Αφηρημένο

P73, ένα μέλος της οικογένειας καταστολέα όγκου ρ53, μετοχές υψηλής διαρθρωτικές και λειτουργική ομοιότητα με p53. Όπως ρ53, ο μεταγραφικά ενεργή TAp73 μπορεί να μεσολαβήσει κυτταρική απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με up-ρυθμίζουν τις εκφράσεις του προ-αποπτωτικών γονιδίων στόχων της, όπως Puma, Bax, NOXA. Εδώ, δείξαμε ένα νέο μοριακός μηχανισμός για TAp73 μεσολάβηση απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη στον καρκίνο κυττάρων των ωοθηκών, και αυτό ήταν ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53. Βρήκαμε ότι TAp73 ενήργησε σαν ένας ενεργοποιητής της c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) μονοπάτι με σηματοδότηση up-ρυθμίζουν την έκφραση της ανάπτυξης στόχου σύλληψης του και βλάβη του DNA που επάγεται από πρωτεΐνη GADD45 άλφα (GADD45α) και στη συνέχεια την ενεργοποίηση από μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση κινάσης-4 (ΜΚΚ4). Η αναστολή της δραστικότητας JNK από ένα συγκεκριμένο αναστολέα ή μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) κατήργησε σημαντικά TAp73 μεσολάβηση απόπτωση που επάγεται από σισπλατίνη. Επιπλέον, η αναστολή της GADD45α με siRNA αδρανοποιείται δραστηριότητες ΜΚΚ4 /ΙΝΚ και επίσης μπλοκάρει επαγωγή απόπτωσης TAp73 μεσολάβηση από σισπλατίνη. Η μελέτη μας έδειξε ότι TAp73 ενεργοποιήσει την JNK αποπτωτικό μονοπάτι σηματοδότησης σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα

Παράθεση:. Zhang Ρ, Liu SS, Ngan HYS (2012) TAp73-Mediated η ενεργοποίηση της c-Jun Ν τερματικής κινάσης αυξάνει την κυτταρική χημειοευαισθησία έναντι σισπλατίνης σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10.1371 /journal.pone.0042985

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 16, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγούστου 2012

Copyright: © Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Wong κοινού Ελέγξτε αυτή Φιλανθρωπικό Ίδρυμα και το ταμείο έρευνας από το Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

P73, ένα νέο μέλος της οικογένειας ρ53 ογκοκατασταλτικό, είναι παρόμοιο με το ρ53 τόσο δομικά και λειτουργικά [1], [2]. Το γονίδιο ρ73 κωδικοποιεί περισσότερα από 20 ισομορφές πρωτεΐνης λόγω της χρήσης διαφορετικών υποκινητών και εναλλακτικά μετα-μεταγραφική μάτισμα. Τα μεταγραφικά ενεργών ισομορφών TAp73, που περιέχει την πλήρη περιοχή Ν-τερματικό τρανσενεργοποίηση, μπορούν να προσδένουν ειδικά ρ53 ανταποκρινόμενα στοιχεία και διαενεργοποιεί μερικά από τα γονίδια-στόχους της ρ53, και στη συνέχεια να επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, ενώ οι ισομορφές DNp73, με κολοβωμένη Ν-τερματικό μετενεργοποίηση τομέα, δρα ως κυρίαρχος-αρνητικός αναστολέας και των δύο TAp73 και p53 [1], [3], [4]. Είναι ενδιαφέρον, TAp73 είναι επίσης ένας μεσολαβητής της κυτταρικής ευαισθησίας σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [1], [4] – [7]. Πολλές προ-αποπτωτικά γονίδια, όπως Puma, Βαχ και NOXA, δρουν ως ενεργοποιητές του μιτοχονδριακού αποπτωτικό μονοπάτι, και να έχουν ρ73 στοιχεία απόκρισης σε προαγωγού τους και μπορεί να είναι up-ρυθμίζεται από ρ73 να επάγει απόπτωση σε απόκριση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Επιπλέον, ρ73-μεσολαβούμενη αυξητική ρύθμιση του CD95 υποδοχέα θανάτου, ένας μεσολαβητής της εξωγενούς αποπτωτικό μονοπάτι, συμβάλλει επίσης στην ρ73-μεσολαβούμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κάτω από ερεθίσματα άγχους [8]. Ωστόσο, σε αντίθεση με p53, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκουν το ρ73-μεσολαβητική κυτταρική απόπτωση δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Η κατανόηση των υποκείμενων ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί θα είναι χρήσιμοι στη στόχευση ρ73 ως ένα καλό υποψήφιο γονίδιο για θεραπεία του καρκίνου.

