Αφηρημένο

Οι μικροσωληνίσκοι είναι ένα εξαιρετικά επικυρωθεί στόχος στη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, η κλινική ανάπτυξη παράγοντες σύνδεσης τουμπουλίνης (ΤΒΑ) έχει παρεμποδιστεί από προβλήματα τοξικότητας και χημειοαντίσταση και κατέστησε αναγκαία την αναζήτηση νέων TBAs. Εδώ, αναφέρουμε την ταυτοποίηση ενός διαπερατό, τουμπουλίνης αποσταθεροποιώντας μόριο νέες κυτταρικές – 4,5,6,7-τετραϋδρο-1Η-ινδαζολο-3-καρβοξυλικό οξύ [1ρ-τολυλ-μεθ- (Ε) -υλιδενο] -υδραζίδιο (όπως ονομάζεται Suprafenacine, SRF). SRF, που προσδιορίζονται από

in silico

διαλογή σχολιασμένα χημικών βιβλιοθηκών, δείχθηκε ότι δεσμεύεται με μικροσωληνίσκους στη θέση κολχικίνη πρόσδεσης και αναστέλλουν τον πολυμερισμό. Αυτό οδήγησε σε G

2 κυττάρων /M διακοπή κύκλου και κυτταρικό θάνατο μέσω ενός αποπτωτικό μονοπάτι μιτοχόνδρια μεσολάβηση. Ο κυτταρικός θάνατος προηγήθηκε απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, JNK – μεσολάβηση φωσφορυλίωση της Bcl-2 και Bad, και ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Περιέργως, SRF βρέθηκε να αναστέλλουν εκλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και ήταν αποτελεσματικό έναντι των ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικών κυττάρων χάρη στην ικανότητά του να παρακάμψει το πολυφαρμακευτική αντίσταση μεταφορέα Ρ-γλυκοπρωτεΐνη. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι SRF έχει δυνατότητες ως χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου και παρέχει μια εναλλακτική σκαλωσιά για την ανάπτυξη βελτιωμένων αντικαρκινικών παραγόντων

Παράθεση:. Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng L, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, ένα ινδαζόλιο-υδραζιδίου Agent, Πολεμά τον Καρκίνο κυττάρων μέσω μικροσωληνίσκων αποσταθεροποίηση. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10.1371 /journal.pone.0110955

Επιμέλεια: Ben CB. Ko, Το Χονγκ Κονγκ Πολυτεχνείο, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10 του Οκτώβρη 2012? Αποδεκτές: 26 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Υγείας της Σιγκαπούρης Grant NMRC1177 /2008. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροσωληνίσκοι – μακρά, νηματοειδή, σε σχήμα σωλήνα πολυμερή – μεσολαβούν σημαντικούς ρόλους στην κυτταρική σηματοδότηση, μεταφορά φορτίων, τη δημιουργία κυτταρικών πολικότητας, διατήρηση του σχήματος κυττάρου, κυτταρική μετανάστευση και την κυτταρική διαίρεση [1], [2]. Που αποτελείται από α- και β-τουμπουλίνης ετεροδιμερή δεσμεύονται σε ένα head-to-ουρά τρόπο, μικροσωληνίσκων δεν είναι απλά πολυμερή ισορροπίας? αντί να είναι ιδιαίτερα δυναμικές δομές και οι ραγδαίες δυναμική συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση είναι ζωτικής σημασίας, σε μεγάλο βαθμό για τις κυτταρικές λειτουργίες τους. Δεν αποτελεί έκπληξη, τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων υπόκειται σε αυστηρό χωρική και χρονική ρύθμιση και αυτό επιτυγχάνεται σε διάφορα επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων (1) μεταγραφή διαφορετικών ισοτόπων τουμπουλίνης που έχουν διαφορετικές λειτουργίες? (2) ρυθμίζοντας α /β – τουμπουλίνης αναλογίες και ετεροδιμερούς αναδίπλωσης (3), μέσω διαφόρων μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της τουμπουλίνης, που με τη σειρά της, μεταβάλλει μικροσωληνίσκων εντοπισμός ή /και την αλληλεπίδρασή του με τα μονοπάτια σηματοδότησης και (4) μέσω αλληλεπίδρασης με microtubule- συνδεδεμένες πρωτεΐνες (χάρτες), όπως δυνεΐνης και κινεσίνη πρωτεΐνες κινητήρα, stathmin, TOG, EB1, dynactin 1, RAC1 κλπ [3] – [5]. Παραδόξως, η ίδια δυναμική φύση των μικροσωληνίσκων καθιστά επίσης εξαιρετικά ευαίσθητος στους αναστολείς. Διαταράσσοντας το λεπτότατα συντονισμένο συμπεριφορά των μικροσωληνίσκων, τα ναρκωτικά σύνδεσης τουμπουλίνης παρεμβαίνει στην διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης και έχουν αποδειχθεί να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική σε ασθενείς με καρκίνο [6].

