Αφηρημένο

υποδοχέα κυττάρου φωτοϋποδοχέα-ειδική (PNR /NR2E3) είναι ένας ορφανός πυρηνικός υποδοχέας που διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς και τη συντήρηση των φωτοϋποδοχέων. Οι μεταλλάξεις που προκαλούν ασθένειες στον PNR έχουν πλειοτροπικές αποτέλεσμα που προκύπτει σε διάφορες παθήσεις του αμφιβληστροειδούς. Πρόσφατα, PNR έχει εμπλακεί στον έλεγχο των κυτταρικών λειτουργιών σε καρκινικά κύτταρα. PNR αναφέρθηκε ότι είναι μία νέα ρυθμιστική της έκφρασης ΕΚα σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, και η υψηλή έκφραση συσχετίζεται με PNR ευνοϊκή απόκριση σε θεραπεία με ταμοξιφαίνη. Επιπλέον, PNR δείχθηκε να αυξηθεί η σταθερότητα της ρ53 σε κύτταρα HeLa, υπονοώντας ότι PNR μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος σε αυτό και άλλων καρκίνων που διατηρούν άγριου τύπου γονίδιο ρ53. Για να διευκολυνθεί περαιτέρω κατανόηση των λειτουργιών PNR στον καρκίνο, χαρακτηρίσαμε ένωση 11a, ένα συνθετικό, υποθετικό αγωνιστή PNR σε αρκετούς κυτταρικούς προσδιορισμούς. Είναι ενδιαφέρον, δείξαμε ότι 11α παρέλειψε να ενεργοποιήσετε PNR και κυτταροτοξικότητα της ήταν ανεξάρτητη της έκφρασης PNR, με εξαίρεση τα δεδομένα PNR ως μεσολαβητής για την 11α κυτταροτοξικότητα. Συστηματική αναλύσεις των κυτταροτοξικών επιδράσεων της 11a σε NCI-60 κυτταρικές γραμμές αποκάλυψε μια ισχυρή θετική συσχέτιση της κυτταροτοξικότητας με την κατάσταση της ρ53, δηλ, ρ53 κυτταρικές σειρές άγριου τύπου ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα στο 11a από ρ53 μεταλλαγμένη ή null κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, η χρήση HCT116 p53 + /+ και p53 – /- ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές που αποκάλυψε ότι ο μηχανισμός της 11α-επαγόμενης κυτταροτοξικότητας έγινε μέσω G

1 /S κύτταρο φάση σύλληψης κύκλου παρά την απόπτωση. Εν κατακλείδι, παρατηρήσαμε μια συσχέτιση της ευαισθησίας 11α με το καθεστώς του p53, αλλά όχι με την έκφραση PNR, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι όγκοι που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 μπορεί να ανταποκρίνεται σε αυτή την ένωση

Παράθεση:. Zhao Z, Wang L, Wen Ζ, Ayaz-Guner S, Wang Υ, Ahlquist P, et al. (2013) Συστηματική Αναλύσεις των κυτταροτοξικών επιδράσεων της Ενωσης 11a, ένα υποθετικό Synthetic αγωνιστή του φωτοϋποδοχέα-Specific πυρηνικού υποδοχέα (PNR), στις γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 8 (9): e75198. doi: 10.1371 /journal.pone.0075198

Συντάκτης: Eric Xu, Van Andel Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 14, 2013? Αποδεκτές: 11 Αυγ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA125387 να WX, ΝΙΗ χορηγήσει CA22443 για PA και DOD ΕΧΕ της HOPE Scholar Award W81XWYH-11-1-0237 έως WX. PA είναι ένας ερευνητής του Ιατρικού Ινστιτούτου Howard Hughes. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων ρυθμίζουν μια ποικιλία των βασικών βιολογικών διεργασιών όπως η ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση των κυττάρων [1-3]. δραστηριότητές τους και τα επίπεδα έκφρασης ελέγχονται αυστηρά, και απορύθμιση των πυρηνικών υποδοχέων (NRS) και coregulators τους εμπλέκεται σε μεταβολικές νόσους και την ανάπτυξη του καρκίνου [4-6]. NRs είναι η δεύτερη μεγαλύτερη οικογένεια πρωτεϊνών που απευθύνονται από τις φαρμακευτικές ναρκωτικών [7]. Από τους 48 πυρηνικούς υποδοχείς εντοπίζονται σε ανθρώπους, περίπου το ήμισυ είναι καλώς χαρακτηρισμένα με γνωστούς φυσικούς συνδετήρες. Οι υπόλοιπες NRs ονομάζονται έτσι ορφανών πυρηνικών υποδοχέων επειδή φυσιολογικές συνδετήρες αυτών παραμένουν άγνωστα. Παρά το γεγονός ότι δεν έχει φυσικούς συνδέτες, ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς μπορούν να στοχευθούν με συνθετικά προσδέματα για τη θεραπεία ασθενειών του ανθρώπου, π.χ. συνθετικά ROR και LRH-1 αγωνιστές χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία του μεταβολισμού και αυτοάνοσες νόσους [8]. Φθορισμού δοκιμασίες πόλωσης, ενισχυμένο φωταύγειας εγγύτητα ομογενής (AlphaScreen) δοκιμασίες, και χρονικής ανάλυσης μεταφορά ενέργειας φθορισμού δοκιμασίες (TR-FERT) έχουν αναπτυχθεί ως εξέταση υψηλής απόδοσης (HTS) προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση ενώσεων που στοχεύουν πυρηνικών υποδοχέων για θεραπευτικούς σκοπούς [9- 12].

