Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα μικρό πληθυσμό του καρκίνου έναρξη βλαστικά κύτταρα (CIC), που είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση του όγκου και της αντίστασης στην αντι -cancer θεραπείες, πιθανώς επιτρέποντας την ανακεφαλαίωση των όγκων μόλις σταματήσει τη θεραπεία. Συνδυασμοί ανοσοποιητικού θεραπείες που βασίζονται με χημειοθεραπεία και άλλους παράγοντες κατά του όγκου μπορεί να είναι σημαντικό κλινικό όφελος στην αγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, κυτταρική ανοσολογική θεραπείες που βασίζονται δεν έχουν πειραματιστεί ακόμα στον πληθυσμό των CICs παχέος εντέρου. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικών παραγόντων, 5-φθοροουρακύλη και δοξορουβικίνη, να ευαισθητοποιήσει CICs του παχέος εντέρου σε κύτταρο κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ. κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων διαμεσολαβείται σε μεγάλο βαθμό από την αλληλεπίδραση TRAIL με DR5, μετά NKG2D-εξαρτώμενη αναγνώριση του παχέος εντέρου στόχων CIC. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

in vivo

ενεργοποίηση των Τ κυττάρων Vγ9Vδ2 ή θετής χορήγηση

ex-vivo

επεκταθεί Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα μετά τη χημειοθεραπεία μπορεί να αυξήσει σημαντικά τις δραστηριότητες κατά του όγκου και αντιπροσωπεύουν μια νέα στρατηγική για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Todaro Μ, Ορλάντο V, ο Κικέρων G, Caccamo Ν, Meraviglia S, Stassi G, et al. (2013) Χημειοθεραπεία ευαισθητοποιεί τον καρκίνο του παχέος εντέρου Έναρξη κύτταρα να Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα. PLoS ONE 8 (6): e65145. doi: 10.1371 /journal.pone.0065145

Επιμέλεια: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια de la Santé (CRP-Santé), το Λουξεμβούργο

Ελήφθη: 5 Μαρτίου, 2013? Αποδεκτές: 23 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Todaro et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις από το ιταλικό Υπουργείο για τη διδασκαλία, το Πανεπιστήμιο και την Έρευνα (αριθ 2008L57JXW να FD.), το ιταλικό Υπουργείο Υγείας (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 «βλαστικά κύτταρα σε διαφορετικές παθολογικές καταστάσεις: καινοτόμες θεραπευτικές approches» για FD), Istituto Superiore di Sanità Oncoproteomic Έργου 2007-527 /Β /3A /3 (σε GS και FD) και το Πανεπιστήμιο του Παλέρμο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν καμία οικονομική ή εμπορική σύγκρουση συμφερόντων. Το αντίστοιχο συγγραφέα, Francesco Dieli, είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας του PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα τελευταία χρόνια, νέες γνώσεις στην έρευνα για τον καρκίνο έχουν δείξει ότι η ικανότητα να αρχίσει και να διατήρηση της ανάπτυξης του όγκου είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του ένα μικρό υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων με βλαστική ικανότητα ιδιότητες εντός της μάζας του όγκου, που ονομάζεται «καρκινικά βλαστικά κύτταρα» (ΚΕΠ) ή «κύτταρα καρκίνου κίνηση» (CICs) [1]. Η χημειοθεραπεία παραμένει η κύρια επιλογή θεραπείας για πολλούς προχωρημένους καρκίνους και έχει κυτταροτοξική δράση κατά των όγκων μέσω μιας σειράς μηχανισμών. Ωστόσο, οι περισσότεροι καρκίνοι είναι ανθεκτικά σε τρέχουσες θεραπείες λόγω των CICs αργή ποδηλασία, η θέση αυτών των κυττάρων εντός κόγχες υποξικών [2], [3], και επειδή τα κακοήθη κύτταρα έχουν την ικανότητα να αναπτύξει μηχανισμούς για να αντισταθεί ή να ξεφύγουν από την κυτταροτοξική αποτελέσματα της χημειοθεραπείας [4], οι οποίες περιλαμβάνουν πάνω ρύθμιση αρκετών συνδέσεως ΑΤΡ των μεταφορέων κασέτας, ενεργός χωρητικότητα επιδιόρθωσης DNA και υπερ-έκφραση αντι-αποπτωτικών μορίων που προκαλούν αλλαγές στα μονοπάτια σηματοδότησης ελέγχου του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και απόπτωσης [5] .

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με χημειοθεραπευτικά φάρμακα επάγει ή αυξάνει την ευαισθησία τους σε κυτταροτοξικότητα με ΝΚ ή Τ λεμφοκύτταρα? Έτσι, οι συνδυασμοί του κυτταρικού ανοσοποιητικού θεραπείες που βασίζονται με χημειοθεραπεία και άλλους παράγοντες κατά του όγκου μπορεί να είναι σημαντικό κλινικό όφελος σε θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου [6].

γδ Τ κύτταρα είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για χρήση σε τέτοιες συνδυασμένες θεραπείες λόγω ισχυρή κυτταροτοξικότητα κατά του όγκου τους και της σχετικής ευκολίας της παραγωγής

