Αφηρημένο

Ιστορικό

λαμινών A-τύπου πρωτεΐνες ενδιάμεσα νήματος V τύπου που κωδικοποιείται από το γονίδιο

LMNA

. Μεταλλάξεις σε

LMNA

προκαλούν ποικίλες εκφυλιστικές ασθένειες που σχετίζονται με την πρόωρη γήρανση. λαμίνες τύπου Α επηρεάζουν επίσης την δραστικότητα της πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος (pRb) και ογκογονιδίων ένας τέτοιος β-κατενίνης. Κατά συνέπεια, έχει σκεφτεί ότι η έκφραση των λαμινών τύπου Α μπορεί επίσης να επηρεάσει την εξέλιξη του όγκου.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Ένα αρχείο του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) και φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου προβλήθηκε για έκφραση των λαμινών τύπου Α. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Cox αναλογικό αναλογία κινδύνου (HR) για να διερευνήσει την επιβίωση των ασθενών. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές CRC που ερεύνησε τις επιπτώσεις της lamin Μια έκφραση άλλων γονιδίων με RT-PCR? επί της κυτταρικής ανάπτυξης με ανάλυση FACS? και διεισδυτικότητα με προσδιορισμούς κυτταρικής μετανάστευσης και siRNA knockdown στοχευμένων γονιδίων. Βρήκαμε ότι lamin Α εκφράζεται σε βλαστικά κύτταρα του παχέος εντέρου και ότι οι ασθενείς με A-τύπου όγκους lamin εκφράζουν έχουν σημαντικά χειρότερη πρόγνωση από τους ασθενείς με όγκους αρνητικούς τύπου Α λαμίνη (HR = 1,85,

σ

= 0,005) . Για να κατανοήσουμε αυτό το εύρημα, έχουμε δημιουργήσει ένα πρότυπο σύστημα με βάση την έκφραση της GFP-λαμίνης Α σε κύτταρα CRC. Βρήκαμε ότι η έκφραση του GFP-λαμίνης Α σε αυτά τα κύτταρα δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά προήγαγε σημαντικά αυξημένη κινητικότητα κυττάρων και διεισδυτικότητα. Ο λόγος για αυτό αυξημένη διεισδυτικότητα ήταν ότι η έκφραση του λαμίνης Α προωθείται προς τα πάνω ρύθμιση της ακτίνης ομαδοποίηση πρωτεΐνη Τ-plastin, οδηγώντας σε μειωτική ρύθμιση του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης Ε-καδερίνης.

Συμπεράσματα

Έκφραση λαμίνες τύπου Α αυξάνει τον κίνδυνο θανάτου από CRC επειδή η παρουσία του προκαλεί αυξημένη διεισδυτικότητα και δυνητικά περισσότερο βλαστικών κυττάρων φαινότυπο-όπως. Αυτή η έκθεση συνδέει άμεσα το A-τύπου έκφραση lamin εξέλιξης του όγκου και αυξάνει το προφίλ του

LMNA

από έναν εμπλέκονται σε πολλές, αλλά σπάνια γενετική συνθήκες σε ένα γονίδιο που εμπλέκεται σε μία από τις συχνότερες ασθένειες στον Δυτικό Κόσμο.

Παράθεση: Willis ΝΔ, Cox TR, Ραχμάν-Casañs SF, Smits Κ, Przyborski Α.Ε., van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C είναι ένα βιοδεικτών κινδύνου για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10.1371 /journal.pone.0002988

Συντάκτης: Kevin G. Hardwick, Πανεπιστήμιο του Εδιμβούργου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 6, Μαΐου, 2008? Αποδεκτές: 17 Ιουλίου 2008? Δημοσιεύθηκε: 20 του Αυγ, 2008

Copyright: © 2008 Willis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικό Σύστημα Υγείας υπηρεσία Έρευνας και ταμεία Ανάπτυξης, Σύνδεσμος για τη Διεθνή Έρευνα του Καρκίνου, πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης Πρόγραμμα 6

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι λαμίνες Α και C είναι ενδιάμεσα πρωτεΐνες πυράκτωσης V τύπος που αποτελούν μέρος ενός νηματώδους δικτύου που ονομάζεται το πυρηνικό έλασμα επένδυση στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη (INM) [1]. λαμινών τύπου Α εναλλακτικά συγκολλημένα προϊόντα του