NR2E3 /PNR είναι ορφανός πυρηνικός υποδοχέας που εκφράζεται έντονα στα κύτταρα του αμφιβληστροειδούς [13] και συγκρατημένα εκφράζονται στον προστάτη και της μήτρας ιστούς [14,15]. PNR ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου ράβδος-ειδικά και καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου κώνου-ειδική με τα κάτω ρύθμιση κυκλίνης D1 και ΤΒΧ2 [16-20]. Αυτό το πρότυπο γονιδιακής ρύθμισης ορίζει το διττό ρόλο της PNR στη μεσολάβηση της ανάπτυξης και της συντήρησης των φωτοϋποδοχέων [21]. Οι μεταλλάξεις στο PNR έχουν βρεθεί σε διάφορες ασθένειες του αμφιβληστροειδούς, συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου ενισχυμένη S-κώνου, αυτοσωματικό κυρίαρχο και υπολειπόμενο μορφές μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια, το σύνδρομο Goldmann-Favre, και συσσωμάτωμα χρωστική εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς [22-27]. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι τα δεδομένα PNR θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα με τη ρύθμιση της σταθερότητας p53 και άλφα υποδοχέων οιστρογόνων (ΕΡα) έκφρασης. Σε HeLa και HCT116 ρ53-θετικών καρκινικών κυτταρικών σειρών, PNR σταθεροποιεί ρ53 με ακετυλίωση και επάγει την απόπτωση [28]. Στα ΕΚα-θετικό καρκίνο του μαστού MCF7 κυτταρικές γραμμές και T47D, PNR ρυθμίζει ΕΡα με άμεση σύνδεση προς την περιοχή προαγωγού ΕΚα, αυξάνοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου ΕΚα [29]. Η έκφραση του PNR είναι επίσης σημαντικά συνδέεται με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση και ευνοϊκές ταμοξιφαίνη απάντηση στην ΕΡα-θετικό, ασθενείς με καρκίνο του μαστού κόμβο αρνητικά [29]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι PNR μπορεί να είναι ένα θεραπευτικό στόχο για ασθένειες του αμφιβληστροειδούς, καρκίνοι διατηρώντας ένα γονίδιο ρ53 άγριου τύπου, και ΕΚα-θετικών καρκίνων του μαστού.

PNR ειδικών αγωνιστών, είτε φυσικό ή συνθετικό, έχουν ταυτοποιηθεί με χρήση υψηλής απόδοσης δοκιμασίες διαλογής. Επειδή Αρο-PNR έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με συν-καταστολείς Ν-COR, SMRT και RetCoR [20,30], η συνθετική PNR ένωση αγωνιστή 11a αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας δέσμευσης σύντηξης τομέα δέσμευσης DNA της GAL4 συνδέτη domain-PNR β-λακταμάση δοκιμασία μετενεργοποίησης και δοκιμασία απελευθέρωσης NCOR [30,31]. Αν και 11α ελέγχθηκε σε δοκιμασίες που βασίζονται σε κύτταρα για αγωνιστικά αποτελέσματα επί PNR και δείχθηκε να έχει χαμηλή τοξικότητα σε κυτταρικές γραμμές ελέγχου, 11α δεν έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύει απευθείας PNR. Αντίθετα, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν ότι η 11α είναι απίθανο να είναι ένα άμεσο αγωνιστή PNR [32]. Το αποτέλεσμά μας συμφωνεί με αυτό αργότερα συμπέρασμα. Όπως PNR πρόσφατα εμπλακεί σε ΕΚα θετικό καρκίνο του μαστού και φαίνεται να ρυθμίζει σταθερότητα ρ53, αυτή η ένωση μπορεί να έχει θεραπευτική χρησιμότητα. Ωστόσο, η συστηματική αξιολόγηση της ένωσης κυτταροτοξικότητα έλειπε και οι κυτταρικοί στόχοι του 11α δεν έχουν ακόμη οριστεί. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε συστηματικά τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του 11α με NCI-60 κυτταρικές γραμμές [33] και διαπίστωσε ότι 11α κυτταροτοξικότητα είναι ανεξάρτητη της έκφρασης PNR αλλά θετικά συσχετίζεται με την ιδιότητα του ρ53, με μεγαλύτερη ευαισθησία σε κυτταρικές σειρές ρ53 άγριου τύπου από ρ53 null /μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιώντας HCT116 p53 + /+ και p53 – /-. Ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές, αποδείξαμε ότι τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της 11a οφείλεται εν πολλοίς ρ53 προκαλούμενη G

1 /S φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου, με ελάχιστη συμμετοχή από την απόπτωση

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας 11α

Η κυτταρική σειρά LM2 ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Joan Massagué [34]. Οι ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές HCT116 ήταν ένα είδος δώρου από τον Dr. Β Vogelstein [35]. Όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Η ΗΕΚ293Τ, MCF7, MDA-MB-231, LM2, MDA-MB-468, ισογονιδιακές κυτταρικές γραμμές SKOV3, και HCT116 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Gibco, Gaithersburg, MD) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco) στους 37 ° C με 5% CO

2. Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών Α2780 και OVCAR3 διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS. Ο καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή T47D διατηρήθηκε σε DMEM /F12 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS. Η ένωση 11a αγοράστηκε από Pharmabridge Inc. (Pennsylvania Biotechnology Center, Doylestown, ΡΑ). Η σκόνη 11a διαλύθηκε σε αιθανόλη και στη συνέχεια σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ) σε τελική συγκέντρωση 8 mM. Ασύγχρονη κύτταρα σπάρθηκαν 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με 11α, έτσι ώστε τα κύτταρα ήταν περίπου 50% -60% συρρέοντα κατά τη στιγμή της προσθήκης 11α. Η τελική συγκέντρωση του 11a σε ηΜ – εύρος μΜ επιτεύχθηκε με αραίωση 11α στο φρέσκο ​​μέσο, ​​και 0.1% DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για κάθε πείραμα. Όλα-trans ρετινοϊκό οξύ, δοξορουβικίνη, ετοποσίδη, σταυροσπορίνη και 3-αμινοβενζαμίδιο αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ).

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες, προκειμένου να επιτευχθεί G

0 συγχρονισμό. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφήνεται να εισέλθει εκ νέου στον κυτταρικό κύκλο με τη συμπλήρωσή του με DMEM συν 10% FBS που περιέχει τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις 11α.

συσκευασίας ρετροϊού, μόλυνση και σταθερή παραγωγή κυτταρικής σειράς

Η συσκευασία πλασμίδια PME-VSVG, ρΗΙΤ60 και pLNCX αγοράστηκαν από OpenBiosystems (Huntsville, AL). Οι ρετροϊοί συσκευάζονται σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ που μορφομετατρέπονται με 3,8 μα ΡΜΕ-VSVG, 1,4 μg ρΗΙΤ60 και 3,8 μg pLNCX-GFP ή pLNCX-PNR χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμετακόμιση-LT1 (Mirus Bio) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο άλλαξε. Τα σωματίδια του ιού στη συνέχεια συλλέχθηκαν 24 έως 48 ώρες αργότερα χρησιμοποιώντας ένα 0.45 μm ηθμού σύριγγας (Thermo Scientific).

Για να μολύνουν τα κύτταρα με ρετροϊούς, οι ιοί αναμίχθηκαν με ίσο όγκο φρέσκου μέσου συμπληρωμένου με 10% FBS. Polybrene προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 5 μg /mL, ώστε να αυξηθεί η αποδοτικότητα μόλυνση. Το μέσο αλλάχθηκε 6 ώρες μετά τη μόλυνση. Τα κύτταρα επελέγησαν με G418 (800 μg /ml) για μια εβδομάδα για να δημιουργηθούν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν GFP ή PNR.

CellTiter Glo δοκιμασίες φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας

Χίλια κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε τετραπλούν σε ένα 384-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις 11α για μια εβδομάδα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας CellTiter Glo σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του XLfit

TM πρόσθετο για το Excel.

δοκιμασίες λουσιφεράσης δημοσιογράφος

Το DR2 γνώμονα αναφοράς της λουσιφεράσης, TLX και COUP-TFI πλασμίδια ήταν ευγενικό δώρα από τον Dr. Ronald Evans. COUP-TFII πλασμίδιο ήταν ένα είδος δώρου από τον Dr. Michael Gould. Τα άλλα πλασμίδια αγοράστηκαν από OpenBiosystems (Huntsville, AL). Λουσιφεράσης δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI). κύτταρα ΗΕΚ293Τ σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (2 χ 10

3 /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνονται χρησιμοποιώντας Transit-LT1 (Mirus Bio) με 20 ng DR2 γνώμονα αναφοράς της λουσιφεράσης, 10 ng β-γαλακτοσιδάσης δημοσιογράφος, και 20ng φορέα έκφρασης CMV για τον έλεγχο, τα δεδομένα PNR, TLX, COUP-TFI ή COUP-TFII. Η ένωση 11a προστέθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε μετά από επώαση για επιπλέον 24 ώρες. β-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Τα κύτταρα (2 χ 10

3 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα. Μετά από 24 ώρες, διάφορες συγκεντρώσεις 11α προστέθηκαν στις πλάκες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες και στη συνέχεια 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (Sigma-Aldrich) διαλύματος (20 μΐ ανά φρεάτιο, 4mg /ml σε PBS) προστέθηκε. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Μετά την απόρριψη του υπερκειμένου, 200 μΐ DMSO προστέθηκαν και η απορρόφηση μετρήθηκε με ένα φίλτρο 540 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας Victor X5 (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ). Προσέγγιση IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με χρήση GraphPad Prism Software (Version 5.04, Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA) και ένα αρχείο καταγραφής των τριών παραμέτρων σε σχέση με ανταπόκριση μη γραμμική παλινδρόμηση.

τηλέφωνα Ανάλυσης Κύκλου

τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, φυγοκεντρήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 80% παγωμένου στάγδην αιθανόλη με συνεχή στροβιλισμό. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν, και η αιθανόλη απομακρύνθηκε. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ΡΙ διαλύματος /RNase (/ml ιωδιούχου προπιδίου 50 μg, 50 μg /ml RNase Α, 0,25% Triton Χ-100 σε PBS). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με ένα FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) με διέγερση στα 488 nm. Ολοκληρωμένη κόκκινη φθορίζουσα ιστογράμματα αναλύθηκαν με ΜΟϋΡΙΤ LT (Verity Σπίτι Λογισμικό, Topsham, ΜΕ).