in vitro

[7]. Ανθρώπινα γδ Τ κύτταρα μπορούν να χωριστούν σε δύο κύριες πληθυσμούς με βάση την έκφραση δ αλυσίδα [8]: γδ Τ κύτταρα που εκφράζουν την αλυσίδα Vδ1 βρίσκονται συχνότερα σε βλεννογόνους ιστούς, όπου εμπλέκονται στη διατήρηση επιθηλιακά ακεραιότητα του ιστού στο πρόσωπο της ζημίας, μόλυνση ή μετασχηματισμό του όγκου, ενώ γδ Τ κύτταρα που εκφράζουν την αλυσίδα Vδ2 ζευγαρωμένα με την αλυσίδα Vγ9 (εδώ και στη συνέχεια ονομάζονται Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα) κυριαρχούν στο περιφερικό αίμα και δευτερογενή λεμφοειδή όργανα [9]. Ενώ ο συνδετήρας (ες) που αναγνωρίζεται από τα κύτταρα Vδ1 παραμένουν άγνωστες, Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα αναγνωρίζουν μη πεπτιδικά αντιγόνα από ένα MHC-απεριόριστη μηχανισμό, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό που τους διακρίνει από αβ Τ κύτταρα [9]. Συγκεκριμένα, Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα αναγνωρίζουν phosphoantigens που παράγονται μέσω των οδών βιοσύνθεσης ισοπρενοειδή [10] – [12]. Phosphoantigens δεν είναι διεγερτικά σε φυσιολογικά επίπεδα, αλλά μετασχηματισμένα και μολυσμένα κύτταρα, παράγουν αυξημένα επίπεδα των μεταβολικών ενδιάμεσα τα οποία είναι ικανά να ενεργοποιήσουν κύτταρα Τ Vγ9Vδ2 [13] – [15]. Κατά συνέπεια, Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα μπορούν επίσης να ενεργοποιηθούν, μέσω ενός έμμεσο μηχανισμό, με aminobisphosphonates, μια κατηγορία φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ορισμένων παθήσεων των οστών, τα οποία αναστέλλουν πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο συνθάση και προκαλούν συσσώρευση ενδογενών ανάντη μεταβολιτών όπως isopentenylpyrophosphate (ΙΡΡ) [16 ]. Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων μπορεί έμμεσα να συμβάλλει στην ανοσολογική άμυνα έναντι καρκινικών κυττάρων, με την παραγωγή κυτοκινών τυπικά των κυττάρων Th1, Th2 ή Th17 [17] – [19], ή διασταυρούμενη ομιλία με δενδριτικά κύτταρα [20], τα μακροφάγα [21] και Β κύτταρα [22] – [24]. Επιπλέον, Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα εκτελέσει απευθείας ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων, η οποία προκαλείται με τον ίδιο τρόπο όπως για CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα, μέσω περφορίνης /γρανζύμου, Fas /FasL, TNF /TNF-R και TRAIL-ρυμουλκουμένων μονοπάτια R [10].

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε το δυναμικό συνεργία του συνδυασμού χημειοθεραπείας και Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα για θεραπεία κατά του όγκου. Συγκεκριμένα, όπως CICs κόλον είναι ανθεκτικά σε αμφότερα τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα και να Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα, έχουμε διαπιστώσει κατά πόσον η χημειοθεραπεία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ευαισθητοποιήσει κόλον στόχους CIC να κύτταρο κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ, βασίζεται σε τρεις σειρές ενδείξεων: (1) πρωτοποριακό εργασία με Mattarollo και συνεργάτες [25] έδειξε υψηλά επίπεδα κυτταροτοξικότητας έναντι στερεών όγκων προερχόμενων κυτταρικών σειρών με τη συνδυαστική θεραπεία που χρησιμοποιεί Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες? (2) το IL-17 που παράγουν γδ Τ κύτταρα παίζουν ένα καθοριστικό ρόλο στην αντικαρκινική ανοσοαποκρίσεις προκαλούμενη από χημειοθεραπεία σε ποντίκια [26]? (3) κατεργασία CICs κόλον με την ζολεδρονάτη διφωσφονικό ενισχύει την ευαισθησία τους στην θανάτωση των κυττάρων Τ Vγ9Vδ2 [27].

Δείχνουμε εδώ ότι χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, 5-φθοροουρακίλη και η δοξορουβικίνη, είναι σε θέση να ευαισθητοποιήσει CICs του παχέος εντέρου με τη μεσολάβηση κυττάρων θανάτωσης Vγ9Vδ2 Τ και αποδεικνύουν ότι οι υποκείμενοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν NKG2D και TRAIL.

Αποτελέσματα

Αντίσταση CICs παχέος εντέρου σε χημειοθεραπεία

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι ο καρκίνος του παχέος εντέρου περιλαμβάνει ένα συντριπτική πλειοψηφία των διαφοροποιημένων κυττάρων και ένα μικρό πληθυσμό CICs που είναι υπεύθυνες για την έναρξη και συντήρηση [28] του όγκου. Για τους σκοπούς αυτούς μελέτη, καθαρίστηκε και πολλαπλασιάστηκε κόλον σφαίρες καρκίνου από χειρουργική θραύσματα 5 ασθενείς με καρκίνωμα του παχέος εντέρου. Αυτές οι γραμμές σφαίρα καρκίνος ταυτοποιήθηκαν μέσω της έκφρασης CD133 και επιθηλιακής ειδικό ESA αντιγόνου, εμφανίζονται τήρηση των πιάτα καλλιέργειας με την παρουσία του ορού και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε μεγάλα, πολυγωνικά κύτταρα του παχέος εντέρου που εκφράζουν δείκτες επιθηλιακών κόλον, όπως βιλλίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι κόλον σφαίρες καρκίνο διατήρησε την ικανότητα να

in vitro

διαφοροποιούνται σε εντερικά κύτταρα που μοιάζουν με τα κύτταρα. Ακόμη σημαντικότερο, όταν ενίεται υποδορίως σε NOD /ποντίκια SCID, από ένα μικρό αριθμό σφαιρών καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά όχι σφαίρα προερχόμενα διαφοροποιημένα κύτταρα, διατήρησε την ικανότητα να σχηματίζουν έναν όγκο που έμοιαζε στενά το ανθρώπινο αρχικό όγκο (Υποστηρικτικά Σχήμα S1).