LMNA

γονίδιο, το οποίο έχει χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 1q21.3 [2]. Μεταλλάξεις σε αυτό το γονίδιο είναι η υποκείμενη αιτία του δώδεκα διαφορετικές γενετικές ασθένειες που ονομάζονται συλλογικά λαμινοπάθειες [3]. Λαμινοπάθειες είναι όλα εκφυλιστικές ασθένειες που πλήττουν κυρίως ιστούς μεσεγχυματικής προέλευσης [3]. Πιθανοί μηχανισμοί που διέπουν λαμινοπάθειες έχουν εντατικά διερευνηθεί κατά τα τελευταία επτά χρόνια και αυτό έχει οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι λαμινών τύπου Α συμβάλλει στην κυτταρική επιβίωση με δύο διαφορετικούς τρόπους. Πρώτον, λαμίνες τύπου Α αλληλεπιδρούν με σημαντικές πρωτεΐνες κυτταροσκελετικές συνδετήρα ονομάζονται nesprins, μέσω πρωτεϊνών τομέα SUN, που συνδέει το INM στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (ONM) μέσω του αυλού [4], [5]. Τα nesprins σε στοιχεία στροφή άγκυρα του κυτταροσκελετού στην ONM [6] – [9], την καλωδίωση με τον τρόπο αυτό τον κυτταρικό σκελετό στο πυρηνικό έλασμα και παρέχοντας μια συσκευή για την μεταγωγή μηχανική καταπόνηση ανίχνευσης από τη μεμβράνη του πλάσματος προς τον πυρήνα [10], [11 ]. Δεύτερον, λαμίνες τύπου Α αλληλεπιδρά με έναν αριθμό εταίρων δέσμευσης εντός του πυρήνα, η οποία με τη σειρά τους αλληλεπιδρούν με και να επηρεάσει την δραστικότητα σημαντικών ρυθμιστών ανάπτυξης. Από τις πρωτεΐνες που λαμινών Α-τύπου αλληλεπιδρούν με, το καλύτερο που χαρακτηρίζεται είναι οι λεγόμενες πρωτεΐνες LEM τομέα [12], συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών αναπόσπαστο μεμβράνης emerin [13], [14] και man1 [15], καθώς και την nucleoskeleton πρωτεΐνη LAP2α [16]. Ένα συγκρότημα λαμίνες τύπου Α και emerin έχει πρόσφατα αναφερθεί για τη ρύθμιση της πυρηνική συσσώρευση του δραστικού β-κατενίνης και απώλεια της λειτουργίας emerin οδηγεί σε αρρύθμιστη σηματοδότηση β-κατενίνης και αυτόματη διεγερτική ανάπτυξη σε ινοβλάστες [17]. Παρομοίως, ένα σύμπλεγμα man1 και λαμίνες τύπου Α έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα ρυθμίζονται SMAD (rSMAD) και να ανταγωνίζονται σηματοδότηση ΤΟΡ-β με αναστολή rSMAD στο INM [18], [19]. Τέλος, ένα συγκρότημα LAP2α και λαμίνες τύπου Α δεσμεύει και πρόσδεσης μη-φωσφορυλιωμένη μορφές του καταστολέα ανάπτυξη pRb στον πυρήνα [20]. LAP2α και Α-τύπου λαμίνες και οι δύο συμμετέχουν στις Rb εξαρτάται E2F καταστολής [21] και την απώλεια της LAP2α ή Α-τύπου λαμίνες σε ινοβλάστες οδηγεί σε επιτάχυνση της εισόδου S-φάσης, μέσω της απώλειας της δραστηριότητας pRb [21], [22].

Λόγω της σημασίας των λαμινών τύπου Α και δεσμευτική τους εταίρους τους στη ρύθμιση των οδών ανάπτυξης, έχει σκεφτεί ότι αυτοί οι λαμίνες θα μπορούσε να συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου [23]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει διαφορική έκφραση λαμίνες τύπου Α σε ιστούς όγκων και έχουν συνδέσει την απουσία λαμίνες τύπου Α για αυξημένο πολλαπλασιασμό στον όγκο. Ωστόσο, έχουν αποτύχει να συνδέσουν αλλαγές στην έκφραση για πρόγνωση του ασθενούς ή απευθείας εξέλιξης του όγκου [24]. Ως εκ τούτου, αποφάσισε να ερευνήσει το πώς η έκφραση των λαμινών τύπου Α θα μπορούσε να επηρεάσει τόσο την εξέλιξη και τα αποτελέσματα ενός κοινού όγκου. Για να γίνει αυτό θα προβληθεί ένα πολύ μεγάλο αρχείο CRC ιστού που συνδέεται με μια εκτεταμένη βάση δεδομένων των ασθενών [25]. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι η έκφραση του λαμίνες τύπου Α εντός ενός όγκου ήταν ένας ιδιαίτερα σημαντικός δείκτης κινδύνου θνησιμότητας που σχετίζονται με όγκο. Στο κατάντη έρευνες, βρήκαμε ότι η έκφραση της λαμίνης Α σε κυτταρικές γραμμές CRC προωθείται διεισδυτικότητα μέσω up-ρυθμιζόμενη έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης ομαδοποίηση Τ-plastin, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε προς τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης Ε-καδερίνης . Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση των λαμινών τύπου Α στο CRC προωθεί την εισβολή όγκου μέσω της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης.

Αποτελέσματα

Lamin A είναι ένας βλαστικών κυττάρων ενηλίκων βιοδείκτη σε παχέος κρύπτες

Πριν να διερευνηθεί κατά πόσον εξέλιξη λαμίνες Α-τύπου επιρροή όγκου, αξιολογήσαμε την κατανομή των λαμίνες τύπου Α σε φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου με χρώση τομών ιστού με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για αυτές τις πρωτεΐνες. Όπως αναμενόταν [26], λαμίνες τύπου Α ήταν εντόνως εκφρασμένο στα λειτουργικά διαφοροποιημένα επιθηλιακά στρώματα και επίσης έντονα εκφράζεται σε περιβάλλοντα στρωματικό ιστό και των υποκείμενων μυών. Αντιστρόφως, η έκφραση λαμίνη τύπου Α ήταν πολύ αδύναμη ή απουσιάζει από την πλειονότητα των κυττάρων εντός των εντερικών κρυπτών. Ωστόσο, η έκφραση λαμίνη τύπου Α ήταν υψηλή σε περίπου πέντε με δέκα στοιχεία στη βάση των κρυπτών (Σχήμα 1Α, βέλη). Τα θετικά χρωματισμένα κύτταρα στις κρύπτες ήταν πολύ όμοια σε αριθμό και κατέλαβαν μια θέση που αντιστοιχεί σε εκείνη γενικά κατανοητό ότι είναι η κολονική επιθηλιακών κόγχη βλαστικών κυττάρων [27], [28]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η ταυτότητα αυτών των Α-τύπου λαμίνη θετικά κύτταρα, σειριακές τομές βάφτηκαν με αντισώματα έναντι λαμίνες Α & amp? C ή το PCNA πολλαπλασιασμό βιοδεικτών. Τα κύτταρα στις κρύπτες που χρωματίζονται θετικά για PCNA ήταν αρνητικά για λαμίνες Α-τύπου, ενώ τα κύτταρα που ήταν αρνητικά για PCNA ήταν θετικά για λαμίνες τύπου Α (Εικόνα 1Β) υπονοώντας ότι ο μικρός αριθμός των Α-τύπου λαμίνη θετική βασικοκυτταρικό κρύπτη κύτταρα θα μπορούσαν πράγματι να θεωρηθεί ότι είναι βλαστοκύτταρα. Βρήκαμε επίσης ότι, ενώ τα αντισώματα που ανιχνεύονται ειδικά λαμίνης Α έκανε λεκιάζει το προτεινόμενο βλαστοκυττάρων κόγχη (αλλά όχι τα κύτταρα στην παρακείμενη ζώνη ενισχύσεως διέλευσης), λαμίνη C δεν ανιχνεύθηκε ούτε στο βλαστοκυττάρων κόγχη ή τη διέλευση ενίσχυση κύτταρα, αλλά εκφράστηκε σε διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα και υποκείμενη muscularis (Σχήμα S1). Έτσι η έκφραση του λαμίνης Α απουσία λαμίνη C φαίνεται να καθορίσει μια ομάδα κυττάρων στο βασικό περιοχή του κολικού κρύπτης, που αντιστοιχεί σε μια περιοχή τεκμηριωθεί ότι είναι ο βλαστοκυττάρων εξειδικευμένες.