Τα περισσότερα από τα φάρμακα που δεσμεύουν μικροσωληνίσκους ταυτοποιηθεί μέχρι τώρα έχουν απομονωθεί είτε από φυτά ή θαλάσσιων οργανισμών κατά τη διάρκεια οθόνες μεγάλης κλίμακας των φυσικών προϊόντων. Οι μικροσωληνίσκων στοχευμένες αντι-μιτωτική φάρμακα συνήθως κατατάσσονται σε δύο ομάδες – μικροσωληνίσκων αποσταθεροποιητικών παραγόντων, όπως αλκαλοειδή της βίνκα, κολχικίνη και παράγοντες σταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων όπως η πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη. Αν και οι ταξάνες και τα αλκαλοειδή της βίνκα εξακολουθούν χορηγούνται για ένα ευρύ φάσμα των καρκίνων και συχνά ενσωματώνονται σχήματα χημειοθεραπείας συνδυασμού [7], [8], η τρέχουσα σουίτα φαρμάκων σύνδεσης τουμπουλίνης έχει αρκετά μειονεκτήματα. Σε σύγκριση με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, φάρμακα που δεσμεύουν μικροσωληνίσκους είναι δομικά πολύπλοκη, χημικά διαφορετικές και έχουν χαμηλή διαλυτότητα. Περαιτέρω, οι δραστικές φάρμακα συμβαίνουν σε ελάχιστες μόνο ποσότητες στην φύση και η σπανιότητα των φυσικών τους πηγών έχει παρεμποδιστεί σοβαρά την κλινική ανάπτυξή τους. Αν και το θέμα αυτό αντιμετωπίστηκε με την ανάπτυξη της μερικής ή ολικής μεθόδους σύνθεσης [9] και μέσω μεταβολικής μηχανικής των ενδιάμεσων μονοπατιού [10], το πρόβλημα εξακολουθεί να υφίσταται όπου η ανάπτυξη νέων ενώσεων που δεσμεύουν μικροσωληνίσκους ανησυχούν. Ένα άλλο μειονέκτημα είναι η αντίσταση του φαρμάκου που προκαλείται από μεταλλάξεις ή /και έκφραση των διαφορετικών ισοτύπων τουμπουλίνης σαν βIII-τουμπουλίνης. Η αντοχή στα φάρμακα μπορεί επίσης να προέλθει από την υπερέκφραση των αντλιών εκροής φαρμάκου, συμπεριλαμβανομένης της αντοχής σε πολλαπλότητα φαρμάκων μεταφορέα Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) ή πολυφαρμακευτική αντίσταση που σχετίζεται πρωτεΐνη (MRP) [11]. Ασθενείς που χορηγούνται με παράγοντες μικροσωληνίσκων πρόσδεσης τείνουν να υποφέρουν από περιφερική νευροπάθεια νευραξόνων που περιορίζει την ανεκτής δόσης [12]. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, διάφορα αντι-μιτωτική φάρμακα με διαφορετικές θέσεις σύνδεσης επί της τουμπουλίνης βρίσκονται σε διάφορα στάδια κλινικής ανάπτυξης. Το οπλοστάσιο παραγόντων μικροσωληνίσκων στόχευσης με βελτιωμένες φαρμακοδυναμικές και φαρμακοκινητικές προφίλ, ελάχιστη νευρολογική τοξικότητα και ευρεία αποτελεσματικότητα φάσματος, συνεχίζει να αυξάνεται [13] – [15]. Στην ιδανική περίπτωση, όπως καλώδια θα πρέπει επίσης να στερείται της P-gp-μεσολάβηση αποβολής του φαρμάκου και να υπόκειται σε εύκολες προσεγγίσεις χημική σύνθεση.

Στην εργασία αυτή αναφέρουμε μια νέα ένωση με βάση το ινδαζόλη ικρίωμα, 4,5,6 , 7-τετραϋδρο-1Η-ινδαζολο-3-καρβοξυλικό οξύ [1ρ-τολυλ-μεθ- (Ε) -υλιδενο] -υδραζίδιο (Suprafenacine ή SRF), που δείχνει ισχυρές αντικαρκινικές ιδιότητες. Συζητάμε την ταυτοποίηση του SRF χρησιμοποιώντας το

in silico

προσέγγιση διαλογής υψηλής απόδοσης, χημικών βελτιστοποίηση και αποσαφήνιση του τρόπου δέσμευσης του μικροσωληνίσκων της. SRF αποσταθεροποιεί μικροσωληνίσκων που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 /M και κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. Επιπλέον, δείχνουμε ότι SRF μπορεί να παρακάμψει την P-γλυκοπρωτεΐνη μεταφορέα, στοχεύει ειδικά τα καρκινικά κύτταρα και είναι αποτελεσματικό κατά πολλών διαφορετικών τύπων καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντισώματα

Νοκοδαζόλη, πακλιταξέλη (ταξόλη), βινμπλαστίνη, κολχικίνη και αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). SRF αγοράστηκε από ChemDiv ενώ SB203580, PD98059 και SP600125 ήταν από την Calbiochem (San Diego, CA). Αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες εταιρείες: βιμεντίνη, α- και β-τουμπουλίνης, JNK-1, MDR-1, Bcl-2, pBcl-2 (T56), pBcl-2 (S70), pBcl-2 (S87) ( Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)? ρρ38, pERK1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Ντένβερ, ΜΑ)? μονοκλωνικό αντι Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (MDR) (Sigma, USA) και μονοκλωνικά αντισώματα ακτίνης ήταν από BD Pharmingen (San Diego, CA). [

3Η] βινβλαστίνη (ειδική δραστικότητα, 11,6 Ci /mmol) και πυριτικού υτρίου δοκιμασία γειτονίας σπινθηρισμού επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (SPA) σφαιρίδια αγοράστηκαν από την GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). [

3Η] κολχικίνη (συγκεκριμένη δραστηριότητα, 80.4 Ci /mmol) ελήφθη από την PerkinElmer (Boston, MA, USA).

