Αφηρημένο

αναστολείς της τυροσινικής κινάσης όπως erlotinib χρησιμοποιούνται συνήθως ως θεραπευτικό μέσο κατά του καρκίνου λόγω της σχετικά χαμηλής παρενέργεια της προφίλ και, μερικές φορές, μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, η αντίσταση erlotinib (ER) σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα είναι να αναγνωριστεί ως μείζον πρόβλημα. Ως εκ τούτου, είναι η κατανόηση του μηχανισμού πίσω ER και η ανάπτυξη αποτελεσματικών σχήματα χρειάζεται. ρόλο αυτοφαγία σε καρκίνο του υπήρξε αμφιλεγόμενη και παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα του συνδυασμού erlotinib-σισπλατίνη χαμηλή δόση στην erlotinib κύτταρα ανθεκτικά αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (ERPC9) και ο ρόλος των αυτοφαγία στο ER. κύτταρα ERPC9 καθιερώθηκαν από erlotinib ευαίσθητα κύτταρα PC9. Κατάλληλες αγωγές έγιναν πάνω από δύο ημέρες και η επιβίωση των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση Alamar Blue. LC3II και ρυθμιστικές πρωτεΐνες του αυτοφαγία μετρήθηκαν με κηλίδα western. Μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει τη μετάφραση της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος. Σε κύτταρα ERPC9, συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται συνεργιστική κυτταρικό θάνατο και μια σημαντική μείωση στην αυτοφαγία. Κατά την έναρξη, τα κύτταρα ERPC9 είχαν σημαντικά υψηλότερο LC3II και χαμηλότερα επίπεδα ρ-mTOR σύγκριση με τα κύτταρα PC9. Η προσθήκη της ραπαμυκίνης αυξημένη αντοχή και 3-μεθυλαδενίνη ευαισθητοποιημένα κύτταρα ERPC9, υποδεικνύοντας αυτοφαγία μπορεί να ενεργεί ως ένας προστατευτικός μηχανισμός. Περαιτέρω εξέταση έδειξε ότι τα κύτταρα ERPC9 έτρεφε υψηλά αρχικά επίπεδα Atg3. Η υψηλή βασική Atg3 ήταν στοχοθετημένη και μείωσε σημαντικά με τη θεραπεία συνδυασμού. siRNA επιμόλυνση Atg3 είχε ως αποτέλεσμα την αντιστροφή του ER? 42,0% περισσότερα κύτταρα πέθαναν σε erlotinib-alone θεραπεία με την επιμόλυνση σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα ERPC9. Εμείς αποκαλύπτουν ένα νέο ρόλο για Atg3 στην προώθηση της ER ως η αναστολή της μετάφρασης Atg3 ήταν σε θέση να οδηγήσει στην εκ νέου ευαισθητοποίηση των κυττάρων ERPC9 με την erlotinib-alone θεραπεία. Επίσης, έχουμε αποδείξει ότι ο συνδυασμός της erlotinib-σισπλατίνη είναι μια αποτελεσματική θεραπεία κατά του καρκίνου erlotinib ανθεκτικά στοχεύοντας (κάτω-ρύθμισης) Atg3 μεσολάβηση αυτοφαγία και την επαγωγή της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

Παράθεση:. Lee JG, Wu R (2012) συνδυασμός Η erlotinib-Cisplatin και Atg3 Μεσολαβεί Autophagy στο Erlotinib Ανθεκτικό Καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (10): e48532. doi: 10.1371 /journal.pone.0048532

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός και η κατανόηση του ρόλου των αυτοφαγία σε ER είναι σημαντική.

Προκειμένου να βελτιωθεί η θεραπεία του NSCLC, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε το μοριακό μηχανισμό υποκείμενων ER και να βρούμε σχήματα που είναι αποτελεσματικές στην αντιμετώπιση ανθεκτικών erlotinib καρκίνων . Έτσι, στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού erlotinib-σισπλατίνη χαμηλής δόσης στην erlotinib ανθεκτικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και να καθορίσει το ρόλο της αυτοφαγία στο ER. Μπορούμε επίσης να προσδιορίσει ένα βασικό ρυθμιστικής πρωτεΐνης στο μονοπάτι αυτοφαγία που είναι σε θέση να διαμορφώνει ER.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Ένα erlotinib κυτταρική γραμμή ευαίσθητη PC9 , ένα ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα με υπερέκφραση του EGFR, ήταν ευγενικά προικισμένος από τον Δρ Halmos (Πανεπιστήμιο Columbia) [24]. Αυτό διατηρήθηκε σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) με αντιβιοτικά Αντιμυκητιασική (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η ERPC9 κυτταρική σειρά ιδρύθηκε από καλλιέργεια κυττάρων PC9 σε 5% FBS μέσο καλλιέργειας που περιέχει erlotinib. Τα κύτταρα αρχικά διατηρείται σε συγκέντρωση erlotinib 33 ηΜ (IC50) και η δόση αυξάνεται σταδιακά σε μια περίοδο 12 εβδομάδων μέχρι την τελική συγκέντρωση της erlotinib ήταν 10 μΜ. Στη συνέχεια, με τη χρήση τεχνικών κλωνοποίησης μονοκύτταρους στην οποία μόνο ενεργά διαιρούμενα κύτταρα επιλέχθηκαν (υποδεικνύοντας αντίσταση), καθορίστηκαν τα κύτταρα ERPC9. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ERPC9 διατηρήθηκαν σε 10% FBS σε μέσο RPMI 1640 που περιέχει την τελική συγκέντρωση εγκατεστημένος erlotinib 10 μΜ.

* Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ανάλυση Alamar Blue. Η ομάδα ελέγχου ενήργησε ως το πρότυπο για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον κυτταρικό θάνατο. (Α) σε κύτταρα ERPC9, συνδυασμός θεραπείας που επάγεται σημαντικά περισσότερο κυτταρικό θάνατο από ενιαίο φαρμακευτικές αγωγές (ρ & lt? 0,0001). Η erlotinib-alone οδήγησε σε 96,6% επιβίωση, σισπλατίνη, 89,3%, και ο συνδυασμός 61,1%? αυτό το αποτέλεσμα ήταν συνεργική (CI 0,12). (Β) Στα μητρικά κύτταρα PC9, συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται σημαντικά περισσότερο κυτταρικό θάνατο από μόνο φαρμακευτικές αγωγές (p & lt? 0,0001) erlotinib-alone οδήγησε σε 79,6% επιβίωση, σισπλατίνη 76,1%, και ο συνδυασμός 49,6%? αυτό το αποτέλεσμα ήταν συνεργική (CI 0,45). (Γ) Σε κύτταρα ΝΗΒΕ, ερλοτινίμπη μόνη, μόνη τη σισπλατίνη, και η θεραπεία συνδυασμού αποδειχθεί ελάχιστο κυτταρικό θάνατο ή αλλαγή στη βιωσιμότητα μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (p = 0,958), υποδεικνύοντας ελάχιστη τοξικότητα με τη συνδυαστική θεραπεία.

Η

Κανονική ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά ιστών ελήφθησαν από το Εθνικό Disease Research Interchange (Philadelphia, ΡΑ) [25] – [27]. Οι ιστοί δεν συλλέχθηκαν από ασθενείς με διάγνωση πνευμονοπάθειες που σχετίζονται. βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα πρωτεάσης-διαχωριστεί απλώθηκαν σε θαλάμους φρεατίων (Corning? 24 χιλιοστά) σε 5 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε βρογχικά επιθηλιακά μέσο ανάπτυξης (Lonza). Μετά από 4-7 ημέρες σε ένα βυθισμένο συνθήκη καλλιέργειας ή όταν καλλιέργειες έφθασαν σε συρροή, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε έναν αέρα-υγρού (ALI) συνθήκη καλλιέργειας σε F12 του Ham ενός /DMEM (1:01) με την προσθήκη των ακόλουθων οκτώ παράγοντες: τρανσφερίνης (5 μg /ml), ινσουλίνη (4 μg /ml), τοξίνη χολέρας (20 ng /ml), επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (10 ng /ml), δεξαμεθαζόνη (0.1 μΜ), εκχύλισμα υποθαλάμου των βοοειδών (15 μg /ml) , BSA (0,5 mg /ml), και all-

trans-ρετινοϊκό οξύ

(30 ηΜ), η οποία διευκόλυνε την πόλωση και βλεννοκροσσωτού επιθηλίου διαφοροποίηση. κύτταρα ΝΗΒΕ καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες μετά τη μεταφορά σε ALI. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO2.

* (Α) Τα επίπεδα Autophagy αξιολογήθηκαν από western blot για LC3II και ρ62. (Β) κύτταρα ERPC9 είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι LC3II σε κύτταρα PC9 (p = 0,030) και σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ρ62 παρά σε κύτταρα PC9 (ρ & lt? 0.0001)? υποδεικνύοντας υψηλότερα αρχικά επίπεδα αυτοφαγία στα κύτταρα αντίσταση erlotinib. Να συμπίπτει, μπορεί να φανεί ότι υπήρχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα των LC3I στα κύτταρα ERPC9 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC9 (p = 0,008)

