Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρή (~ 22 νουκλεοτίδια) ρυθμιστικά RNA που μπορούν να διαμορφώσουν την έκφραση γονιδίων και είναι παρεκκλίνοντα που εκφράζεται σε πολλές ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs αναστέλλουν την μετάφραση και να διευκολύνει την αποικοδόμηση των στοχευμένων αγγελιοφόρων RNA τους (mRNAs) καθιστώντας τους ελκυστικούς υποψηφίους για χρήση στη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, το δυναμικό κλινική χρησιμότητα των miRNAs στη θεραπεία του καρκίνου βασίζεται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητά μας να κατανοήσουν και να προβλέψει με ακρίβεια τις συνέπειες των διακυμάνσεων στα επίπεδα του miRNAs στο πλαίσιο των πολύπλοκων κυττάρων όγκου. Για να αξιολογηθεί η προβλεπτική ικανότητα των σημερινών μοντέλων, τα επίπεδα των miRNAs και στοχευμένη mRNAs τους μετρήθηκαν σε λέιζερ κατέλαβε (LCM) επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών μικρο-ανατομή (CEPI) και σε σύγκριση με τα επίπεδα στα κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακά (ΟΣΕ). Βρήκαμε ότι η προβλεπόμενη αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στα επίπεδα των miRNAs και τα επίπεδα των στόχων mRNA τους κρατούνται για μόνο ~ 11% της προβλεπόμενης mRNAs στόχου. Έχουμε αποδείξει ότι αυτό το χαμηλό αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στα επίπεδα των miRNAs και mRNAs στόχο τους

in vivo

δεν είναι απλώς ένα κατασκεύασμα της ανακριβείς προβλέψεις στόχου miRNA αλλά η πιθανή συνέπεια της έμμεσης κυτταρικές διεργασίες που διαμορφώνουν τις ρυθμιστικές επιπτώσεις των miRNAs

in vivo.

τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν την πολυπλοκότητα των miRNA με τη μεσολάβηση κανονισμού

in vivo

και η αναγκαιότητα της κατανόησης της βάσης αυτών των περιπλοκών στα καρκινικά κύτταρα πριν από το θεραπευτικό δυναμικό των miRNAs μπορούν να υλοποιηθούν πλήρως .

Παράθεση: Shahab ΝΔ, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, Bowen NJ, Benigno ΒΒ, et al. (2011) Αποδεικτικά στοιχεία για την πολυπλοκότητα των microRNA διαμεσολαβείται από τον κανονισμό στον καρκίνο των ωοθηκών: Συστήματα Προσέγγιση. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10.1371 /journal.pone.0022508

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10, Μάρτη του 2011? Αποδεκτές: 27 Ιουν του 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Shahab et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ινστιτούτο καρκίνου των ωοθηκών, το Ίδρυμα ωοθηκών κύκλο, το Ίδρυμα Robinson Family, The Deborah Nash Willingham Κληροδότημα, το Ίδρυμα Καταρράκτη και OBNET Γυναικών Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μέλη μιας κατηγορίας άφθονη μικρών (~ 22 nts) ρυθμιστικών RNAs πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους σε μια ποικιλία βιολογικών διαδικασιών και ασθενειών σε φυτά και ζώα [1]. Από πρόσφατο ενδιαφέρον, είναι η πιθανή συμβολή της έκτροπα εξέφρασε miRNAs την έναρξη του καρκίνου και την ανάπτυξη [2], [3]. Πολυάριθμες

in vitro

μελέτες έχουν αποδείξει ότι miRNAs είναι ικανά να αναστέλλουν την μετάφραση και /ή τη διευκόλυνση της υποβάθμισης [4], [5], [6], [7] στοχευμένων mRNAs τους καθιστώντας τους ελκυστικούς υποψηφίους για πιθανή χρήση στη θεραπεία του καρκίνου [8], [9]. Ωστόσο, το δυναμικό κλινική χρησιμότητα των miRNAs στη θεραπεία του καρκίνου βασίζεται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητά μας να κατανοήσουν και να προβλέψει με ακρίβεια τις συνέπειες των διακυμάνσεων στα επίπεδα του miRNAs στο πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων

in vivo

. Η γενική προσδοκία που αλλάζει στα επίπεδα του miRNAs θα συσχετίζεται αντίστροφα (IC) με τις αλλαγές στα επίπεδα των στόχων mRNA τους [10], [11], [12], [13], [14] δεν έχει ακόμη δοκιμαστεί οριστικά εντός από τα συμφραζόμενα των κυττάρων του όγκου

in vivo.