Cell Culture

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa, MDA -ΜΒ-231, Α549, HCT15, Jurkat, PC12 και SH-SY5Y) και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (CCL-116 και WI-38) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). SNU 16, ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου κυτταρική γραμμή, ελήφθη από την κορεατική Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (KCLB, Σεούλ, Κορέα). Η ανθρώπινη επιθηλιακά F10 πρωτογενή κυτταρική γραμμή, και η γονική κυτταρική σειρά για τα μεταλλαγμένα ανθεκτικά στα φάρμακα, ΚΒ-3-1 και πολυανθεκτική γραμμή, ΚΒ-V1 ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από τον Δρ Peter Droge (NTU, Σιγκαπούρη) και Dr. Μ Gottesman (NCI, Bethesda, MD), αντίστοιχα [16]. Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε είτε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ή RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θαλάμου. Για ΚΒ-3-1 και ΚΒ-1V, το μέσο συμπληρώθηκε με επιπλέον 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 10 μg /mL βινβλαστίνη, αντίστοιχα. Όλες οι ανθεκτικές γραμμές επωάστηκαν σε ναρκωτικά ελεύθερα μέσα ενημέρωσης πριν από την κυτταρική δοκιμασίες πολλαπλασιασμού.

κυτταρικού κύκλου Ανάλυση

εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου παρακολουθήθηκε με τη χρήση DNA κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα περίπου 2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 24 φρεατίων. Όταν μονοστοιβάδες ήταν 50-70% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φάρμακα όπως υποδεικνύεται. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 80% αιθανόλη για 1 ώρα στους -20 ° C. Τα σταθερά κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση ρυθμιστικό (10 mM Tris-HCl ρΗ 8.0, 10 mM NaCl, 50 μg /mL ΡΙ, 10 μg /L RNase Α, 0,1% ΝΡ-40) για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Το περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε σε ένα σύστημα FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Για κάθε ανάλυση, 10.000 κύτταρα μετρήθηκαν και το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT.

Η απόπτωση Δοκιμασίες

Η απόπτωση παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλό χρώση μέθοδο. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης αννεξίνης V-FLOUS (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) χρησιμοποιώντας το nm μπλε λέιζερ 488 για διέγερση και 505LP καθρέφτη-530/30 BP φίλτρο και 550LP καθρέφτη-575/26 συνδυασμούς φίλτρο BP για την ανίχνευση φλουορεσκεΐνης και ΡΙ φθορισμού, αντίστοιχα. Για κάθε δείγμα, 10,000 γεγονότα συλλέχθηκαν.

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης Μετρήσεις

Οι αλλαγές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ανιχνεύθηκε με τη χρήση της μιτοχονδριακής μεμβράνης Δυναμικό κιτ ανίχνευσης (Stratagene, Cedar Creek, ΤΧ) και με βάση σχετικά με τη χρήση του κατιονικού χρωστικής, 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδιούχο (κοινώς γνωστό ως JC-1). JC-1 μορφές φθορίζοντα κόκκινα συσσωματώματα στα μιτοχόνδρια των κυττάρων, ενώ άθικτα σε αποπτωτικά κύτταρα, κατάρρευση του μιτοχονδριακού δυναμικού προκαλεί JC-1 για να παραμείνει στο κυτταρόπλασμα σε μονομερική πράσινο μορφή της. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SRF, με την παρουσία ή απουσία της JNK αναστολέα SP600125, και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν με PBS και σφαιροποιήθηκαν (400

g

, 5 λεπτά, RT). Στη συνέχεια, σφαιρίδια (1 × 10

6 κύτταρα /δείγμα) επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ 1 Χ διάλυμα χρώσης JC-1 και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Μετά από πλύσεις με 2Χ ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε τελικό όγκο 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ανιχνεύσεως. εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν σε FACSCalibur Σύστημα BD (BD Biosciences, San Jose, CA) και το λογισμικό CellQuest χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Απώλεια μιτοχονδριακής δυναμικό μετρήθηκε ως η αναλογία του φθορισμού κόκκινο-προς-πράσινο? σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, η αναλογία αυτή θα μειωθεί σε αποπτωτικά κύτταρα.

Caspase Δοκιμασία Ενεργοποίησης

Caspase-3 δραστικότητα μετρήθηκε με τη χρήση του Συστήματος CaspACE Assay (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με την πωλητή πρωτόκολλο. Εν συντομία, 2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων. Όταν μονοστοιβάδες ήταν 50-60% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SRF παρουσία ή απουσία του αναστολέα JNK, SP600125 και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σφαιρίδια πλύθηκαν με παγωμένο PBS και επαναιωρήθηκαν στο Cell Lysis Buffer. Μέθοδος ψύξης-απόψυξης χρησιμοποιήθηκε για τη λύση των κυττάρων και τα προϊόντα λύσης διατηρήθηκαν σε πάγο για 15 λεπτά. Μετά την αποσαφήνιση των προϊόντων λύσης με φυγοκέντρηση (15, 000

g

, 20 λεπτά, 4 ° C), το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό δραστικότητας κασπάσης-3. Σε μια πλάκα 96 φρεατίων, 2 μΐ (10 mM απόθεμα) Ac-DEVD-ρΝΑ υπόστρωμα προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης που περιέχει κυτταρικό λύμα, DTT, Caspase Ρυθμιστικού Δοκιμασίας και απιονισμένο νερό σε τελικό όγκο 100 μΙ. Οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 20-22 ° C για 4 ώρες και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας Benchmark Microplate Reader Plus (Bio-Rad, Hercules). Ανεπεξέργαστα εκχυλίσματα κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για τα πειράματα.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Για ανοσοϊστοχημεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% PFA που ακολουθείται από επώαση σε ένα διάλυμα αποκλεισμού (5% BSA σε PBS) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά 3Χ PBS πλύσεις, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100, πλύθηκε 3 Χ με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με α- ή β-τουμπουλίνης αντισώματα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, τα δείγματα επωάστηκαν με 488 AlexaFluor-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Molecular Probes, Eugene, Oregon) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα παρατείνει Gold αντι-fade (Molecular Probes, Eugene, Oregon) που περιέχει DAPI και οπτικοποιούνται σε 60X μεγέθυνση σε μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακού λέιζερ Zeiss LSM META510. Όλα επεξεργασία και ανάλυση εικόνας μετά την εξαγορά έγινε με τη χρήση του λογισμικού MetaMorph (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA).

