Αφηρημένο

Η γενετική αναδιάταξη του

ROS1

τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ξεχωριστή μοριακή υπογραφή της ανθρώπινης μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ωστόσο, άμεση απόδειξη των πνευμόνων καρκινογένεση που επάγεται από

ROS1

γονίδια σύντηξης μένει να επαληθευτεί. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι

EZR-ROS1

διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην ογκογένεση του NSCLC που φιλοξενεί το γονίδιο σύντηξης.

EZR-ROS1

εντοπίστηκε σε τέσσερις γυναίκες ασθενείς του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Τρεις από αυτούς ήταν ποτέ καπνιστές. Διάμεση διαγραφή 6q22-q25 ως αποτέλεσμα γονιδιακής σύντηξης. Η έκφραση της κινάσης της σύντηξης σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που επάγεται από αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη

in vitro

, και υποδόριων όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Αυτή η μετατροπή ικανότητα οφείλεται στην δράση της κινάσης της. Ο /ΚΟΑ /ROS1 αναστολέα κινάσης, crizotinib, κατέστειλε σύντηξης που προκαλείται αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη ALK των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3. Το πιο σημαντικό, που ιδρύθηκε διαγονιδιακές σειρές ποντικού ειδικά εκφράζουν EZR-ROS1 στον πνεύμονα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα αναπτύσσονται πολλαπλά οζίδια αδενοκαρκίνωμα και στους δύο πνεύμονες σε νεαρή ηλικία. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η

EZR-ROS1

είναι ένα καίριο ογκογονίδιο σε ανθρώπινο NSCLC, και ότι αυτό το ζωικό μοντέλο θα μπορούσε να είναι πολύτιμη για την εξερεύνηση θεραπευτικών παραγόντων κατά του

ROS1

-rearranged καρκίνο του πνεύμονα.

Παράθεση: Arai Υ, Totoki Υ, Takahashi Η, Nakamura Η Χάμα Ν, Kohno Τ, et al. (2013) Mouse Μοντέλο για ROS1-Μετατεθεί καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10.1371 /journal.pone.0056010

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3, Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 4 Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Arai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα για την προώθηση των θεμελιωδών Σπουδών στις Επιστήμες Υγείας από το Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Καινοτομίας, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Έρευνας και Ανάπτυξης ταμεία (23-Α-7 και 23-Β-28), Έρευνα Επιχορήγηση της πριγκίπισσας Τακαμάτσου Cancer Research Ταμείο και επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας για την 3η μακροπρόθεσμης συνολικής στρατηγικής 10 ετών για τον έλεγχο του καρκίνου. Εθνικό Κέντρο Βιοτράπεζας Καρκίνου υποστηρίζεται από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Έρευνας και Ανάπτυξης του Ταμείου, την Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LADC), η πιο κοινή μορφή καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC), περιλαμβάνει αρκετές διαφορετικές γονιδιωματικές υποσύνολα που ορίζονται από μοναδικές ογκογόνο αλλοιώσεις, και ένα σημαντικό ποσοστό των περιπτώσεων LADC λιμάνι μεταβολές του οδηγού σε

EGFR, KRAS

και

ALK

γονίδια στο αλληλοαποκλείονται τρόπο, με σπάνιες εξαιρέσεις [2] – [5]. Η κατανόηση της μοριακής βάσης του καρκίνου μας επιτρέπει να αναπτύξουμε θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν γενετική druggable εκτροπές που προσδιορίζονται στο γονιδιώματα του καρκίνου. Οι αναστολείς τυροσίνης κινάσης (ΤΚΙδ) που στοχεύουν τις πρωτεΐνες EGFR και ALK είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές στη θεραπεία της LADC μεταφέρουν

EGFR

μεταλλάξεις και

ALK

συντήξεις, αντίστοιχα [2] – [6]. Ωστόσο, η ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού ΤΚΙ απαιτεί πειραματική επιβεβαίωση των γενετικών ανωμαλιών, όπως προσφυγής και druggable. Τα διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών που φέρουν

EGFR

μεταλλάξεις ή

EML4-ALK

συντήξεις γονιδίου έχουν καταδείξει επιτυχώς την ογκογόνο δυναμικό των αλλοιώσεων και την αποτελεσματικότητα της θεραπείας ΤΚΙ [7], [8]. Γενετική αναδιάταξη του

ROS1

πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ξεχωριστή μοριακή υπογραφή για την ανθρώπινη LADC [9] – [16]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο ποντικού του

ROS1

σύντηξης, και έδειξε ότι

EZR-ROS1

ως βασικό ογκογονίδιο οδηγού στον πνεύμονα καρκινογένεση.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση EZR-ROS1 γονιδιακή σύντηξη σε LADC του μη καπνιστές

Ολόκληρο μεταγραφικό υψηλής απόδοσης αλληλούχηση των δειγμάτων όγκου είναι μία από τις πιο αποτελεσματικές μεθόδους για την ταυτοποίηση ογκογονίδια σύντηξης [17]. Ανάλυση των πέντε περιπτώσεις LADC της δεν είχαν καπνίσει ποτέ, χωρίς να