Η απόπτωση δοκιμασία μετράται με αννεξίνη V /PI χρώση

Τα κύτταρα βάφτηκαν με Alexa-488 Αννεξίνη V και ΡΙ, και αξιολογήθηκαν για την απόπτωση με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen). Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και χρωματίστηκαν με 5 μΙ αννεξίνης V και 1 μΙ PI (100 μg /ml) σε 1 × δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη FACSCalibur. Τόσο νωρίς αποπτωτικών (ανεξίνη V-θετικά, ΡΙ-αρνητικά) και αργά (ανεξίνη V-θετικά και PI-θετικά) αποπτωτικά κύτταρα που περιλαμβάνονται στο προσδιορισμούς κυτταρικού θανάτου που αναλύθηκαν από FlowJo (Δέντρο Αστέρι Inc., Ashland, OR).

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 1% Triton Χ 100, 1 mM DTT, αναστολείς πρωτεάσης και βενζονάσης) . Μετά τη φυγοκέντρηση, η συνολική πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη BioRad Δοκιμασία (BioRad), και 25 μg πρωτεΐνης επιλύθηκε SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για 1,5 ώρες σε 0,35 A. Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% άπαχο γάλα και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες ή όλη τη νύχτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ορατή χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) σε φιλμ αυτοραδιογραφίας. αντίσωμα αντι-PNR δημιουργήθηκε από την Genemed Synthesis Inc., TX. Δύο ΚΕΗ-συζευγμένα πεπτίδια συντέθηκαν με Genemed Synthesis Inc.: PETRGLKDPEHVEALQD και LSQHSKAHHPSQP, που αντιστοιχούν σε ανθρώπινη PNR αμινοξέα 331-347 και 353-365, αντίστοιχα. Αυτά τα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοποίηση κουνελιών. Ο αντιορός καθαρίστηκε με συνάφεια μετά την τελική αφαίμαξη για να ληφθεί ειδικό αντίσωμα αντι-PNR. Τα αντισώματα αντι-ρ53 και αντι-ρ21 ελήφθησαν από την Pierce (Rockford, IL)? αντί-Κυκλίνη D1 και αντι-Hsp90 αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)? αντίσωμα αντι-PARP λήφθηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ).

Η ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το HP Total RNA Kit (VWR Scientific, West Chester, ΡΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 μα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Superscript II RT σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA) και ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green χρωστική (Roche Scientific, Basel, Switzerland) και ένα όργανο CFX96 (BioRad, Hercules, CA ). Οι εκκινητές αλληλουχίες (IDT, Coralville, ΙΑ) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: COUP TFII: προς τα εμπρός, 5′-GCCATAGTCCTGTTCACCTC-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GGTACTGGCTCCTAACGTATTC-3 ‘? RARB2: προς τα εμπρός, 5’-GTGGAGTTTGCTAAACGTCTG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-TCATGGTGTCTTGTTCTGGG-3 ‘? NGFI-Α: προς τα εμπρός, 5’-CAGCACCTTCAACCCTCAG-3 ‘? αντιστραφεί, 5’-AGTCGAGTGGTTTGGCTG-3 ‘? 18S: προς τα εμπρός, 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ‘? αντίστροφη, 5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3 ‘.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα της GI

50 τιμές μεταξύ άγριου τύπου, μεταλλαγμένα, και μηδενική κυτταρικές σειρές ρ53 υπολογίστηκε με χρήση δύο όψεων unpaired τεστ Wilcoxon Rank Sum. Η στατιστική σημαντικότητα της γονιδιακής έκφρασης στις δοκιμασίες ανάλυση και την απόπτωση qRT-PCR υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα διπλής όψης Student t-test.

Αποτελέσματα

11α δεν έχει αγωνιστικά αποτελέσματα προς PNR σε κύτταρο- δοκιμασίες που βασίζονται

για να διερευνήσουν κυτταρικές λειτουργίες των PNR, χρησιμοποιήσαμε ένωση 11α (δομή φαίνεται στο Σχήμα 1Α), ένα περιγράφηκε προηγουμένως θεωρούμενη αγωνιστή PNR με μια ομάδα κυκλοπροπυλ αμίδιο ανέφερε ότι προσπορίζει υψηλή αγωνιστική δραστηριότητα προς PNR (ΕΚ