CICs χαρακτηρίζεται από υψηλή αντοχή σε φάρμακα και η γενική τοξίνες οι οποίες στοχεύουν ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και τα ανταλλακτικά τους αργή διαιρούμενα κύτταρα, λόγω μιας ανοδική ρύθμιση αρκετών συνδέσεως ΑΤΡ των μεταφορέων κασέτας, ενεργός χωρητικότητα επιδιόρθωσης DNA, υπερ-έκφραση των αντι-αποπτωτικών μορίων που προκαλούν αλλαγές στα μονοπάτια σηματοδότησης ελέγχου του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και απόπτωσης [5]. Κατά συνέπεια, η έκθεση των 5 διαφορετικές κόλον γραμμές CIC (CIC # 1 έως CIC # 5) σε 5-FU (2,5 και 25 μg /ml) (Σχήμα 1Α) ή DXR (0,025 και 0,25 μΜ) (Εικόνα 1Β) για 24-72 hrs είχε ουσιαστικά καμία σημαντική κυτταροτοξική δράση, όπως προσδιορίζεται με χρώση ΡΙ. Υψηλότερες δόσεις 5-FU (250 μg /ml) και DXR (2,5 μΜ) προκάλεσε χαμηλά, ακόμη ανιχνεύσιμη κυτταροτοξικότητα του CIC γραμμών που κυμαίνεται από 15 ± 5% έως 23 ± 6% (μέση τιμή ± SD). Αντιστρόφως, 5-FU και DXR ήταν πλήρως ικανή να σκοτώσει 3 διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD-1, SW620 και SW403, και 2 διαφοροποιημένα κυτταρικές γραμμές (CDC # 3 και 4 CDC #) που ελήφθησαν από δύο ασθενείς (Ρ # 3 και P # 4) όπου σχηματίζουν τις γραμμές CICs ελήφθησαν επίσης, με μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην κυτταροτοξικότητα έως και 85%. Η βιωσιμότητα των μη επεξεργασμένων κυττάρων ήταν όλα πάνω από 90% (Σχήματα 1Α και Β).

CICs Colon, διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 και # 4 CDC υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές Οι συγκεντρώσεις της 5-FU ή DXR για 48 ώρες. Κυτταροτοξικότητα (% ± SD) προσδιορίστηκε από το βαθμό της μείωσης των βιώσιμων κυττάρων με την ικανότητα να διατηρεί CFSE και αποκλείουν PI (CFSE

υψηλό PI

-). Παρουσιάζεται είναι ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία.

Η

Η χημειοθεραπεία ευαισθητοποιεί CICs Colon να Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων κυτταροτοξικότητα

Κατ ‘αναλογία με την αντίστασή τους στη χημειοθεραπεία, οι πέντε δοκιμαστεί παχέος εντέρου CIC γραμμές, ήταν επίσης ανθεκτικά σε Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα, ακόμη και όταν μια αναλογία Ε: Τ του 50:1 χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 2Α). Η κακή κυτταροτοξική δράση έναντι CICs του παχέος εντέρου δεν ήταν ένα εγγενές χαρακτηριστικό των Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων, επειδή τα διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 και CDC # 4 φονεύθηκαν αποτελεσματικά από δύο κυτταρικές σειρές Vγ9Vδ2 Τ COLD2 -1 και COLD2-2 ελήφθησαν από δύο διαφορετικούς ασθενείς καρκίνου του παχέος εντέρου (Ρ # 3 και # 4 P) (Σχήμα 2Α), όπως επίσης και κυτταρικές σειρές Τ Vγ9Vδ2 ελήφθησαν από υγιή άτομα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως έλεγχος, όλες οι κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν Vγ9Vδ2 Τ απέτυχε να σκοτώσει το φυσιολογικό κύτταρο κόλον γραμμή CCL-241 (Εικόνα 2Α).

(Α) ποσοστό κυτταροτοξικότητας από 2 διαφορετικά να Vγ9Vδ2 Τ κυτταρικές γραμμές, COLD2-1 και COLD2-2 ελήφθη από 2 ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου, κατά των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σφαίρα από 5 διαφορετικούς ασθενείς (CIC # 1 έως CIC # 5), διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 και CDC # 4, και η κανονική κυτταρική γραμμή κόλου CCL-241, σε αναλογία Ε: Τ του 50:1. (Β) Τρεις διαφορετικές CICs κόλον στόχου (CIC # 2, CIC # 4 και 5 CIC #) κατεργάζεται με ή χωρίς είτε 5-FU (2.5 έως 250 μg /ml) ή DXR (0.025 να 2,5 μΜ) για 48 ώρες ελέγχθηκαν για την ευαισθησία τους σε 2 διαφορετικές σε κυτταρικές σειρές Vγ9Vδ2 Τ, COLD2-1 και COLD2-2 ελήφθη από 2 ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου και χρησιμοποιείται σε αναλογία Ε: Τ του 20:01. Τα αποτελέσματα δείχνουν την κυτταροτοξικότητα των στόχων όγκου μετά από 6 ώρες συν-καλλιέργειας με κυτταρικές γραμμές Vγ9Vδ2 Τ. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD ποσοστό από 5 διαφορετικά πειράματα, κάθε διεξάγονται εις τριπλούν.