EGFR /KRAS /ALK

μετατροπές χρησιμοποιώντας αλληλουχίας μεταγραφικό εντοπίστηκαν 56 διαβάζει επιτακτικούς του σε πλαίσιο

EZR-ROS1

σημείο γονίδιο σύντηξης που συνδέει

EZR

εξόνιο 10 έως

ROS1

εξόνιο 34 σε ένα όγκο. RT-PCR ανάλυση του συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς επιβεβαίωσε όγκου-ειδική έκφραση του μεταγράφου σύντηξης (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας μεταγραφικό αποδεικνύεται σαφώς μια συγκεκριμένη αύξηση στην έκφραση του συντηγμένου 3 ‘τμήμα του

ROS1

(εξώνια 34 έως 43) μετά το σημείο θραύσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η

EZR-ROS1

σύντηξης μεταγραφής προκαλεί παρεκκλίνουσα υπερέκφραση του

ROS1

περιοχή κινάσης τυροσίνης, μαζί με το τμήμα 5 ‘του

EZR

(Σχήμα 1Β). συστοιχία SNP συγκριτική γενωμική υβριδισμού (array CGH) δεδομένα έδειξαν ότι αυτό το γονίδιο σύντηξης που παράγεται από ένα μεγάλο διάμεσο διαγραφή που εκτείνεται ~41.5 Mb στο χρωμόσωμα 6q22-q25 (Σχήμα 1 C). Γονιδιωματικής PCR και ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε επίσης η διαγραφή του 41,5 Mb προκαλεί σωματικά συγχωνεύσεις των

EZR

ιντρονίου 10 στο 6q25 με το

ROS1

ιντρόνιο 33 στο 6q22 (Σχήμα S1).

(Α) Junction διαβάζει εκπροσωπούν

EZR-ROS1

μεταγραφές σύντηξης σε δείγμα LCY66T (αριστερά). Sanger αλληλούχιση του RT-PCR προϊόντος επικυρώνεται όγκου-ειδικά εντός πλαισίου μετάγραφο σύντηξης (δεξιά). m: μοριακό δείκτη. προφίλ (Β) Έκφραση του

EZR

και

ROS1

στην LCY66T. Ενεργό έκφραση του

ROS1

γονίδιο παρατηρήθηκε μετά το σημείο σύντηξης. (C) SNP array CGH ανάλυση της LCY66T. Αντιγραφή αριθμού όλη χρωμοσώματος 6 σχεδιάζεται ως ο λόγος log2.

Η

RT-PCR και Sanger ανάλυση της αλληλουχίας των 569 LADC δείγματα από τα ιαπωνικά άτομα, συμπεριλαμβανομένων των προαναφερθέντων περιπτώσεων (343 περιπτώσεις με πρώιμη παθολογική φάση και 226 περιπτώσεις με προχωρημένο στάδιο), προσδιόρισε τέσσερις περιπτώσεις που φιλοξενούν αυτή την μεταγραφή σύντηξης (Εικόνα S2). Και οι τέσσερις

EZR-ROS1

σύντηξης-θετικές περιπτώσεις ήταν γυναίκες, και έτρεφε ούτε

EGFR

/

KRAS /HER2

μεταλλάξεις, ούτε

EML4-ALK /KIF5B-RET

συγχωνεύσεις. Τρεις περιπτώσεις ήταν ελάχιστα διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα δεν κάπνισαν ποτέ, και η άλλη ήταν μια μέτρια διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του καπνιστή.

Μετασχηματισμός Δραστηριότητα της EZR-ROS1

EZR-ROS1

cDNA απομονώθηκαν από το δείγμα όγκου που κωδικοποιείται από μια πρωτεΐνη 858 αμινοξέων (Εικόνα 2Α? αριθμός πρόσβασης GenBank /DDBJ AB698667). Η πρωτεΐνη συνδέει τον τομέα FERM [18] του εζρίνης (EZR) με τα διαμεμβρανική και κινάσης πεδία του ROS1, αλλά στερείται το μεγαλύτερο μέρος της περιοχής τυλιγμένης σπείρας του EZR.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του EZR, ROS1 , EZR-ROS1 και διαγραφές /μεταλλάξεις των γονιδίων EZR-ROS1. Η οργάνωση του τομέα εμφανίζεται. C-C: περιοχή συσπειρωμένης σπείρας? TM: διαμεμβρανική? C-ERMAD: C-τερματικό ΜΣΙ σχετίζεται τομέα. (Β) ROS1 φωσφορυλίωση σε άγριου τύπου και μεταλλαγμένων EZR-ROS1 (Ε /Κ) εκφράζοντα ΝΙΗ3Τ3 κλώνους. Κυτταρολύματα από κάθε κλώνο ανοσοστυπώθηκαν με αντι-V5-tag (επάνω) και αντι-φωσφορυλιωμένες ROS1 (Tyr-2274, κάτω) αντισώματα. (C) Καταστολή των ROS 1 δραστηριότητα κινάσης της EZR-ROS1 από crizotinib αναστέλλει την ενεργοποίηση STAT3. κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιμολυσμένα με 1: άδειο φορέα, 2: άγριου τύπου EZR-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 στερήθηκαν ορού και υποβάλλονται σε θεραπεία για 2 ώρες με DMSO ή 1 μΜ crizotinib, και ανοσοαποτύπωση με τις σχετικές αντισώματα . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. E /R: EZR-ROS1, ρ-E /R: φωσφορυλιωμένη EZR-ROS1 ανιχνεύεται με ένα αντι-φωσφοτυροσίνης-2274 αντίσωμα ROS1. (Δ) μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων EZR-ROS1 εκφράζουν ΝΙΗ3Τ3 κλώνους. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα του σχηματισμού αποικιών για κάθε κλώνο σχεδιάζεται στην κορυφή (γραμμή κλίμακας, 100 μm). Ο αριθμός των αποικιών που λαμβάνονται για κάθε κλώνο σχεδιάζεται στο κάτω μέρος. * P & lt? 0,05. (Ε) Crizotinib επαγόμενη καταστολή της ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν EZR-ROS1. Bar γραφική παράσταση που δείχνει το ποσοστό των ΝΙΗ3Τ3 αποικιών που διεγείρεται από