50 & lt? 200 nM) [31]. Η ένωση 11a συντέθηκε και

δεδομένα φασματομετρίας μάζας (Σχήματα S1 και S2) 1H-NMR και επιβεβαίωσε τη σωστή μοριακή δομή και το μοριακό βάρος του 11α. TLX, COUP-TFI και COUP-TFII βρίσκονται στην ίδια υποοικογένεια πυρηνικό υποδοχέα ως PNR [36], τα οποία δεσμεύονται σε μια άμεση επανάληψη του μοτίβου GGTCA με ένα 2-bp αποστάσεως (DR2) [37]. Προκειμένου να αξιολογηθεί η εξειδίκευση της 11α να PNR, η ενεργοποίηση των PNR και αυτές που συνδέονται στενά με ορφανοί υποδοχείς με 11α συγκρίθηκαν σε μια δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης DR2 καθοδηγείται (Εικόνα 1Β και 1Γ). κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης για PNR [13], TLX [38], COUP-TFI [39] ή COUP-TFII [39] και ένα DR2 καθοδηγείται γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης, και τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με 11α χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 15 ηΜ έως 150 ηΜ για να ελαχιστοποιηθεί το κυτταροτοξικό αποτέλεσμα. Στα 15 ηΜ, 11α δεν ενεργοποιούν καμία από τις πυρηνικών υποδοχέων που ελέγχθηκαν. Καθώς η συγκέντρωση αυξάνεται, 11α ελαφρώς ενεργοποιηθεί TLX, COUP-TFI και COUP-TFII με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, η ενεργοποίηση PNR παρατηρήθηκε μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (& gt? 150 ηΜ) (Σχήμα 1Β). Σημειώσαμε ότι οι συγκεντρώσεις της 11a μεγαλύτερο από 150 nm ήταν κυτταροτοξικά και επάγεται σοβαρή κυτταρικό θάνατο, η οποία περιόρισε την ακρίβεια της δοκιμασίας λουσιφεράσης ανταποκριτή. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η 11α δεν έχει προφανή αγωνιστικά αποτελέσματα προς PNR. Επειδή PNR ήταν το λιγότερο ενεργοποιηθεί μεταξύ των τεσσάρων πυρηνικών υποδοχέων δοκιμάστηκε στο ενδεικνυόμενο εύρος συγκεντρώσεων 11α (σχήμα 1Γ), τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξειδίκευση του 11α προς PNR είναι χαμηλή και η αγωνιστικότητα των 11α δεν είναι πιθανώς μια άμεση επίδραση, όπως φαίνεται στη μελέτη απελευθέρωση NCOR όπου 11α ανέστειλε επίσης ΤΡβ-NCOR και τις αλληλεπιδράσεις RARα-NCOR [32].

(Α) Χημική δομή 11α. κύτταρα ΗΕΚ293Τ που μορφομετατρέπονται με τα υποδεικνυόμενα κατασκευάσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν με 0,1% DMSO, 15 ηΜ, 30 ηΜ, 60 ηΜ, 120 ηΜ ή 150 ηΜ 11α. Τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετικές μονάδες της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε με το μάρτυρα DMSO ± SD. (Β) Σύγκριση μεταξύ των διαφορετικών πυρηνικών υποδοχέων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 11α. (Γ) Σύγκριση μεταξύ διαφόρων δόσεων 11α με διαφορετικές πυρηνικούς υποδοχείς.

Η

Επειδή 11a ενεργοποιείται PNR που σχετίζονται με πυρηνικούς υποδοχείς COUP-TFI και COUP-TFII στη δοκιμασία λουσιφεράσης DR2 σε σχετικά χαμηλή συγκέντρωση 30 ηΜ (Σχήμα 1) και μόνο COUP-TFII μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλα καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [40], εξετάσαμε αν 11α θα μπορούσε να μεταβάλλει την έκφραση του COUP-TFII γονιδίων κατάντη στόχου σε MCF7 και T47D, δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με θετικούς ΕΚα . COUP-TFII έχει εμπλακεί σε διάφορους καρκίνους τόσο για ογκογόνο και όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα [41]. Στα καρκινικά κύτταρα του μαστού, RARB2 [42,43] και NGFI-Α [44,45] είναι δύο καλά χαρακτηρίζεται άμεσοι στόχοι up-ρυθμίζεται από COUP-TFII. All-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι αυξάνουν COUP-TFII επίπεδο mRNA, καθώς και την ενίσχυση της γονιδιακής έκφρασης κατάντη στόχου COUP-TFII [46]. Πράγματι, 1 μΜ atRA βρέθηκε να αυξάνει COUP-TFII επίπεδο mRNA με περίπου 1,5- και 2,5-φορές σε MCF7 και T47D κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα S3). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και 11α δεν αύξησε τα επίπεδα COUP-TFII mRNA στα δύο κυτταρικές σειρές, η θεραπεία είχε σαν αποτέλεσμα 11α πάνω ρύθμιση των γονιδίων στόχων COUP-TFII. Στην κυτταρική σειρά MCF7, 0.1 μΜ 11α επάγεται NGFI-A γονιδιακής έκφρασης σε ένα παρόμοιο επίπεδο με 1 μΜ atRA. 1 μΜ 11α επάγεται NGFI-Α έκφραση ~ 5 φορές πάνω από αυτή του 1 μΜ atRA (Σχήμα S3A). Επειδή NGFI-Α έκφραση είναι πολύ χαμηλή για να ανιχνευθούν σε κύτταρα T47D, μετρήσαμε ένα άλλο γονίδιο στόχο COUP-TFII, RARB2. Σε κύτταρα T47D, atRA αυξήθηκαν σημαντικά το επίπεδο RARB2 mRNA από 30 φορές. Αν και 11α αύξησε επίσης την έκφραση RARB2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, το μέγεθος της ενεργοποίησης δεν ήταν συγκρίσιμη με atRA (Σχήμα S3b). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πιθανώς 11α ρυθμίζει δραστικότητα COUP-TFII σε ένα γονίδια και κυττάρου-ειδικό τρόπο.

