG7787-Alexa647 και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε σε FACSCalibur. Η πρόσληψη εκφράστηκε σε αριθμό εσωτερικεύεται μορίων RG7787, το οποίο υπολογίστηκε με την παραδοχή ότι η RG7787-Alexa647 GEOMEAN επιφανειακή έκφραση της KLM-1 ίσο με 60 x 10

3 μόρια RG7787 (= mesothelin επιφάνειας χώρων ανά KLM-1 κυττάρων δεσμευτικό χαρακτήρα, όπως αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής και χάντρες QuantiBRITE R-PE).

η μεθυλίωση ανάλυση

η αξιολόγηση της κατάστασης μεθυλίωσης μιας περιοχής στην ιστοσελίδα υποκινητή του γονιδίου mesothelin έγινε από EpigenDx (Hopkinton, ΜΑ). Όξινο θειώδες τροποποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Zymo Έρευνας EZ μεθυλίωσης Gold. Γονιδιωματικό DNA (500 ng) χρησιμοποιείται για την τροποποίηση όξινου θειώδους, ακολουθούμενη από ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας Hot-Star Taq πολυμεράση (Qiagen). Pyrosequencing εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το PSQ HS 96 Pyrosequencing System (Qiagen). Η ανέλυσε περιοχή επιλέχθηκε βάσει των διαθέσιμων εκκινητών (ADS2475-RS1 και ADS2475-RS2) σε EpigenDx, η οποία καλύπτει ένα 147-bp περιοχή ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής mesothelin (chr16: 808.890 έως 808.742? ENST00000563941). Η μεθυλίωση ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με PyroQCpG λογισμικού, το οποίο υπολογίζει για κάθε μεμονωμένο CpG την αναλογία μεταξύ μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων μορφή του, με αποτέλεσμα το μέσο ποσοστό βαθμού μεθυλίωσης.

Mesothelin επιμόλυνση σε KLM-1-R

κύτταρα KLM-1-R επιμολύνθηκαν με Lipofectamine (Invitrogen) με pcDNA3.1 ελέγχου (+) (Invitrogen) ή pMH107, ένα φορέα pcDNA3.1 (+) με cDNA mesothelin πλήρους μήκους και Geneticin ως επιλέξιμο δείκτη [27]. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν για τρεις ημέρες, που επιλέγονται με 6 μg /ml Geneticin, και διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο RPMI με 3 μg /ml Geneticin. Ενιαία διαλογή κυττάρων με ένα FACSVantage SE (BD Biosciences) και μετέπειτα επακόλουθη επέκταση είχε ως αποτέλεσμα την κυτταρική γραμμή μονοκλωνικού KLM-1-R-

Msln

ότι υψηλά και ομοιογενώς εκφράζονται mesothelin στην επιφάνειά του.

προκαλούμενη από τοξίνη ΑΟΡ-ριβοσυλίωση EF-2

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Applied Science), και 3 μg κυτταρολύματος επωάστηκε με ρυθμιστικό ADP-ριβοσυλίωση [20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 1 mM EDTA, και 50 mM DTT], 5 μΜ 6-Βιοτίνη-17-NAD (Trevigen) και 10 ng του RG7787 για διάφορα χρονικά σημεία στους 25 ° C. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε SDS /PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western με σύζευγμα στρεπταβιδίνης HRP (Invitrogen) για την ανίχνευση βιοτίνη EF-2.

κηλίδος Western

Cells ADP-ριβοσυλιωμένη συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με D- PBS, και διαλυτοποιημένο σε ρυθμιστικό RIPA με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Applied Science). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Coomassie Plus (Pierce). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε NuPAGE 4% -12% πηκτώματα Bis-Tris (Invitrogen) για SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Invitrogen). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-MN (Rockland), κουνελιού αντι-EF-2 # ab33208 (Abcam) και ποντικού αντι-β-ακτίνης # 8226 (Abcam). HRP-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα ποντικού (Santa Cruz Biotechnology) έγιναν ορατά με ECL ή ECL Plus υποστρώματα (GE Healthcare). EF-2 επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικά και ρυθμίζεται για την β-ακτίνη με Image J [28].