Η JNK ανήκει σε μία υπεροικογένεια που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης (ΜΑΡ) κινάσες. Οι πρωτεϊνικές κινάσες JNK περιέχουν JNK1, JNK2 και JNK3. JNK1 και JNK2 είναι πανταχού παρούσες ανιχνεύσιμες. Το JNK3 περιορίζεται κυρίως στον εγκέφαλο, την καρδιά και όρχεις [9]. Η JNK σηματοδότησης αποκρίσεις μονοπάτι σε διάφορα ερεθίσματα άγχους, μέσω της μεταγωγής του ανάντη ΜΑΡΚΚΚ συμπεριλαμβανομένων MEKKs, και εν συνεχεία ενεργοποίηση της JNK με φωσφορυλιωμένα σε θέσεις Thr και Tyr από τις JNK απευθείας ανάντη κινάσες ΜΚΚ4 /ΜΚΚ7. Η ενεργοποίηση της JNK φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής καθοδικά c-Jun και άλλους παράγοντες μεταγραφής [9], [10]. Το μονοπάτι σηματοδότησης JNK δρα ως θετικός διαμορφωτής κλειδί της κυτταρικής αποπτωτική απόκριση να τονίσει ερεθίσματα [9] – [11]. Επιπλέον, η JNK οδός σηματοδότησης συμβάλλει κριτικά στη σισπλατίνη εξαρτώμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [12] – [15]

Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να μελετηθεί η επίδραση της TAp73 (TAp73α) επί κυτταρική απόκριση σε. σισπλατίνη σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών. Μας ενδιέφερε το αν TAp73 θα είχε κανένα ρυθμιστικό ρόλο σε άλλα αποπτωτικά μονοπάτια, όπως το μονοπάτι σηματοδότησης ΙΝΚ, κατά την κατεργασία σισπλατίνη.

Αποτελέσματα

TAp73α ενισχύει την κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη στον καρκίνο κυττάρων των ωοθηκών

για να ερευνηθεί ο ρόλος του TAp73 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, ανθρώπινο σισπλατίνη ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών SKOV3 γραμμές (null-p53) και OVCA433 (άγριου τύπου ρ53) διαμολύνθηκαν σταθερά με το πλασμίδιο pEGFP -TAp73α (Σχήμα 1Α). Η επίδραση της TAp73α στην κυτταρική ανταπόκριση στη σισπλατίνη εκτιμήθηκε τόσο από δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΧΤΤ και κλωνογονική δοκιμασία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β και 1Γ, TAp73α αυξήθηκε σημαντικά την κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη τόσο null-p53 SKOV3 και κυττάρων ρ53 OVCA433 άγριου τύπου, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα. Τέτοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε τόσο βραχυπρόθεσμα (από ΧΤΤ δοκιμασία) και μακροπρόθεσμα (από κλωνογόνο δοκιμασία) δοκιμασίες πολιτισμό. Επιπλέον, κυτταρική απόπτωση που επάγεται από σισπλατίνη αυξήθηκε επίσης με υπερέκφραση του TAp73α, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία TUNEL και διασπάται ανάλυση έκφρασης PARP (Σχήμα 2Α και 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TAp73 προωθούνται κυτταρική ευαισθησία στην cisplatin μέσω της επαγωγής κυτταρικής απόπτωσης, και τέτοια λειτουργία TAp73 ήταν ρ53-ανεξάρτητη, όπως τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια και στις δύο ρ53 και ρ53 null-κύτταρα άγριου τύπου.