(Α) Λεπτές τομές φορμαλίνης σταθερών, κερί ενσωματωμένα δείγματα φυσιολογικού κόλου βάφτηκαν ακόλουθη μεσολάβηση θερμότητα ανάκτηση αντιγόνου με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι JoL2 λαμίνες A /C. Οι τομές ελαφρά βάφτηκαν αντίθετα με Mayers Haemalum. Αιχμές βελών υποδεικνύουν διαφοροποιημένων κυττάρων του επιθηλίου, ενώ τα βέλη δείχνουν την αναμενόμενη τοποθεσία του βλαστικού κυττάρου κόγχη στη βάση της κρύπτης. Ράβδοι κλίμακας = 150 μm (αριστερό πάνελ) & amp? 50 μm (πάνελ δεξιά). (Β) Διαδοχικές τομές από φυσιολογικό κόλον χρωματίστηκαν με αντισώματα είτε λαμίνες A /C (JoL2) ή PCNA (PC10) και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Τα βέλη δείχνουν αργά διαιρούμενα κύτταρα στη βάση των κρυπτών, οι οποίες λεκέ θετικά με JoL2 αλλά αρνητικά με την PC10. Ράβδοι κλίμακας = 150 μm.

Η

Η έκφραση των λαμινών τύπου Α είναι ένας δείκτης κινδύνου στο CRC

Η Ολλανδία Cohort Study για τη διατροφή και τον καρκίνο [29] είναι μια προοπτική μελέτη κοόρτης. Αρχικά, τα δείγματα ιστών από 819 ασθενείς κλήθηκαν από 54 εργαστήρια παθολογίας σε όλη την Ολλανδία. περιπτώσεις περιστατικό που περιλαμβάνονται εκείνες τις ασθενείς που αναπτύσσουν καρκίνο του παχέος εντέρου μεταξύ 1989 και 1993. όγκου υλικό δεν ήταν διαθέσιμο για το 5% των περιπτώσεων και των υπόλοιπων 775 διαθέσιμα δείγματα ιστού, 737 περιείχαν επαρκές υλικό όγκου για ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Χρησιμοποιώντας τυποποιημένες παραμέτρους για τη δοκιμή σε επίπεδο σημαντικότητας 5% και με ισχύ 90%, το ελάχιστο μέγεθος του πληθυσμού που απαιτούνται για την ανίχνευση αυτοπεποίθηση μικρές αναλογίες κινδύνου ήταν 516, έτσι ήταν ασφαλές να υποθέσουμε ότι το μέγεθος του δείγματος ήταν αρκετά μεγάλη για να παράγει στατιστική σημαντικότητα .

χρώση ανοσοϊστοχημική

για την ανίχνευση της έκφρασης του λαμίνες A /C ανάκτηση εξής αντιγόνου εκτελέστηκε σε όλα τα διαθέσιμα δείγματα. Σε όλα τα τμήματα του ιστού που περιβάλλει το στρωματικό καρκίνος ήταν πάντα έντονα θετικό για λαμίνες A /C παρέχει έναν εσωτερικό θετικό έλεγχο. Χρησιμοποιώντας χρώση των στρωματικών ιστών ως κριτήριο για την επιτυχή ανάκτηση αντιγόνου, 673 (91%) των δειγμάτων ήταν διαθέσιμα για βαθμολόγηση. Βρήκαμε ότι ενώ υπήρξε κάποια διακύμανση στην ένταση της συνολικής χρώσης, της πυρηνικής λαμίνη έκφραση A /C εντός του όγκου μπορούσε να χαρακτηριστεί εύκολα ως είτε υπάρχουν (Σχήμα 2Ε-Η) ή απών (Εικόνα 2A-D) από τον πυρήνα. Διαπιστώθηκε επίσης ότι σε ένα μικρό αριθμό περιπτώσεων, υπήρχε κυτταροπλασματική χρώση σποραδική και αυτά τα δείγματα βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά όταν πυρηνική χρώση ήταν απούσα. Μετά τυφλή βαθμολόγησης των διαφανειών, ανάκτηση πληροφοριών του ασθενούς και την επιβίωση από τη βάση δεδομένων οδήγησε ο τελικός αριθμός των μοναδικών περιπτώσεις που πρέπει να μειωθεί στο 658 λόγω της επικάλυψης των κωδικών διοίκησης των ασθενών, και 2 επιπλέον περιπτώσεις αποκλείστηκαν μετά τον χαρακτηρισμό του ως όγκοι σφραγιστικό δαχτυλίδι.