In Vitro

πολυμερισμού τουμπουλίνης Δοκιμασία

πολυμερισμού τουμπουλίνης ήταν μετράται

in vitro

χρησιμοποιώντας το κιτ πολυμερισμού τουμπουλίνης Δοκιμασία (Κυτταροσκελετός, Denver, CO). Τουμπουλίνης διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα 1 (80 mM PIPES, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA ρΗ 6,9, 10 μΜ φθορίζον ανταποκριτή, 1 mM GTP) σε μια τελική συγκέντρωση 10 mg /ml. Για την ανίχνευση πολυμερισμού τουμπουλίνης, ένα μίγμα που περιέχει 85 μΐ τουμπουλίνης (τελική συγκέντρωση 2 mg /ml), 4,4 μΐ GTP (απόθεμα 100 mM), 280 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος 1 και 75 μΐ τουμπουλίνης γλυκερόλη Ρυθμιστικό (80 mM PIPES, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA, 60% γλυκερίνη, ρΗ 6.9), έγινε και διατηρείται επί πάγου. Στη συνέχεια, 5 μΐ της προς δοκιμή ένωσης, η πακλιταξέλη, νοκοδαζόλη ή ρυθμιστικό αναφοράς δειγματίστηκε σε κάθε φρεάτιο μιας μισο περιοχής 96-φρεατίων, μαύρο, με επίπεδο πυθμένα πλάκας (Corning Costar). Η πλάκα θερμάνθηκε για 1 λεπτό σε μία συσκευή ανάγνωσης 37 ° C προθερμασμένο πλάκα. Ο πολυμερισμός ξεκίνησε με σιφωνισμό 50 μΙ του μίγματος αντίδρασης /φρεάτιο και παρακολουθήθηκε με μέτρηση της μεταβολής του φθορισμού (Ε

x = 360 nm? Ε

m = 420 nm). Η μέτρηση έγινε χρησιμοποιώντας SpectraFluor Plus συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (TECAN GmbH, Αυστρία). Οι αναγνώσεις λήφθηκαν κάθε λεπτό για 1 ώρα (συνολικά 61 αναγνώσεων).

τουμπουλίνης Ανταγωνισμός-Binding Scintillation Proximity Assay

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη για δέσμευση του ανταγωνισμού προς κολχικίνη και δεσμευτικές θέσεις επί βινμπλαστίνη τουμπουλίνης και διεξάγεται σε πλάκα 96 φρεατίων. Βιοτίνη σημασμένο τουμπουλίνης (Cytoskeleton, Denver, CO) διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα G-ΡΕΜ (80 mM PIPES ρΗ 6.8, 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP και 10% γλυκερίνη) σε μία τελική συγκέντρωση του 0,8-1 mg /ml. [

3Η] κολχικίνη ή [

3Η] βινβλαστίνη (τελική συγκέντρωση 50 ηΜ και 100 mM, αντίστοιχα), 50 μΜ SRF και 1.0 μg του επισημασμένου με βιοτίνη τουμπουλίνης αναμίχθηκε σε τελικό όγκο αντίδρασης 100 μλ του G-ΡΕΜ ρυθμιστικού και επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 37 ° C. Στρεπταβιδίνη SPA σφαιρίδια (80 μg /φρεάτιο) προστέθηκε σε κάθε μείγμα αντίδρασης και επωάζεται για επιπλέον 30 λεπτά στους 4 ° C. Οι ραδιενεργές απαριθμήσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετρητή σπινθηρισμού Wallac Microbeta (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ). Για τις αντιδράσεις ελέγχου, SRF παραλείφθηκε από το μείγμα αντίδρασης.

In Vivo

Μελέτες Αποτελεσματικότητας

σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) θηλυκά ποντίκια, ηλικίας 4-6 εβδομάδων, ελήφθησαν από το Κέντρο ζώων Πόρων (Murdoch, Αυστραλία). Στα ποντίκια εμφυτεύτηκε υποδορίως στο πλευρό με 1 χ 10

7 HCT15 ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν το μέγεθος του όγκου φθάσει σε 100-200 mm

3 ή μεγαλύτερο. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) με 20 mg /kg /δόση SRF στην τελική του σύνθεση δοσολογία ή 0,9% αλατούχο όχημα. Η ένωση δόθηκε σε ποντικούς που φέρουν όγκο κατά τις ημέρες 1, 4, 7 και μετά στάσης, και μάζα του όγκου [(μήκος Χ πλάτος

2) /2] προσδιορίζονται μια φορά τρεις μέρες 9 ημέρες.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές. Όλα τα ποσοτικά στοιχεία παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν μέσω μαθητή

t

δοκιμών, και τις αξίες του

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Αναγνώριση της SRF ως ένα μυθιστόρημα τουμπουλίνης μικρό μόριο