( Α) Η GFP-TAp73α υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων σε SKOV3 (C8, C24 και C28) και OVCA433 (C1, C7 και C12) τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot. (Β και Γ) Τόσο δοκιμασία βιωσιμότητας ΧΤΤ και κλωνογονική δοκιμασία έδειξαν σημαντικά μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV3 και OVCA433 σε σύγκριση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (V) σε απόκριση στη θεραπεία σισπλατίνη. Το ποσοστό των κυττάρων /αποικιών που επιβιώνουν σε σχέση με σισπλατίνη κύτταρα /αποικίες στον έλεγχο μέσου χωρίς φάρμακο μετρήθηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*: ρ & lt? 0,05? **: Ρ & lt? 0,01)

Η

(Α) TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8, C24 και C28 και. OVCA433 C1, C7 και C12) και τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (V) του SKOV3 και OVCA433 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4 μg /ml σισπλατίνης για 48 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό TUNEL. Περισσότεροι από 500 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε ομάδα, τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν ήταν η σχετική των αποπτωτικών κυττάρων στο σύνολο των κυττάρων και τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (**: ρ & lt? 0,01). (Β) TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα και τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα υπέστησαν κατεργασία με διαφορετικές δόσεις (αναφέρεται) της σισπλατίνης για 24 ώρες, και η διάσπαση της PARP ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western.

Η

TAp73α μεσολαβεί στην ενεργοποίηση της JNK οδός σηματοδότησης

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση των ΙΝΚ συμβάλλει κριτικά στη σισπλατίνη που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση [12] – [15]. έτσι Υποθέσαμε ότι TAp73α μεσολάβηση κυττάρων απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη θα μπορούσε να δράσει μέσω της ενεργοποίησης του JNK οδού σηματοδότησης. Η επίδραση της TAp73α στην ενεργοποίηση των σημάτων JNK ήταν αρχικά αναλύθηκε με τη μέτρηση του επιπέδου φωσφορυλίωσης της JNK (ρ-ΙΝΚ) και του υποστρώματος του c-Jun (ρ-c-Jun) σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, αμφότερα τα ρ-JNK και ρ-c-Jun ήταν προφανώς αυξημένα σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η αύξηση του ρ-JNK και ρ-c-Jun περαιτέρω επαυξημένης σε αυτά τα κύτταρα σε απόκριση προς την σισπλατίνη, μόνο μια μικρή αύξηση του ρ-JNK και ρ-c-Jun παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου. Ο χρόνος και η εξαρτώμενη από τη δόση πειράματα έδειξαν ότι η σισπλατίνη-επαγόμενη ενεργοποίηση JNK συνέβησαν σε συντομότερο 6 ώρες και μέχρι 48 ώρες μετά τα κύτταρα σε επεξεργασία με 4 μg /ml σισπλατίνης, και η αποτελεσματική δοσολογία cisplatin για την ενεργοποίηση JNK ήταν τόσο χαμηλή ως 2 μg /ml για τη θεραπεία 12 ώρες σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8? OVCA433 C1? Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η ενεργοποίηση των ΙΝΚ εξηρτάτο από την μετενεργοποιήσεως δραστηριότητα του TAp73α καθώς το επίπεδο ρ-ΙΝΚ δεν άλλαξε στα κύτταρα σταθερώς που υπερεκφράζουν DNp73α (Εικόνα 3C και 3D), ένα ακρωτηριασμένο ισομορφή ρ73 χωρίς δραστηριότητα διενεργοποίησης. Για να επαληθευθεί αν η επίδραση της υπερέκφρασης TAp73α στην προαγωγή της κυτταρικής ευαισθησίας ήταν ειδική για σισπλατίνη, εκτελέσαμε επίσης τα παρόμοια πειράματα με την αγωγή της ταξόλης, η οποία είναι επίσης μια πρώτης γραμμής αντικαρκινικό φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι η ταξόλη δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσουν JNK οδού σε TAp73 υπερεκφράζεται ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, αν και θα μπορούσε να ενισχυθεί TAp73α την ευαισθησία των κυττάρων σε απόκριση σε ταξόλη (σχήμα S1).

(Α) Αύξηση του ρ-JNK και pc -Jun ανιχνεύθηκε σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8, C24 και C28 και OVCA433 C1, C7 και C12) και ενισχύεται περαιτέρω κατά την κατεργασία σισπλατίνη (4 μg /ml για 24 ώρες), σε σύγκριση με τους μάρτυρες (P: γονικών κυττάρων ? V: κενό φορέα ελέγχου). (Β) TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) εκτέθηκαν σε 4 μg /ml σισπλατίνης για διαφορετικές χρονικές περιόδους, ή σε διαφορετικές δόσεις σισπλατίνης για 12 ώρες. Η ρ-ΙΝΚ επίπεδο μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος western. (Γ) DNp73α (GFP-DNp73α) ήταν υπερ-εκφράζεται σε SKOV3 (D2) και OVCA433 κύτταρα (D18). (D) αριθ ενεργοποίηση της JNK παρατηρήθηκε σε DNp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 D2 και OVCA433 D18).