RNA βαθιά αλληλούχιση και ανάλυση δεδομένων

Το συνολικό RNA εξήχθη από KLM-1 και KLM-1 -R κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen RNeasy, και στη στήλη χώνευση DNA (Qiagen) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά ποιότητα του RNA ελέγχου με έναν Agilent Bioanalyzer, ολικό RNA δείγματα εστάλησαν για την κατασκευή της βιβλιοθήκης και βαθιά αλληλούχιση στον πυρήνα εγκατάσταση NCI (Bethesda, MD). Οι πρώτες σειρές ελεγχόμενη ποιότητα και ευθυγραμμισμένο με REFSEQ [29]. Πρώτες μετρήσεις ομαλοποιούνται και φορτώνονται σε Qlucore Γονιδιωματική Explorer v_3.0 (35) για την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης. Εφαρμογή φίλτρου διακύμανσης Qlucore, μια λίστα με τις 989 πιο σημαντικά αλλάξει γονίδια δημιουργήθηκε το οποίο θα χωρίζεται σε πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια.

Γονιδιακή Ρύθμιση Ανάλυση Εμπλουτισμός

(GSEA) ευθυγράμμιση έγινε μέσα από Qlucore. Για ευθυγράμμιση με Gene οντολογίας (GO), Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) – και Reactome-μονοπάτια, το πάνω και κάτω-ρυθμίζονται λίστα γονίδιο φορτώθηκε σε string-db.org [30] και p-τιμές για σύνολα δεδομένων με σημαντικές αλλαγές εξήχθησαν.

Η στατιστική ανάλυση

τα πειράματα που συνήθως πραγματοποιείται ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές, και αντιπρόσωπο ή κατά μέσο όρο δεδομένα που εμφανίζονται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της μέτρησης της επαναληπτικές πειραμάτων. Εφαρμοσμένη στατιστικά στοιχεία περιλαμβάνουν Student t-τεστ ή μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές δοκιμές σύγκρισης του Tukey. Η στατιστική ανάλυση και το σχήμα σύνταξη διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad PRISM 6 (GraphPad Software, Inc.). Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Αποτελέσματα

KLM-1 κύτταρα απομονώθηκαν μετά SS1-LR-σε πρωτογενή ενέργεια επώασης είναι ανθεκτικά σε αντι-mesothelin Rits

Όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων, κύτταρα KLM-1 διακοπτόμενα εκτεθεί με SS1-LR-GGS και επιζώντα κύτταρα (KLM-1-R) επεκτάθηκαν σε RIT-ελεύθερο μέσο. KLM-1 και τα κύτταρα KLM-1-R ήταν αδιάκριτοι από φωτεινού πεδίου μικροσκοπία (S2A Σχ.) Και σχετικά με κυτταρομετρία ροής προς τα εμπρός και πλευρική σκέδαση, υποδεικνύοντας μία παρόμοια κυτταρικό μέγεθος και το κοκκώδες (S2B Εικ.). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σε σύγκριση με σπορά 1 χ 10

5 κύτταρα κατά την ημέρα 0, και μετρώντας βιώσιμα κύτταρα την ημέρα για 6 ημέρες. KLM-1-R κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά ταχύτερα από ό, τι τα κύτταρα KLM-1 από την ημέρα 2 στο (

σ

& lt? 0,0001) (S2C Εικ.). Για να αξιολογηθεί το επίπεδο της αντίστασης, KLM-1 και KLM-1-R κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με αντι-mesothelin Rits. αναλύσεις βιωσιμότητας ΑΤΡ έδειξαν ότι η KLM-1 κύτταρα ήταν ευαίσθητα στην SS1-LR-σε πρωτογενή ενέργεια (IC

50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) και RG7787 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml), σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα [19]. Σε αντίθεση, η KLM-1-R κύτταρα ήταν πολύ ανθεκτικά στα δύο RITS (IC

50s & gt? 1 μg /ml) (Σχήμα 1Α). Και SS1P (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε ανθεκτικά κύτταρα, υπήρξε μια μικρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε συγκεντρώσεις πάνω από ένα RIT 100 ng /ml. Ως μάρτυρας, εξετάσαμε τη δραστικότητα της LMB-2, ενός αντι-CD25 RIT [31] που δεν δεσμεύει κύτταρα KLM-1, και παρατηρήθηκε μια μη-ειδική μείωση στο 1 μg /ml LMB-2. Αυτό δείχνει ότι η μείωση στο 1 μg /ml σε RG7787 KLM-1-R θα μπορούσε να αποδοθεί σε μη ειδική πρόσληψη (Εικ. 1Α). Η καθιερωμένη αντίσταση ήταν σταθερή? Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε όταν KLM-1-R κύτταρα ήταν σε RIT-free καλλιέργειας για αρκετούς μήνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή προσδιορισμοί ΑΤΡ δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων και τον κυτταρικό θάνατο [32], αξιολογήσαμε απόκριση με το κιτ αννεξίνης V-ΡΕ ανίχνευσης απόπτωσης. Σε αντίθεση με την KLM-1 (