Δεδομένου ότι επάγεται 11α κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις και PNR δείχθηκε να διεγείρει απόπτωση σε διάφορους τύπους κυττάρων [ ,,,0],28], θα διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον ήταν PNR μεσολάβηση 11α-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Επειδή PNR είναι μη ανιχνεύσιμη με κηλίδωση Western σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, αρκετές σταθερές καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές υπερέκφραση PNR, MCF7, MDA-MB-231, LM2 [34] και MDA-MB-468 κύτταρα, παράχθηκαν (Σχήμα 2Α). ΜΤΤ δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρου στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η IC

50 τιμές για 11α σε GFP-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τον έλεγχο και PNR που υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές. Τα IC

50 τιμές στα κύτταρα που υπερεκφράζουν PNR ήταν παρόμοιες με τις αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Σχήμα 2Β-Ε), με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 0,05 έως 0,7 μΜ. Επειδή PNR υπερέκφραση δεν επηρέασε 11α κυτταροτοξικότητα σε οποιοδήποτε από τα κύτταρα που δοκιμάστηκαν, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η 11α-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα είναι πιθανόν ανεξάρτητο του PNR σε αυτά τα κύτταρα.

(α) Καρκίνος του μαστού κύτταρα μολύνθηκαν με ρετροϊούς που εκφράζουν GFP ή PNR. έκφραση PNR ανιχνεύθηκε στο κηλίδος Western και Hsp90 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) MCF7, (Γ) MDA-MB-231, (D) LM2 και (Ε) MDA-MB-468 κύτταρα καρκίνου του μαστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 11 α 10

-8 να 10

-3 Μ για 72 ώρες, και 11α IC

50 τιμές ελήφθησαν από ΜΤΤ δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

η

11α κυτταροτοξικότητα συσχετίζεται με την ιδιότητα του p53 σε NCI-60 κυτταρικές σειρές

για να περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού της κυτταροτοξικότητας και των κυτταρικών στόχων του 11α, χρησιμοποιήσαμε την Αναπτυξιακή Therapeutics Program (DTP) NCI-60 υπηρεσία ελέγχου κυτταρική γραμμή, μια δημόσια προσβάσιμη υπηρεσία που βοηθά στον καθορισμό ένωση κυτταροτοξικότητα σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών 60 του καρκίνου, για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα της 11a σε 60 κυτταρικές γραμμές [47]. Τα στοιχεία 11α κυτταροτοξικότητας για 58 του NCI-60 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από DTP και GI είναι

50 δεδομένα φαίνονται στα Σχήματα S4-S6. Αυτή η μελέτη αποτελούνταν από 60 κυτταρικές σειρές από 9 διαφορετικούς τύπους καρκίνου: λευχαιμία, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, του καρκίνου του παχέος εντέρου, καρκίνο του ΚΝΣ, μελάνωμα, καρκίνο των ωοθηκών, νεφρικό καρκίνο, καρκίνο του προστάτη και του καρκίνου του μαστού. Η δοκιμασία σουλφοροδαμίνης-Β (SRB) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η GI

50 (50% αναστολή ανάπτυξης) τιμές των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Παρά το ευρύ φάσμα των κυτταρικών σειρών που εμπλέκονται, η GI

50 τιμές 11α έπεσε σε ένα στενό εύρος (10

-6-10

-5 Μ). Από προηγούμενη μελέτη μας προτείνει ότι PNR σταθεροποιεί p53 από την μετα-μεταφραστική τροποποίηση σε HeLa και κυτταρικές σειρές HCT116 [28], εξετάσαμε έπειτα αν η ευαισθησία 11α συσχετίστηκε με επίπεδο έκφρασης p53 ή κατάσταση μετάλλαξης. Η κατάσταση μετάλλαξης της ρ53 των κυτταρικών γραμμών NCI-60 προσδιορίστηκε προηγουμένως [48]. Τα 58 κυτταρικές σειρές που λάβαμε GI

50 δεδομένα από DTP μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: ρ53 άγριου τύπου και ρ53 μεταλλαγμένη /null (Πίνακας 1). Με τη σύγκριση της GI

50 τιμές των δύο ομάδων (Σχήμα 3), βρήκαμε ότι κυτταρικές σειρές ρ53 άγριου τύπου ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα από ρ53 μεταλλαγμένη ή null κυτταρικές σειρές, με μέση GI

50 τιμές 12,0 μΜ και 19,9 μΜ αντίστοιχα (p = 0,039, δύο όψεων). Αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν p53 ως υποθετικό καθοριστικός παράγοντας της 11α-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

P53 WT

p53 Mut /Null

CELL LINE

πυκνό. (ΜΜ)

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΡΑΜΜΗ

πυκνό. (ΜΜ)

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΡΑΜΜΗ

πυκνό. (ΜΜ)

ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΡΑΜΜΗ

πυκνό. (µM)