Η

Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε αποδείξει ότι ζολεδρονάτη ευαισθητοποιεί παχέος εντέρου CICs να κυτταροτοξικότητα κυττάρου Vγ9Vδ2 T [27]. Η ικανότητα του Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων να σκοτώσουν κόλον CICs καρκίνο στη συνέχεια αξιολογήθηκε μετά την επεξεργασία των στόχων με χημειοθεραπεία. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα που ελήφθησαν με τρεις διαφορετικούς κλάδους CIC (CIC # 2, # CIC 4 και 5 CIC #) δείχνονται στο Σχήμα 2Β. Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων κυτταροτοξικότητα ενισχύθηκε σε όλες τις περιπτώσεις από την προ-επεξεργασία του CICs στόχου με χημειοθεραπεία. Λεπτομερώς, σχεδόν πλήρη λύση των γραμμών CIC προέκυψε από τη συνένωση των υψηλότερων δόσεων 5-FU (250 μg /ml) ή DXR (2,5 μΜ) και Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, με ποσοστά κυτταρικού θανάτου πάνω από 90% σε Ε: Τ αναλογία 20:01. Η θεραπεία των στόχων με χαμηλότερες δόσεις χημειοθεραπείας (2,5 και 25 μg /ml 5-FU και 0,025 και 0,25 μΜ DXR) είχε ως αποτέλεσμα ενισχυμένη θανάτωση των CIC γραμμών με Vγ9Vδ2 κύτταρα Τ, υποδεικνύοντας ότι η χημειοθεραπεία και Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα έχουν προσθετική δραστικότητα, ακόμη και όταν χρησιμοποιούνται σε υποβέλτιστες δόσεις.

Η χημειοθεραπεία απορυθμίζει DR5 (TRAIL-R2) των υποδοχέων θανάτου έκφραση σε CICs

για να αποκρυπτογραφήσει τους μοριακούς μηχανισμούς πίσω από τη χημειοθεραπεία με τη μεσολάβηση ευαισθητοποίηση των CICs να Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα, εστιάσαμε στην έκφραση του mRNA που κωδικοποιεί για τα μόρια που είναι γνωστό ότι είναι συνδέτες για υποδοχείς πλήκτρο ενεργοποίησης για Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων και των υποδοχέων θανάτου, πριν και μετά την έκθεση του CICs σε παράγοντες χημειοθεραπείας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, όλα αυτά τα μόρια εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε CICs, αν και η έκφραση κυμαίνονταν σταθερά μεταξύ διαφορετικών γραμμών CIC? Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε όλες τις ελεγχόμενες γραμμές CIC για το HLA τάξης Ι, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /Β και η έκφραση ULPBP1-4 πριν και μετά την έκθεση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες.

RT- PCR της έκφρασης του mRNA που κωδικοποιεί για διαφορετικά μόρια επιφάνειας σε CICs κόλον σε επεξεργασία με ή χωρίς είτε 5-FU (25 μg /ml) ή DXR (0.25 μΜ) για 48 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές ± SD από 4 ξεχωριστά πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν με σφαίρες καρκίνου του παχέος εντέρου από 5 διαφορετικούς ασθενείς (CIC # 1 έως # CIC 5).

Η

Η έκφραση του Fas (CD95), ΤΝΡ-α R1, DR4 (TRAIL-R1) και DR5 (TRAIL-R2) υποδοχέων θανάτου αυξήθηκε στην πλειονότητα των γραμμών CIC μετά από έκθεση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (Σχήμα 3), αλλά αυξημένη έκφραση του Fas, TNF-R1 και DR4 δεν πέτυχαν στατιστική σημασία. Το μεγαλύτερο και σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε μόνο για έκφραση DR5 μετά την έκθεση του CICs σε 5-FU και, αν και σε μικρότερο βαθμό, DXR (Σχήμα 3). Προς τα πάνω ρύθμιση DR5 ακόλουθες 48 ώρες έκθεσης των CICs κόλον σε χημειοθεραπεία επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ειδικό mAb (Σχήμα 4).

CICs Colon υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο, ​​5-FU (25 μg /ml) ή DXR (0.25 μΜ) για 48 ώρες, πλύθηκαν εκτεταμένα και χρωματίστηκαν με αντι-DR5 mAb. Η κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα δείχνουν DR5. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) για χρώση DR5 υποδεικνύεται στην επάνω δεξιά γωνία του κάθε πάνελ. Διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν mAb έλεγχο ισοτόπου, ενώ γκρι συμπληρώθηκε ιστόγραμμα αντιπροσωπεύουν αντι-DR5 mAb.

Η

Η δολοφονία της χημειοθεραπείας έλαβαν CICs από Vγ9Vδ2 κύτταρα Τ διαμεσολαβείται από NKG2D και TRAIL

Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα εκμεταλλεύονται διαφορετικές οδούς για θανάτωση κυττάρων όγκου που βασίζονται στην έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών και προαποπτωτική μορίων ή στην κυτταρική επαφή-εξαρτώμενη λύσης μέσω ΝΚ-όπως ή TCR αλληλεπιδράσεις που εξαρτώνται από [9]. Εκτιμήσαμε των μηχανισμών που ευθύνονται για τη δολοφονία της χημειοθεραπείας-ευαισθητοποιημένων CICs από Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, από μεμονωμένα κλείδωμα TCR ή NKG2D υποδοχείς. Η κυτταροτοξικότητα της χημειοθεραπείας προεπεξεργασμένων κόλον γραμμές CIC από δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές Vγ9Vδ2 Τ ανεστάλη σημαντικά με αντι-NKG2D mAb, ενώ η Vγ9Vδ2 TCR φαίνεται να παίζει έναν δευτερεύοντα ρόλο όπως υποδεικνύεται από την αποτυχία των αντι-CD3 και αντι-τηγάνι γδ TCR mAbs να αναστέλλουν την κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 5). Επιπλέον, θανάτωση Vγ9Vδ2 Τ κυττάρου της χημειοθεραπείας-ευαισθητοποιημένων στόχων αξιολογήθηκε με την παρουσία μεβαστατίνη, η οποία αναστέλλει 3-υδροξυ-3-μεθυλγλουταρυλ-ΟοΑ και αποτρέπει ζολεδρονάτη μεσολάβηση συσσώρευσης ενδογενών phosphoantigens ως ΙΡΡ. Η μεβαστατίνη απέτυχε να αναστείλει τη θανάτωση όλων των ελεγχθέντων χημειοθεραπείας προεπεξεργασμένων κόλον γραμμές CIC από δύο διαφορετικές αλλογενή κυτταρικές γραμμές Vγ9Vδ2 Τ (Σχήμα 5), υποδεικνύοντας έτσι ότι προκαλούμενη από χημειοθεραπεία ευαισθητοποίηση των CICs να κυτταροτοξικότητα κυττάρων Vγ9Vδ2 T δεν εξαρτώνται από την παραγωγή μεταβολιτών μεβαλονικού.