σ

& lt? 0,0001), KLM-1-R κύτταρα δεν έδειξε καμία ή περιορισμένη απόπτωση όταν υποβάλλονται σε θεραπεία για 72 ώρες με 100 ng /ml (

σ

= 0,33 ) ή 1 μg /ml RG7787 (

σ

= 0,02), σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 1Β). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η KLM-1-R κύτταρα είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στη δραστηριότητα των κυττάρων θανάτωσης των αντι-mesothelin Rits

Α:. KLM-1 και κύτταρα ανθεκτικά KLM-1 (KLM-1-R) επωάστηκαν για 72 ώρες με την αντι-mesothelin SS1-LR-GGS, RG7787 ή αντι-CD25 LMB-2 ως μάρτυρα. Η αναστολή της ανάπτυξης αξιολογήθηκε με ΑΤΡ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Με IC

’50 κάτω από 10 ng /ml, KLM-1 είναι ευαίσθητος στις αντι-mesothelin Rits, πράγμα που δεν συμβαίνει στην περίπτωση των KLM-1-R (IC

50s & gt? 1 μg /ml). 1 μg /ml LMB-2 μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι αυτή η συγκέντρωση RIT επάγει μη ειδική πρόσληψη. Β: KLM-1 και KLM-1-R κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με 100 ή 1000 ng /ml RG7787. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με την αννεξίνης V-ΡΕ Apoptosis Detection Kit I. RG7787 προκαλεί μια σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων KLM-1, ενώ η KLM-1-R κύτταρα δεν δείχνει σημαντική αύξηση στην απόπτωση. C: KLM-1 και KLM-1-R κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με ΗΒ21 (Fv) -ΡΕ40. Η αναστολή της ανάπτυξης αξιολογήθηκε με ΑΤΡ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Και οι δύο κυτταρικές σειρές είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε αυτό το RIT.

Η

Αντίσταση στα κύτταρα KLM-1-R είναι ειδικά για αντι-mesothelin Rits

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον η αντίσταση στην KLM-1- R ισχύει επίσης για Rits στοχευμένες ενάντια σε άλλους υποδοχείς επί KLM-1-R κύτταρα, ελέγξαμε ΗΒ21 (Fv) -ΡΕ40 που στοχεύει CD71 [33]. CD71 εκφράζεται στην επιφάνεια σε ένα εξίσου υψηλό επίπεδο σε KLM-1 και KLM-1-R (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), και οι δύο κυτταρικές σειρές είχε παρόμοια ευαισθησία σε ΗΒ21 (Fv) -ΡΕ40 μετά από επώαση 72 ωρών (Σχ. 1C). Για την αξιολόγηση της ευαισθησίας προς άλλα θεραπευτικά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή για 72 ώρες με πακλιταξέλη, έναν αναστολέα μιτωτική, και γεμσιταβίνη, ένα ανάλογο νουκλεοζίτη. αναλύσεις βιωσιμότητας έδειξε καμία διαφορά στην ευαισθησία στην πακλιταξέλη μεταξύ της KLM-1 και KLM-1-R (IC

50 KLM-1 = 3.0 ± 1.6 ng /ml έναντι IC

50 KLM-1-R = 3.7 ± 1.7 ng /ml) (

σ

= 0.80). KLM-1-R (IC

50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) ήταν 3 φορές λιγότερο ευαίσθητος σε γεμσιταβίνη από KLM-1 (IC

50 = 15,2 ± 1,9 ng /ml) (

p

= 0.04), η οποία είναι πολύ λιγότερο έντονη από την αντοχή σε RG7787. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αντίσταση στην KLM-1-R δεν είναι γενική και, επομένως, ειδικά για αντι-mesothelin Rits.

έκφραση Mesothelin και πρόσληψη RG7787 μειώνεται στο KLM-1-R

Η το πρώτο βήμα στο μηχανισμό RIT της δράσης είναι δεσμευτική στο στοχευόμενο αντιγόνο επιφανείας κυττάρου που ακολουθείται από εσωτερικοποίηση RIT. επιφανειακή έκφραση mesothelin, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, ήταν 4,9 ± 0,5 φορές μικρότερη σε KLM-1-R (12 x 10

3 θέσεις ανά κύτταρο) σε σύγκριση με KLM-1 (60 x 10

3 ιστοσελίδες ανά κύτταρο) (Σχ. 2Α). Ροής που εμφανίζεται κυτταρομετρία ενός ομογενούς πληθυσμού κυττάρων KLM-1-R, γεγονός που υποδηλώνει μια ομοιόμορφη μείωση στην έκφραση επιφανείας mesothelin. Ανάλυση των mesothelin-αρνητικά κύτταρα Α431 και η χρήση ενός ελέγχου ισοτύπου αντίσωμα επιβεβαίωσε ότι το σήμα mesothelin σε κύτταρα KLM-1-R ήταν ειδική. Όπως ήταν αναμενόμενο, κηλίδες Western έδειξαν ότι τα κύτταρα KLM-1 περιείχε μία κύρια ζώνη του ώριμου mesothelin σε 37-kDa και μία ασθενέστερη προδρόμου ζώνη στα 72-kDa. Τα ανθεκτικά κύτταρα είχαν μικρές ποσότητες ώριμων mesothelin, αλλά ο πρόδρομος δεν ανιχνεύθηκε, πιθανόν λόγω της χαμηλής αφθονίας του (Εικ. 2Β). Περίσσεια αποβολή του mesothelin στην KLM-1-R θα μπορούσαν να ευθύνονται για τα χαμηλά επίπεδα επιφάνειας mesothelin. Χρησιμοποιώντας την Δοκιμασία Meso Scale, διαπιστώσαμε ότι ρίξει mesothelin ήταν 4,8 ± 0,03 φορές χαμηλότερα από τα μέσα ενημέρωσης της KLM-1-R (40.7 ± 5.3 pg /10

5 κύτταρα) σε σύγκριση με KLM-1 (149,0 ± 23,4 pg /10

5 κύτταρα). Σε μέσο χωρίς κύτταρα (αρνητικός έλεγχος), δεν mesothelin ανιχνεύθηκε. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τη διαφορά στα επιφανειακά επίπεδα και δείχνουν ότι η χαμηλή mesothelin επί KLM-1-R δεν οφείλεται σε αυξημένη απόπτωση. Για να προσδιοριστεί εάν μειωθεί mesothelin οφειλόταν σε λιγότερο mRNA, πραγματοποιήσαμε RT-PCR και διαπίστωσε ότι mesothelin RNA ήταν 7.3 ± 4.3 φορές χαμηλότερη σε KLM-1-R (C

T = 24.1 ± 0.09) σε σύγκριση με KLM-1 (C

T = 21,54 ± 0,73). Για να αξιολογηθεί κατά πόσον το υπόλοιπο mesothelin στην επιφάνεια KLM-1-R θα μπορούσαν να δεσμεύουν και εσωτερικεύουν αντι-mesothelin Rits, αξιολογήσαμε την κυτταρική εσωτερίκευση του RG7787-Alexa647. Η πρόσληψη στην KLM-1-R αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερη από την KLM-1 σε κάθε χρονικό σημείο (4 έως 5 φορές,

σ

& lt? 0,01). Μετά από 150 λεπτά επώασης, π.χ., KLM-1 εσωτερικεύεται περίπου 40 x 10

μόρια 3 RG7787, σε σύγκριση με μόνο 8 x 10

3 στην KLM-1-R (Εικ. 2C). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η KLM-1-R κύτταρα έχουν μια μερική ρύθμιση προς τα κάτω σε mesothelin και επομένως εσωτερικεύουν σημαντικά λιγότερο RG7787, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη αντοχή

Α:. Επίπεδα mesothelin επιφάνειας είναι 5 φορές μικρότερη σε ανθεκτικά KLM-1 (KLM-1-R) σε σύγκριση με KLM-1. έκφραση Mesothelin της KLM-1, KLM-1-R και mesothelin-αρνητικά κύτταρα Α431 (αρνητικός έλεγχος) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Γεμιστά ιστογράμματα είναι οι έλεγχοι δευτερεύον αντίσωμα. Β: επίπεδο πλήρους πρωτεΐνης mesothelin μειώνεται στο KLM-1-R. Πρόδρομος (72 kDa) και διασπάται ώριμη mesothelin (37 kDa) ήταν παρούσες στην KLM-1. Σε KLM-1-R, ο διασπασμένος τμήμα ανιχνεύθηκε σε χαμηλά επίπεδα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν σε μη επεξεργασμένα KLM-1 και KLM-1-R λύμα κυττάρου με κηλίδα Western. β-ακτίνης δρα ως έλεγχος φόρτωσης. C: Σε κάθε χρονικό σημείο, κυτταρική πρόσληψη του RG7787-Alexa647 στην KLM-1 είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι στην KLM-1-R και σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι στην KLM-1-R-