Η

Ναρκωτικά:. Οι τιμές IC50 και θεραπεία Ομάδες

Η σισπλατίνη , ραπαμυκίνη και 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA), και erlotinib αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals (Huston, ΤΧ, USA). 3-MA διαλύθηκε σε νερό και όλα τα άλλα φάρμακα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για να σχηματίσουν συγκεντρώσεις στοκ σισπλατίνης 10 mM, 10 μΜ erlotinib, ραπαμυκίνης 27,4 mM, και 3-ΜΑ 100 mM. 3-ΜΑ παρασκευάζεται φρέσκο ​​κάθε φορά και άλλα φάρμακα διατηρήθηκαν στους -20 ° C και όλα αραιώθηκαν σε κατάλληλη συγκέντρωση πριν από τη χρήση. Η διάρκεια της θεραπείας για όλα τα πειράματα αποτελούνταν από δύο ημέρες. Τα κύτταρα πρώτα επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν με 10% FBS σε μέσο RPMI 1640 για 24 ώρες πριν από την έναρξη της θεραπείας για να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν στην πλάκα. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με 0.1% FBS σε μέσο RPMI 1640 που περιέχει κατάλληλες συγκεντρώσεις φαρμάκου για δύο ημέρες. Κατά τον προσδιορισμό των αξιών IC, πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν και οι αποκρίσεις δόσης έγιναν μέσω της χρήσης των ευαίσθητων κυττάρων PC9 με κατεργασία κυττάρων σε ένα σειριακό φάσμα συγκεντρώσεων φαρμάκου για κάθε φάρμακο (erlotinib ή σισπλατίνη). Επίσημη ομάδες θεραπείας αποτελούνταν από ένα 2 × 2 παραγοντικό πειραματικό σχεδιασμό [28]: ελέγχου (0,1% DMSO), erlotinib (10 ηΜ), σισπλατίνη (3 μΜ), και ο συνδυασμός της erlotinib και σισπλατίνη (10 ηΜ + 3 μΜ). Επίσημη φαρμακευτικές αγωγές διεξήχθησαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές PC9 και ERPC9 υποβλήθηκαν φαρμακευτικές αγωγές. Πειράματα που απαιτούν τη χρήση της ραπαμυκίνης και 3-ΜΑ υποβλήθηκαν το ίδιο πρωτόκολλο.

* επίπεδα Autophagy μετρήθηκαν μέσω Western Blot για LC3II. (Α & amp? C) σε κύτταρα ERPC9, υπήρξε μια σημαντική μείωση στην LC3II με θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με άλλες ομάδες (p = 0,011). Η μείωση του LC3II ήταν συνεργική με τη συνδυαστική θεραπεία, αντανακλώντας την ίδια συνεργιστική τάση για κυτταρικό θάνατο. (Β) Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα LC3II σε κύτταρα ΝΗΒΕ (p = 0.958). (D) Σημαντικά μεγαλύτερη LC3II (πράσινο) φθορισμό παρατηρήθηκε σε ERPC9 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα PC9 (p & lt? 0,0001). Σε ERPC9 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία συνδυασμού, μια σημαντική μείωση στην πράσινου φθορισμού παρατηρήθηκε σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες (ρ & lt? 0,0001). Πράσινο = LC3 και το Μπλε = DAPI.

Η

Κυττάρου Βιωσιμότητας Δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το μπλε Δοκιμασία Alamar (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Με την ολοκλήρωση της φαρμακευτικής αγωγής, το αρχικό μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε 10% Alamar Μπλε χρωστική και επωάστηκαν για 1 ώρα σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 5% CO2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και του θανάτου μετρήθηκαν στη συνέχεια στα 530 nm μήκος κύματος διέγερσης και 590 nm εκπομπής χρησιμοποιώντας Packard Fluorocount. Η αναλογία της κυτταρικής βιωσιμότητας υπολογίστηκε με την εξίσωση ως εξής: α. (Απορρόφηση της ομάδας θεραπείας) /(απορρόφηση της ομάδας ελέγχου) χ 100

* Η ραπαμυκίνη και 3-ΜΑ, χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του ρόλου του αυτοφαγία και η σύνδεσή της με την αντίσταση erlotinib. Κατάλληλες ομάδες υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε (Α) 10 ηΜ ραπαμυκίνης ή (Β) 5 μΜ 3-ΜΑ με θεραπεία συνδυασμού φαρμάκων. Σε κύτταρα ERPC9, κυτταρική επιβίωση αυξήθηκε 16,5% όταν η ραπαμυκίνη προστέθηκε στη θεραπεία συνδυασμού (p = 0.004). Σε σύγκριση με 3-ΜΑ αγωγή ERPC9 κύτταρα, υπήρξε μια μείωση 10,5% στην κυτταρική επιβίωση σε ομάδα αγωγής συνδυασμού και 9,1% μείωση σε 3-ΜΑ με τη συνδυαστική θεραπεία (ρ = 0,032 και ρ = 0,037, αντίστοιχα). (Γ) Κατά την 3-ΜΑ προστέθηκε με την erlotinib-μόνο (p & lt? 0.0001) και σισπλατίνη μόνη (p & lt? 0.0001) θεραπεία εκεί ήταν ένα 39,2% και 31,0% μεγαλύτερο κυτταρικό θάνατο, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τη θεραπεία με ενιαία φαρμακευτική αγωγή μόνη της .