Η κυτταρική γραμμή Vγ9Vδ2 Τ COLD2-1 καλλιεργήθηκε με δύο χημειοθεραπεία επεξεργασμένο CICs κόλου (CIC # 3 και 5 CIC #) σε μία αναλογία Ε: Τ του 20:01, παρουσία αντισωμάτων αποκλεισμού για ο TCR γδ, CD3, NKG2D, ή με την παρουσία μεβαστατίνη. Ειδικά επίπεδα κυτταροτοξικότητας επιτυγχάνεται με την κυτταρική γραμμή Τ Vγ9Vδ2 COLD2-1 ήταν 65 ± 11 για CIC # 3 και 71 ± 9 για CIC # 5. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD δύο πειραμάτων που διεξάγονται εις τριπλούν. Η ποσοστιαία αναστολή με αντι-NKG2D mAb ήταν σημαντικά διαφορετική από τις τιμές σε όλες τις άλλες ομάδες (* ρ & lt? 0.001).

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω οι μηχανισμοί θανάτωσης της χημειοθεραπείας-ευαισθητοποιημένων CICs του παχέος εντέρου κατά Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, θα ανέστειλε ατομικά την εξωκυπάρωσης κόκκο, TNF-α-, ρυμουλκουμένων και FasL μεσολάβηση μονοπάτια. Πειράματα Killing αναστολής αποκάλυψε ότι κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ κυττάρου της χημειοθεραπείας προεπεξεργασμένων κόλον στόχους CIC αναστάλθηκε σημαντικά με αντι-DR5 mAb, ενώ τα mAb κατά DR4, TNF-α, και FasL, ή αγωγή με CMA να μπλοκάρουν την οδό κόκκο εξωκυττάρωση, όλα απέτυχαν να αναστείλουν. Σχήμα 6 δείχνει αντιπροσωπευτικά δεδομένα με δύο κυτταρικές σειρές Vγ9Vδ2 Τ και των γραμμών δύο παχέος εντέρου CIC, η CIC # 2 και CIC ​​# 4.

Η κυτταρική σειρά Vγ9Vδ2 Τ COLD2-1 καλλιεργήθηκε με δύο χημειοθεραπεία αντιμετωπίζονται CICs παχέος εντέρου ( CIC # 3 και CIC ​​5 #) σε μία αναλογία Ε: Τ του 20:01, παρουσία αντισωμάτων αποκλεισμού σε TNF-α, FasL (CD95L), TRAIL υποδοχείς R1 (DR4) ή R2 (DR5) ή κονκαναμυκίνης A (CMA). Ειδικά επίπεδα κυτταροτοξικότητας επιτυγχάνεται με την κυτταρική γραμμή Τ Vγ9Vδ2 COLD2-1 ήταν 61 ± 7 για CIC # 3 και 65 ± 12 για CIC # 5. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD από πειράματα που διεξάγονται εις τριπλούν. Επί τοις εκατό αναστολή με αντι-DR5 και αντι-TRAIL mAbs ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις τιμές σε όλες τις άλλες ομάδες (* p & lt? 0.001).

Η

Συζήτηση

Είναι πλέον αναδύεται ότι ο καρκίνος είναι παράγεται από ένα πληθυσμό κυττάρων που εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά βλαστική ικανότητα, που ονομάζεται βλαστικά κύτταρα του καρκίνου ή του καρκίνου-κύτταρα έναρξης (CICs) [1], [2]. Αυτά τα κύτταρα, τα οποία συμβάλλουν μόνο σε μικρό κλάσμα της συνολικής μάζας του όγκου, υφίστανται μακροπρόθεσμη επέκταση με διατήρηση της ικανότητάς τους να αναπαράγει την αρχική φαινοτύπου του όγκου, παρέχοντας έτσι αποδείξεις για την αυτο-ανανέωση και την ικανότητα ογκογενή [1], [ ,,,0],2]. Ο πληθυσμός CIC είναι πιο ανθεκτικό από διαφοροποιημένα πρωτογενή κύτταρα με τα συμβατικά χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία και να υποθετική καινοτόμων θεραπειών όπως εκείνες που βασίζονται στη χρήση του TRAIL. Αυτό ανθεκτικότητα έχει αποδοθεί στο γεγονός ότι CICs εκφράζουν γονίδια ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα συμπεριλαμβανομένων των υψηλών επιπέδων των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και ABC (Binding ΑΤΡ κασέτας) μεταφορείς που αντλεί τα φάρμακα, αλλά και στο γεγονός ότι οι στόχοι χημειοθεραπεία διαιρούμενα κύτταρα και συνεπώς αποτυγχάνει να σκοτώσει την αργή ποδηλασία CICs [3] – [5].

τα δεδομένα από πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός χημειοθεραπείας με ανοσοθεραπεία έχει τα οφέλη επιβίωσης από τη χημειοθεραπεία μόνη της [6], [29], όπως περιγράφεται για παράδειγμα, με τον συνδυασμό χημειοθεραπείας και μονοκλωνικών αντισωμάτων [30] – [32]. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι χημειοθεραπευτικά φάρμακα μπορεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα όγκου σε κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από CD8, ΝΚΤ ή Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα [33] thorugh αρκετούς διαφορετικούς μηχανισμούς [34]. Ωστόσο, πρόσφατα βρέθηκε ότι οι CICs κόλον είναι ανθεκτικά στην κυτταρική κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ, εκτός αν ευαισθητοποιούνται με ζολεδρονάτη [35]: Παρομοίως, έχουμε τώρα δοκιμαστεί η πιθανότητα ότι τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί επίσης να ευαισθητοποιήσει CICs κόλον για θανάτωση Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων.