Η

Η αναστολή της δράσης της JNK εξασθενίζει TAp73α-απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη

Για να περαιτέρω διερευνήσει κατά πόσον TAp73α μεσολάβηση η ενεργοποίηση του JNK συνέβαλαν στην επαγωγή απόπτωσης σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, ένας ειδικός αναστολέας της δραστηριότητας της κινάσης JNK, SP600125, χρησιμοποιήθηκε. Μετά την επεξεργασία του 20 μΜ SP600125 για 8 ώρες, το επίπεδο ρ-ΙΝΚ μειώθηκε έως και 60% στις TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1, Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η αναστολή της JNK ενεργοποίησης από SP600125 μείωσε σημαντικά την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από σισπλατίνη σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία TUNEL και διασπάται ανάλυση έκφρασης PARP (Σχήμα 4Β και 4C).

(Α) TAp73α- υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ SP600125 για διαφορετικές χρονικές περιόδους (αναφέρεται). Μετρήθηκαν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της JNK και c-Jun. (Β και Γ) TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) και τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (V) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ SP600125 ή DMSO και στη συνέχεια με σισπλατίνη. Το κύτταρο απόπτωση εκτιμήθηκαν με δοκιμασία TUNEL (ράβδοι σφάλματος υποδεικνύεται μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα? *: Ρ & lt? 0,05) και την διάσπαση της ανάλυσης PARP. Η αναστολή της JNK εξασθενημένου TAp73α μεσολάβηση απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη. (D) TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με JNK siRNAs (Si-JNK) ή το ανακατωμένο έλεγχο siRNA (Control). Οι ενεργοποιήσεις των JNK και c-Jun απουσίαζαν κατά την κατεργασία σισπλατίνη, και συνδέονται με σημαντικά μειωμένη κυτταρική απόπτωση (Ε και F).

Η

Η ενεργοποίηση της οδού της JNK με TAp73α εμπλέκεται σε σισπλατίνη απόπτωση ήταν καταδεικνύεται επίσης από την παρατήρηση ότι η σιωπή του JNK1 και -2 σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα μπλοκαριστεί σημαντικά σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, η αγωγή των siRNAs κατά JNK1 και -2 σε καρκινικά κύτταρα (SKOV3 C8? OVCA433 C1) προφανώς κάτω ρυθμισμένα /2 έκφραση JNK1 σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα στοιχεία ελέγχου siRNA, και η θεραπεία, στη συνέχεια κατέστειλε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της JNK και υπόστρωμα της γ-Ιούνιος Όπως αποδεικνύεται από TUNEL δοκιμασίας και διασπάται ανάλυση έκφρασης PARP, ο σισπλατίνη απόπτωση σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8? OVCA433 C1) ήταν σημαντικά εξασθενημένο από JNK φίμωση κατεργασία (Σχήμα 4Ε και 4F). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι η ενεργοποίηση της JNK οδού με TAp73α συνέβαλαν στην TAp73α διαμεσολαβείται απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη.

TAp73α μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του GADD45α είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της JNK οδού σηματοδότησης