SR12.70HL-608.27KM1220.90OVCAR-551.50A54916.20K-5623.59SW-62030.50OVCAR-813.30NCI-H46018.20MOLT-47.36SF-26838.20ADR-RES3.16HCT-1165.39RPMI-82261.24SF-2955.27SKOV340.20LOX IMVI7.10EKVX2.84SF-53924.20786-021.10MALME-3M20.90HOP-6219.40SNB-1932.40RXF 39326.30SK-MEL-51.28HOP-9217.60SNB-7518.50SN12C27.50UACC-2573.46NCI-H22616.90U25121.40TK-1029.80UACC-6221.40NCI-H237.49M1416.80PC-312.10A49811.60NCI-H322M54.80MDA-MB-43514.50DU-14537.90ACHN13.70NCI-H52213.60SK-MEL-222.80MDA-MB-23116.50CAKI-114.20COLO 20512.40SK-MEL-2818.50HS578T53.40UO-3116.90HCC-299822.30IGROV124.20BT-5492.00MCF74.35HCT-1516.80OVCAR-315.70T-47D6.34average GI5011.96HT2915.90OVCAR-411.00average GI5019.92Table 1. 11α αποτελέσματα κυτταροτοξικότητας για τις κυτταρικές σειρές 58 στο NCI60 διαλογής κυτταρική σειρά

GI

50 αξίες και την κατάσταση p53 (WT: άγριου τύπου? Mut /Null.: μεταλλαγμένα ή null) εμφανίζονται για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι CSV Λήψη CSV

11α GI

50 τιμές (μΜ) συναρτήσει του p53 WT και Mut /Null ομάδες στο διάγραμμα κουτί. Οι ελάχιστες και μέγιστες τιμές, διάμεσες τιμές και μέσες τιμές που παρουσιάζονται. δοκιμή σημαντικότητα διεξήχθη με δύο όψεων unpaired δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon. *, Ρ & lt?. 0.05

Η

Η απόπτωση δεν είναι ο κύριος μηχανισμός που αντιπροσωπεύουν 11α-διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα

Για να μελετηθεί ο μηχανισμός της επαγόμενης 11α κυτταροτοξικότητας, επιλέξαμε τρεις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με αντιπροσωπευτική κατάσταση μετάλλαξης του p53: SKOV3 (p53 null), Α2780 (ρ53 άγριου τύπου) και OVCAR3 (μετάλλαξη p53, p.R248Q) [49]. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 11α (0 έως 1 μΜ), και η αναλογία διασπασμένη PARP προς το συνολικό PARP χρησιμοποιήθηκε ως ένας δείκτης της απόπτωσης [50]. Η δοξορουβικίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα SKOV3 (Σχήμα 4Α). Ακόμη και στις υψηλότερες συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν, μόνο μέτρια 11α επαγόμενη διάσπαση PARP σε κύτταρα SKOV3 αλλά όχι σε Α2780 ή κύτταρα OVCAR3 (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, το βασικό επίπεδο διασπασμένη PARP ήταν επίσης υψηλότερη σε κύτταρα SKOV3 σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές. Για να διερευνηθεί ποσοτικά το αποπτωτικό αποτέλεσμα 11α, διπλή χρώση αννεξίνης V /PI διεξήχθη. Σύμφωνα με τις δοκιμασίες που διασπάται-PARP, 11α μόνο μέτρια επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα SKOV3, αλλά όχι σε Α2780 ή OVCAR3 κύτταρα χρησιμοποιώντας ετοποσίδη ως θετικός έλεγχος (Σχήμα 4Β και σχ S7). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην κυτταρική σειρά MCF7 καρκίνου του μαστού, όπου και οι δύο δοξορουβικίνη και σταυροσπορίνη επάγεται σημαντική απόπτωση ενώ 11α δεν διεγείρει απόπτωση στις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν (Σχήμα 4C και 4D). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση δεν είναι ο κύριος μηχανισμός που αντιπροσωπεύουν 11α-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

SKOV3, Α2780 και OVCAR3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Α) και MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις της 11a ή δοξορουβικίνη για 24 ώρες. Σύνολο κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν για διάσπαση PARP χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΡΑΚΡ σε κηλίδες Western. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των μη διασπάται και διασπάστηκε πρωτεϊνών ΡΑΚΡ. (Β) και (Δ) Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με 2 μΜ 11α, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V /PI και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής. 50 μΜ ετοποσίδη (Β) ή 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS) (D) χρησίμευσαν ως θετικοί έλεγχοι για την απόπτωση. Η στατιστική σημαντικότητα εμφανίζονται ως ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO

Η

11α προκαλεί G

1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε p53-εξαρτώμενο τρόπο

από 11α απέτυχε να επάγει σημαντική απόπτωση σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, υποθέσαμε ότι 11a επαγόμενη κυτταροτοξικότητα μπορεί να αποδοθεί στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, το οποίο θα μπορούσε να προκαλέσει αναστολή της ανάπτυξης, όπως καθορίζεται από την σουλφοροδαμίνης Β (SRB) χρωματομετρική ανάλυση που χρησιμοποιείται για την NCI-60 κυτταρική γραμμή διαλογής κυτταροτοξικότητα. Για να διακρίνουμε περαιτέρω εάν 11α κυτταροτοξικότητα συσχετίζεται με την ιδιότητα του p53, ορθοκολικό καρκίνο ισογονιδιακές HCT116 p53 + /+ και ρ53 HCT116 – /- χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές γραμμές [35]. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά ισογονιδιακές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν διαφορετική ευαισθησία στο 11α. Η ρ53 άγριου τύπου κυτταρική σειρά (IC

50 = 0.0337 μΜ) ήταν περίπου 10 φορές πιο ευαίσθητη από την p53 κυτταρική μηδενική γραμμή (IC