οι αρχικές δοκιμές κυτταροτοξικότητας αποκάλυψαν ότι σε αναλογία με προηγουμένως αναφερθέντα αποτελέσματα μας [27], πολλοί κόλον CIC γραμμές ήταν ανθεκτικά στην κυτταροτοξική δράση του Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, αλλά η προθεραπεία με χαμηλές, υποθανατηφόρες Οι συγκεντρώσεις των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων 5-FU και DXR ευαισθητοποιεί στόχους CIC να θανάτωση Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων, με αποτέλεσμα σε προσθετικό δραστικότητα κυτταροτοξικότητας.

Vγ9Vδ2 κύτταρα Τ αλληλεπιδρούν με και να σκοτώσουν τους στόχους όγκου thorugh αρκετούς διαφορετικούς μηχανισμούς συμπεριλαμβανομένων εξωκυττάρωση κοκκίων, υποδοχέα θανάτου /συνδετήρες αλληλεπιδράσεις με TNF, TRAIL και FasL, και ΤΟΚ ή NKG2D μεσολάβηση αναγνώριση phosphoantigens ή στρες-επαγώγιμους μόρια, αντίστοιχα. Όλες οι γραμμές που εξετάστηκαν κόλον CIC εκφράζουν συντακτικά mRNA που κωδικοποιεί για HLA-τάξης Ι, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B, ULPBP1-4, Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) και DR5 (TRAIL -R2) μόρια πάνω στην επιφάνειά τους, αλλά η έκφραση όλων αυτών των μορίων δεν καθιστά CICs ευαίσθητα σε θανάτωση Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων. Ωστόσο, η έκθεση των CICs παχέος εντέρου σε 5-FU και, αν και σε μικρότερο βαθμό DXR, αύξησε σημαντικά την έκφραση του DR5.

Αρκετές προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές στη βιβλιογραφία έχουν δείξει ότι πολλές χημειοθεραπευτικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των 5-FU και DXR , ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση DR5 σε κυτταρικές γραμμές όγκου των διακριτών ιστικής προέλευσης [36] – [42]. Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα έχει αναφερθεί σε διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα, ενώ, με τις γνώσεις μας, δεν υπάρχει καμία ένδειξη παρόμοιων αυξητική ρύθμιση DR5 σε CICs. Το αν ή όχι προκαλούμενη από χημειοθεραπεία DR5 αυξητική ρύθμιση περιορίζεται σε CICs κόλον ή είναι ένα γενικό φαινόμενο που παρατηρείται σε άλλες CICs είναι στην πραγματικότητα υπό μελέτη.

Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε ότι Vγ9Vδ2 κύτταρα Τ εκμεταλλεύονται διαφορετικούς μηχανισμούς για να σκοτώσουν τους στόχους CIC, η οποία εξαρτώνται αυστηρά από τον τρόπο του στόχου CICs ευαισθητοποίησης. Ανεξάρτητα από το αν χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ή ζολεδρονάτη χρησιμοποιήθηκαν για να ευαισθητοποιήσει CICs, Vγ9Vδ2 κύτταρα Τ θανάτωση αυτών των στόχων ήταν ΤΟΚ ή NKG2D μεσολάβηση: σύμφωνο με προηγούμενη αναφορά μας [27] χημειοθεραπεία ευαισθητοποιημένα CICs παχέος εντέρου σκοτώθηκαν μετά από NKG2D μεσολάβηση αναγνώριση και TRAIL /αλληλεπίδραση DR5, ενώ και οι δύο μηχανισμοί ήταν περιττό να την κυτταροτοξικότητα της ζολεδρονάτη-ευαισθητοποιημένων CICs του παχέος εντέρου, που έχασαν τη ζωή τους σχεδόν αποκλειστικά από ΤΟΚ-μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης και της οδού περφορίνης /γράνζυμο.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναδείξει τη σημασία της NKG2D -MICA /B αλληλεπιδράσεις για την αναγνώριση των κυττάρων του όγκου και την αποτελεσματική κυτταροτοξική δραστικότητα από Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα [35] – [44]. Η διαφορά μεταξύ NKG2D μεσολάβηση αναγνώριση της χημειοθεραπείας ευαισθητοποιημένων CICs κόλον και TCR-μεσολαβούμενη αναγνώριση των ζολεδρονάτη ευαισθητοποιημένων στόχοι CIC ​​δεν μπορεί να εξηγηθεί διαφορική έκφραση του MICA /Β ή ULBPs αφού ούτε 5-FU ούτε DXR αλλάξει συστατική επίπεδα έκφρασης αυτών των μορίων. Είναι πιθανό ότι phosphoantigens παραγωγής /έκφραση με CICs του παχέος εντέρου είναι πολύ χαμηλά, κάτω από το όριο που απαιτείται για την αποτελεσματική αναγνώριση από την αντιδραστική Vγ9Vδ2 TCR, ως εκ τούτου, στοχεύουν αναγνώριση γίνεται μόνο μέσω NKG2D: Η διαπίστωση ότι CICs του παχέος εντέρου γίνονται ευαίσθητα στην κυτταροτοξικότητα Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων κατά την έκθεση να ζολεδρονάτη [27], η οποία ενισχύει τη συσσώρευση phosphoantigen και την παραγωγή, υποστηρίζει αυτή τη δυνατότητα.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

in vivo

ενεργοποίηση των Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων ή επίκτητη μεταφορά του

ex vivo

ενεργοποιημένα Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, μαζί με ή σύντομα μετά την χορήγηση ορισμένων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων μπορεί να αυξήσει σημαντικά αποτελέσματα κατά του όγκου τους. έτσι Πρόσθετες κλινικές μελέτες που απαιτούνται για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της παρούσας combinatory θεραπείας, πιθανώς συμπεριλαμβανομένης της ανοσοθεραπευτική προσέγγιση νέα γδ Τ κυττάρων που βασίζεται

ex-vivo

επέκταση πολυκλωνικών γδ Τ κυττάρων που ακολουθείται από εισαγωγή ενός CD19-ειδικό χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου καθιστούν διπλής ειδικότητας και πιο αποτελεσματική στη δολοφονία του CD19

+ κυτταρικές σειρές όγκων

in vitro

και σε ξενομοσχεύματα [45].