Msln

(επιμολυσμένα με mesothelin ). Η πρόσληψη αξιολογήθηκε στα 30, 75 και 150 λεπτά. Μέση GEOMEAN εντάσεις φθορισμού μετατρέπονται σε ποσότητα μορίων RG7787.

Η

AZA αποκαθιστά μερικώς mesothelin έκφραση επιφάνεια KLM-1-R με περιορισμένη επίδραση στην ευαισθησία στην RG7787

έκφραση

Mesothelin μπορεί να σιωπήσει με DNA μεθυλίωση CpG θέσεων στην περιοχή του υποκινητή του [34-37]. AZA, ένας αναστολέας της μεθυλοτρανσφεράσης του DNA, μπορεί να αντιστρέψει όπως υπερμεθυλίωση. Δώσαμε κύτταρα 500 nM AZA καθημερινά για 3 εβδομάδες, και διαπίστωσε ότι η έκφραση mesothelin αυξήθηκε το KLM-1-R (KLM-1-R-ΑΖΑ) κατά περίπου 3 φορές, μέχρι 34 x 10

3 ιστοσελίδες ανά κυττάρων, η οποία εξακολουθεί να είναι μικρότερη από το 60 x 10

3 θέσεις ανά κύτταρο στην KLM-1 (Εικ. 3Α). ΑΖΑ βελτίωσε την ευαισθησία σε RG7787 σε KLM-1 και KLM-1-R, αν και ο τελευταίος παρέμεινε ιδιαίτερα ανθεκτικά μετά από επώαση 72 hr (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml) (Σχ. 3Β). Τα δεδομένα αυτά συνδέουν mesothelin κάτω ρύθμιση με υπερμεθυλίωση

Α:. AZA οδηγεί σε 2,8-πλάσια αύξηση της έκφρασης επιφάνειας mesothelin σε ανθεκτικά KLM-1 (KLM-1-R). Η κυτταρομετρία ροής ιστόγραμμα της KLM-1, KLM-1-R, και η KLM-1-R-ΑΖΑ. Γεμιστά ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν ελέγχους δευτερεύον αντίσωμα. Β: Τρεις εβδομάδες επώασης με ΑΖΑ, έναν αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA, αυξάνει την ευαισθησία στο RG7787. KLM-1, KLM-1-R, και οι AZA-κατεργασμένα κύτταρα (KLM-1-ΑΖΑ και KLM-1-R-ΑΖΑ) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με RG7787. Η αναστολή της ανάπτυξης αξιολογήθηκε με ΑΤΡ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν AZA-επεξεργασμένα κύτταρα. C: CpGs σε μια περιοχή ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής mesothelin είναι πιο μεθυλιωμένα σε KLM-1-R από ό, τι σε KLM-1. Τρεις εβδομάδες επώασης με ΑΖΑ μειώνεται μεθυλίωση σε κύτταρα KLM-1-R. Η ανέλυσε περιοχή βρίσκεται σε chr16: 808.890 με 808742 και εκτείνεται 147 bp και επτά CpGs. D: Mesothelin επιμόλυνση σε KLM-1-R αποτέλεσμα σημαντική υπερέκφραση mesothelin σύγκριση με KLM-1 (5 φορές) και KLM-1-R (23 φορές). Η κυτταρομετρία ροής επίπεδα επιφάνειας mesothelin στην KLM-1, KLM-1-R και ανθεκτικά κύτταρα mesothelin-επιμολυσμένα (KLM-1-R-

Msln

). Ε: Mesothelin υπερέκφραση σε KLM-1-R αποκαθιστά την ευαισθησία στην RG7787. KLM-1 και KLM-1-R-

Msln

κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με RG7787. αναστολή της ανάπτυξης αξιολογήθηκε με ένα ΑΤΡ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας.