για τον εντοπισμό νέων αντικαρκινικών μορίων που δρουν μέσω δέσμευσης τουμπουλίνης, έχουμε ξεκινήσει ένας στόχος με βάση το

in silico

διαλογή μικρών μορίων χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη ChemDiv . Οι αρχικές επιτυχίες που προσδιορίζονται από την εικονική οθόνη ελέγχθηκαν για την ικανότητά τους να αναστέλλουν τόσο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης. Από όλες τις ενώσεις που εξετάστηκαν, ένα ινδαζόλιο παράγωγο υδραζιδίου – 4,5,6,7-τετραϋδρο-1Η-ινδαζολο-3-καρβοξυλικό οξύ [1- (3-υδροξυ-4-μεθοξυ-φαινυλ) μεθ- (Ε) – υλιδενο] -υδραζίδιο, βρέθηκε να αναστέλλει ισχυρώς μικροσωληνίσκων πολυμερισμού (IC

50 = 0.77 μΜ). Για τον προσδιορισμό περαιτέρω αναλόγων με βελτιωμένες ικανότητες, Σχέσεις Δομής μελέτες δραστικότητας (SAR) διεξήχθησαν [Methods S1] και μια εστιασμένη βιβλιοθήκη του 72 αναλόγων συντέθηκε και διαλογή για την ικανότητά τους να αναστέλλουν τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων. Η προσπάθεια αυτή προσδιορίζεται το ανάλογο 4,5,6,7-τετραϋδρο-1Η-ινδαζολο-3-καρβοξυλικό οξύ [1-

ρ- τολυλ-

μεθ- (Ε) -υλιδενο] -υδραζίδιο (αναλογικό 4? εφεξής SRF), ως ένα ισχυρό μόριο (IC

50 = 0.38 μΜ) [Σχήμα 1Α].

(Α) Χημική δομή του SRF. (Β) Επίδραση του SRF σε μικροσωληνίσκων πολυμερισμού

in vitro

. Καθαρίστηκε τουμπουλίνης επωάστηκε στους 37 ° C σε απουσία (DMSO) ή παρουσία φαρμάκων, όπως ταξόλη (3 μΜ), νοκοδαζόλη (10 μΜ), SRF και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 420 nm κάθε 1 λεπτό επί μία περίοδο 60 λεπτών. SRF ανέστειλε πολυμερισμού μικροσωληνίσκων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως δεικνύεται από την μείωση της απορρόφησης με το χρόνο. (Γ) Ομοεστιακή μικρογραφήματα των κυττάρων HeLa που εκτίθενται σε SRF, ταξόλη και νοκοδαζόλη. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-τουμπουλίνης αντίσωμα. επεξεργασία SRF καταστρέφει εντελώς το περίπλοκο δίκτυο των μικροσωληνίσκων. Κλίμακα ράβδου = 10 μΜ.

Η

SRF αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων

Χρησιμοποιήσαμε ένα χρωματομετρικό προσδιορισμό για να αξιολογηθεί η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του SRF σε καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από ένα ευρύ φάσμα αντιπροσωπευτικών τύπων όγκων – αδενοκαρκίνωμα τραχήλου (HeLa, ΚΒ-3-1, ΚΒ-V1), λέμφωμα Τ-κυττάρων (Jurkat), γαστρικό καρκίνωμα (SNU-16), ο καρκίνος του μαστού (MDA-MB-231), του πνεύμονα καρκίνου (Α549), ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (HCT-15) και νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) [Πίνακας 1]. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν έδειξαν ευαισθησία σε SRF με IC

50 τιμές στο υπομικρομοριακή εύρος (83 με 381 nM). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με την ταξόλη, SRF επέδειξαν υψηλότερη δραστικότητα έναντι κυτταρικών γραμμών ΗΟΤ-15 νευροβλαστώματος SH-SY5Y και ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα. Επιπλέον, ελέγξαμε επίσης την επίδραση του SRF στα φυσιολογικά κύτταρα, όπως ινοβλάστες του δέρματος κυτταρική σειρά CCL-116 και ανθρώπινων επιθηλιακών F10 πρωτογενή κυτταρική γραμμή. Τόσο CCL-116 και F10 εμφάνισαν μεγαλύτερη από 80% επιβίωση μετά από έκθεση 24 ωρών σε SRF ενώ μόνο το 60% επιβίωση παρατηρήθηκε όταν τα ίδια κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ταξόλη υπό τις ίδιες συνθήκες [Σχήμα S1]. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν ότι SRF στοχεύει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα και είναι αποτελεσματική έναντι πολλών διαφορετικών τύπων καρκίνου.

Η

SRF μπορεί να παρακάμψει τους p-γλυκοπρωτεΐνη αποβολής του φαρμάκου

αντλία

Η κλινική επιτυχία τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου έχει παρεμποδιστεί από την ανάπτυξη της φαρμακευτικής αντίστασης. Το φαινόμενο της ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα συνδέεται συχνά με μια αύξηση στην έκφραση του

MDR1

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί την Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp), ένα ενεργειακό εξαρτώμενη αντλίας εκροής. Για να είναι κλινικά σημαντική, SRF πρέπει να είναι σε θέση να παρακάμψει το P-gp μεσολάβηση εκροής. Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται επίδραση των SRF στον πολλαπλασιασμό των επιδερμικών καρκινώματος κυτταρικής γραμμής ΚΒ-V1, ένα ανθεκτικό σε βινμπλαστίνη υπογραμμή που προέρχεται από το πατρικό ΚΒ-3-1 κύτταρα [16] [Πίνακας 2]. κύτταρα ΚΒ-V1 είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε Ρ-gp και δείχνουν διασταυρούμενη ανθεκτικότητα σε κολχικίνη και αδριαμυκίνη [Εικόνα S2]. Σύγκριση της αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση που προκαλείται από SRF και ταξόλη αποκάλυψε ότι SRF είναι 35 φορές πιο ισχυρή από ό, τι η ταξόλη έναντι κυτταρικής γραμμής ΚΒ-V1 ενώ και οι δύο ενώσεις έδειξαν παρόμοια αποτελεσματικότητα έναντι ΚΒ-3-1 κύτταρα, όπως τα κύτταρα αυτά δεν είναι γνωστό να υπερεκφράζουν Ρ-gp [17]. Η ικανότητα του SRF να παρακάμψει το P-gp πιθανώς εξηγεί γιατί είναι πιο ισχυρή από την ταξόλη στο νευροβλαστώματος SH-SY5Y και HCT-15 ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος κύτταρα ως τους δύο αυτούς τύπους καρκινικών κυττάρων εκφράζουν αυξημένα επίπεδα της Ρ-gp πρωτεΐνη [17] – [19].