GADD45α έχει αναγνωριστεί ως ένα συνεργάτη σύνδεσης και ενεργοποίησης της JNK ανάντη κινάσης MEKK4 /MTK1, και την σύνδεση του με MEKK4 /MTK1 να ενεργοποιήσετε την κατάντη γονίδιο ΜΚΚ4 και JNK [17], [18]. Από την άλλη πλευρά, GADD45α είναι μια καλά καθορισμένη γονίδιο στόχος της ρ73 [19], [20]. Έτσι, υποθέσαμε ότι GADD45α θα μπορούσαν να παίξουν ένα ρόλο στην ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης JNK διαμεσολαβείται από TAp73. αξιολογήθηκε για πρώτη φορά η επίδραση της TAp73 στην έκφραση GADD45α. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α και 5Β, η έκφραση των GADD45α ήταν ρυθμισμένη τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα. Σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, TAp73α μεσολάβηση πάνω ρύθμιση GADD45α πρωτεΐνης αυξήθηκε περαιτέρω (Σχήμα 5Β). Όπως GADD45α μπορούν να αλληλεπιδρούν άμεσα με MEKK4 /MTK1 να ενεργοποιήσετε ΜΚΚ4 υπόστρωμα της κινάσης της [17], [18], τότε να μετρηθεί το επίπεδο φωσφορυλίωσης των ΜΚΚ4 σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, παρατηρήθηκε αύξηση του φωσφορυλιωμένου ΜΚΚ4 στη TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα και περαιτέρω ενισχυμένη σε απόκριση προς την σισπλατίνη θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TAp73α μεσολάβηση της ενεργοποίησης του JNK οδού σηματοδότησης ενδεχομένως μέσω αυξητική ρύθμιση του γονιδίου στόχου GADD45α του και την επακόλουθη ενεργοποίηση των ΜΚΚ4, ανάντη συστατικό της JNK οδού σηματοδότησης.

(Α) Αύξηση της έκφρασης mRNA GADD45α σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8, C24 και C28 και OVCA433 C1, C7 και C12). (Β) Αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης GADD45α και το επίπεδο φωσφορυλίωσης ΜΚΚ4 στην TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8, C24 και C28 και OVCA433 C1, C7 και C12). (C) GADD45α χτυπήθηκε κάτω στο TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) από siRNAs (Si1-GADD45α και Si2-GADD45α) θεραπεία. Η ενεργοποίηση των ΜΚΚ4, JNK και c-Jun είχαν μειωθεί, ακόμη και κάτω από τη θεραπεία με σισπλατίνη.

Η

Για να επαληθεύσετε την περαιτέρω αυτά τα ευρήματα, ένα ζευγάρι των siRNAs κατά GADD45α (Si1-GADD45α και Si2-GADD45α) ήταν που χρησιμοποιούνται για την νοκ ντάουν παροδικά την έκφραση GADD45α. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ΜΚΚ4, JNK και c-Jun μειώθηκαν συνεπώς από την προς τα κάτω ρύθμιση του GADD45α, ακόμη και σε απόκριση σε θεραπεία cisplatin (Σχήμα 5C). Ως εκ τούτου, επιβεβαιώθηκε ότι TAp73α μεσολάβηση πάνω ρύθμιση GADD45α ήταν υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης JNK σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

GADD45α είναι υπεύθυνη για TAp73α απόπτωση που διαμεσολαβείται

Για να προσδιοριστεί αν η σιωπή του GADD45α έχει επίδραση στην σισπλατίνη απόπτωση σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GADD45α siRNAs και κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η σισπλατίνη απόπτωση ήταν δραματικά μειωμένα σε GADD45α-σιγήσει TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8? OVCA433 C1). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι TAp73α μεσολάβηση του up-ρύθμιση του GADD45α ήταν υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της JNK οδού και την κυτταρική απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σηματοδότησης.

απόπτωση των κυττάρων ελαττώθηκε σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα (SKOV3 C8 και OVCA433 C1) σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη μετά τη θεραπεία GADD45α siRNAs. Η απόπτωση των κυττάρων μετρήθηκε με (Α) δοκιμασία TUNEL (ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα? *: Ρ & lt? 0,05? **: Ρ & lt? 0,01) και (Β) η διάσπαση της δοκιμασίας PARP

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι, για πρώτη φορά, εξ όσων γνωρίζουμε, TAp73 διαμεσολαβείται εν μέρει κυτταρική απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη μέσω της ενεργοποίησης του JNK οδός σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι, σε απάντηση στην σισπλατίνη, TAp73α ενεργοποιηθεί η JNK οδός σηματοδότησης μέσω του up-ρύθμιση του κατάντη του γονιδίου της GADD45α, και η απάντηση ήταν TAp73-εξαρτώμενη και p53-ανεξάρτητη.