4 μm φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη τμήματα από 656 ανεξάρτητες ανθρώπινου παχέος αδενοκαρκινώματα ελήφθησαν από ασθενείς που συμμετείχαν στην Ολλανδία Cohort Study για τη διατροφή και τον καρκίνο. Τομές ιστού υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό ποντικού JoL2 αντι-ανθρώπινο λαμίνη A /C αντίσωμα πριν οπτικοποίηση χρωμογόνου και ελαφριά αντιχρωματισμός με Mayers Haemalum να διαφοροποιηθούν πυρήνες. Α-D δείχνουν θετικά χρώση στρωματικών (S) ιστός που περιβάλλει αρνητικά χρώση του όγκου (Τ) ιστού. (Α) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα σταδίου Ι? (Β) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο αδενοκαρκίνωμα II? (C) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο αδενοκαρκίνωμα ΙΙΙ? (D) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο IV αδενοκαρκίνωμα. Ε-Η δείχνουν θετικά χρώση στρωματικών (S) ιστός που περιβάλλει θετικά χρώση του όγκου (Τ) ιστού. (Ε) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα σταδίου Ι? (F) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο αδενοκαρκίνωμα II? (G) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο αδενοκαρκίνωμα ΙΙΙ? (H) Μέτρια καλά διαφοροποιημένο στάδιο IV αδενοκαρκίνωμα. Ράβδοι κλίμακας = 30 μm.

Η

Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης, 246 ασθενείς πέθαναν, με 163 από αυτούς τους ασθενείς πεθαίνουν ως αποτέλεσμα της CRC. Από τα 656 δείγματα διαθέσιμα ανοσοϊστοχημικώς αξιολογηθούν έκφραση πυρηνικών λαμίνη A /C βρέθηκε να είναι θετικός σε 463 (70%) ασθενείς και αρνητική σε 193 (30%) ασθενείς. Εντός της ομάδας του δείγματος των ασθενών που πέθαναν από σχετικές CRC αιτίες κατά τη διάρκεια της μελέτης (δέκα έτη), 127 σημείωσε θετικό για λαμινών A /C, ενώ 36 σημείωσε αρνητική. Χρησιμοποιώντας τους υπολογισμούς Cox αναλογικών κινδύνων [30], διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς εκφράζουν λαμινών A /C εντός του όγκου ήταν σχεδόν διπλάσιες πιθανότητες να πεθάνουν (Αναλογία κινδύνου [HR] 1,85? 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI] 1,16 – 2,97) του CRC σχετικών αίτια σε σύγκριση με clinicopathogically ταυτόσημες ασθενείς που ήταν αρνητικοί για λαμίνες A /C (

σ

= 0.005) (Σχήμα 3). Έτσι, η έκφραση της lamin A /C σε όγκο ήταν συσχετίζεται έντονα με σχετικές CRC θάνατο.

ασθενών Συνολικά αθροιστική ανάλυση κινδύνου για την παρουσία της έκφρασης lamin A /C και του παχέος θνησιμότητα που συνδέεται με τον καρκίνο της φάσης Ι-ΙΙΙ στην Ολλανδία Cohort Study για τη διατροφή και τον καρκίνο. αναλογία σε σχέση κινδύνου (HR) = 1,85 (95% CI = 1,16 – 2,97),

σ

= 0.005 (Προσαρμοσμένα για το φύλο και την ηλικία κατά τη διάγνωση).

Η

Η έκφραση της lamin Α σε κυτταρικές σειρές CRC προωθεί την αύξηση της εισβολής

Το εύρημα ότι η έκφραση της lamin A /C σε όγκους ασθενών συσχετίζεται στενά με το CRC που σχετίζονται με θνησιμότητα ήταν απρόσμενη και σε κάποιο βαθμό αντίθετος προς την πραγματικότητα. Επομένως, για να κατανοήσουμε γιατί η έκφραση του λαμίνες A /C αυξάνει τον κίνδυνο θανάτου σε CRC, έχουμε αποκτήσει μια σειρά κυτταρικών γραμμών CRC και αρχικά τους αξιολογείται για λαμίνη A /C με ανοσοκηλίδωση. Σε μία προ-μεταστατική κυτταρική γραμμή, SW480, λαμίνη Α ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη (Εικόνα S2A, Β), ενώ τα επίπεδα της έκφρασης του λαμίνες B

1, B

2 και C ήταν παρόμοιες με άλλες κυτταρικές γραμμές CRC (π.χ. ΗΤ29 ). Ως εκ τούτου, SW480 επιλέχθηκε για έρευνα. Να καθορίσουν τον τρόπο έκφρασης των lamin Α μπορεί να επηρεάσει SW480, καλλιέργειες σταθερά επιμολυσμένα με είτε GFP ή GFP-λαμίνη Ένα μόρφωμα. Μετά σταθερή επιμόλυνση με GFP-λαμίνη ένα μέτριο ποσότητες τόσο ενδογενών λαμίνης Α, καθώς και την πρωτεΐνη σύντηξης ανιχνεύθηκαν, ενώ σε GFP επιμολυσμένα καλλιέργειες, λαμίνη Α παρέμεινε απών (Εικόνα S2C, D). Η μορφολογία των κυττάρων σε GFP και GFP-λαμίνης Α επιμολυσμένα καλλιέργειες ήταν επίσης διαφορετική. Η μορφολογία των κυττάρων στις καλλιέργειες GFP επιμολυσμένα (SW480 /CNTL) δεν μπορούσε να διακριθεί από μη επιμολυσμένα καλλιέργειες (SW480), με πολλά κύτταρα που ήταν ιδιαίτερα πεπλατυσμένο ή αναπτύσσονται σε ένα πάνω στο άλλο. Αντίθετα, σε GFP-λαμίνης Α επιμολυσμένα καλλιέργειες (SW480 /λάμα), κύτταρα είχαν περισσότερο άτρακτο σαν εμφάνιση και μεγάλωσε ως μονοστιβάδα σε χαμηλή κυτταρική πυκνότητα (Σχήμα 4Α).