EZR-ROS1

ή

CCDC6-RET

μετά τη θεραπεία με 200 ηΜ crizotinib ή βανδετανίμπη σε σχέση με εκείνα που σχηματίζονται από κύτταρα DMSO-θεραπεία. EZ-ROS: EZR-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P & lt? 0,05. (F) Αντιπροσωπευτική εικόνες ποντικών υποδορίως μεταμοσχευθεί με κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν άγριου τύπου, κινάσης-μεταλλαγμένο, ή αμινο-τερματικό διαγράφεται EZR-ROS1. Ένα EML4-ALK-εκφράζουν ΝΙΗ3Τ3 κλώνος χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος. Ο αριθμός των όγκων ανά ένεση σε κάθε επιμόλυνσης φαίνεται παρακάτω φωτογραφίες.

Η

Για να εξετάσει την ογκογόνο δράση του

EZR-ROS1

σύντηξης

in vitro

, ιδρύσαμε σταθεροί κλώνοι ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν άγριου τύπου EZR-ROS1 και κινάση-νεκρή μεταλλαγμένο EZR-ROS1 (KD), στην οποία η ΑΤΡ-δέσμευσης κατάλοιπο λυσίνης μεταλλάχθηκε σε μεθειονίνη (K491M), καθώς επίσης και μεταλλάξεις με σειριακά διαγράφεται αμινο-τερματικό FERM τομείς (DL1, DL2 και DL3? Εικόνα 2Α). Η αυτοφωσφορυλίωση των συγκεκριμένων υπολειμμάτων τυροσίνης είναι ένα κρίσιμο γεγονός στην ενεργοποίηση των διακριτών μονοπατιών μεταγωγής σήματος, και Tyr-2274 του ROS1 είναι μια ειδική θέση αυτοφωσφορυλίωσης ουσιώδης για την επαγωγή δραστικότητα κινάσης για μετασχηματισμό [19]. Σε προσδιορισμούς μετασχηματισμό, φωσφορυλίωση του Tyr-2274 (που αντιστοιχεί στην Tyr-785 σε άγριου τύπου EZR-ROS1 σύντηξης) παρατηρήθηκε σε έναν άγριου τύπου EZR-ROS1 εκφράζουν τον κλώνο, αλλά δεν ανιχνεύθηκε σε κινάσης-νεκρό (KD) και διαγράφεται (DL) μεταλλάξεις? Αυτό συνεπάγεται ότι η αμινο-τερματικό τμήμα του FERM (1-88 αμινοξέα) είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση ROS1 κινάσης (Σχήμα 2Β). Άγριου-τύπου

EZR-ROS1

αλλά όχι KD μεταλλάξεις /DL επαγόμενη ειδικά ενεργοποίηση STAT3 για κατάντη σηματοδότησης, και παρήγαγε σημαντικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (Σχήμα 2C, D). Η αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη που προκαλείται από

EZR-ROS1

κατεστάλη με κατεργασία με crizotinib, ένα ΤΚΙ κατά ALK /ΚΟΑ /ROS1, ενώ η αύξηση που προκαλείται από άλλο ογκογονίδιο του πνεύμονα,

CCDC6-RET

[11] δεν είχε (Σχήμα 2Ε). Αντιθέτως, βανδετανίμπη, ΤΚΙ κατά RET /EGFR /VEGFR ήταν αποτελεσματικό στην αναστολή του σχηματισμού αποικίας του CCDC6-RET εκφράζοντα κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα που εκφράζουν EZR-ROS1. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, θεραπεία crizotinib κατέστειλε φωσφορυλίωση EZR-ROS1, και αναστέλλουν την ενεργοποίηση των STAT3.

Στη συνέχεια, τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 εγχύθηκαν υποδορίως σε ανοσολογικά εκτεθειμένους ποντικούς. Άγριου-τύπου EZR-ROS1-κλώνους έκφρασης πάντοτε παρήγαγαν όγκους (6/6), ενώ κανένα από τα KD και DL μεταλλάγματα που εκφράζουν κλώνοι παρήγαγαν όγκους (Σχήμα 2F), επιβεβαιώνοντας ότι

in vivo

ογκογόνο δραστικότητα του

EZR-ROS1

απαιτεί δράση κινάσης ROS1.