Η

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Millipore, Billerica, ΜΑ) που περιέχει ένα συνδυασμό αναστολέα πρωτεάσης και κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Sigma-Aldrich) . Υποβλήθηκαν σε λύση πρωτεΐνες φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις 14.000 rpm στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα ποσοτικοποιήθηκαν ως προς την περιεκτικότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας Bio-Rad DC Kit Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA) και ένα φασματοφωτόμετρο μετράται στα 650 nm. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια διαχωρίζονται από μία γέλη 4~20% κλίση SDS /PAGE (Thermo Fisher Scientific, Newington, ΝΗ) και μεταφέρθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Bio-Rad). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιέχει 0,05% Tween20 (TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντι-Ρ62 (1:1000, Millipore) , -LC3, -Beclin 1, ρ-Akt, -Akt, π-mTOR, -mTOR, -Atg3, -Atg7, -Atg5-12 συγκρότημα (1:1000, Cell σηματοδότησης, Boston, MA), un-διασπαστεί και -cleaved κασπάσης 3, un-διασπάται και -cleaved PARP (1:500, κυτταρική σηματοδότηση), σε 2,5% άπαχο γάλα σε TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν 30 λεπτά (χ3) με TBST και ανιχνεύθηκε με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:2000, κυτταρική σηματοδότηση) σε 2,5% άπαχο γάλα σε TBST για 1 ώρα σε RT. Για να καθοριστεί ίση φόρτωση και να τυποποιήσουν την ποσότητα της πρωτεΐνης που φορτώνονται, κηλίδες ακολούθως απογυμνώνεται και επανα-στυπώθηκαν με αντι-β-ακτίνης ποντικού μονοκλωνικό (Sigma-Aldrich) και η αναλογία της έντασης ζώνης (μέγεθος Χ πυκνότητα) που ενδιαφέρει με ελήφθησαν σχετίζεται β-ακτίνης του. Συγκροτήματα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας Fuji 4000 λογισμικού ή μέσω φιλμ.

* (Α) Western στύπωμα της ρ-Ακί, Akt, ρ-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12, ATG7, και Atg3 δείχνονται . (Β) Υπήρχε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα Atg3 στα κύτταρα ERPC9 σύγκριση με κύτταρα PC9 (p = 0,018) και (Γ) σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο p-mTOR (p = 0,021) περαιτέρω επικύρωση ότι τα επίπεδα αυτοφαγία είναι υψηλότερα σε κύτταρα ERPC9.

Knock Down του Atg3 από siRNA η επιμόλυνση

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύουν ειδικά τα ανθρώπινα Atg3 ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA). ERPC9 και PC9 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες (6 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επιμολύνονται με Atg3 siRNA για 24 ώρες σε αντιβιοτικό media ελεύθερη ανάπτυξη? χρησιμοποιώντας siRNA Lipofectamine RNAiMAX και ΟΡΤΙ-ΜΕΜ Ι-μειώνεται από ορό μέσο (Invitrogen). Διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

* (Α) p-Akt, Akt, π-mTOR, mTOR, Beclin 1, Atg5-12, ATG7 και Atg3 μετρήθηκαν μέσω της ανάλυσης κηλίδος western. (Β) με τη συνδυαστική θεραπεία erlotinib-σισπλατίνη, υπήρξε μια σημαντική αλλαγή μόνο σε Atg3? επίπεδο Atg3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες (p = 0,028). Αυτό υποδηλώνει ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να στοχεύει στην βασική γραμμή υπερέκφραση Atg3 σε κύτταρα ERPC9.

Η

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές, και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 15 λεπτά σε RT. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται εκ νέου με PBS δύο φορές, επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 0.2% Trinol Χ για 5 λεπτά σε RT, και αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (PBS με 3% BSA) για 5 λεπτά σε RT. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα, αντι-LC3 (1:200, κυτταρική σηματοδότηση) όλη τη νύκτα σε 4 ° C σκοτεινό δωμάτιο, πλύθηκαν 3 φορές την επόμενη ημέρα, και επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG Alexa Flour 488 αντίσωμα (1:1000 , Invitrogen) για 1 ώρα σε RT σε ένα σκοτεινό δωμάτιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ, εργαστήρια Vector, Burlingame, CA) προστέθηκε σε χρώση των πυρήνων. Zeiss LSM700 ομοεστιακό (Carl Zeiss, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει τις εικόνες, καθώς και όλες οι εικόνες ελήφθησαν με την ίδια ρύθμιση για να υπάρξει συνέπεια. ανάλυση εικόνας έγινε με τυφλό τρόπο.