Η

Οι CpGs στην περιοχή mesothelin προαγωγός υπερμεθυλίωση στην KLM-1-R

Για να επιβεβαιώσετε ότι το γονίδιο mesothelin υπόκειται πράγματι σε υπερμεθυλίωση στην KLM-1-R, πραγματοποιήσαμε μια διερευνητική ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των επτά CpGs στην περιοχή mesothelin υποκινητή (chr16:. 808.890 με 808.742, S3 σχήμα) με τη χρήση θειώδους αλληλουχίας. Αυτή η περιοχή 147-bp περιοχή επιλέχθηκε με βάση τα διαθέσιμα σε EpigenDx εκκινητές. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτές οι CpGs είχαν σημαντικά υψηλότερο μεθυλίωση στην KLM-1-R (59 ± 3,6%) σε σύγκριση με KLM-1 (41 ± 4,8%) (

σ

& lt? 0,05) (Σχ. 3C) . Η θεραπεία με AZA έφερε τα επίπεδα μεθυλίωσης στο KLM-1-R πίσω σε εκείνες της KLM-1 (p & gt? 0,05). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω ότι η ρύθμιση προς τα κάτω mesothelin στην KLM-1-R συνδέεται με υπερμεθυλίωση του γονιδίου mesothelin.

Η υπερέκφραση του mesothelin στην KLM-1-R αποκαθιστά την ευαισθησία στην RG7787

Για να επαναφέρετε mesothelin έκφραση σε KLM-1-R, εισάγαμε cDNA mesothelin πλήρους μήκους (KLM-1-R-

Msln

). mesothelin επιφανειακή έκφραση KLM-1-R-

Msln

ήταν 22,6 ± 5,3 φορές υψηλότερη από εκείνη της KLM-1-R, και υπερέβη το πρωτότυπο έκφραση σε KLM-1 κατά 5,3 ± 1,3-φορές, με αποτέλεσμα σε περίπου 300 x 10

3 θέσεις ανά κύτταρο (Σχ. 3D). Κατά συνέπεια, η πρόσληψη του RG7787-Alexa647 στην KLM-1-R-

Msln

σε κάθε χρονικό σημείο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στην KLM-1 (5 έως 10 φορές,

p

& lt? 0,05) και KLM-1-R (24- έως 46-φορές,

σ

& lt?. 0.001) (Σχήμα 2C). Μετά από επώαση 72 ωρών, RG7787 είχε παρόμοια IC

50 σε KLM-1-R-

Msln

(4,49 ± 1,11 ng /ml) όπως στο KLM-1 (4,41 ± 0,38 ng /ml) (

σ

= 0.80). Ωστόσο, η KLM-1-R-

Msln

ήταν περισσότερο ευαίσθητη από KLM-1 σε υψηλότερες συγκεντρώσεις RG7787, με τη βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται στο μηδέν στα 100 ng /ml (Σχ. 3Ε). Εισαγωγή pcDNA3.1 ελέγχου (+) δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα mesothelin ή αντίσταση στην RG7787 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι η αντίσταση στην KLM-1-R συνδέεται με μια μείωση στην mesothelin. Προκειμένου να επιτευχθεί ένα παρόμοιο επίπεδο ευαισθησίας σε RG7787 δει σε KLM-1, KLM-1-R απαιτεί σημαντικά υψηλότερα επίπεδα mesothelin από KLM-1. Το εύρημα αυτό υπαινίσσεται ότι η αντίσταση θα μπορούσε επίσης να συνδέεται με αναποτελεσματική εμπορία RG7787 στο κυτταρόπλασμα, ή ότι η αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών επηρεάζεται σε KLM-1-R.

αναστολή της σύνθεσης πρωτεΐνης με RG7787 περιορίζεται στην KLM-1- R, EF-2 ΑϋΡ ριβοσυλίωσης είναι άθικτο

αναστολής σύνθεσης πρωτεΐνης ενεργοποιείται μετά τη διακινεί τοξίνη από την κυτταρική επιφάνεια στο κυτοσόλιο και αδρανοποιεί EF-2 από την ADP-ριβοσυλίωση. κύτταρα KLM-1 επωάστηκαν με RG7787 για 16 ώρες, και KLM-1-R κυττάρων για 16 και 48 ώρες, μετά τις οποίες η σύνθεση της πρωτεΐνης εξετάστηκε με μέτρηση [

3Η] ενσωμάτωση λευκίνης (Σχ. 4Α). Μετά από 16 ώρες, RG7787 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην πρωτεϊνοσύνθεση σε KLM-1, αλλά όχι σε KLM-1-R.