Υλικά και Μέθοδοι

περιφερική δείγματα αίματος και του καρκίνου του παχέος εντέρου

ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) και ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου ελήφθησαν σύμφωνα με τα δεοντολογικά πρότυπα της θεσμικής επιτροπής του ανθρώπινου πειραματισμού από ασθενείς που υποβάλλονται σε εκτομή του παχέος εντέρου για αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Η ιστολογική διάγνωση βασίστηκε σε μικροσκοπικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων καθορισμό του ιστολογικού τύπου και βαθμού. PBMC απομονώθηκαν από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας χρησιμοποιώντας Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) και κρυοσυντηρήθηκαν σε 80% RPMI 1640 (Life Technologies, Μόντσα, Ιταλία), 10% DMSO (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και 10% αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Life Technologies).

Σύμφωνα με την ιταλική νομοθεσία (άρθρο 13 του νομοθετικού διατάγματος αριθ. 196/03), η μελέτη αυτή δεν απαιτείται άδεια από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές της διακήρυξης του Ελσίνκι και όλα τα άτομα έδωσαν έγγραφη συγκατάθεση συμμετοχής.

Καθαρισμός και Πολιτισμού CICs

καρκινικούς ιστούς πλύθηκαν εκτενώς σε αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει αντιβιοτικά και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε DMEM /F12 (Life Technologies) που περιέχει πενικιλλίνη (500 IU /ml), στρεπτομυκίνη (500 μg /ml) και αμφοτερικίνη Β (1,25 μg /ml) (Life Technologies). Η ενζυματική πέψη διεξήχθη χρησιμοποιώντας κολλαγενάση (Life Technologies, 1,5 mg /ml) και υαλουρονιδάση (Sigma, 20 μg /ml) σε ϋΜΕΜ που περιέχει αντιβιοτικά /αντιμυκητιασικά για 1 ώρα. Τα ανακτημένα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό (DMEM /F12) συμπληρωμένο με 6 mg /ml γλυκόζη, 1 mg /ml NaHCO3, 5 mM HEPES, 2 mM L-γλουταμίνη, 4 μg /ml ηπαρίνη, 4 mg /ml BSA , 10 ng /ml βΡΟΡ, 20 ng /ml EGF, 100 μg /ml apotrasferrin, 25 μg /ml ινσουλίνη, 9,6 μg /ml putrescin, 30 ηΜ σεληνικό νάτριο άνυδρο και 20 ηΜ προγεστερόνη (Sigma) σε μία τελική συγκέντρωση του 3 × 10

5 κύτταρα /ml. Αυτές οι συνθήκες καλλιέργειας επιλογή για τα ανώριμα κύτταρα όγκου που πολλαπλασιάζονται αργά, προκαλώντας, μέσα σε 2-3 μήνες, σε συσσωματώματα κυττάρου όγκου, που ονομάζεται «σφαίρες». κύτταρα σχηματισμού σφαίρας μπορεί να διαδοθεί με ενζυματική διάσπαση των σφαιρών (3 mM EDTA, 50 ηΜ DTT σε PBS), που ακολουθείται από επανα-επιμετάλλωση των απλών κυττάρων και των υπολειμματικών μικρά συσσωματώματα κυττάρων σε φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό [28], [46] , [47].

ογκογονικότητα αξιολογήθηκε με υποδόρια εμφύτευση είτε αναλυτικών κυττάρων σφαίρα καρκίνο του παχέος εντέρου ή διαφοροποιημένα κύτταρα που προέρχονται σφαίρα-[27]. Διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα γραμμές DLD-1, SW620 και SW403 (American Type Culture Collection) ελήφθησαν από τον Dr. Ruggero Ντε Μαρία ( «Regina Elena» National Cancer Institute, Ρώμη, Ιταλία) και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει αντιβιοτικά και 10% FCS . Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διεξήχθησαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα.

Αντι-όγκου Agents, αντισώματα και αντιδραστήρια

Ο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες 5-fluorourcil (5 -FU) και δοξορουβικίνη (DXR) ελήφθησαν από την Sigma, μέσω του φαρμακείου του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου. Φάρμακα διαλύθηκαν σε DMSO και αραιώθηκαν στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις σε PBS πριν από τη χρήση

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα μη συζευγμένο, FITC-, ΡΕ-, ΡΕ-Cy5- ή APC-συζευγμένη μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs):. Anti -TCR Vδ2 (Β6, BD Biosciences, San Jose, CA), αντι-NKG2D (1D11, eBioscience, San Diego, CA), αντι-CD95L (2C101, Vinci Biochem, Firenze, Ιταλία), αντι-MICA /Β (6D4 , BD Biosciences)

Επιπλέον, τα ακόλουθα καθαρισμένα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν επίσης:. αντι-CD3 (κλείδωμα, ΜΕΜ-57), αντι-HLA Τάξης I μονομορφικής (ΜΕΜ-147) από τον καθηγητή Vaclav Horejsi (Ινστιτούτο Μοριακής Γενετικής, Πράγα, Δημοκρατία της Τσεχίας), αντι-ΤΟΚ τηγάνι γδ (IMMU510, δώρο του Dr. Marc Bonneville, Institut de Biologie, Nantes, Γαλλία), αντι-TNF-α (ινφλιξιμάμπη, ένα δώρο από τον καθηγητή Τζιοβάνι triolo , Dipartimento Biomedico di Medicina Interna e specialistica, Università di Palermo, Παλέρμο, Ιταλία), υποδοχέων αντι-TRAIL TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (LIT, DcR1) και TRAIL-R4 (TRUNDD , DcR2) όλα παρέχονται από το Δρ Henning Walczak (Tumor Ανοσολογίας Μονάδα, Τμήμα Ιατρικής, Imperial College, London, UK).