* (Α) Αποκλεισμός Atg3 μετάφρασης και autophagy με Atg3 siRNA επιμόλυνση σε κύτταρα ERPC9 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. (Β) Μετά ERPC9 κύτταρα επιμολύνθηκαν με Atg3 siRNA, κύτταρα έγινε σημαντικά πιο ευαίσθητα σε erlotinib (p = 0.043) και συνδυασμού (p = 0,002) θεραπείες φαρμάκου σε σύγκριση με ERPC9 κυττάρων με μη-ειδική διαμόλυνση siRNA. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα δείγματα αγωγή σισπλατίνη, ωστόσο, (ρ = 0.924). (C) Atg3 siRNA επιμόλυνση ήταν σε θέση να παράγει μια σημαντική αύξηση στην ευαισθησία προς την ενιαία φαρμακευτικές αγωγές στην γονική PC9 κυτταρική γραμμή, καθώς και.

Η

Η φαρμακολογική και Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση και προσδιορισμός των σημαντικών διαφορών μεταξύ των ομάδων έγιναν με χρήση t-test δύο ουρά σπουδαστή και ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA), όταν απαιτείται. Όλα στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού πρίσματος (La Jolla, CA). Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική σε αυτή τη μελέτη. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα.

* Η απόπτωση μετρήθηκε μέσω Western Blot για διασπασμένης κασπάσης 3 και PARP διασπάται. (Α & amp? D) σε κύτταρα ERPC9 αγωγή με erlotinib-σισπλατίνη συνδυασμό, μια σημαντική αύξηση της διασπασμένης κασπάσης 3 και PARP διασπάται παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα (p = 0,045 και ρ = 0,007, αντίστοιχα). Επιπλέον, υπήρχαν σημαντική αύξηση διασπασμένης κασπάσης 3 και PARP διασπάται σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες (ρ = 0,030 και ρ = 0,003, αντίστοιχα). (Β & amp? C) Κατά την έναρξη, υπήρχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα τόσο διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη PARP σε ERPC9 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC9 (p & lt? 0,0001 και p = 0,0004, αντίστοιχα)

Η

Εκτός. , μέθοδος Chou-Talalay [29] χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί ο δείκτης συνδυασμού (CI) για την αξιολόγηση για συνέργεια, προσθετικές επιδράσεις ή ανταγωνισμό θεραπείας συνδυασμού της erlotinib και σισπλατίνη (πολύ ισχυρή συνέργεια, ισχυρή συνέργεια, μέτρια συνεργία, ελαφρά συνέργεια, πρόσθετο, και ο ανταγωνισμός ορίστηκαν ως CI & lt? 0.3, 0.3 & lt? CI & lt? 0.7, 0.7 & lt? CI & lt? 0,85, 0,85 & lt? CI & lt? 1, CI = 1, και CI & gt?. 1, αντίστοιχα)

Αποτελέσματα

οι τιμές IC50 σε PC9 και ERPC9 κύτταρα

Η ανασταλτική συγκέντρωση (IC) 50 αξίες της erlotinib και σισπλατίνη είχαν καθιερώθηκε για πρώτη φορά στα κύτταρα PC9 πριν από την εξέταση των επιπτώσεων του συνδυασμού των δύο παραγόντων ως θεραπεία συνδυασμού σε κύτταρα ανθεκτικά erlotinib PC9 (ERPC9). Η αποφασιστική IC50 για erlotinib ήταν 33 ηΜ σε κύτταρα PC9 και 878 ηΜ σε κύτταρα ERPC9 (περίπου 26 φορές υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα PC9) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)? Αυτό επιβεβαιώνει ότι ERPC9 κύτταρα δημιουργήθηκαν με τρόπο που επέτρεψε να γίνουν πιο ανθεκτικά και ενδεχομένως μιμούνται ό, τι φαίνεται κλινικά. Η IC50 σισπλατίνη ήταν 18 μΜ σε κύτταρα PC9 και 40 μΜ σε κύτταρα ERPC9 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεδομένης της σισπλατίνης IC 50 δεν αυξήθηκε σημαντικά, αυτή η περαιτέρω υποστηρίζει ότι τα κύτταρα ERPC9 παρουσιάσει ειδικές αντίσταση στην erlotinib.