Ιδρύθηκε στοιχεία έχουν δείξει ότι η μεταγραφικά ενεργή TAp73 ενισχυμένη κυτταρική ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς σισπλατίνη φαρμάκου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [5] – [7], [21]. Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι η έκφραση TAp73 σε καρκίνους των ωοθηκών ήταν πολύ υψηλότερο σε απόκριση καρκίνους σε σύγκριση με την αδιάφορη καρκίνους [22]. Η μελέτη μας επιβεβαίωσε ότι TAp73 έκανε ενισχύουν την κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αν και TAp73 είναι λειτουργικά παρόμοια με ρ53, λειτουργική έκφραση ρ53 έχει δειχθεί ότι είναι αναγκαία για TAp73 διαμεσολαβείται κυτταρικής απόπτωσης υπό διέγερση βλάβη του DNA [23]. Από την άλλη πλευρά, ορισμένες μελέτες πρότειναν ότι ρ73-διαμεσολαβούμενη χημειοευαισθησία είναι ανεξάρτητη από την έκφραση ρ53 σε μερικά καρκινικά κύτταρα [5], [24]. Στη παρούσα μελέτη μας, TAp73α απόπτωση που διαμεσολαβείται παρατηρήθηκε σε κύτταρα SKOV3 ρ53-ηυΙΙ, υποδεικνύοντας ότι TAp73 απόπτωση που διαμεσολαβείται ήταν ρ53-ανεξάρτητη, τουλάχιστον στο μοντέλο των κυττάρων μας, τονίζοντας περαιτέρω την ανεξάρτητο ρόλο της ρ73 μεταξύ των μελών της οικογένειας του στην βλάβη του DNA απόκριση.

Οι λειτουργίες JNK οδού θανάτου κυττάρου ως σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής απόπτωσης σε απόκριση σε διάφορα ερεθίσματα άγχους και πράγματι παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε αποπτωτικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένων εξωγενών (υποδοχείς θανάτου) [11] και τις εγγενείς (μιτοχονδριακή ) οδών [11], [25]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η σισπλατίνη-μεσολαβητική ενεργοποίηση του JNK οδού σε καρκινικά κύτταρα σηματοδότηση συνέβαλαν κριτικά να σισπλατίνη εξαρτώμενη απόπτωση [12] – [15]. Up-ρύθμιση της έκφρασης του Fas L προέκυψε από την ενεργοποίηση της JNK και του υποστρώματος του c-Jun διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη σισπλατίνη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [15]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι JNK και του υποστρώματος του c-Jun ενεργοποιήθηκαν σε TAp73α υπερεκφράζονται κύτταρα και περαιτέρω επαυξημένης σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη θεραπεία. Η καταστολή της ενεργοποίησης ΙΝΚ με αναστολέα JNK ή JNK siRNAs στα κύτταρα αυτά ακύρωσε TAp73α απόπτωση. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι τα πάνω ρύθμιση της δραστικότητας JNK συνέβαλαν στην TAp73 διαμεσολαβείται επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη. Αυτή ήταν η πρώτη φορά για να δείξει ότι TAp73 λειτουργούσε ως ανάντη ενεργοποιητή του μονοπατιού ΙΝΚ να ενεργοποιήσει σήματα JNK να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση.

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις υποκείμενες μηχανισμούς με τους οποίους TAp73 up-ρύθμιση του επιπέδου φωσφορυλίωσης της JNK, ένα γονίδιο στόχος p73 GADD45α γνώριζε. GADD45α είναι μια καλά καθορισμένη κατάντη γονίδιο του TAp73 και p53 [19], [20] και μπορεί να προκληθεί από παράγοντες βλάβης του DNA, και παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης [26]. Είναι ενδιαφέρον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του JNK αποπτωτικό μονοπάτι από GADD45α στενά εμπλέκεται σε GADD45α διαμεσολαβείται επαγωγή απόπτωσης [27], [28]. GADD45α αλληλεπιδράσει άμεσα με MEKK4 /MTK1 να ενεργοποιήσετε το υπόστρωμα ΜΚΚ4 κινάσης, και, κατά συνέπεια, up-ρυθμίζουν την ενεργοποίηση της JNK, ένα γεγονός που εμπλέκεται στην επαγωγή της απόπτωσης [17], [18]. Η μελέτη μας έδειξε ότι οι εκφράσεις τόσο GADD45α και ενεργός ΜΚΚ4 πάνω ρυθμισμένα σε TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα, και αυτή η επίδραση περαιτέρω επαυξημένης μετά την έκθεση σισπλατίνη. Από την άλλη πλευρά, όταν GADD45α σίγησε, οι ενεργοποιήσεις του ΜΚΚ4, JNK και c-Jun καταργήθηκαν, ακόμη και κάτω από τη θεραπεία της σισπλατίνης, και ο TAp73α μεσολάβηση cisplatin επαγόμενη απόπτωση επίσης σημαντικά αποκλειστεί. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TAp73 ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει την JNK αποπτωτικό μονοπάτι με up-ρύθμιση της έκφρασης GADD45α σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη.