(Α) Η μορφολογία του μη επιμολυσμένα SW480, SW480 /CNTL και SW480 /Λάμα συγκρίθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. SW480 /CNTL και μη επιμολυσμένα κύτταρα επέδειξαν πεπλατυσμένη μορφολογία και πολυεπίπεδη ανάπτυξη. Αντίθετα, έκτοπη έκφραση της GFP-λαμίνης Α (SW480 /λάμα) φάνηκε να επάγει μορφολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της εμφάνισης μιας ατράκτου-όπως το σχήμα και την ανάπτυξη, ως μονοστιβάδα. μπαρ κλίμακας = 10 μm. (Β) τραύματα Scratch έγιναν σε 100% συρροή καλλιέργειες SW480 /CNTL ή κύτταρα /Λάμα SW480. εικόνες αντίθεσης φάσης ελήφθησαν κάθε δύο ώρες επί μία περίοδο 12 ωρών από ταυτόσημες περιοχές. Κλίμακα bar = 200 μm. (Γ) Το μέγεθος του τραύματος σε σχέση με το μέγεθος της πληγής εκκίνησης μετρήθηκε μετά από 12 ώρες σε τρία ανεξάρτητα πειράματα και εκφράζονται ως ποσοστό μείωση του μεγέθους της πληγής +/- τυπική απόκλιση (S.D.). μετανάστευση των κυττάρων ~seven φορές πιο γρήγορα σε SW480 /Λάμα σε σύγκριση με τις καλλιέργειες /CNTL SW480, σ & lt? 0.005. (D) τα χαρακτηριστικά του κύκλου κυττάρων διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η αναλογία των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου δίδεται ως μέσος όρος ± Τ.Α. τριών αντιγράφων. Δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές σε κύτταρα δυναμική κύκλο ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές.

Η

Τα αποδημητικά /μεταστατικής συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων είναι συνήθως σχετίζεται με φαινοτυπικές αλλαγές [31]. Για να διερευνηθεί αν αλλαγμένη μορφολογία των κυττάρων συσχετίζονται με αλλοιωμένη μεταναστευτική συμπεριφορά πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς κυτταρικής κινητικότητας στις καλλιέργειες. Μετά το μηδέν τραυματισμό, το κλείσιμο της πληγής ήταν επτά φορές ταχύτερη σε καλλιέργειες που επιμολύνθηκαν με GFP-λαμίνης Α σε σύγκριση με καλλιέργειες που επιμολύνθηκαν με GFP (Σχήμα 4Β & amp? C) ή μη επιμολυσμένα κύτταρα (δεν δείχνεται), που δείχνει ότι τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με GFP-λαμίνης Α ήταν πράγματι περισσότερο κινητικά είτε από κύτταρα επιμολυσμένα με GFP ή μη επιμολυσμένα κύτταρα. Ερευνήσαμε άλλα χαρακτηριστικά της κυτταρικής συμπεριφοράς τους, η οποία θα μπορούσε να μεταβάλει, ως αποτέλεσμα της έκφρασης του λαμίνη Α, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης και διαίρεσης. Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής εμείς δεν βρήκε σημαντικές διαφορές στη δυναμική του κυτταρικού κύκλου στη GFP-λαμίνης Α έναντι του GFP επιμολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 4D). Έτσι από τα χαρακτηριστικά ερευνήσαμε μόνο κύτταρο μορφολογία και κινητικότητα άλλαξαν στα κύτταρα που εκφράζουν λαμίνης Α

Σε μια πρόσφατη μελέτη [32], η έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης ομαδοποίηση, L-plastin σε κύτταρα SW480 οδήγησε σε κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και αυξημένη διεισδυτικότητα. Plastins είναι μία οικογένεια πρωτεϊνών ακτίνης ομαδοποίηση που εμπλέκονται στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και εκφράζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών [33], [34]. Ενισχυμένη έκφραση του άλλου μέλους της οικογένειας plastin, T-plastin έχει συσχετισθεί με κύτταρα ανθεκτικά τόσο φάρμακα και ακτινοβολία. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η σημαντικά αυξημένη έκφραση των Τ-plastin αναφερθεί σε cisplatin ανθεκτικών ανθρώπινων καρκίνων [34]. Επομένως, η ανθεκτική στα φάρμακα όγκοι είναι πιθανό να είναι πιο επιθετική. Η ανακάλυψή μας ότι το ποσοστό θνησιμότητας σε ασθενείς με lamin A /C εκφράζοντας όγκους είναι διπλάσιο από αυτό των ασθενών με /C αρνητικό όγκους lamin Μια υποδηλώνει ότι η έκφραση lamin A /C συνδέεται επίσης με την πιο επιθετική συμπεριφορά όγκου. Επιπλέον, λαμίνη A /C πιστεύεται ότι επηρεάζει ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού μέσω αλληλεπιδράσεων με πρωτεΐνες συνδέτη όπως nesprins [4]. Επιπλέον, η δραστικότητα Τ-plastin έχει αναφερθεί σε κύτταρα καρκινώματος του κόλου ΗΤ29 [33], οι οποίες είναι γνωστό ότι λαμίνη Μια θετική (αυτό το χαρτί). Εξετάσαμε ως εκ τούτου εάν η έκφραση του GFP-λαμίνης Α σε κύτταρα SW480 προκαλούνται κατάντη αλλαγές στα Τ-plastin έκφρασης και αν Τ-plastin θα μπορούσε να εμπλέκεται στην αυξημένη διεισδυτικότητα που παρατηρείται εδώ.