Η erlotinib-σισπλατίνη Θεραπεία Συνδυασμού σε ERPC9, PC9, και κανονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα βρόγχου

το Σχήμα 1Α και το Σχήμα 1 Β δείχνουν το ποσοστό των ERPC9 και κυτταρικής επιβίωσης PC9 αφού υποβληθούν σε θεραπείες με φάρμακα διήμερο. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με erlotinib-σισπλατίνη συνδυασμός, 61,1% των κυττάρων επιβίωσαν ERPC9? αυτό ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με erlotinib-μόνο (96,6%) και σισπλατίνη μόνη της (89,3%). Με άλλα λόγια, ο συνδυασμός θεραπείας σκότωσε έναν σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων (38,9%) σε σύγκριση με erlotinib-μόνο (0.4%, ρ = 0,001), σισπλατίνη μόνο (10,7%, ρ = 0,0002) και τον έλεγχο μη-κατεργασμένα κύτταρα (0,0 %, p & lt? 0,0001). Επιπλέον, ο συνδυασμός της θεραπείας που προκαλείται ισχυρή θάνατο συνεργιστική κυττάρων παρά την αντίσταση ERPC9 κύτταρα »στην erlotinib (CI = 0,12, όπως υπολογίζεται με τη μέθοδο Chou-Talalay [29]). Μια παρόμοια τάση της συνεργιστικής κυτταρικού θανάτου παρατηρήθηκε στα γονικών PC9 κυττάρων με erlotinib-σισπλατίνη θεραπεία συνδυασμού? επιβίωση των κυττάρων μετά την erlotinib-μόνη θεραπεία ήταν 79,6%, σισπλατίνη ήταν 76,1%, και ο συνδυασμός ήταν 49,6% (p & lt? 0,0001) (CI = 0,45). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η προσθήκη της σισπλατίνης στην erlotinib μπορεί να είναι ένα αποτελεσματικό σχήμα στη θανάτωση erlotinib ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, ακόμη και σε χαμηλές δόσεις όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό.

Κανονικό κύτταρα ανθρώπινου βρογχικά επιθηλιακά (ΝΗΒΕ) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση η τοξικότητα της θεραπείας συνδυασμού erlotinib-σισπλατίνη. Δύο ημέρες θεραπεία με erlotinib-alone, σισπλατίνη μόνη της, και ερλοτινίμπη-σισπλατίνη συνδυασμός αποδεικνύεται ελάχιστα κυτταρικό θάνατο και σημαντικές διαφορές στον κυτταρικό θάνατο και βιωσιμότητα μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (p = 0,958), υποδεικνύοντας μια ασφαλή θεραπευτικό δείκτη στην τρέχουσα δοσολογία για μη-καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1Γ).

Baseline Autophagy επίπεδα σε ERPC9 κύτταρα

ρόλο Autophagy στον καρκίνο του υπήρξε αμφιλεγόμενη και δεν έχει μελετηθεί με μεγάλη λεπτομέρεια [30]. Για να εξεταστεί ο ρόλος αυτοφαγία στο ER, η σύγκριση των αρχικών επιπέδων του αυτοφαγία μεταξύ ERPC9 και τα κύτταρα PC9 μετρήθηκαν μέσω της ανάλυσης κηλίδος western για LC3II [31] και ρ62. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τα επίπεδα LC3II ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα ERPC9 συγκριτικά με κύτταρα PC9 (p = 0.030). Επιπλέον, τα επίπεδα ρ62 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε κύτταρα ERPC9 από κύτταρα PC9 (ρ & lt? 0,0001). Και τα δύο αυτά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα ERPC9 λιμάνι υψηλότερα αρχικά επίπεδα αυτοφαγία από erlotinib ευαίσθητα κύτταρα PC9.

Συνδυασμός Η erlotinib-σισπλατίνη Θεραπεία και LC3II

Η περαιτέρω εξέταση της θεραπείας συνδυασμού στα κύτταρα ERPC9 αποκάλυψε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα του LC3II σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3C (p = 0,011). Η μείωση των επιπέδων LC3II σε ανάλυση κηλίδος western ήταν συνεργιστική, αντανακλώντας την ίδια συνεργιστική τάση που παρατηρείται σε κυτταρικό θάνατο με τη συνδυαστική θεραπεία. Αυτό υποδηλώνει ότι η αυτοφαγία μπορεί να είναι συνδεδεμένη μηχανισμός ER, και η θεραπεία συνδυασμού ερλοτινίμπη-σισπλατίνη μπορεί να λειτουργήσει με στόχευση αυτοφαγία. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στις LC3II στα κύτταρα ΝΗΒΕ (Σχήμα 3Β).

Οι ίδιες αλλαγές στις LC3II επίσης ορατά μέσω ανοσοφθορισμού (Σχήμα 3D). Υπήρξε μια σημαντική μείωση στο φθορισμό LC3II στα κύτταρα θεραπεία συνδυασμού erlotinib-σισπλατίνη σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες θεραπείας (p & lt? 0.0001).