Είναι ενδιαφέρον, προηγούμενη έκθεση έχει προτείνει μια διαγώνια συζήτηση μεταξύ του μονοπατιού ΙΝΚ και ρ73, και πρότεινε ότι JNK ήταν ένας σημαντικός ρυθμιστής σε ρ73 απόπτωση που διαμεσολαβείται σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη [13]. Έδειξαν ότι ρ73 ήταν ένα υπόστρωμα της JNK κινάσης. JNK φωσφορυλιωμένη ρ73 σε ορισμένες περιοχές για να ενισχυθεί η δραστικότητα μεταγραφής ρ73 και ρ73-μεσολαβούμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα παρουσία της σισπλατίνης. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η υπερ-έκφραση του TAp73 ενεργοποίησε τη δραστηριότητα JNK σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη. TAp73 ενεργούσε ως ανάντη ενεργοποιητής του αποπτωτικού μονοπατιού JNK μέσω του πάνω ρύθμιση GADD45α, και την επακόλουθη ενεργοποίηση των ΜΚΚ4 (Σχήμα 7). Έτσι, τα αποτελέσματα μας παρείχε μια νέα οπτική γωνία με την εγκάρσια talk μεταξύ ρ73 και JNK οδού σε απόκριση κυτταρικής απόπτωσης.

παράγοντα βλάβης του DNA, η σισπλατίνη επάγει συσσώρευση TAp73 και την επακόλουθη αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών γονιδίων στόχων του να επάγει κυτταρική απόπτωση. Ταυτόχρονα, αυξητική ρύθμιση του γονιδίου στόχου TAp73, GADD45α ενεργοποιεί την JNK αποπτωτικό μονοπάτι μέσω της αλληλεπίδρασής της με MEKK4 /MTK1 να επάγει απόπτωση.

Η

Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν σαφώς μια νέα οδό TAp73-μεσολαβητική κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Έχουμε αποδείξει ότι TAp73α επάγεται την αποπτωτική απόκριση μέσω της ενεργοποίησης του GADD45α-ΜΚΚ4-JNK καταρράκτη κυτταρικού θανάτου και παρέχεται μία νέα σενάριο για την διαγώνια συζήτηση μεταξύ ρ73 και της JNK αποπτωτική παθολογική οδό υπό καταπονήσεις. Αυτό TAp73-εξαρτώμενα και ρ53-ανεξάρτητη κυτταρική απόκριση θα παίξουν σημαντικό ρόλο στην απόκριση βλάβη του DNA στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, καθώς η λειτουργία ρ53 ήταν ελαττωματικό στην πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων. Η καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών στον TAp73 μεσολάβηση αποπτωτική απόκριση είναι πολύτιμη ως προς τη στόχευση p73 ως θεραπευτικό υποψήφιο γονίδιο.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας των ναρκωτικών

ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές SKOV3 (p53 null) και OVCA433 (άγριου τύπου ρ53) ήταν το δώρο από τον καθηγητή Τσάο, Τμήμα Ανατομίας, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, όπου SKOV3 αποκτήθηκε από την ATCC, Manassas, [29], και OVCA433 ιδρύθηκε και περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Αυτά διατηρήθηκαν σε Minimum Essential Medium (ΜΕΜ) (Invitrogen Corporation, Grand Island, υν), με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen), και επωάζονται σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2.

Cis-Diamineplatinum (II) διχλωρίδιο (σισπλατίνη, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ), και η JNK-ειδικός αναστολέας SP600215 (Calbiochem, San Diego, CA) διαλύθηκαν σε χιλιοστά Q νερό και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma), αντίστοιχα, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C. Αυτά τα διαλύματα αραιώθηκαν περαιτέρω σε μέσο καλλιέργειας πριν από τη θεραπεία κυττάρων. DMSO αραιώθηκε σε μέσο μόνο ως έλεγχος.

πλασμίδια, siRNA και διαμόλυνση

Τα πλασμίδια pEGFP-TAp73α και ρΕΟΡΡ-DNp73α δομήθηκαν με PCR ενίσχυση της πλήρους μήκους περιοχής κωδικοποίησης του TAp73α και DNp73α επί cDNAs των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Και τα προϊόντα PCR υποβάλλονται σε πέψη και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε πλαίσιο εντός του φορέα έκφρασης pEGFP (εργαστήρια Clontech, Mountain View, CA). Για σταθερή κλώνους, οι επιμολύνσεις pEGFP-TAp73α και ρΕΟΡΡ-DNp73α επιλέχθηκαν με G418 (Invitrogen) για 14 ημέρες και στη συνέχεια οι απλές αποικίες συλλέχθηκαν και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Τα siRNAs έναντι JNK και GADD45α και το ανακατωμένο siRNA (αρνητικός έλεγχος) (Applied Biosystems από Life Technologies, Foster City, CA) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα σε 20 ηΜ τελική συγκέντρωση. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RT-PCR

Το ολικό RNA των κυττάρων εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen), και cDNA συνετέθη με υψηλό Ικανότητα RNA-to-cDNA κύριο kit Mix (Applied Biosystems). Οι ειδικοί εκκινητές (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG και TCCCGGCAAAAACA ΑΑΤΑΑΟ) χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν ανθρώπινα GADD45α cDNA.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 0.05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Invitrogen) και οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας συμβατικές RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [16]. Τα αντισώματα έναντι GFP, JNK και GADD45α αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα έναντι ΜΚΚ4, PARP και c-Jun και τις ενεργές μορφές της JNK, c-Jun (Ser63) και η ΜΚΚ4 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ).

ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων

η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΧΤΤ (2,3-δις [2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλο] -2Η -tetrazolium-5-καρβοξανιλιδο εσωτερικό άλας) κιτ II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκα 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη (4 μg /ml) κατά την επόμενη ημέρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε μετά από μία ημέρα θεραπείας για τέσσερις διαδοχικές ημέρες.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Η ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων μετρήθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε μέσο που περιέχει σισπλατίνη (0,15 μg /ml) ή χωρίς φάρμακο μέσο σε μια συγκέντρωση 500 κυττάρων ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από 48 ώρες επώαση, όλα αυτά τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 10-12 ημέρες. Επιβίωσαν αποικίες σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη και στη συνέχεια χρωματίστηκαν σε 1% Giemsa (Merck, Damstadt, Germany). Αποικίες που αποτελούνται από περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα αποπτωτικά κύτταρα εξετάστηκαν με δοκιμασία TUNEL (in situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες μία ημέρα πριν από 4 μg /ml σισπλατίνης αγωγή για 48 ώρες. Μετά τη στερέωση και διαπερατότητα, κύτταρα βάφτηκαν με μίγμα της αντίδρασης TUNEL, και αντίθετα με ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) (Sigma).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. SPSS 16.0 (SPSS) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων. Μια τιμή P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

TAp73α ενισχυμένη κυτταρική ευαισθησία στην ταξόλη, αλλά όχι μέσω της οδού JNK. (Α) δοκιμασία ΧΤΤ βιωσιμότητας έδειξαν TAp73α-υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV3 και OVCA433 ήταν πιο ευαίσθητα σε αγωγή με ταξόλη, σε σύγκριση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (V). (Β) Μετά από σισπλατίνη ή θεραπεία ταξόλη για 24 ώρες, το επίπεδο φωσφορυλίωσης της JNK δεν αυξήθηκε σε SKOV3 και OVCA433 κύτταρα επεξεργασμένα με ταξόλη, ακόμη και με TAp73α υπερ-έκφραση κυττάρων (C: έλεγχος? D: σισπλατίνη: Τ50 και Τ500: 50 ng /ml και 500 ng /ml Taxol)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0042985.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθ ΝΔ Τσάο , Τμήμα Ανατομίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ για την παροχή των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών OVCA433 και SKOV3.