Ανάπτυξη LADC σε EZR-ROS1 διαγονιδιακά ποντίκια

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το ρόλο του

EZR-ROS1

στην πνεύμονα καρκινογένεση, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν το γονίδιο σύντηξης υπό τον έλεγχο ενός κυψελιδικό επιθήλιο-ειδικό γονίδιο επιφανειοδραστικό C υποκινητή τύπου 2 [20] (Εικόνα 3Α). Πήραμε τέσσερις ανεξάρτητες γραμμές (TGA, Β, Γ και Δ) με διαφορετικό αριθμό αντιγράφων του διαγονιδίου (Σχήμα S3) και ανιχνεύεται πνεύμονα οζίδια αδενοκαρκινώματος σε όλες τις γραμμές που εξετάστηκαν, εκτός από TGD. Ανάλυση του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης σύντηξης μεταξύ των οποίων δεν αποκάλυψε καμία έκφραση στο TGD (Σχήμα S4). Ο ρυθμός γεννήσεων των διαγονιδίου θετικών απογόνων ήταν χαμηλή σε TGC (διαγονιδιακή-θετικός αριθμός F1 απογόνων: συνολικός αριθμός F1? 1:03), και απέτυχε να συμβαδίσει μια γραμμή TGC, στη συνέχεια, αναλύσαμε κυρίως μία γραμμή (TGA), η οποία ελλιμενίζει περίπου τέσσερα αντίγραφα του διαγονιδίου. RT-PCR και ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως επαλήθευσε

EZR-ROS1

έκφραση mRNA και πρωτεΐνης του πνεύμονα-ειδική, και υπέδειξε φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης σύντηξης EZR-ROS1 (Σχήμα 3Β). Παρά το γεγονός ότι τα ενδογενή

Ezrin

ήταν πανταχού εκφράζεται σε πολλούς ιστούς, η ενδογενής

ROS1

-transcript ανιχνεύθηκε μόνο στο στομάχι, τους νεφρούς και τους πνεύμονες. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ενδογενούς ROS1 ήταν πολύ ασθενές σε σύγκριση με τα επίπεδα του γονιδίου σύντηξης στα διαγονιδιακά ποντίκια (Εικόνα S4). Ακόμη και στις τέσσερις εβδομάδων, πολλαπλές βλάβες πάνω από 1 mm σε διάμετρο ανιχνεύθηκαν στα διαγονιδιακά ποντίκια, και οι όγκοι που καταλαμβάνει πάνω από το 40% των χωρισμένο επιφάνεια του πνεύμονα (Σχήμα 3C και το Σχήμα S5). Αξονική τομογραφία εξέταση ανιχνεύονται πολλαπλά οζίδια και στα δύο πνεύμονες, και οι ποντικοί εμφάνισαν μειωμένη επιβίωση (Σχήμα 3Δ, E). Η ιστολογική εξέταση των όγκων του πνεύμονα στις διαγονιδιακές σειρές ποντικών δείξει γενικά αδενοκαρκινώματα με μοτίβο θηλώδη /lepidic ανάπτυξης (Σχήμα 3C). Αυτές οι βλάβες φάνηκαν να είναι επεμβατική αδενοκαρκινώματα με μέτρια μιτωτική δραστηριότητα όπως αποκαλύπτεται από θετική Ki-67 χρώση (Σχήμα S6a). Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, των γραμμών TGB, παρατηρήσαμε συσσώρευση κυτταροπλασματικής βλεννίνης στα κύτταρα του όγκου (Σχήμα S6B).

(Α) Σχηματική παρουσίαση του

SP-C /EZR-ROS1 /πολυΑ

διαγονιδίου. (Β) Έκφραση του εξωγενούς

EZR-ROS1

γονιδίου σε διαγονιδιακά ποντίκια. RT-PCR (επάνω) και ανάλυση ανοσοκηλίδας (κάτω) των ιστών ποντικού απεκάλυψε ότι EZR-ROS1 ειδικώς εκφράζεται στους πνεύμονες των δύο διαγονιδιακών ποντικών (TgA21 και TgA25). HT: καρδιά, LV: συκώτι, ST: το στομάχι, SP: σπλήνα, KD: νεφρά, LG: πνευμόνων (C) Εκπρόσωπος ιστολογική ανάλυση των αλλοιώσεων του πνεύμονα σε διαγονιδιακά ποντίκια. χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης δείχνει αλλοιώσεις ευρεία και στις δύο 4 εβδομάδων και 15 εβδομάδων ποντικούς σύντηξης-θετική. TG: Fusion-θετικό, CR: σύντηξης αρνητικά. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (D) Αξονική τομογραφία (αριστερά) των πνευμόνων σε TgA04 ποντίκι κατά την εβδομάδα 19. Ενισχυμένη βλάβες και στους δύο πνεύμονες εντοπίστηκαν. Πολλαπλές οζώδεις αλλοιώσεις (δεξιά) παρατηρήθηκαν στην υπεζωκοτική επιφάνεια του πνεύμονα σε TgC01 ποντικού σε νεκροψία. (Ε) Η επιβίωση καμπύλες για διαγονιδιακών ποντικών και ελέγχου που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier.