50 = 0.3188 μΜ) σε ένα πιλοτικό οθόνη που εκτελούνται από το Screening μικρό μόριο και Σύνθεση διευκόλυνση (SMSSF) του Πανεπιστημίου του Wisconsin (Εικόνα 5Α). Η διαφορική ευαισθησία επιβεβαιώθηκε αργότερα με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ πολλαπλασιασμού όπου ρ53 άγριου τύπου κύτταρα (IC

50 = 0.36 μΜ) ήταν περισσότερο ευαίσθητα από τα μηδενικά κύτταρα p53 (IC

50 = 1.76 μΜ) (Εικόνα 5Β). Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός με τον οποίο οι δύο ισογονιδιακές κυτταρικές γραμμές έδειξαν διαφορική ευαισθησία σε 11α, αξιολογήσαμε τις αποπτωτικά αποτελέσματα της 11a σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 11α για 24 ώρες, και η απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία PARP-διάσπασης, στα οποία η αναλογία διάσπασης PARP δείχνει την αποπτωτική κατάσταση. Το σχήμα 5C δείχνει ότι μόνο μέτρια διάσπαση PARP παρατηρήθηκε είτε σε p53 + /+ ή p53 – κύτταρα HCT116 – /. Να εξετάσει κατά πόσον PARP έπαιξε ρόλο στην 11α κυτταροτοξικότητα, είμαστε συν-κατεργασμένα κύτταρα με 11α και 3-αμινοβενζαμιδίου (3-ΑΒ), ένας ειδικός αναστολέας PARP [51]. αναστολή PARP δεν επηρέασε την κυτταροτοξικότητα της 11a (Σχήμα 5D), υποδεικνύοντας ότι διαμεσολαβείται 11α κυτταροτοξικότητα ήταν ανεξάρτητη δραστηριότητας PARP. Η αποπτωτική δράση της 11a εξετάστηκε περαιτέρω με χρώση Αηηβχίη V /PI. Ενώ σταυροσπορίνη προκάλεσε σοβαρή απόπτωση, 11α δεν προκάλεσε καμία απόπτωση στα ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με DMSO έλεγχο (Σχήμα 5Ε). Επειδή πρωτεΐνη PNR δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε αυτά τα κύτταρα, θα υπερ-εκφράζεται PNR ακολουθούμενη από επεξεργασία με 11α. Τα αποτελέσματά μας ενίσχυσε ότι η αποπτωτική επίδραση ήταν ανεξάρτητη από PNR (Σχήμα 5F)

(Α) IC

50 τιμές 11α σε p53 + /+ και p53 -. /- HCT116 κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν εις τετραπλούν σε πλάκες 384-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις 11α για 7 ημέρες. Η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίστηκε με δοκιμασία φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας CellTiter Glo. (Β) IC

50 τιμές της 11a εξετάστηκαν με τους προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ μετά από 72 ώρες επώαση με 11α. (Γ) Οι δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0, 1, 10, 100 ή 1000 ηΜ 11α για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΡΑΚΡ για την ανίχνευση διάσπασης PARP. Hsp90 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις 11α παρουσία ή απουσία 2 πιΜ 3-αμινοβενζαμίδιο (3-ΑΒ) για 72 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε δοκιμασίες ΜΤΤ. (Ε) Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με 1 μΜ 11α, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V /PI και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής. 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για απόπτωση. Η στατιστική σημαντικότητα εμφανίζονται ως ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του DMSO. (F) Οι δύο κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μα GFP ή PNR για 24 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με DMSO ή 1 μΜ 11α για άλλες 24 ώρες. κηλίδα Western διεξήχθη για να εξετάσει τη διάσπαση PARP.

Η

Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η 11α θα μπορούσε να έχει πιο βαθιές επιπτώσεις στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου από την απόπτωση. Για να εξεταστεί αν επάγεται 11α διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα συγχρονίστηκαν στο G

0 /G

1 φάση με ασιτία ορού για 24 ώρες. Το Σχήμα 6 δείχνει τα αποτελέσματα της ανάλυσης προφίλ κυτταρικού κύκλου των κυττάρων HCT116 σύγχρονη αγωγή με DMSO ή 50 ηΜ 11α αμέσως μετά την απελευθέρωση της στέρησης ορού. Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, η πλειονότητα των κυττάρων ήταν σε φάση S μετά από 12 ώρες (64% για + /+ κύτταρα ρ53 και 58% για ρ53 – /- κύτταρα), και τα κύτταρα επιστρέφονται στο G

1 φάση 24 ώρες αργότερα. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με το φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο των 24 ωρών για αυτές τις ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, όταν τα συγχρονισμένα ρ53 κύτταρα άγριου τύπου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ 11α, μια συγκέντρωση κοντά στην κυτταροτοξικότητα IC

50 33,7 nm, G

1 /S διακοπή του κυτταρικού φάση κύκλου τητα για μέχρι και 24 ώρες ( Σχήμα 6Β). Μετά τη θεραπεία με 11α για 12 ώρες, μόνο το 10% των κυττάρων επέστρεψε στην φάση S σε σύγκριση με το 64% που έλαβαν θεραπεία με DMSO, και η πλειονότητα των κυττάρων που 11a-αγωγή συνελήφθησαν σε G

0 /G

1 φάση (87%). Το G

1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου φάση διατηρήθηκε μετά από 24 ώρες (Σχήμα 6Β).