η

SRF αποσταθεροποιεί την συγκρότηση των μικροσωληνίσκων με σύνδεση προς την κολχικίνη-θέση πρόσδεσης

για να αξιολογηθεί η κύριος τρόπος δράσης του SRF, έχουμε προφίλ επίδρασή του στην πολυμερισμού της τουμπουλίνης

in vitro

[Εικόνα 1Β]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SRF αναστέλλει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης σε εξαρτάται από τη συγκέντρωση τρόπο με ένα IC

50 0,38 μΜ. Επιπλέον, η μικροσωληνίσκους διαταράσσοντας επίδραση του SRF συγκρίθηκε με δύο διαφορετικούς μικροσωληνίσκων στοχευμένα φάρμακα, ταξόλη, Νοκοδαζόλη, γνωστή ως αντι-νεοπλασματικοί παράγοντες, παρεμβαίνοντας τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης. Αξιοσημείωτα, SRF επηρέασε την έναρξη του πολυμερισμού (φάση σχηματισμού πυρήνων) και του ρυθμού (φάση επιμήκυνση) του με αποτέλεσμα τη μειωμένη πολυμερές τουμπουλίνης μάζα. Επίσης μελετήσαμε την επίδραση του SRF στο συγκρότημα μικροσωληνίσκων σε κυτταρικό επίπεδο, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Τα κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε SRF για 24 ώρες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με μικροσωληνάρια α- ή β-τουμπουλίνης αντισώματα. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, τα οποία διατηρούν ένα περίπλοκο και οργανωμένο δίκτυο μικροσωληνίσκων, θεραπεία SRF προκάλεσε ολοκληρωτική καταστροφή αυτού του δικτύου κυτταροσκελετού και την εμφάνιση των άφθονη, χαρακτηριστικό σύντομες δέσμες που διανέμονται σε όλο το κυτταρόπλασμα στα κύτταρα αυτά [Εικόνα 1Γ]. Παρόμοια διάσπαση των μικροσωληνίσκων παρατηρήθηκε με νοκοδαζόλη έκθεση ενώ θεραπεία ταξόλη παράγεται μικρότερη αλλά πυκνότερο μικροσωληνίσκων συνεπής με το ρόλο του ως μικροσωληνίσκων σταθεροποιητικό παράγοντα [Σχήμα 1 C].

Ενώσεις που αναστέλλουν τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης ως επί το πλείστον συνδέονται με τη γνωστή διακριτές τοποθεσίες, δηλαδή ταξόλη, βινβλαστίνη, θέσεις orcolchicine της τουμπουλίνης. Μία δοκιμασία ανταγωνιστικής δέσμευσης εγγύτητας σπινθηρισμού (SPA) χρησιμοποιήθηκε για να probeSRF θέση σύνδεσης επί της τουμπουλίνης. SRF δεν μειώνουν ειδικές απαριθμήσεις SPA διεγείρεται με σύζευξη του επισημασμένου με βιοτίνη τουμπουλίνης με [

3Η] ταξόλη ή με [

3Η] βινβλαστίνη, αλλά έντονα ανταγωνίστηκε για δέσμευση του [

3Η] κολχικίνη με την τουμπουλίνη [Εικόνα 2Α και 2Β]. Στη συνέχεια, οι μελέτες μοριακής μοντελοποίησης και σύνδεσης έγιναν για να εξακριβώσει περαιτέρω την κατάσταση δέσμευση του SRF. Χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή του τουμπουλίνης-κολχικίνη: stathmin πεδίο που ομοιάζει (ΠΣΠ 1SA0), αμφότερα κολχικίνη [Εικόνα 2C] και SRF [Εικόνα 2D] ήταν αγκυροβολημένο στην κολχικίνη-θύλακα σύνδεσης της τουμπουλίνης. Παρά τη δομική ανομοιότητα, SRF μοιράζεται το ίδιο καρτεσιανό χώρο, όπως η κολχικίνη. Σε αντίθεση με κολχικίνη, SRF στερείται αλληλεπιδράσεις δεσμού υδρογόνου με Cys241 της β-αλυσίδας. Αντ ‘αυτού, η ινδαζόλη δακτύλιος του SRF σχηματίζει αλληλεπίδραση δεσμού υδρογόνου με Asn349, Lys352 της β-αλυσίδας, καθώς και Val181 και Thr179 της α-αλυσίδας ενώ ο 4-μεθυλο ομάδα των απομακρυσμένων μορφών δακτύλιος φαινυλίου υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με β-αλυσίδα Lys 254. στο σύνολό τους, οι μελέτες σύνδεσης αποκαλύπτουν ότι αν SRF και κολχικίνη συνδέονται με ίδια θέση επί της τουμπουλίνης, SRF έχει μια δεσμευτική κατάσταση ελαφρώς διαφορετική από αυτή της κολχικίνης [Εικόνα 2Ε].