Η

Παρά την παρουσία πολλαπλών όγκων στους πνεύμονες των διαγονιδιακών ποντικών, δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουν μακρινές μεταστάσεις κατά τη νεκροψία σε TGA, Β και Γ ποντίκια. Έτσι, είναι πιθανό ότι η έκφραση του

EZR-ROS1

από μόνη της δεν αρκεί για να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα μεταστατικού.

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη εντόπισε

EZR- ROS1

ως κεντρικό ογκογονίδιο οδηγού στον πνεύμονα καρκινογένεση. Ezrin εκφράζεται παντού σε πολλούς ιστούς. Στο

EZR-ROS1

σύντηξης ανιχνεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA των περιπτώσεων LADC, 5 ‘τμήμα του

EZR

προκαλεί παρεκκλίνουσα υπερέκφραση της περιοχής της κινάσης του

ROS1

. Καμία εμφανής επίδραση στα επίπεδα μεταγραφής του 3 ‘τμήμα του

παρατηρήθηκε EZR

. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στην πλεονάζουσα έκφραση του άγριου τύπου

EZR

πάνω από το γονίδιο σύντηξης. Μπορούμε επίσης αποκάλυψε ότι η ενεργοποίηση της κινάσης ROS1 στην παρούσα σύντηξης απαιτεί την περιοχή FERM Ν-τερματικό του EZR. FERM συνεργάτες με πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων φωσφολιπιδίων, πρωτεϊνών σκαλωσιές EBP50 και E3KARP, και άλλες πρωτεΐνες που συνδέονται με μεμβράνες που μπορεί να ρυθμίζει την διμερισμό ή ολιγομερισμό εζρίνης [21]. Πολλές πρωτεΐνες κινάσης σύντηξη, καθώς και ALK και RET, εμφανίζουν δράση κινάσης τυροσίνης συστατική αποδίδεται σε τομείς διμερισμού στην αμινο-τερματική συνεργάτη σύντηξης [6], [22]. Ωστόσο, μια άλλη πρωτεΐνη σύντηξης ROS1, FIG-ROS1, το οποίο βρίσκεται στο ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα, χολαγγειοκαρκίνωμα και αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, δεν έδειξε ιδιότητες διμερισμού, αντί υφιστάμενες ως μονομερές στην πρωτεΐνη σύντηξης παρά τη συγκράτηση των τομέων διπλής ελίκωσης και ένα φερμουάρ λευκίνης [19 ]. Ως εκ τούτου, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ενεργοποίηση ROS1 από τον τομέα FERM παραμένει ασαφής.

Τα διαγονιδιακά ποντίκια έδειξαν εμφάνιση πολλαπλών οζίδια αδενοκαρκινώματος σε πρώιμο σημείο, και την ταχεία εξέλιξη των όγκων. Τα χαρακτηριστικά αυτά είναι σε γενικές γραμμές παρόμοιο με το

EML4-ALK μοντέλο

ποντίκι [8]. Αρκετές ομάδες ανέφεραν ότι βλεννώδες μοτίβο ηθμοειδή και κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι είναι χαρακτηριστικά ιστολογικά χαρακτηριστικά της Ε

ML4-ALK

θετικό ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα [23] – [25]. Πρόσφατα, ερευνήσαμε ιστοπαθολογική

ROS1

-σύντηξης θετικών ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα [16]. Αν και άλλοι ερευνητές ανέφεραν ότι η λειτουργία των κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι δεν ήταν κοινή σε

ROS1

-rearranged καρκίνων του πνεύμονα [10], διαπιστώσαμε ότι το 53% των περιπτώσεων έτρεφε βλεννώδες ηθμοειδή ή κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι χαρακτηριστικά παρόμοια με το

ALK

-rearranged καρκίνων του πνεύμονα, αλλά ότι το υπόλοιπο έδειξε θηλώδη /lepidic πρότυπο ανάπτυξης.

EZR-ROS1

-θετικό όγκους φαινόταν λιγότερο καλά διαφοροποιημένες, και έδειξε πιο συχνά ιστολογικά χαρακτηριστικά των βλεννωδών ηθμοειδή ή κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι. μοντέλο ποντικού μας

EZR-ROS1

καρκίνο του πνεύμονα δείξει γενικά θηλώδη /lepidic πρότυπο ανάπτυξης, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις, παρατηρήσαμε συσσώρευση κυτταροπλασματικής βλεννίνης σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία είναι αρκετά μοιάζει με την χαρακτηριστική ιστολογία αναφέρθηκαν σε ποσοστό

ROS1

-rearranged καρκίνο του πνεύμονα. Προς το παρόν δεν έχουμε καμία απάντηση γιατί μόνο ένα μέρος των ποντικών έτρεφε όγκων με τη συσσώρευση βλεννίνη.