Διαμόρφωση της Autophagy Alters Ευαισθησία σε θεραπεία

Για να προσδιοριστεί αν αυτοφαγία είναι ένα βασικό μηχανισμό επιβίωσης υποκείμενες ER, αυτοφαγία επαγωγή παράγοντα, ραπαμυκίνη, και παράγοντας αναστολής, 3-ΜΑ, χρησιμοποιήθηκαν. Αν ρόλο αυτοφαγία είναι η προώθηση της αντίστασης και επιβίωσης ενάντια θεραπεία, αναμένεται ότι θα υπάρξει αυξημένη επιβίωση των κυττάρων με επαγωγή αυτοφαγία και συνομιλούν μείωση στην επιβίωση των κυττάρων όταν αυτοφαγία αναστέλλεται μετά υποβάλλονται σε θεραπεία συνδυασμού. Όπως υπέθεσε, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ραπαμυκίνης με θεραπεία συνδυασμού erlotinib-σισπλατίνης έδειξε σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση των κυττάρων και τη βιωσιμότητα (16,5%) σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν erlotinib-σισπλατίνη συνδυασμός χωρίς ραπαμυκίνη (ρ = 0,0004). Αντιστρόφως, όταν 3-ΜΑ προστέθηκαν με συνδυασμό erlotinib-σισπλατίνη, την επιβίωση των κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη (9,1%) σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα μόνο με αγωγή erlotinib-σισπλατίνη συνδυασμός μόνο (ρ = 0.037) (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, ο συνδυασμός της 3-ΜΑ, erlotinib και σισπλατίνη ήταν σε θέση να σκοτώσει σημαντικά περισσότερα κύτταρα από 3-MA μόνο (44,6% και 34,1% κυτταρικό θάνατο, αντίστοιχα) (p = 0.032). Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Β έδειξε ότι αναστέλλοντας autophagy με 3-ΜΑ ήταν σε θέση να ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε θεραπεία συνδυασμού, το σχήμα 4C δείχνει τα αποτελέσματα της 3-ΜΑ αγωγή ERPC9 κυττάρων με erlotinib-μόνο και σισπλατίνη μόνο. Όταν 3-ΜΑ προστέθηκαν σε erlotinib-μόνο (ρ & lt? 0,0001) και σισπλατίνη μόνο (ρ & lt? 0,0001) θεραπεία υπήρχε θάνατος μεγαλύτερη κύτταρο 39,2% και 31,0%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τη θεραπεία με ενιαία φαρμακευτική αγωγή χωρίς 3-MA . Αυτά συνδέονται ευρήματα υποστηρίζουν περαιτέρω ότι η αυτοφαγία μπορεί να είναι ένας προστατευτικός μηχανισμός που επιτρέπει μεγαλύτερη επιβίωση σε κύτταρα ERPC9.

Atg3 και p-mTOR στην ERPC9 κύτταρα

Το Σχήμα 5 δείχνει τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος western των βασικών ρυθμιστικές πρωτεΐνες στο μονοπάτι αυτοφαγία: p-Akt, Akt, π-mTOR, mTOR, Beclin-1, συγκρότημα Atg5-12, ATG7 και Atg3. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις ρ-Ακί, Akt, mTOR, Beclin-1, Atg5-12 συγκρότημα, και ATG7 μεταξύ ERPC9 και κυττάρων PC9 (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, κατά την έναρξη, ρ-mTOR ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα ERPC9 συγκριτικά με κύτταρα PC9 (p = 0,021) (Σχήμα 5C). Επιπλέον, υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο βασικής γραμμής των Atg3 σε κύτταρα ERPC9 συγκριτικά με κύτταρα PC9 (p = 0,018) (Σχήμα 5Β). Ένας από τους κύριους ρόλους της Atg3 είναι να μετατρέψει LC3I να LC3II για την προώθηση αυτοφαγία [32] και κατά συνέπεια υπήρχε ένα σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο της LC3I στα κύτταρα ERPC9 από κύτταρα PC9 (πάνω LC3I μετετράπη) (p = 0,008) (Εικόνα 2Α) . Το χαμηλότερο επίπεδο p-mTOR υποστηρίζει περαιτέρω τη διαπίστωση της τριτοβάθμιας βασικά επίπεδα της αυτοφαγία στα κύτταρα ERPC9. Ενώ, οι έκτακτες υψηλά επίπεδα Atg3 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο συστατικό για την ανάθεση και τη συμβολή στα υψηλότερα βασικά επίπεδα της αυτοφαγία και την προώθηση του ER.