(Α) SRF ανταγωνίζεται με κολχικίνη για σύνδεση προς μικροσωληνάρια ως προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία γειτονίας σπινθηρισμού ανταγωνισμός πρόσδεσης (SPA). Σε σύγκριση με τον έλεγχο (κανένας ανταγωνιστής), SRF μειωμένη δέσμευση από 2,5 φορές κολχικίνη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου. (Β) SRF και βινβλαστίνη έχουν διακριτές θέσεις πρόσδεσης για τουμπουλίνης ως SRF δεν ανταγωνίζεται με βινβλαστίνη. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. (Ο-Ε) Cartoon αναπαράσταση του τρόπου κολχικίνης (C) και SRF (D) σύνδεση σε τουμπουλίνη. Ο τρόπος δέσμευσης των φαρμάκων σε τουμπουλίνης εξετάστηκε από μελέτες σύνδεσης χρησιμοποιώντας GOLD μοριακού πρόγραμμα σύνδεσης (Γενετική Βελτιστοποίηση για Ligand σύνδεσης, Cambridge Κρυσταλλογραφικής Κέντρο Δεδομένων, Ηνωμένο Βασίλειο) [Μέθοδοι S1]. Οι ενώσεις (κολχικίνη ή SRF) έχουν ελλιμενίζεται στο κολχικίνη-θύλακα σύνδεσης της τουμπουλίνης χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή της τουμπουλίνης-κολχικίνη: stathmin πεδίο που ομοιάζει [κωδικός ΠΣΠ: 1SA0]. Οι αλληλεπιδράσεις Η-δεσμό μεταξύ του δακτυλίου του ινδαζολίου SRF και N349 και K352 της β-αλυσίδας (πράσινο), καθώς και την T179 και V181 της α-αλυσίδας (μπλε) επισημαίνονται. Πίνακας Ε δείχνει επικάλυψη του SRF και κολχικίνη τονίζοντας τη διαφορά στη σύνδεση πρότυπα αυτών των μορίων.

Η

συλλήψεις SRF κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση

Δεδομένου ότι η δυναμική των μικροσωληνίσκων έχει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του κύκλου των κυττάρων, μιτωτική στάβλο μπορεί να οδηγήσει σε διάφορους χημειοθεραπευτικούς εκβάσεις συμπεριλαμβανομένων μιτωτικό θάνατο, μιτωτική έξοδο, απόπτωση ή ανευπλοειδίας [11], [20]. Για τη μελέτη της επίδρασης SRF για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του SRF για 24 ώρες και του κυτταρικού κύκλου παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής. θεραπεία SRF προκάλεσε μια πλήρη κατάρρευση όλων των κυττάρων στο G

1 φάσης σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και δραματική αύξηση του G

2 /M πληθυσμός των κυττάρων που κατεργάστηκαν με 10 μΜ του SRF [Σχήμα 3Α και Εικόνα S3]. Παρόμοιες επιδράσεις επί των μικροσωληνίσκων παρατηρήθηκε με νοκοδαζόλη και ταξόλη. σύλληψη κυτταρικού κύκλου συνοδεύτηκε από την αποτυχία της μιτωτικής ατράκτου να διαχωρίσουν σε ταχέως διαιρούμενα κύτταρα [Σχέδιο 3Β]. Ωστόσο, καμία σημαντική αύξηση του G

2 /M φάση παρατηρήθηκε σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (CCL-116, WI-38 και F10) κατά την αγωγή SRF [σχήμα S4]. Από τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου προκαλεί πάντα την απόπτωση, πραγματοποιήσαμε αννεξίνη V-PI διπλή χρώση στα κύτταρα του SRF-επεξεργασία, ώστε να παρακολουθεί την έκθεση φωσφατιδυλσερίνης, ένα σήμα για την πρώιμη απόπτωση. Μετά από μια σύντομη έκθεση 7 h, ο πληθυσμός των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+ /ΡΙ

-) αυξήθηκε δραματικά από 2,4% έως 21,7% [Εικόνα 3C], υποδεικνύοντας έτσι ότι SRF προκαλεί ταχεία απόπτωση στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα .

(Α) ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA των κυττάρων σε επεξεργασία με SRF (10 μΜ), νοκοδαζόλη ή ταξόλη. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα ενός παραμέτρων των επεξεργασμένων κυττάρων. Όπως ταξόλη και νοκοδαζόλη, SRF-μεσολάβηση αναστολή της δυναμικής μικροσωληνίσκων είχε ως αποτέλεσμα τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου στο G

2 /M φάση μετάβασης. (Β) μικρογραφίες φθορισμού των μιτωτικών κυττάρων που είχαν προ-αγωγή με τις δεικνυόμενες ενώσεις. Σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα όχημα, SRF και άλλες σχηματισμό TBAs ανέστειλε και το διαχωρισμό της μιτωτικής ατράκτου. Οι μικροσωληνίσκοι (πράσινο) βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-τουμπουλίνης αντίσωμα? πυρήνα (μπλε) βάφτηκε με DAPI. Εικόνες αποκτήθηκαν σε 60X μεγέθυνση. Κλίμακα bar = 5 μΜ. (C) SRF-θεραπεία επάγει ταχεία απόπτωση σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Μετά από μια σύντομη 7 hr SRF έκθεσης (10 μΜ), αποπτωτικά εξέλιξη παρακολουθήθηκε με διπλό χρώση κυττάρων με Αννεξίνη V-FITC (FL-1) /ΡΙ (FL-2). Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, το ποσοστό της αννεξίνης V

+ /ΡΙ

– (υποδεικνύοντας πρώιμη απόπτωση) των κυττάρων αυξήθηκε από 2,4% (σε έλεγχο) στο 21,7%. Η κινητική αυτής της προσαύξησης είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με νοκοδαζόλη και ταξόλη. Και οι δύο αυτές ενώσεις επαγόμενη απόπτωση σε περίπου 25,4% (νοκοδαζόλη) και 33,2% (ταξόλη) των κυττάρων εντός αυτής της χρονικής περιόδου. Τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν (n = 3) και ο μέσος όρος της αξίας των δεδομένων.