Το

EZR-ROS1

γονίδιο σύντηξης ήταν ειδικά ανιχνεύονται στον καρκίνο του πνεύμονα δείγματα των γυναικών δεν είχαν καπνίσει ποτέ, χωρίς να

EGFR, KRAS,

και

ALK

αλλαγές. Εκτιμάται ότι περίπου 2% των ασθενών σε λευκό και ομάδες καρκίνου του πνεύμονα Ασίας είχαν

ROS1

-rearrangements, οι οποίες εμφανίζονται σε σημαντικά υψηλότερα ποσοστά σε νεότερους, Απαγορεύεται το κάπνισμα σε θηλυκά άτομα [10], [11], [16]. Αν και κάθε μεταβολή είναι σπάνια,

ROS1

συγχωνεύσεις με πολλά είδη 5 ‘γονιδίων εταίρο (

CCDC6, CD74, EZR, ΕΙΚ, KDELR2, LRIG3, sdc4, SLC34A2 και TPM3

) έχουν αναφερθεί στον πνεύμονα, του εγκεφάλου, των χοληφόρων οδών, και καρκίνους των ωοθηκών [9] – [16], [26] – [28]. Αυτά

ROS1

-rearranged όγκων θα μπορούσε να στοχευθεί θεραπευτικά με ειδικούς αναστολείς της κινάσης, συμπεριλαμβανομένης της crizotinib [10], [14], [27], [29]. Δύο ασθενείς LADC είχε μια αξιοσημείωτη κλινική ανταπόκριση προς crizotinib [10], [14]. Έτσι, μας

EZR-ROS1

καρκίνο του πνεύμονα ζωικό μοντέλο θα μπορούσε να είναι πολύτιμη για την αξιολόγηση του θεραπευτικού δυναμικού αυτών των ενώσεων και των νέων φαρμάκων, καθώς και βιολογικά χαρακτηριστικά του

ROS1

-rearranged καρκίνο του πνεύμονα

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

ιστός δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που παρέχονται από το Εθνικό Αντικαρκινικό Κέντρο Βιοτράπεζας, Ιαπωνία. Υψηλού μοριακού βάρους γονιδιωματικό DNA και RNA εκχυλίστηκαν από νωπά δείγματα κατεψυγμένου όγκου και μη καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Εθνικού Κέντρου Καρκίνου, Τόκιο, Ιαπωνία.

Ανάλυση Δεδομένων Ολόκληρο-μεταγραφικό Ακολουθία

βιβλιοθήκες cDNA προσθήκη (150-200 bp) παρασκευάστηκαν από 2 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας το mRNAseq Kit Προετοιμασία του δείγματος (Illumina). Οι βιβλιοθήκες υποβλήθηκαν σε ζεύγη-άκρο αλληλουχίας των 50 bp στο HiSeq2000 (Illumina), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Paired-άκρο διαβάζει χαρτογραφήθηκαν με γνωστές αλληλουχίες RNA στην REFSEQ, Ensembl, και LincRNA βάσεις δεδομένων χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Bowtie όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30].

RT-PCR, Genomic PCR και προσδιορισμός αλληλουχίας

Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript III (Life Technologies). cDNA ή γονιδιωματικό DNA υποβλήθηκε σε PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας Ex-Taq (Takara Bio) και εκκινητές EZR-E10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) και ROS1-E34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). Τα PCR προϊόντα αλληλουχήθηκαν απευθείας με αλληλούχηση Sanger χρησιμοποιώντας το κιτ τερματιστή BigDye (Life Technologies).

SNP Array CGH Ανάλυση

χρωμοσωμικό αντίγραφο αριθμό για τους όγκους προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας συστοιχίες υψηλής ανάλυσης SNP ( GeneChip Χαρτογράφηση 250K-Nsp σειρά, Affymetrix). Γονιδιωματικό DNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες SNP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αντίγραφο αριθμοί υπολογίστηκαν από τα σήματα υβριδοποίησης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CNAG [31].

φορέα κλωνοποίησης, και Παραγωγή διαγραφής και σημειακές μεταλλάξεις

Η περιοχή κωδικοποίησης του

EZR-ROS1

cDNA ελήφθη με PCR ενίσχυση από cDNA LCY66 όγκου χρησιμοποιώντας Phusion Taq πολυμεράση (New England Biolabs) και εκκινητές EZR-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) και ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).

EML4-ALK

cDNA και

CCDC6-RET

cDNA ενισχύθηκαν από μια

EML4-ALK

-θετικό δείγμα πρωτοπαθούς καρκίνου του πνεύμονα (Ε13? Α20) και από ένα

CCDC6-RET

-θετικό πρωταρχικό δείγμα καρκίνου του πνεύμονα (C1? R12), αντίστοιχα. Τα προϊόντα PCR υποκλωνοποιήθηκαν σε ένα pcDNA3.1D-V5-His πλασμιδίου (Life Technologies). Αντικατάσταση της λυσίνης με μεθειονίνη στο κωδικόνιο 491 στο

EZR-ROS1

γονίδιο πραγματοποιήθηκε με χρήση κατευθυνόμενης σε θέση μεταλλαξογένεσης κιτ Primestar (Takara Bio). Μεταλλάξεων Ν-τερματικής διαγραφής του τομέως FERM του

EZR-ROS1

cDNA κατασκευάστηκαν με PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές EZR-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) και ROS1-H1R1 για DL1, EZR-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) και ROS1-H1R1 για DL2, και EZR-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) και ROS1-H1R1 για DL3. Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Life Technologies), και σταθεροί κλώνοι απομονώθηκαν με G418 επιλογής (0,7 mg /ml). Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα ενσωματώνονται και καλλιεργήθηκαν σε 0,4% μαλακό άγαρ εις τριπλούν και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε μετά από 21 ημέρες. Ποσοτικοποίηση της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη, υπό την προϋπόθεση, με ή χωρίς crizotinib (S1068, Σέλεκ) και βανδετανίμπη (S1046, Σέλεκ) μετά από 9 ημέρες έγινε με CytoSelect-96 σετ (Cell Biolabs). Η ένωση διάλυμα προστέθηκε στο ανώτερο στρώμα του μαλακού άγαρ κάθε 3 ημέρες.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

λύματα ολόκληρων κυττάρων εκχυλίστηκαν με αντιδραστήριο CelLytic Μ (# C2978, Sigma), και υποβλήθηκαν σε SDS -PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση σε μεμβράνη PVDF. Ανίχνευση κηλιδώσεων Western εκτελέστηκε με το κιτ WesternBreeze χημιφωταύγειας Ανοσοανίχνευση (Life Technologies) χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα εναντίον ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), φωσφορυλιωμένη-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), STAT3 (# 610189, BD), φωσφορυλιωμένη-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), ρ44 /42 ΜΑΡΚ (# 4695, Cell Signaling Technology), φωσφορυλιωμένη-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , Ezrin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), και β-ακτίνης (# A5441, Sigma).

καταστολή της ROS 1 κινάσης Δραστηριότητα της EZR-ROS1 από Crizotinib

Επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (κενό φορέα, άγριου τύπου EZR-ROS1, μεταλλάξεις KD /DL) στερήθηκαν τον ορό για 2 ώρες, στη συνέχεια προστέθηκε για 2 ώρες με 1% DMSO ή 1 μΜ crizotinib, τότε το μέσο καλλιέργειας ήταν άλλαξε με πρότυπο 10% μέσου FBS για 10 λεπτά. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως.

υποδόρια μεταμόσχευση σε ανοσοκατασταλμένους ποντικούς

Ένα σύνολο 1 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς (BALB /c- ηυ /ηυ, CLEA Japan). Τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για σχηματισμό όγκου. Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας ζώο του Εθνικού Κέντρου Καρκίνου.

Δημιουργία και εξέταση των

EZR-ROS1

διαγονιδιακά ποντίκια

FLAG-tagged

EZR-ROS1

cDNA υποκλωνοποιήθηκε σε ένα

SPC-iNOS

πλασμίδιο (που παρέχεται από τον Dr. Hagiwara), η οποία περιελάμβανε ένα

SPC

υποκινητή και ένα σήμα πολυαδενυλίωσης, αντικαθιστώντας το

iNOS

θραύσματος με το cDNA. Η κασέτα έκφρασης με το

SPC

προαγωγός αποκόπηκε από το κατασκεύασμα και εγχύθηκε σε έμβρυα προπυρηνικά σταδίου του C57BL /6J ποντίκια (Unitech Ιαπωνία). Ο αριθμός αντιγράφων του διαγονιδίου προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος Southern του DNA από τις ουρές των ζώων. Τα διαγονιδιακά γραμμές διατηρήθηκαν με παλίνδρομης διασταυρώσεως για C57BL /6 ποντίκια. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα όργανα των διαγονιδιακών ποντικών και υποβλήθηκαν σε ανάλυση RT-PCR για την ανίχνευση

EZR-ROS1

, ενδογενής

ROS1

, ενδογενής

Ezrin

και

GAPDH

mRNA. Για την ανίχνευση EZR-ROS1 πρωτεΐνη, ενδογενές ROS1 και Ezrin σε ιστούς, λύθηκαν ομογενοποιήματα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση αντι-ROS1, αντι-Ezrin και αντισώματα αντι-β-ακτίνης. Η εξέταση των όγκων του πνεύμονα σε ζώντα ζώα εκτελέστηκε με μια συσκευή CT ακτίνων Χ (Explore μικρο-CT, GE Healthcare). Ιστοί πνεύμονα μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Αιματοξυλίνης-Ηωσίνη χρώση και ανοσοϊστοχημεία για Ki67 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32].

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Ανίχνευση

EZR-ROS1

γονιδιωματικής σύνδεσμος ρήξης. Ηλεκτροφόρημα για Sanger αλληλουχίας των γονιδιακών θραυσμάτων που περιλαμβάνει το

EZR-ROS1

σημείο διακοπής διασταύρωση των LCY66 όγκου. προϊόντα γονιδιωματικής PCR ενισχύθηκε από τους εκκινητές EZR-E10-CF1 και ROS1-E34-CR1 άμεσα την αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας το έναυσμα EZR-E10-CF1. Οι αριθμοί πάνω από το ηλεκτροφόρημα δείχνουν γονιδιωματική θέση στο χρωμόσωμα 6 (ανθρώπινο γονιδίωμα χτίσει 37,3). Ένα θραύσμα γονιδιώματος των 35 bp του

EZR

ιντρόνιο 10 αναστράφηκε εντός του ιντρονίου πριν από την σύντηξη σε

ROS1

ιντρόνιο 33.

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

Ανίχνευση μεταγράφων γονιδίου σύντηξης σε κλινικά δείγματα με RT-PCR. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα RT-PCR δείχνει σύντηξη θετικά και σύντηξη-αρνητικών περιπτώσεων χρησιμοποιώντας τους εκκινητές EZR-E10-CF1 και ROS1-E34-CR1. Μ: μοριακών δεικτών, NC: αρνητικός μάρτυρας. RT-PCR για άγριου τύπου

EZR

μεταγραφή (εναύσματα EZR-e4-CF1 και EZR-Ε7-CR1) και για το

GAPDH

(εκκινητές για GAPDH-F και GAPDH-R) είναι . επίσης, παρουσιάζεται

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s002

(PDF)

Εικόνα S3. ανάλυση αριθμός

αντιγραφής του διαγονιδίου σε διαγονιδιακά ποντίκια. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τις ουρές των διαγονιδιακών ποντικών που παράγεται από προπυρηνικά σταδίων C57BL 6J εμβρύων /. Αυτό gDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Southern με ένα θραύσμα PCR ενισχυμένο SPC υποκινητή του 464 bp, που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας εκκινητές SPC-pro-F και SPC-pro-R, ως ανιχνευτή. Τα δείγματα ελέγχου σχετικά με το δικαίωμα αποτελούνταν από γονιδιωματικό DNA ποντικού με τις υποδεικνυόμενες αντίγραφα του διαγονιδίου ανά διπλοειδές γονιδίωμα. Οι αριθμοί ταυτότητας των ποντικών θετικά για το διαγονίδιο εμφανίζεται στο πάνω μέρος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s003

(PDF)

Εικόνα S4.

Gene εκφράσεις σε διαγονιδιακά ποντίκια. Η έκφραση των γονιδίων υποδεικνύονται στο αριστερό διερευνήθηκε με RT-PCR ή ανάλυση ανοσοστυπώματος. Σε RT-PCR, κύκλοι PCR για να ενισχύσουν τα γονίδια-στόχοι υποδεικνύεται στο δεξιά πλευρά. Ezrin έδειξε πανταχού παρούσα έκφραση ενδογενούς, ωστόσο η ενδογενής έκφραση ROS1 ήταν χαμηλή. Αριθ έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης EZR-ROS1 ανιχνεύθηκε σε ποντίκια TGD γραμμή (*). SW480 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για έκφραση της σύντηξης. HT: καρδιά, LV: συκώτι, ST: το στομάχι, SP: σπλήνα, KD: νεφρά, LG:. Πνεύμονα

doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s004

(PDF)

Εικόνα S5. ανάπτυξη όγκων του πνεύμονα

σε διαγονιδιακά ποντίκια. Lung ιστούς των ποντικών TGA ήταν διατομής και ιστολογικά χαρακτηριστεί. Ο αριθμός και το μέγεθος των βλαβών ρωτήθηκαν σε ποντίκια σύντηξης-θετικό (Tg) και τα ποντίκια σύντηξης-αρνητικό (CR) στις 4 εβδομάδες και 15 εβδομάδες μετά τη γέννηση. (Α) καρκινικές βλάβες είχαν ταξινομηθεί κατά μήκος του μέγεθος σε διάμετρο (mm), και μετρήθηκαν. (Β) του όγκου χωρητικότητα υπολογίστηκε από την συμπερασματική περιοχή του όγκου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s005

(PDF)

Εικόνα S6.

ιστολογική χαρακτηρισμό των όγκων του πνεύμονα σε διαγονιδιακά ποντίκια. (Α) χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης ενός πνεύμονα ποντικού που δείχνει επεμβατική αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα που περιβάλλει ένα πνευμονική σκάφος (Α1). Μεγαλύτερη μεγέθυνση του όγκου (Α2). χρώση Θετικές Ki-67 στον όγκο (α3). μπαρ κλίμακα, 100 μm. (Β) χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης ενός πνεύμονα ποντικού που δείχνει κυτταροπλασματική βλεννίνης στα κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (Β1). Μεγαλύτερη μεγέθυνση του όγκου (Β2). μπαρ κλίμακα, 200 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s006

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Κ Hagiwara (Σαϊτάμα Ιατρικό Πανεπιστήμιο ) για την παροχή του πλασμιδίου SPC-iNOS, Δρ. Γ Nanya και S. Ogawa (Πανεπιστήμιο του Τόκιο) για την παροχή του προγράμματος CNAG, και η κα Ν Okada, Η Shimizu, Α Kokubu, Τ Urushidate, S. Ohashi και W. Mukai για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια τους.