Θεραπεία Συνδυασμού Στόχοι Atg3

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω πως συνδυασμένη θεραπεία ρυθμίζει προς τα κάτω αυτοφαγία ειδικώς σε κύτταρα ERPC9, διεξήχθη ανάλυση κηλίδος Western για αλλαγές στις ρυθμιστικές πρωτεΐνες αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στην ρ-Ακί, Akt, mTOR, ρ-mTOR, Beclin-1, Atg5-12 συγκρότημα, και ATG7 μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Υπήρξε, ωστόσο, σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο Atg3 όταν έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό erlotinib-σισπλατίνη σε σύγκριση με το επίπεδο βασικής γραμμής ελέγχου (ρ = 0.005) (Σχήμα 6Β). Το εύρημα αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι η erlotinib-σισπλατίνης θεραπεία συνδυασμού μπορεί κατά κάποιο τρόπο ως στόχο την υπερ-έκφραση ή μετάφραση του Atg3 παρατηρείται σε κύτταρα ERPC9. Επιπλέον, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι Atg3 είναι ένα κρίσιμο συστατικό της προσδίδει ER και την επιβίωση.

siRNA αναστολή των Atg3 Αντιστρέφει Η erlotinib Αντίσταση

Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των υψηλών επιπέδων αναφοράς της Atg3 δει σε ERPC9 κύτταρα, κύτταρα ERPC9 επιμολύνονται με Atg3 siRNA και να αντιμετωπίζονται κατάλληλα. siRNA επιμόλυνσης ήταν επιτυχής στην παρεμπόδιση δραστηριότητα μετάφραση και autophagy Atg3 (που αντιπροσωπεύεται από χαμηλή LC3II και υψηλά επίπεδα ρ62 σε σχετική κύτταρα χωρίς Atg3 siRNA) όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επιβίωση των κυττάρων στην ομάδα ελέγχου των κυττάρων ERPC9 επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA (NS siRNA) σε σύγκριση με τα κύτταρα ERPC9 χωρίς την επιμόλυνση (ρ = 0.445). Ωστόσο, με Atg3 siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα ERPC9 επανα-ευαισθητοποιούνται στην erlotinib-μόνη θεραπεία και είχε μια σχετική σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο του 32,0% σε σύγκριση με το erlotinib-alone θεραπεία ERPC9 κύτταρα με NS siRNA επιμόλυνση (p = 0,043). κύτταρα ERPC9 έγινε επίσης σημαντικά πιο ευαίσθητα στη θεραπεία συνδυασμού μετά Atg3 siRNA επιμόλυνση σε σύγκριση με NS siRNA επιμολυσμένα κύτταρα? Παρατηρήθηκε 10,3% περισσότερο κυτταρικό θάνατο (p = 0,002) (Σχήμα 7Β). Ωστόσο, το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα ERPC9 αγωγή σισπλατίνη επιμολυσμένα με Atg3 siRNA? δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των κατεργασμένων σισπλατίνη Atg3 siRNA και NS siRNA (70,2% έναντι 70,8%, αντίστοιχα) (p = 0.924). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν και υποστηρίζει ότι η γραμμή βάσης πάνω ρύθμιση του Atg3 είναι στενά εμπλέκονται στην ER και την επιβίωση των κυττάρων και αναστέλλοντας τη μετάφραση του Atg3 σε κύτταρα ERPC9 είναι σε θέση να αντιστρέψει ER και προσδίδουν εκ νέου ευαισθησία σε θεραπείες erlotinib. Επιπλέον, το κλείδωμα Atg3 δεν παρείχε αύξηση ευαίσθητα σε φαρμακευτική αγωγή με σισπλατίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή της Atg3 είναι ειδικό για ER.

Atg3 siRNA επιμόλυνση ήταν σε θέση να παράγει μια σημαντική αύξηση στην ευαισθησία προς την ενιαία θεραπείες στη γονική κυτταρική σειρά PC9. Erlotinib με Atg3 siRNA ήταν σε θέση να προκαλέσει 11,5% περισσότερο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με το NS θεραπεία siRNA erlotinib (p & lt? 0.0001) και σισπλατίνη με Atg3 siRNA ήταν σε θέση να προκαλέσουν 9,7% περισσότερο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με το NS siRNA σισπλατίνη θεραπεία (p & lt? 0,0001). Η διαφορά σε κυτταρικό θάνατο μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με συνδυασμό Atg3 siRNA σε σύγκριση με τη θεραπεία συνδυασμού με NS siRNA ήταν μικρή (4,5%)? Αν και αυτή η διαφορά ήταν σημαντική (ρ = 0,002).

Η απόπτωση

Η απόπτωση μετρήθηκε μέσω ανάλυσης κηλίδος western της διασπασμένης κασπάσης 3 και PARP διασπάται. Υπήρχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ (p = 0.004) και διασπασμένη κασπάση 3 (ρ & lt? 0,0001) σε ERPC9 κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα PC9 (Εικόνα 8Β και 8C, αντίστοιχα).