Η

SRF επάγει την απόπτωση μέσω JNK μεσολάβηση φωσφορυλίωση της Bcl-2 και Bad

The Bcl- 2 οικογένεια των πρωτο-ογκογονιδίων είναι master ρυθμιστές της απόπτωσης και λειτουργούν ως μοριακή ροοστατών να ελέγχουν την κυτταρική επιβίωση [21]. Από αντι-μιτωτικές φάρμακα όπως η πακλιταξέλη, βινκριστίνη, βινμπλαστίνη, επάγουν Bcl-2 υπερφωσφορυλίωση της περιοχής βρόχου [22] – [26], διερευνήσαμε την επίδραση της SRF επί Bcl-2. Εκχυλίσματα από κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 10 μΜ SRF για 24 ώρες αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ΒοΙ-2. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μαζί με μια Bcl-2, SRF-κατεργασμένα κύτταρα έχουν επιπλέον ζώνη (ες) που έχει βραδύτερο ρυθμό μετανάστευσης σε σύγκριση με Bcl-2 [Σχήμα 4Α, άνω πάνελ]. Σε αντίθεση με τα κύτταρα HeLa, τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα έλειπε εντελώς το επιπλέον ταινία. Ομοίως, η κατάσταση φωσφορυλίωσης του Bcl-2 στην κανονική διπλοειδή πνεύμονα κυτταρική σειρά ινοβλαστών WI-38 παρέμεινε αμετάβλητη ακόμη και μετά από τη θεραπεία 24 ώρες SRF [Εικόνα 4Α, Μέση Panel]. Για να επιβεβαιωθεί ότι η ζώνη (ες) είναι πράγματι φωσφορυλιωμένες μορφές του Bcl-2, στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με φωσφο Bcl-2-ειδικών αντισωμάτων. SRF επαγόμενη τη φωσφορυλίωση της Bcl-2 σε πολλαπλά υπολείμματα (T56, S70 και S87), όλα εκ των οποίων βρίσκονται εντός ενός εύκαμπτου περιοχή βρόγχου [Σχήμα 4Β]. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις επαναλαμβάνουν περαιτέρω το γεγονός ότι SRF επιλεκτική στόχους καρκινικά κύτταρα. Εκτός από την Bcl-2, ένα 24 ώρες έκθεσης σε θεραπεία SRF επάγεται επίσης την φωσφορυλίωση του προ-αποπτωτικών Bcl-2 μέλος της οικογένειας – Bad [Εικόνα 4C] ενώ Bcl-x

L, Bak και Βαχ παρέμεινε ανεπηρέαστη [Εικόνα S5].

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των HeLa και WI-38 εκχυλίσματα κυττάρων κατεργάστηκαν με 10 μΜ SRF επί 24 ώρες και ανιχνεύθηκαν με αντι-Bcl-2 μονοκλωνικό αντίσωμα. Μια βραδύτερη μεταναστευτική ζώνη που αντιστοιχεί σε φωσφορυλιωμένη μορφή του Bcl-2 είναι παρόν σε HeLa εκχυλίσματα αλλά απουσιάζει από WI-38 προϊόντα λύσεως, δείχνοντας ότι SRF επάγει επιλεκτική φωσφορυλίωση της Bcl-2 σε καρκινικά κύτταρα. (Β) SRF μεσολαβεί Bcl-2 υπερφωσφορυλίωση. Drug αγωγή κυτταρολύματα HeLa διαχωρίστηκαν επί 12% SDS-PAGE και ανοσοστύπωμα έγινε χρησιμοποιώντας ειδικά φωσφο-αντισώματα έναντι T56, S70 και S87 κατάλοιπα του Bcl-2? όλα αυτά τα αμινοξέα βρίσκονται στην περιοχή εύκαμπτη θηλειά της πρωτεΐνης. Ανάλυση φυσικά (C) Χρόνος Bad φωσφορυλίωσης που προκαλείται από τη θεραπεία SRF. κυτταρολύματα HeLa αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-Bad μονοκλωνικό αντίσωμα. SRF (10 μΜ) θεραπεία μεταβάλλεται κατάσταση φωσφορυλίωσης του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bad όπως υποδεικνύεται από την εμφάνιση ενός μετακινείται βραδύτερα φωσφο-Bad ζώνη στα 24 ώρες. Η ζώνη απουσίαζε από τον έλεγχο (DMSO αγωγή) κυττάρων, ακόμη και μετά από 24 ώρες.

Η

Οι ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών (ΜΑΡΚ), που εκφράζεται σε όλους τους τύπους κυττάρων, μετάγουν σήματα από την κυτταρική μεμβράνη προς τον πυρήνα σε απόκριση σε μία ποικιλία ερεθισμάτων και επίσης ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών διεργασιών κρίσιμης σημασίας για την κυτταρική ομοιόσταση [27]. Μεταξύ των διαφόρων οδών που προκαλούνται από τα μέλη της οικογένειας ΜΑΡΚ, το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση 1 και 2 (ERK1 /2), c-Jun Ν-τελική κινάση /στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (JNK /SAPK) και p38 ΜΑΡΚ είναι γνωστό ότι