Οι αλλαγές στην Τ-plastin και Ε- επίπεδα έκφρασης καντερίνης ερευνήθηκαν με RT-PCR. Βρήκαμε ότι η T-plastin δεν εκφράστηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με GFP, αλλά ήταν παρούσα σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα που εκφράζουν GFP-λαμίνης Α Σε αντίθεση, η Ε-καντερίνη εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα που εκφράζουν GFP μόνο του, αλλά απουσίαζε από κύτταρα που εκφράζουν GFP-λαμίνης Α (Σχήμα 5Α). Έτσι, η αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων που εκφράζουν GFP-λαμίνη Μια πιθανή προκύπτει επειδή τα κύτταρα αυτά είναι λιγότερο προσκολλημένα, ως αποτέλεσμα της απώλειας της έκφρασης Ε-καδερίνης και επιδεικνύουν βελτιωμένη δυναμική ακτίνης. Για να καθοριστεί αν η λαμίνη συντηρούμενο επάνω ρυθμισμένη έκφραση των Τ-plastin παρατηρείται πράγματι να προκαλέσει ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης και αυξημένη κινητικότητα κυττάρου, εκτελέσαμε siRNA knockdown του Τ-plastin σε GFP-λαμίνης Α εκφράζουν SW480 κύτταρα. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με συγκεκριμένες siRNA, T-plastin ήταν ανιχνεύσιμη και Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω (Σχήμα 5Β). Είναι σημαντικό ότι, μετά τον τραυματισμό το μηδέν, το κλείσιμο της πληγής ήταν επίσης σημαντικά βραδύτερη σε καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με Τ-plastin ειδικό siRNA σε σύγκριση με καλλιέργειες που κατεργάζονται με μπερδεμένο siRNA (Σχήμα 5C, D). Έτσι τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση των Τ-plastin, που προκύπτουν από την έκφραση του λαμίνης Α επηρεάζει την έκφραση Ε-καδερίνης και άμεσα οδηγεί σε πιο επεμβατική ιδιότητες της λαμίνης Α επιμολυσμένα CRC κυτταρική γραμμή.

(Α) Η έκφραση του Τ-plastin και Ε-καδερίνης μεταγραφές σε SW480 /CNTL και κυττάρων SW480 /Λάμα διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ημι-ποσοτική RT-PCR. Ίση φόρτωση του υλικού εκκίνησης προσδιορίστηκε με ενίσχυση β-ακτίνης. κύτταρα SW480 /Λάμα βρέθηκαν να εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των Τ-plastin mRNA σε σύγκριση με SW480 /CNTL, αλλά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα mRNA E-cadherin σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

σ

& lt? 0.005). (Β) τις καλλιέργειες SW480 /Λάμα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μπερδεμένο siRNA ή siRNA ειδικά Τ-plastin. 108h μετά τη θεραπεία RNA εκχυλίστηκε και ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για την T-plastin και Ε-καδερίνης. Εκατό τοις εκατό knockdown του Τ-plastin συνοδεύτηκε από την εκ νέου έκφραση των μεταγραφημάτων Ε-καδερίνης. (C, D) Εναλλακτικά, το μηδέν τραυματισμού διεξήχθη επί συρρέουσες καλλιέργειες 108h μετά τη θεραπεία siRNA και το κλείσιμο του τραύματος μετρήθηκε όπως περιγράφεται στην Εικόνα 4Β, C. μετανάστευση των κυττάρων & gt? 2 φορές γρηγορότερα σε καλλιέργειες που κατεργάζονται με μπερδεμένο siRNA σε σύγκριση με καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με Sit-plastin (

σ

& lt? 0,05). μπαρ κλίμακα = 200 μm.

Η

Συζήτηση

Στην εργασία αυτή αναφέρουμε δύο νέα και μη αναμενόμενα ευρήματα. Πρώτον, λαμίνη Α αλλά όχι λαμίνη C είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης του βλαστικού κυττάρου θέση στην κολονική κρύπτη και, δεύτερον, η έκφραση του λαμίνη A /C σε ιστούς CRC συσχετίζεται ισχυρά με σχετίζονται CRC θνησιμότητα και επομένως λαμίνη A /C αντιπροσωπεύει ένα νέο και σημαντικό προγνωστικό βιοδείκτη στο CRC.

Η θέση της βλαστοκυττάρων θέση στο παχύ έντερο έχει παρέκταση από το κελί κινητική και τη ραδιενεργό σήμανση μελέτες. Με ραδιοσήμανση κύτταρα κρύπτης φάση S με τριτιωμένη θυμιδίνη, η μέση ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων σε σχέση με τη θέση των κυττάρων τους έχει μετρηθεί. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, την προέλευση της μετανάστευσης και, κατ ‘επέκταση, η βλαστοκυττάρων θέση έχει προβλεφθεί να κατοικεί στη βάση της κρύπτης [35]. Ο αριθμός των βλαστικών κυττάρων που καταλαμβάνει αυτή τη θέση προσεγγίζει πέντε με έξι κύτταρα [36]. Πιο πρόσφατα, η έκφραση του Wnt στοιχείου απόκρισης Lgr5 έχει δειχθεί να καθορίσει κολονική βλαστικών κυττάρων και έχει χρησιμοποιηθεί για να επιβεβαιώσει ότι τα βλαστικά κύτταρα καταλαμβάνουν μια θέση στη βάση των κρυπτών [27]. Τα κύτταρα του ισοδύναμου αριθμού και καταλαμβάνουν ακριβώς εκείνη την θέση εύκολα χρωματίζονται με αντισώματα ανίχνευσης λαμίνες A /C ή λαμίνη Α αλλά δεν χρωματίζονται με αντισώματα ειδικά ανίχνευση λαμίνη C. Σε αντίθεση, στα κύτταρα που καταλαμβάνει τη ζώνη ενισχύσεως διέλευσης, έκφραση αμφοτέρων λαμίνης Α και λαμίνη C είναι απόν. Όπως αναμενόταν [26], [37], [38], και οι δύο λαμίνες ανιχνεύονται εύκολα στο λειτουργικό διαφοροποιημένο επιθήλιο στο βλεννογόνο του κόλου. Σε συμφωνία με την ιδέα ότι λαμίνης Α είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης της κολονικής βλαστικών κυττάρων, τα κύτταρα στη βάση της κρύπτης που είναι θετικές για λαμίνη Α, είναι γενικά αρνητική για το PCNA πρωτεΐνη αντιγραφή του DNA, όπως θα αναμενόταν σε κύτταρα τα οποία είναι ως επί το πλείστον ηρεμίας [39]. Αυτό λαμίνης Α είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης των ενήλικων βλαστικών κυττάρων έχει σημαντικές συνέπειες γενικού χαρακτήρα για τη νόσο. Οι λαμίνες A /C είναι μεταλλαγμένα σε ένα ευρύ φάσμα των εκφυλιστικών ασθενειών που συνδέονται με την πρόωρη γήρανση [3] και έχει προταθεί ότι μία αιτία της εκφύλισης σε αυτές τις ασθένειες είναι η απώλεια της λειτουργίας του ενήλικα βλαστικά κύτταρα [40]. Αυτό lamin Μια έκφραση σημειώνεται στο κελί θέση ενήλικα βλαστικά του παχέος εντέρου, του προσδίδει άμεση στήριξη σε αυτή την υπόθεση. Το εύρημα ότι η λαμίνης Α μπορεί να είναι ένα υποθετικό βλαστοκυττάρων βιοδεικτών έχει περαιτέρω συνέπειες για την ανακάλυψή μας ότι η έκφραση του λαμίνη A /C σε CRC συσχετίζεται στενά με αυξημένο κίνδυνο CRC που σχετίζονται με θνησιμότητα, δεδομένου ότι θα μπορούσε να θεωρηθεί εφικτή ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν λαμίνης α μπορεί να έχει μια πιο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν φαινότυπο και ως εκ τούτου να είναι εγγενώς πιο επικίνδυνη [41].

μας εύρημα ότι η έκφραση ενός τύπου λαμίνες στην CRC ιστός συσχετίζεται με μία δύο φορές αύξηση στην σχετίζονται CRC θνησιμότητα , σε σύγκριση με απουσία λαμίνες Α-τύπου, για πρώτη φορά συνδέει άμεσα αυτές τις πρωτεΐνες σε εξέλιξη μιας κοινής ασθένειας. Προηγούμενες μελέτες έχουν περιγράψει αλλαγμένη έκφραση λαμίνες τύπου Α σε ένα εύρος καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του δέρματος, του πνεύμονα, λεμφαγγεία και των μαλακών ιστών [24], [37], [42] – [44]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες ήταν σε θέση να συνδέσει είτε απουσία ή παρουσία λαμίνες τύπου Α για την εξέλιξη του όγκου, αν και τουλάχιστον μία μελέτη [24] πρότεινε ότι η απώλεια της έκφρασης του λαμίνες A /C συσχετίστηκε με αυξημένη ρυθμούς πολλαπλασιασμού σε όγκους. Το άλλο πρόβλημα με αυτές τις προηγούμενες μελέτες είναι ότι ένας περιορισμένος αριθμός δειγμάτων ήταν διαθέσιμα για ανάλυση και, κατά συνέπεια, να μελετήσει τα μεγέθη έπεσε κάτω από το όριο για αξιόπιστη στατιστική ανάλυση. Αντίθετα, η σημερινή διαπίστωση μας βασίζεται σε μια αρκετά αρκετά μεγάλη ομάδα για να προσφέρει απόλυτη εμπιστοσύνη στα επίπεδα σημαντικότητας που αναφέρθηκαν.

Το εύρημά μας είναι σε κάποιο βαθμό αντίθετος προς την πραγματικότητα, σε αυτή την έκφραση των λαμινών τύπου Α σε διάφορα κύτταρα γενικά επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [21], ενώ απουσία ενός τύπου λαμίνες μπορεί να συσχετιστεί με μια αποτυχία να υποστούν διακοπή αύξησης κατά συρροή [22]. Ως εκ τούτου, η μηδενική υπόθεση που χρησιμοποιείται κατά την έναρξη της μελέτης ήταν ότι η απουσία λαμίνες τύπου Α θα συσχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο θανάτου καρκίνο. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο CRC κυτταρικές σειρές που δεν μπορούσαν να ανιχνεύσουν αισθητές μεταβολές στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα που εκφράζουν λαμίνης Α σε σύγκριση με τα κύτταρα του ταυτόσημο γενετικό υπόβαθρο που στερούνταν έκφραση του λαμίνη. Ωστόσο, εντόπισε σημαντικά αυξημένη διεισδυτική ιδιότητες όταν συγκρίνεται λαμίνης Α κύτταρα που εκφράζουν σε κύτταρα στα οποία η έκφραση του λαμίνης Α είναι απούσα. Οι επεμβατική ιδιότητες αυτών των κυττάρων προκύπτει επειδή η παρουσία του λαμίνης Α προκαλεί κατάντη άνω ρύθμιση των Τ-plastin, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης. Plastins είναι μια προσφάτως περιγραφείσα οικογένεια πρωτεϊνών ακτίνης ομαδοποίηση που έχουν εμπλακεί στην εισβολή /μετάσταση [34]. Στην ίδια γραμμή κυττάρων, όπως χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση της L-plastin έχει αναφερθεί ότι οδηγεί σε προς τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αυξημένη διεισδυτικότητα και να έχει στενά συσχετισθεί με μετάσταση [32]. τρέχουσα ευρήματά μας είναι απολύτως συνεπής με την προηγούμενη μελέτη, αλλά δείχνουν, πρώτον, ότι lamin Μια ελέγχει αυτή την οδό και, δεύτερον, ότι εισβολής μπορεί να προκαλείται από την έκφραση των Τ-plastin μέσω του ίδιου μηχανισμού. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης ότι η ενδογενής λαμίνης Α ανιχνεύθηκε σε SW480 κύτταρα κατά σταθερή έκφραση του GFP-λαμίνη Α, ενώ με την παρουσία GFP μόνη λαμίνης Α παρέμεινε απούσα. Είναι καλά γνωστό ότι λαμίνες τύπου Α είναι επιρρεπείς σε διάσπαση στην μη-ελικοειδή περιοχή συνδετήρα 2 [3]. Lamin Α υπάρχει στα κύτταρα είτε ως παράλληλη ρυθμιστές έντασης ή αντι-παράλληλο τετραμερή κατά την οποία η περιοχή της κεφαλής Ν-τερματικό επικαλύπτει το συνδετήρα 2 περιοχή [45]. Δεδομένου ότι η χαρακτηριστική ομάδα GFP βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο, ίσως αυτή η μεγάλη πρωτεΐνη προστατεύει συνδετήρα 2 από πρωτεολυτική αποικοδόμηση και επομένως σταθεροποιεί τόσο GFP-λαμίνης Α και ενδογενών λαμίνη A. Η συνέπεια αυτής της υπόθεσης είναι ότι η απουσία του λαμίνης Α σε κυτταρικές σειρές SW480 οφείλεται σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης.

Πώς η παρουσία λαμίνης Α επηρεάζει την έκφραση μιας πρωτεΐνης ακτίνης ομαδοποίηση αποτελεί το αντικείμενο της κατάντη μελετών. Ωστόσο, μπορεί να προβλεφθεί δύο διακριτούς μηχανισμούς. Έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι λαμίνες τύπου Α επηρεάζουν άμεσα την οργάνωση του κυτταροσκελετού, την αντοχή σε εφελκυσμό των κυττάρων [46] και την ικανότητά τους να αποκρίνονται στο στρες [10]. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου LINC, η οποία μεσολαβεί ενώσεις μεταξύ του πυρηνικού ελάσματος και του κυτταροσκελετού μέσω των nesprins [4]. Ως εκ τούτου, μία πιθανότητα είναι ότι η παρουσία ή απουσία λαμίνης Α σε ένα καρκινικό κύτταρο μπορεί να οδηγήσει απευθείας στο κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση μέσω ενός βρόχου ανάδρασης, ο οποίος ανιχνεύει την αντοχή σε εφελκυσμό του κυττάρου. Εναλλακτικά, λαμίνη Α έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με μια σειρά παραγόντων μεταγραφής [17] και η παρουσία του μπορεί να επηρεάσει άμεσα την έκφραση των Τ-plastin. Είτε έτσι είτε αλλιώς, η φαινοτυπική αποτέλεσμα αυτής της αναδιοργάνωσης είναι αυξημένη εισβολής και πιθανώς αυξημένο μεταστατικό δυναμικό.

Εν κατακλείδι, προτείνουμε ότι το υψηλό κίνδυνο θνησιμότητας από σχετικές CRC αίτια σε ασθενείς που εμφανίζουν έκφραση lamin τύπου Α κατά τους όγκου ανακύπτει επειδή λαμίνης Α είναι ένας ρυθμιστής ανάντη ενός μονοπατιού που συνδέει δυναμική ακτίνη σε απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και κατά συνέπεια αυξημένη επεμβατική δυναμικό του όγκου. Αυτός ο φαινότυπος μπορεί να είναι με τη σειρά του αντικατοπτρίζει μια πιο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητα των καρκίνων. Ενώ οι μεταλλάξεις στο λαμίνες A /C έχουν εμπλακεί σε ένα ευρύ φάσμα των σπάνιων γενετικών ασθενειών [3], τρέχοντα ευρήματα μας για πρώτη έκφραση φορά σύνδεσμος αυτών των πρωτεϊνών με την πρόοδο της μία από τις συχνότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με την Δυτική κόσμο.

Υλικά και Μέθοδοι

Η ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης (4 μm) της κανονικής βλεννογόνο του παχέος εντέρου και του παχέος αδενοκαρκινώματος de-paraffinised και ενυδατώνεται σε ξυλόλιο και αιθανόλη. Για ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές βυθίστηκαν σε 3% Η

2O

2 για να σβήσει η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης πριν επωάστηκαν σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6,0) για 20 λεπτά στους 90 ° C. Οι τομές στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% φυσιολογικό ορό αίγας που ακολουθείται από επώαση με είτε JoL2, αντι-λαμίνη A /C mAb ποντικού [47] [1:10], PC10, αντι-ΡΟΝΑ ποντικού mAb [1:100], RalC, αντι -lamin C πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού [24] [1:100] ή 133A2, αντι-λαμίνη Ένα ποντίκι mAb [48] [1:100] όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο κατσίκα IgG αντι-ποντικού αραιώνεται σε 1:400 για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η τυποποιημένη διαδικασία ABC στη συνέχεια διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες από την Dako (DakoCytomation, Glostrup, Δανία). Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο ακολουθούμενη από ελαφρά αντιχρωματισμός με Mayers Haemalum.

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο προ-μεταστατικές κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου ΗΤ29 και SW480 ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων, ΗΝΩΜΈΝΟ ΒΑΣΊΛΕΙΟ. ΗΤ29 καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Sigma, UK) συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C με 5% CO

2. SW480 κύτταρα και επιμολυσμένα παράγωγα αναπτύχθηκαν σε Leibovitz-15 μέσο (L-15) (Invitrogen, UK) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C χωρίς CO

2.

Σταθερή επιμόλυνση του GFP-δημοσιογράφους σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος SW480 του παχέος εντέρου

SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με κατασκευάσματα DNA που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη σύντηξης της EGFP-λαμίνης ενός πλήρους μήκους (δώρο από τον Δρ Μ Izumi, Ινστιτούτο Φυσικής και χημικής Έρευνας, Saitama, Japan) και EGFP.