κονκαναμυκίνης Α (CMA) και η μεβαστατίνη αγοράσθηκαν από την Sigma, ενώ ζολεδρονάτη ήταν από τη Novartis Pharma, Βασιλεία, Ελβετία.

δημιουργία πολυκλωνικών Vγ9Vδ2 Τ κυτταρικών γραμμών

κυτταρικές γραμμές Πολυκλωνικά Vγ9Vδ2 Τ παρήχθησαν με πρώτη εμπλουτισμό PBMC χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης κυττάρων γδ Τ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία), που ακολουθείται από τη διαλογή και μόνο Vγ9Vδ2 Τ κυττάρων μέσω ενός FACSAria (BD Biosciences) με συγκεκριμένα mAbs. Τα κύτταρα (2 χ 10

3) στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κάθε τρυβλίο με στρογγυλό πυθμένα, πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν 2 χ 10

4 ακτινοβολημένα (40 Gy) αλλογενές PBMC, 2 × 10

3 ακτινοβολημένα ( 70 Gy) EBV-μετασχηματισμένα αλλογενή κύτταρα Β, 0,5 μg /ml ΡΗΑ (Sigma), και 200 ​​U /ml ανασυνδυασμένης ιντερλευκίνης 2 (Proleukin, Novartis Pharma). Καλλιέργεια γραμμές επεκτάθηκαν σε 200 U /ml IL-2 και επαναδιεγέρθηκαν κάθε 2 εβδομάδες. Συνήθως, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 4-6 εβδομάδες καλλιέργειας που θα χρησιμοποιηθεί για λειτουργικές δοκιμασίες

in vitro

.

Τα κυτταροτοξικά Δοκιμασία

Στόχος του παχέος εντέρου CIC (10

5 cellsml) προ-θεραπεία με 5-FU (2,5 έως 250 μg /ml), DXR (0,025 έως 2,5 μΜ) ή ζολεδρονικό (0,5 μΜ) για 24, 48 ή 72 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν εκτεταμένα σε PBS και χρωματίστηκαν με CFSE (Merck, Μιλάνο, Ιταλία), ως εξής: 50 μΙ CFSE προστέθηκαν σε 1 ml του στοχοκυττάρου σφαίρα εναιώρημα (5 × 10

5 κύτταρα /ml) σε PBS για να ληφθεί η τελική συγκέντρωση 2,5 μΜ CFSE. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37 ° C και αναμίχθηκε ήπια κάθε 5 λεπτά. Στο τέλος της επώασης, 1 ml FBS προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα για να σταματήσει η αντίδραση χρώσης και τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 600 g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε μέσο απαλλαγμένο από ορό.

κυτταρικές γραμμές Vγ9Vδ2 Τ επανααιωρήθηκαν σε τελικές συγκεντρώσεις 10

6 και 2,5 χ 10

6 κύτταρα /ml, προστέθηκαν σε CFSE-βάφονται CICs κόλον στόχο (1 × 10

5 ) και συν-καλλιέργειες διατηρήθηκαν για 6 ώρες 37 ° C παρουσία 5% του CO

2. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με 20 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, Sigma, 1 μg /ml) επί 10-15 λεπτά σε πάγο. Τέλος, 100 μλ κρύο PBS προστέθηκαν πριν την εξαγορά σε ένα FACSCalibur κυτταρομετρητή (BD Biosciences). Ο υπολογισμός της κυτταρολυτικής δραστικότητας έγινε με βάση τον βαθμό της μείωσης των βιώσιμων κυττάρων στόχων με την ικανότητα να διατηρούν CFSE και εξαιρούν ΡΙ (CFSE

υψηλή ΡΙ

-), σύμφωνα με αναφορά [27]

παράγοντες αποκλεισμού χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των μηχανισμών Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα κυτταροτοξικότητα του CICs παχέος εντέρου. Για να αξιολογηθεί η συνεισφορά του μεβαλονικού μεταβολίτες κυττάρων στόχων όγκου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεβαστατίνη (25 μΜ για 2 ώρες) ενός επιλεκτικού αναστολέα ανάντη της οδού μεβαλονικού. Μετά από αυτή την περίοδο επώασης, τα κύτταρα στόχοι πλένονται, και Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα προστίθενται σε παρουσία 25 μΜ μεβαστατίνη, για να διατηρηθεί μια σταθερή συγκέντρωση του φαρμάκου αυτού κατά την διάρκεια της επώασης διότι η επίδρασή της είναι ταχέως αναστρέψιμη [27]. Για να ανασταλεί περφορίνης διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα, Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα επωάστηκαν με κονκαναμυκίνη Α (CMA, 15 ηΜ) για 30 λεπτά στους 37 ° C πριν συγκαλλιέργεια με CICs στόχο, χωρίς περαιτέρω πλύσιμο [27]. Για να εμποδίσει τις σχετικές κυτταροτοξικών μονοπάτια, ειδικές ή ισότυπου ελέγχου mAbs χρησιμοποιήθηκαν σε 10 μg /ml τελική συγκέντρωση λίγο πριν δοκιμασία συν-επώαση [27].

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR