Αφηρημένο

Ιστορικό

ειδικό αντιγόνο

προστάτη (PSA) είναι παραδοσιακά χρησιμοποιείται ως δείκτης για την παρουσία καρκίνου του προστάτη (PCA) και ακτινοθεραπεία χρησιμοποιείται γενικά για τη θεραπεία ακατάλληλο για χρήση και τοπικά προχωρημένο PCa. Ωστόσο, πώς επίπεδο κυτταρικής PSA συνδέεται με την ευαισθησία του προστάτη στην ακτινοθεραπεία είναι άγνωστη. Η προηγούμενη διαπίστωση ότι η RelB με βάση το NF-κΒ εναλλακτική οδό ρυθμίζει διαφορετικά PSA και η ιντερλευκίνη-8 (IL-8) στην επιθετική προστάτη έχει σκηνοθετήσει την προσοχή μας στο ρόλο της RelB στην απόκριση του προστάτη στην ακτινοθεραπεία.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

RelB και τους στόχους της PSA και IL-8 σε κύτταρα του προστάτη ήταν χειραγωγείται από έκτοπη έκφραση στα κύτταρα του προστάτη με χαμηλό ενδογενές επίπεδο RelB (LNCaP) και με RNAi με βάση το knock-down σε κύτταρα του προστάτη με υψηλό συστατική επίπεδο RelB (PC3). Τα αποτελέσματα της RelB, PSA και IL-8 με την απόκριση του προστάτη στην αγωγή ακτινοβολίας εξετάστηκαν

in vitro

και σε όγκους ξενομοσχεύματος. RelB ρυθμίζει PSA και IL-8 σε ένα αντίστροφο τρόπο. Όταν τα κυτταρικά επίπεδα του PSA και IL-8 απ ‘ευθείας διαμορφωμένο με γενετικούς χειρισμούς ή με την προσθήκη των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση της IL-8 ενισχυμένη ραδιοαντοχή κυττάρων προστάτη και ταυτόχρονα ρυθμισμένα προς τα κάτω PSA. Σε αντίθεση, up-ρύθμιση του PSA οδήγησε σε μειωμένη ραδιοαντοχή με ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω της IL-8.

Συμπέρασμα /Σημασία

RelB διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην απόκριση του προστάτη στην ακτινοθεραπεία και το αντίστροφο έκφραση της IL-8 και PSA. Τα αποτελέσματα προσδιορίσει μία προηγουμένως μη αναγνωρισμένη σχέση μεταξύ της IL-8 και PSA στην απόκριση των κυττάρων του προστάτη σε ακτινοθεραπεία

Παράθεση:. Xu Y, Fang F, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) αντίστροφη σχέση μεταξύ της PSA και IL-8 στον καρκίνο του προστάτη: μια Insight σε ένα NF-κΒ που διαμεσολαβείται από μηχανισμού. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10.1371 /journal.pone.0032905

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιούν, 2011? Δεκτές: 7 Φεβ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Μάρτη του 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA 49797 για να DKS και CA 11580 σε WHS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια στη Βόρεια Αμερική και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ άνδρες [1]. Η συγκέντρωση στον ορό του PSA σε άνδρες χρησιμοποιείται ως δείκτης της νόσου του προστάτη και αυξημένο επίπεδο PSA χρησιμοποιείται εκτενώς ως βιοδείκτης του προστάτη. Η ακτινοθεραπεία χρησιμοποιείται γενικά για τη θεραπεία του πρώιμου σταδίου, ακατάλληλο για χρήση και τοπικά προχωρημένο προστάτη. Ωστόσο, αν κυτταρική PSA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες της ανταπόκρισης του όγκου σε ακτινοθεραπεία είναι άγνωστη.

ΝΡ-κΒ, μία φλεγμονώδης απόκριση παράγοντα μεταγραφής, παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και την αντίσταση στη θεραπεία με επαγόμενη κυτταροτοξικότητα [2] . Το υψηλό επίπεδο συστατική του ΝΡ-κΒ σε καρκίνους έχει ενοχοποιηθεί ως ένα σημαντικό προστατευτικό μηχανισμό έναντι της θεραπείας του καρκίνου [3]. Έτσι, η αναστολή του NF-κΒ εξετάζεται ως στόχος για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των συμβατικών χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας [4]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η υπερέκφραση του RelB, μέλος ΝΡ-κΒ, η καταστολή της έκφρασης PSA σε ανδρογόνα αποκριτικά κύτταρα LNCaP PCa, γεγονός που υποδηλώνει ένα αρνητικό αποτέλεσμα του ΝΡ-κΒ επί της έκφρασης PSA [5]. Serendipitously, έχουμε επίσης βρει ότι σε ζώα που φέρουν RelB-υπερεκφράζεται όγκους LNCaP, το επίπεδο κυκλοφορίας του IL-8 ήταν αυξημένη.

IL-8, ένας ΝΡ-κΒ-ενεργοποιημένη κυτοκίνης, πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη μετάσταση των όγκων και την αντίσταση στη θεραπεία [6] – [9]. Το επίπεδο κυκλοφορίας του IL-8 είναι αυξημένη σε προχωρημένο προστάτη στο στάδιο όταν ο όγκος δεν ανταποκρίνεται πλέον στις αντι-ανδρογόνα θεραπείες [10]. Επιπλέον, η έκφραση της IL-8 ενισχύει προστάτη ανεξάρτητο από ανδρογόνο μετάσταση [11], [12]. Έτσι, η έκφραση της IL-8 μπορεί να έχουν σημαντικές προγνωστική αξία για την ανάπτυξη του προστάτη και η απόκριση στη θεραπεία. Η παρούσα μελέτη ερεύνησε τους ρόλους του PSA και IL-8 στο ραδιοαντοχή των κυττάρων προστάτη χρησιμοποιώντας το

in vitro

και

in vivo

προσεγγίσεις. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν την προηγουμένως μη αναγνωρισμένο ρόλο της IL-8 και PSA ως καθοριστικούς παράγοντες της ευαισθησίας του προστάτη στην ακτινοθεραπεία.

Αποτελέσματα

NF-κΒ up-ρυθμίζει IL-8, αλλά ρυθμίζει προς τα κάτω PSA σε προστάτη κύτταρα

η ενεργοποίηση του μονοπατιού NF-κΒ πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στην ανάπτυξη της ραδιοαντοχή των καρκινικών κυττάρων. Επειδή ΚεΙΑ και RelB είναι τα δύο κύρια μέλη της οικογένειας ΝΡ-κΒ βρίσκεται σε κύτταρα προστάτη [13], προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της ΚεΙΑ και RelB επί της IL-8 και η έκφραση του PSA και ραδιοευαισθησία χρησιμοποιώντας πολλαπλές προσεγγίσεις για την ενεργοποίηση και απενεργοποίηση του NF -κB μονοπάτι. Πρώτον, ΚεΙΑ ή RelB υπερεκφράστηκε σε κύτταρα LNCaP με επιμόλυνση με τους αντίστοιχους κατασκευάσματα cDNA της. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, τα επίπεδα του PSA μειώθηκαν τόσο από ΚεΙΑ και RelB όταν ήταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα LNCaP. Σε αντίθεση, τα επίπεδα της IL-8 αυξήθηκαν τόσο από ΚεΙΑ και RelB. Η αντίστοιχη επίδραση της ΚεΙΑ και RelB για ραδιοαντοχή των κυττάρων LNCaP ήταν μεγαλύτερη με υπερέκφραση του RelB.

Για να χειριστείτε τη λειτουργία NF-κΒ, ΚεΙΑ και RelB cDNA κατασκευάσματα (Α), ΚεΙΑ και RelB siRNAs (Β), και αναστολείς ΚεΙΑ και RelB πυρηνικής μετατόπισης (IκBαM και p100M) (C) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα LNCaP πριν την αγωγή IR. Τα επίπεδα των επιμολυσμένων πρωτεϊνών και της σχετικής PSA στόχου ποσοτικοποιήθηκαν με κηλίδες Western (άνω πάνελ). Τα Δυτικά εικόνες ομαλοποιήθηκαν με β-ακτίνη και στη συνέχεια κανονικοποιείται από τον έλεγχο του οχήματος. Οι Διπλώστε αλλαγές υποδεικνύονται. IL-8 συγκεντρώσεις σε μέσα ποσοστώθηκαν με ένα κιτ ELISA (μεσαίο πλαίσιο). επιβιώσεις κυττάρων ποσοτικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης (κάτω πίνακας). * (Ρ & lt? 0,05) και ** (ρ & lt? 0,01) υποδεικνύουν στατιστική σημασίες όπως σε σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου

Η

Δεύτερον, η ενδογενής ΚεΙΑ και RelB σε κύτταρα LNCaP ήταν νοκ-κάτω με τη χρήση του RNA. παρεμβολές προσέγγιση (RNAi). ΚεΙΑ siRNA ή RelB siRNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα LNCaP να σιγήσει τους έκφραση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, τα επίπεδα του PSA αντιστρόφως συσχετίζονται με τα μειωμένα επίπεδα τόσο ΚεΙΑ και RelB, με μεγαλύτερη επίδραση παρατηρείται για RelB. Τα επίπεδα της IL-8 ομοίως μειώθηκαν σε ΚεΙΑ και RelB νοκ-κάτω στα κύτταρα, με μεγαλύτερη ισχύ για ΚεΙΑ siRNA. Ραδιοευαισθησία των κυττάρων LNCaP ενισχύθηκε με τη μείωση είτε ΚεΙΑ ή RelB (Εικ. 1Β). Η επιβίωση των κυττάρων σε siRNA ελέγχου μειώθηκε σε 46,3% με αγωγή ακτινοβολίας, ενώ η επιβίωση των κυττάρων μειώθηκε περαιτέρω σε 30,1% ή 23,4% όταν ΚεΙΑ ή RelB χτυπήθηκε κάτω. Η στατιστική ανάλυση έδειξε τις σημαντικές διαφορές των ΚεΙΑ siRNA και RelB siRNA σε σύγκριση με τον έλεγχο των siRNA. Έτσι, knock-down της RelB σχεδόν διπλασίασε το κύτταρο θανάτωση επίδραση της ακτινοβολίας. Ωστόσο, η θανάτωση των RelB siRNA συν ακτινοβολίας ήταν ελαφρώς μικρότερη από ό, τι τα συνδυασμένα αποτελέσματα των siRNA μόνο και μόνο ακτινοβολία. Έτσι, είναι δυνατόν το δεύτερο χτύπημα σε κύτταρα που είχαν ήδη πεθάνει μπορεί να ευθύνεται για αυτή την παρατήρηση. Τρίτον, ΚεΙΑ και RelB ανεστάλησαν αναστέλλοντας πυρηνική μετατόπιση τους για να επιβεβαιώσουν περαιτέρω τους ρόλους τους στην ρύθμιση της PSA και IL-8 εκφράσεις. Μεταλλαγμένα κατασκεύασμα για ΙκΒα (IκBαM) [14] ή ρ100 (p100M) [15] διαμολύνθηκε σε κύτταρα LNCaP να εμποδίσει ΚεΙΑ: ρ50 διμερές ή RelB: ρ52 διμερές πυρηνικής μετατόπισης, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Γ, οι απαντήσεις των PSA και IL-8 εκφράσεις ήταν παρόμοια με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τη μέθοδο της RNAi (Σχ. 1Β). Έτσι, απόφραξη είτε ΚεΙΑ ή RelB πυρηνική μετατόπιση ενισχυμένη αποτελεσματικά την ραδιοευαισθησία των κυττάρων LNCaP.

PSA συσχετίζεται αντιστρόφως προς την IL-8 σε κύτταρα προστάτη

PSA και IL-8 έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικό βιοδείκτες σε πολλαπλά στάδια της εξέλιξης του προστάτη. Έχουμε δείξει ότι πάνω ρύθμιση της IL-8, αλλά κάτω ρύθμιση PSA συνδέεται με την αύξηση ογκογονικότητα των κυττάρων προστάτη [5]. Δύο κυτταρικές σειρές προστάτη χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση της συσχέτισης του PSA στην IL-8: LNCaP, ένα ανδρογόνο κυτταρική γραμμή ανταποκρίνεται PCa, εκφράζει PSA και ένα χαμηλό επίπεδο της IL-8? PC3, ένα ανδρογόνο-ανεξάρτητες PCa κυτταρική γραμμή εκφράζει υψηλό επίπεδο της IL-8, αλλά είναι μη ανιχνεύσιμο PSA. Μετά την επιμόλυνση μιας έκφρασης cDNA IL-8 κατασκεύασμα σε κύτταρα LNCaP, τα σχετικά επίπεδα του PSA ποσοτικοποιήθηκαν. Καθώς η αυξημένη IL-8 έκφραση, επίπεδα κυτταρικής PSA μειώθηκαν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, knocking- κάτω PSA από την PSA siRNA οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στα κυτταρικά επίπεδα IL-8 (Σχ. 2Α). Επιπλέον, εκφράζουν PSA σε κύτταρα PC3 οδήγησε σε μείωση της IL-8 παραγωγής. Ωστόσο, δεν υπήρχαν εκφράσεις του PSA σε κύτταρα PC3, ακόμη και όταν η IL-8 knocked- κάτω από siRNA (Σχ. 2Β). Έχει δειχθεί ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μπορεί να μεσολαβεί στην prosurvival μονοπάτι της IL-8: CXCR2 σηματοδότηση [16]. Για να διερευνήσουν κατά πόσον ΝΡ-κΒ μπορεί να είναι ένας μεσολαβητής για την παρατηρούμενη αντίστροφη σχέση μεταξύ IL-8 και PSA, ένας ΝΡ-κΒ-λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή ήταν συν-επιμολύνθηκε σε LNCaP κυττάρων με το κατασκεύασμα έκφρασης PSA ή PSA siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, υπερέκφραση του PSA καταστέλλεται αλλά ανεπάρκεια PSA ενισχυμένη NF-κΒ-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική ενεργοποίηση.

Για να χειριστούν PSA και IL-8 σε κύτταρα PCa, κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με ένα κατασκεύασμα cDNA IL-8 και ένα PSA siRNA (Α)? Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με cDNA PSA κατασκευάσει και IL-8 siRNA (Β). Για να ελεγχθεί αν PSA επηρεάζει μεταγραφικής ενεργοποίησης ΝΡ-κΒ, ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή ΝΡ-κΒ-λουσιφεράσης συν-επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή έκφρασης του PSA ή PSA siRNA και έκφραση β-gal κατασκεύασμα σε κύτταρα LNCaP. Οι λουσιφεράσης αποκρίσεις ομαλοποιήθηκαν με δραστηριότητες β-gal (C). επίπεδα PSA και IL-8 προσδιορίστηκαν ποσοτικά με κηλίδες Western με ομαλοποίηση όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1.

Η

PSA και IL-8 παίζουν απέναντι ρόλους στη ακτινοευαισθησία κυττάρων προστάτη

Ον NF -κB ρυθμιζόμενων προϊόντων γονιδίων, PSA και IL-8 μπορεί να παίξει ένα σημαντικό ρόλο στις απαντήσεις του προστάτη στην ακτινοθεραπεία. Ως εκ τούτου, χειραγωγείται τα επίπεδα του PSA και IL-8 για να προσδιοριστεί άμεσα ρόλους τους στην ακτινοευαισθησία των κυττάρων του προστάτη. Αύξηση της IL-8 σε κύτταρα LNCaP είτε κατεργασία των κυττάρων με IL-8 πρωτεΐνη (Εικ. 3Α, άνω πλαίσιο) ή σταθερώς επιμόλυνση IL-8 cDNA σε κύτταρα (Σχ. 3Α, χαμηλή πάνελ) είχε ως αποτέλεσμα μείωση των επιπέδων PSA και την ευαισθησία στην ακτινοβολία. Επιπλέον, λεντοϊού που βασίζεται shRNA σταθερό knock-down του PSA σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε αύξηση της IL-8 επίπεδα και τη μείωση ραδιοευαισθησία των κυττάρων (Σχ. 3Β). Για την περαιτέρω επαλήθευση τους ρόλους των PSA και IL-8 σε ακτινοευαισθησία κυττάρων προστάτη, PSA και IL-8 σε PC3 κύτταρα ρυθμίζεται από την επιμόλυνση του PSA cDNA και IL-8 siRNA, αντιστοίχως. Φακοϊό βάση την έκφραση του PSA και knock-down της IL-8 σε κύτταρα PC3 οδήγησε σε υψηλά επίπεδα PSA, μείωση της IL-8 επίπεδα και αυξάνεται ραδιοευαισθησία των κυττάρων PC3 (Σχ. 3C). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την αντίστροφη σχέση μεταξύ της IL-8 και PSA σε κύτταρα του προστάτη και υποδηλώνουν ότι η PSA και IL-8 έχουν αντίθετα αποτελέσματα επί της ακτινοευαισθησία των κυττάρων του προστάτη.

Για τον προσδιορισμό των ρόλων των PSA και IL- 8 σε ραδιοευαισθησία των κυττάρων προστάτη, κύτταρα LNCaP υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-8 πρωτεΐνης ή σταθερά επιμολυσμένα με IL-8 cDNA (Α) και σταθερώς transducted με PSA shRNA φακοϊό (Β)? PC3 κύτταρα σταθερώς transducted με PSA cDNA και IL-8 shRNA φακοϊού (C). Τα επίπεδα του PSA ποσοτικοποιήθηκαν με κηλίδες Western και τα επίπεδα της IL-8 προσδιορίστηκαν ποσοτικά είτε με κηλίδες Western ή κιτ ELISA. Η κυτταρική επιβίωση ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασίες αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. Western blots ομαλοποιήθηκαν με ελέγχους και την ανάλυση κλάσμα κυτταρικής επιβίωσης όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1.

Η

Up-ρύθμιση του RelB μειώνει ραδιοευαισθησία του LNCaP όγκου

in vivo

Η

λαμβάνονται τα παραπάνω στοιχεία

in vitro

εμπλέκουν RelB και στοχεύει, IL-8 και PSA, όπως έχει σημαντικό ρόλο στην ραδιοευαισθησία του προστάτη. Για την επαλήθευση του ρόλου της RelB στην ραδιοευαισθησία του προστάτη και την αντίστροφη σχέση μεταξύ της IL-8 και εκφράσεις PSA

in vivo

, ένα σταθερό RelB εκφράζουν LNCaP κλώνος δημιουργήθηκε (Σχ. 4Α) και υποδόρια ένεση σε ο πλευρά γυμνών αρσενικών ποντικών? η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε επί 50 ημέρες με μέτρηση του μεγέθους του όγκου. Tumor αλλαγή ρυθμού αύξησης ποσοτικοποιήθηκε με τον χρόνο (ημέρες) που απαιτείται για το μέγεθος του όγκου να φθάσει σε όγκο 500 mm

3. Σύκο. 4Β δείχνει ότι ο μέσος χρόνος για την ομάδα ελέγχου να φθάσει τις 500 mm

3 ήταν 54 ± 6,7 ημέρες. Όγκου αύξηση ρυθμού ανάπτυξης στην RelB-εκφράζεται κλώνος πήρε 43 ± 5,6 ημέρες για να φθάσει τις 500 mm

3. Τα ζώα με ένα μέσο μέγεθος όγκου 500 mm

3 τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες για 1) κατεργασία με κλασματοποιημένη ακτινοβολία (3 Gy ακτινοβολίας ανά ημέρα για 5 ημέρες) και 2) μάρτυρες προσομοίωσης. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν ανώδυνα, όταν οι όγκοι έφθασαν το μέγιστο μέγεθος 2000 mm

3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, στους μη ακτινοβοληθέν ποντίκια, οι όγκοι του φορέα ελέγχου αυξήθηκε από 500 χιλιοστά

3 με 2.000 mm

3 σε 25 ± 3,7 ημέρες, ενώ ο όγκος εκφράζει RelB φτάσει στο ίδιο μέγεθος σε 14 ± 2,3 ημέρες. Η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) απέτρεψε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των όγκων ελέγχου εντός της περιόδου των 50 ημερών του πειράματος. Ωστόσο, IR σταμάτησε μόνο την ανάπτυξη των όγκων που εκφράζουν RelB για 20 ημέρες μετά την ακτινοβολία, μετά το οποίο παρατηρήθηκε εκ νέου ανάπτυξη του όγκου. τερματίστηκε το πείραμα επειδή μερικά ποντίκια στα ακτινοβολείται ομάδες ανέπτυξαν κακές συνθήκες υγείας που εμπλέκονται με κλινικά συμπτώματα συστημικής νόσου, όπως η αφυδάτωση, κοπιαστική ή ρηχή αναπνοή, και να χάσει το 20% του μέγιστου βάρους τους. Μετά αφαιρέθηκαν οι όγκοι, η έκφραση του RelB και τα επίπεδα του PSA και IL-8 στους ιστούς του όγκου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο αντίσωμα για κάθε πρωτεΐνη. Συνεπής με τα υψηλά επίπεδα του RelB προσδιορίζονται στις RelB-εκφράζεται όγκους, IL-8 ήταν αυξημένη αλλά PSA μειώθηκε στους ίδιους ιστούς όγκου (Εικ. 4D).

Ένα σταθερό RelB εκφράζεται LNCaP κλώνος χαρακτηρίζεται από Western blots (Α). Τα κύτταρα /LNCaP RelB ενέθηκαν σε αρσενικούς ποντικούς για σχηματισμό όγκου και την ανάπτυξη φθάνοντας μέχρι 500 mm

3 (Β). Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή IR (5 × 3 Gy) και οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν μέχρις ότου φθάσει 2000 mm

3 (C). RelB, PSA και IL-8 επίπεδα ποσοτικοποιήθηκαν στα προϊόντα λύσης του όγκου και αναλύθηκαν στατιστικώς (D). Στατιστική σημασίες όγκων του όγκου (Γ) και τα επίπεδα των πρωτεϊνών στόχου (D) μεταξύ RelB εκφράζονται και ελέγχου του οχήματος και στις δύο ΝΟ- IR και IR αντιμετωπίζονται ομάδες υποδεικνύονται.

Η

κάτω ρύθμιση του RelB ενισχύει ραδιοευαισθησία των όγκων PC3

Για να αξιολογηθούν περαιτέρω τον προστατευτικό ρόλο του RelB έναντι ακτινοβολίας, ένα φακοϊό που βασίζεται RelB siRNA PC3 κλώνος επελέγη (Εικ. 5Α) και εγχύεται στα πλευρά γυμνών αρσενικών ποντικών. Στην ομάδα siRNA ελέγχου, ο μέσος χρόνος για έναν όγκο μέχρι τα 500 mm

3 ήταν 11 ± 2,1 ημέρες, ενώ ο μέσος χρόνος στην ομάδα knock-down RelB επεκταθεί σε 26 ± 5,1 ημέρες (Εικ. 5Β). Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR σε 3 χ 5 Gy μετά του όγκου έφθασε μέσο μέγεθος 500 mm

3. Σε μη ακτινοβοληθέν ποντίκια ελέγχου, το μέγεθος του όγκου στην ομάδα siRNA ελέγχου αυξήθηκε γρήγορα από το 500 mm

3 έως 2000 mm

3 εντός 15 ± 3,1 ημέρες. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου siRNA, ανάπτυξη όγκου στην ομάδα knock-down RelB ήταν σημαντικά βραδύτερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου siRNA. IR ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ελέγχου με την τάση να regrowth μετά από 20 ημέρες μετά IR. Είναι ενδιαφέρον, IR ελέγχεται όχι μόνο επανανάπτυξης όγκου, αλλά επίσης μείωσε το μέγεθος του όγκου στην ομάδα RelB siRNA (Σχ. 5C). Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν

in vivo

δεν είναι απλές αντανακλάσεις των διαφορών ανάπτυξης

in vitro

επειδή δεν υπάρχουν σημαντικές μειώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων, όταν RelB ήταν σταθερά νοκ-κάτω σε κύτταρα PC-3. Έτσι, το αποτέλεσμα ραδιοευαισθητοποίηση με knock-down του RelB οφείλεται στην αναστολή της ακτινοβολίας επαγόμενου ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Τα αποτελέσματα του siRNA με τη μεσολάβηση knock-down του RelB επιβεβαιώθηκαν με αναλύσεις Western blot RelB και IL-8 στους ιστούς του όγκου (Σχ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το ρόλο του RelB στην απόκριση του προστάτη στην ακτινοθεραπεία.

Μια φακοϊό που βασίζεται RelB siRNA knock-down PC3 κλώνος χαρακτηρίζεται από κηλίδες Western (Α). Τα κύτταρα /PC3 RelB shRNA ενέθηκαν σε αρσενικούς ποντικούς για σχηματισμό όγκου (Β). Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR (3 χ 5 Gy), όταν οι όγκοι του όγκου έφθασαν 500 mm

3 και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως 2000 mm

3 (C). RelB και IL-8 επίπεδα ποσοτικοποιήθηκαν στα προϊόντα λύσης του όγκου και αναλύθηκαν στατιστικώς (D). Στατιστική ανάλυση για τους όγκους των όγκων και των επιπέδων των πρωτεϊνών στόχων, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 4.

Η

Συζήτηση

Το PSA είναι ένας υποδοχέας ανδρογόνου (AR) -regulated πρωτεάσης σερίνης που παράγεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [17]. Αν και ένα ανυψωμένο επίπεδο PSA στον ορό συσχετίζεται με την παρουσία του προστάτη, πολλοί παράγοντες, όπως η φλεγμονή, μόλυνση, υπερπλασίας του προστάτη, καθώς και διεργασίες ιστού, να οδηγήσει σε κάποια απώλεια της ακεραιότητας του προστατικού αδένα και διαρροή του PSA από τον αυλό προς το διάμεσο υγρό και στη γενική κυκλοφορία. [18], [19]. Επιπλέον, η PCA μπορεί να είναι παρούσα υπό την απουσία των αυξημένων επιπέδων PSA στον ορό [20]. Πράγματι, δεν υπάρχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του PSA στο ανδρογόνο ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές PCa, όπως PC3 και DU-145. Αν και PSA χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης για τη διάγνωση της προστάτη, βιολογική λειτουργία του δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι το επίπεδο κυτταρικής PSA μπορεί να είναι ένας σημαντικός δείκτης της απόκρισης προστάτη κυττάρων σε IR. Κάτω ρύθμιση του PSA σε ανδρογονο αποκρίνονται LNCaP κύτταρα οδηγεί σε μειωμένη ραδιοευαισθησία και την έκφραση του PSA σε ανδρογονο-ανεξάρτητο κύτταρα PC3 αποτέλεσμα αυξημένη ακτινοευαισθησία, γεγονός που υποδηλώνει ότι το PSA παίζει σημαντικό ρόλο στην απόκριση των κυττάρων του προστάτη σε ακτινοθεραπεία.

IL-8, ένας προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη, εκφράζει μοναδικά σε ανδρογόνα ανεξάρτητο κύτταρα προστάτη αλλά όχι σε ανδρογονο-αποκριτικά κύτταρα του προστάτη [8], [21]. Αυξημένα επίπεδα της IL-8 σε προχωρημένο προστάτη θεωρήθηκε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση μετά θεραπείες [6], [12]. Η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει μια ενδιαφέρουσα σχέση μεταξύ της PSA και IL-8 στην απόκριση των κυττάρων του προστάτη σε ακτινοθεραπεία. Η αντίστροφη σχέση μεταξύ της PSA και IL-8 εκφράσεις συγχέει το συμπέρασμα ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές στην ραδιοευαισθησία του προστάτη εξαρτώνται από το επίπεδο PSA? Εναλλακτικά, η παρατηρούμενη επίδραση του PSA μπορεί να διαμεσολαβούνται, εν μέρει, από μια αλλαγή στην IL-8 επίπεδο. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην παρούσα έκθεση καταδεικνύουν άμεσα το ρόλο της IL-8 στο ακτινοευαισθησία των κυττάρων του προστάτη. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα αναδεικνύουν την περίπλοκη σχέση μεταξύ της IL-8 και της PSA, που συμβάλλουν στην αντιμετώπιση των κυττάρων του προστάτη σε ακτινοθεραπεία.

NF-κΒ είναι συστατικά ενεργός σε πολλούς καρκίνους, και λειτουργεί σε πάνω ρύθμιση αντιαποπτωτικών και ογκογόνου γονίδια [10], [22], [23]. Μια άλλη σημαντική βιολογική λειτουργία του ΝΡ-κΒ έχει σχέση με το συντονισμό των έμφυτες και προσαρμοστικές αποκρίσεις του ανοσοποιητικού που διατηρούν κυψελοειδή συστήματα άμυνας [3]. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ ως εκ τούτου θεωρείται χρήσιμο συμπλήρωμα στην παραδοσιακή χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. ΝΡ-κΒ αποτελείται από πέντε Rel σχετίζονται πρωτεΐνες, οι οποίες περιέχουν την ΚεΙΑ /ρ50 ετεροδιμερές μεσολάβηση κλασσική πορεία και η RelB /ρ52 ετεροδιμερές μεσολάβηση εναλλακτικής οδού [3], [10], [13]. RelB είναι μοναδικά εκφράζεται σε προχωρημένο κύτταρα προστάτη και η εναλλακτική πορεία RelB που βασίζεται παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση του προστάτη [24], [25]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η εκλεκτική αναστολή της εναλλακτικής οδού καταστέλλει σημαντικά την ογκογονικότητα των κυττάρων προστάτη [5], [26], [27]. Τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι RelB μπορεί επίσης να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ραδιοαντοχή κυττάρων προστάτη, εν μέρει, μέσω ενός αντίστροφου επίδραση στις εκφράσεις του IL-8 και PSA.

δραστικότητα AR είναι απαραίτητη για την την έναρξη και την εξέλιξη του προστάτη. Ακόμα και όταν PCa εξελίσσεται σε ορμονοάντοχου στάδια, AR σηματοδότηση παραμένει μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών ανεξάρτητου από ανδρογόνο [28]. Έτσι, κατάλυση της λειτουργίας AR είναι ο στόχος της θεραπείας πρώτης γραμμής. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι θεραπείες είναι αποτελεσματικές αρχικά, υποτροπιάζοντες όγκοι προκύπτουν με την αποκατάσταση της δραστηριότητας AR [29] ή ακόμα και με άλλους υποδοχείς σύνδεσης συνδετήρα [30]. Ως στόχο AR, έλεγχο PSA ελέγχει τη διαχείριση της ΣΕΣ. Ωστόσο, η παρουσία του AR δεν είναι επαρκής για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, επειδή το επίπεδο του PSA μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από πολλούς άλλους παράγοντες. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τόσο AR και σηματοδότηση ΝΡ-κΒ είναι σημαντικοί παράγοντες στην εξέλιξη του προστάτη. Η αποκατάσταση της δραστηριότητας AR απουσία ανδρογόνων θεωρείται ένας μηχανισμός για την PCA καθώς προχωρεί προς την ορμονοάντοχου στάδιο [29]. Επιπλέον, NF-κΒ-διαμεσολαβούμενη IL-6-STAT3 ενεργοποίηση πιστεύεται ότι είναι ένας άλλος σημαντικός μηχανισμός για μετάσταση όγκου [31]. Ωστόσο, διαγώνια συζήτηση μεταξύ των δύο οδών σήματος είναι αόριστη. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η υπερέκφραση του RelB αύξησε το κυτταρικό επίπεδο της IL-8, αλλά μείωσε το επίπεδο του PSA, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ΝΡ-κΒ γονίδια στόχους μπορεί να ρυθμίζεται διαφορικά με διαφορετικά μέλη της οικογένειας του ΝΡ-κΒ ή ότι RelB μπορούν να χρησιμεύσουν ως συν-ενεργοποιητής για την IL-8 μεταγραφή ενώ υπηρετούσε ως αρνητικός συν-ρυθμιστή για μεταγραφή PSA. Έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός RelB και του υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή από ένα στοιχείο RelB /AhR μοναδικά βρίσκεται ανοδικά από την θέση της IL-8-κΒ [32]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η NF-κΒ καταστέλλει μεταγραφή PSA μέσω ενός ανδρογόνου στοιχείο υποδοχέα που βρίσκεται στην περιοχή προαγωγού ενός γονιδίου [33]. Το εύρημά μας είναι σύμφωνη με την πιθανότητα ότι το ΝΡ-κΒ δεν έχει μόνο την ικανότητα να ενεργοποιούν το γονίδιο-στόχο της, αλλά και να αναστέλλει γονίδιο στόχος της ανάλογα με τη σύνθεση των παραγόντων που επηρεάζουν την μεταγραφή.

Η θεραπεία ακτινοβολίας προκαλεί διακοπή της αναπτύξεως και του θανάτου σε καρκινικά κύτταρα είτε με άμεση ιονισμό του DNA ή από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) που μπορούν να βλάψουν το DNA. Έχει δειχθεί ότι οι γονοτοξικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των IR, που προκαλείται από δίκλωνα σπασίματα (DSBs) διεγείρουν την οδό NF-κΒ να δημιουργήσει θετική ανάδραση βρόχους μέσω της παραγωγής κυτοκίνης, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA [34] – [36]. Η κυτοκίνη που ενεργοποιείται ΝΡ-κΒ οδού μπορεί επίσης να οδηγήσει στην επαγωγή αντιοξειδωτικών ενζύμων, τα οποία προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από ROS παραγωγή θεραπευτικά. προηγούμενες μελέτες μας, πράγμα που αποδεικνύει ότι η αναστολή του NF-κΒ και αντιοξειδωτική στόχο του, υπεροξειδιομαγγανίου δισμουτάσης (MnSOD), αυξάνουν αξιοσημείωτα ραδιοευαισθησία των επιθετικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη [5], [25], είναι συνεπείς με το εύρημα για αυτό αργότερα μηχανισμό.

Ο μηχανισμός με τον οποίο το PSA μπορεί να ρυθμίζει την κυτταρική απόκριση σε θεραπεία με ακτινοβολία παραμένει άγνωστη. Είναι πιθανό ότι η παρατηρούμενη αρνητική επίδραση του PSA οφείλεται, εν μέρει, με την αύξηση της IL-8 επίπεδο όταν το PSA είναι μειωμένη. Πράγματι, αντίστροφη συσχέτιση του PSA και IL-8 παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις αποκρίνονται στο ανδρογόνο και ανεξάρτητου από ανδρογόνα κύτταρα PCa, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυξημένη αναλογία της IL-8 προς το PSA συμβάλλει στην ραδιοαντοχή των κυττάρων του προστάτη. Μελλοντική μελέτη για να καθορίσουν τον τρόπο το επίπεδο του PSA επηρεάζει την παραγωγή της IL-8 θα είναι ενδιαφέρουσα.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη χρησιμοποιεί συμπληρωματικά πειραματικές προσεγγίσεις για να δείξει ότι RelB συμβάλλει στην ραδιοαντοχή των κυττάρων του προστάτη και αντιστρόφως ρυθμίζει IL -8 και PSA εκφράσεις. Η αντίστροφη σχέση μεταξύ IL-8 και τα επίπεδα PSA είναι προγνωστική για την απόκριση των κυττάρων προστάτη στην ακτινοβολία, γεγονός που υποδηλώνει τη δυνατότητα να ενισχύει την ακτινοθεραπεία του προστάτη με άμεση διαμόρφωση της IL-8 ή /και PSA επίπεδα. Αυτή είναι η πρώτη πειραματική απόδειξη να εμπλέξει το ρόλο του PSA σε ακτινοθεραπεία των κυττάρων του προστάτη. Insights που λαμβάνονται από την παρούσα μελέτη παρέχει μια επιστημονική βάση για τη χρήση του λόγου /PSA-8 IL σαν ένα κυτταρικό δείκτη για τη διαχείριση των κυττάρων του προστάτη από την ακτινοβολία.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπεία

Ανθρώπινο καρκίνωμα του προστάτη LNCaP και PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσα RPMI με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR χρησιμοποιώντας μία μηχανή ακτίνων Χ 250 kV (Faxitron Χ-ray Corp.) με αιχμή ενέργειας 130 kV, 0,05 φίλτρο mm ΑΙ, σε μια δόση από το 0 έως 5 Gy. Για να εξεταστεί η επίδραση της IL-8 στις απαντήσεις ακτινοβολία, τα κύτταρα LNCaP προκατεργάστηκαν με IL-8 (BD Biosciences) σε συγκεντρώσεις από 0 έως 100 pg /ml για 12 ώρες πριν από την έκθεση σε ακτινοβολία. Ακτινοευαισθησία κυττάρων προστάτη προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

τηλέφωνα επιμόλυνση

Για να εκφράσουν ΚεΙΑ, RelB, PSA, IL-8, πρωτεΐνες p100M και IκBαM σε κύτταρα PCa, χρησιμοποιήθηκαν κατασκευές έκφρασης που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες. ΚεΙΑ (p65) κατασκεύασμα έκφρασης είναι ένα δώρο από το εργαστήριο του Νανσύ Ρύζι (ΝΙΗ)? το cDNA p65 κλωνοποιήθηκαν μεταξύ H

ind

III – X

βα

sites Ι σε φορέα PRC-CMV? RelB, PSA και IL-8 κατασκευασμάτων έκφρασης αγοράστηκαν από Open Biosystems. Κατάλογος RelB αριθ .: MHS1010-7507797? Κατάλογος PSA αριθ .: MHS1010-9205472? IL-8 Κατάλογος No .: MHS1010-58052. Το cDNA κλωνοποιήθηκε μεταξύ Ε

cor

V – Ν

ot

sites μου στο φορέα pCMV-αθλητισμό6? κατασκεύασμα P100M παρασχέθηκε από το εργαστήριο Dr. Shao-Cong της Sun στο Pennsylvania State University [37]. ακολουθία P100M κλωνοποιήθηκε μεταξύ H

ind

III – X

βα

sites Ι pCMV 4? IκBαM κατασκεύασμα που παρέχονται από το εργαστήριο Dr. Veronique Imbert, η πρόσφυση Cellulaire, Hôpital de Sainte Marguerite, Μασσαλία, Γαλλία. ΙκΒα μεταλλαγμένη αλληλουχία (S32-36A) κλωνοποιήθηκε σε Ε

cor Ιστοσελίδα V στο pcDNA 3.1 φορέα. Όλες οι φορείς περιέχουν έναν υποκινητή CMV και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς διεγέρσιμη κατάσταση. Οι σταθερές διαμολυσμένοι κλώνοι επιλέχθηκαν με αντίσταση σε νεομυκίνη. Να χτυπήσει κάτω ενδογενή ΚεΙΑ, RelB, PSA και IL-8 σε κύτταρα προστάτη, η συγκεκριμένη siRNA (Santa Cruz Biotech.) Ήταν επιμολυσμένα. Lentivirus που βασίζεται shRNA κατασκευάζει (Open Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για να σταθερά νοκ-κάτω τους στόχους σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκαν με κηλίδες Western. Ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ ΝΡ-κΒ-λουσιφεράσης που περιέχει τέσσερα αντίγραφα των στοιχείων NF-κΒ συνδεδεμένη με έναν υποκινητή SV40 σε φορέα pGL3 (Promega) προηγουμένως κατασκευάσθηκε [25]. Το κατασκεύασμα ανταποκριτής συν-επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης του PSA ή PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) Και β-γαλακτοσιδάσης (β-gal) κατασκεύασμα σε κύτταρα LNCaP να προσδιοριστεί η επίδραση του PSA στην ενεργοποίηση της μεταγραφής ΝΡ-κΒ.

Ζώα

τεσσάρων εβδομάδων αρσενικό NCRNU (nu /nu αθυμικά γυμνά) ποντίκια αγοράστηκαν από την Taconic (Hudson). 1.8 × 10

6 προστάτη κύτταρα αναμιγνύονται με Matrigel (BD Biosciences) εγχύθηκαν στα δεξιά πλευρά των ποντικών. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν εβδομαδιαία χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο τύπο (Α × Β

2 × 0,52? Α και Β αντιπροσωπεύουν το διαγώνιο μήκη όγκου). Οι ιστοί όγκου συλλέχθηκαν, και 100 μg ιστοί υποβλήθηκαν σε λύση για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κηλίδες Western. διαδικασίες πείραμα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Κεντάκι, το πρωτόκολλο Έγκριση αρ 01077M2006.

κηλίδα Western.

Για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης, των κυττάρων και των ιστών εκχυλίσματα ήταν διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE, 8% (w /v) γέλη πολυακρυλαμιδίου, και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και γίνεται αποτύπωμα με αντισώματα έναντι πρωτογενούς ΚεΙΑ, RelB, Ρ100, ΙκΒα, PSA, IL-8 και β-ακτίνης. Ένα αντι-ποντικού IgG-HRP συζευγμένου δευτερογενούς αντισώματος αίγας χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ΚεΙΑ, PSA, IL-8, και β-ακτίνης. Άλλες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντι-κουνελιού IgG-HRP συζευγμένου δευτερογενούς αντισώματος αίγας. Τα ανοσοστυπώματα έγιναν ορατές με ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

IL-8 ποσοτικοποίηση

Καλλιεργημένα μέσα συλλέχθηκαν στο τέλος των πειραματικών διαδικασιών. Τα επίπεδα της IL-8 που εκκρίνονται από καλλιεργημένα κύτταρα ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα IL-8 Elisa kit (BD Biosciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

Στατιστικές αναλύσεις δεδομένων

.

Πολλαπλές ανεξάρτητα πειράματα για κάθε σύνολο δεδομένων. Εικόνες στη Δυτική κηλίδες ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού Carestream Μοριακής Απεικόνισης (Carestream Health Inc.). Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και της εξέτασης πολλαπλού Σύγκριση του Tukey, ακολουθούμενη από ανάλυση των δεδομένων με Graphpad Prism.