για παράδειγμα, οι προηγούμενες ανεξάρτητες εκτιμήσεις των σχετικών επιπέδων miRNA σε καρκίνους των ωοθηκών έναντι ελέγχων συχνά έχουν ασυνεπής, πιθανώς λόγω των διαφορών στον τύπο δείγματος (

π.χ.

., δείγματα χύμα ιστού έναντι των κυττάρων μικρο-ανατομή, κ.λπ.), βιολογική μεταβλητότητα μεταξύ διαφορετικών καρκίνος υπο-τύποι και τα μεμονωμένα δείγματα ασθενών (

π.χ.

., [15], [16], [17], [18], [19], [20]) ή λόγω ανακρίβειες στην πρόβλεψη των στόχων του mRNA [21], [22].

σε μια προσπάθεια να μειωθεί η διακύμανση που μπορεί να συγκαλύψει βιολογικά σημαντικές τάσεις, έχουμε διεξάγει μικροσυστοιχιών (Affymetrix) αναλύσεις των miRNAs και mRNA από τα ίδια τα κύτταρα των ωοθηκών επιθηλιακού καρκίνου (CEPI) απομονώθηκαν από δείγματα ασθενών με σύλληψη λέιζερ μικρο-ανατομή (LCM). Παρακολουθήσαμε τις διαφορές στα επίπεδα έκφρασης των miRNAs μεταξύ επιφανειακά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών (ΟΣΕ) CEPI και (συλλέγονται από τις ωοθήκες της κανονικής ασθενείς) με τα επίπεδα έκφρασης των υποθετικών στόχων mRNA τους, όπως καθορίζεται από διάφορους αλγόριθμους πρόβλεψης και πειραματική επαλήθευση. Ενώ μπορεί να προκύψουν ωοθηκών είτε από το κροσσωτό επιθήλιο της σάλπιγγα ή ΟΣΕ, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι και οι δύο κατηγορίες των κυττάρων αποτελούν μέρος ενός μεταβατικού επιθηλίου της κοινής καταγωγής και έτσι είτε μπορεί να χρησιμεύσει ως προπομπός για CEPI [23]. Από ΟΣΕ μπορούν να συλλέγονται από την επιφάνεια των ωοθηκών με ελάχιστη μόλυνση, είχαν επιλεγεί ως κατάλληλους ελέγχους στη μελέτη μας

Βρήκαμε ότι μόνο το ~ 11% των στόχων mRNA εμφανίζουν σημαντική. (P & lt? 0.005) αλλαγές στα επίπεδα της έκφρασης σε CEPI σχέση με το φυσιολογικό ήταν IC με τις αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs ρυθμίζουν τους (p & lt? 0,01). Τα επίπεδα της πλειοψηφίας (~79%) των mRNA στόχου παρέμειναν αμετάβλητες σε CEPI ενώ το υπόλοιπο (~ 10%) των στόχων του mRNA που εμφανίζονται αλλαγές στα επίπεδα συσχετίζονται θετικά (PC) με τις αντίστοιχες miRNAs ρυθμίζουν τους. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η χαμηλή προβλεψιμότητα των miRNA ρυθμιστικές επιδράσεις στην CEPI απομονώθηκαν από δείγματα ασθενών οφείλεται στην πολυπλοκότητα της λειτουργίας των miRNAs

in vivo

.

Αποτελέσματα

Η πλειοψηφία των miRNAs διαφορικά εκφρασμένο σε CEPI σε σχέση με τον ΟΣΕ είναι πάνω ρυθμισμένα

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των προφίλ έκφρασης των miRNAs ανιχνεύονται στο miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) διεξήχθη σε τρεις CEPI και τρία δείγματα ασθενών ΟΣΕ (Σχήμα 1? βλέπε πίνακα 1 για πληροφορίες σχετικά με την κλινική δείγματα). Η miRChip περιέχει συνολικά 13.349 ανιχνευτές συμπεριλαμβανομένων 467 σχολιασμένα ανθρώπινα miRNAs (Sanger miRBase V9.2 [24], [25], [26]), 455 miRNAs σχολιασμένα σε διάφορα άλλα είδη και 12894 (διερευνητική) ανιχνευτές προβλεφθεί, αλλά ως ακόμα δεν επικυρωθεί /σχολιασμένη miRNAs. Χρησιμοποιώντας ένα όριο του 2-πλάσια ή μεγαλύτερη αλλαγή, 42 ανιχνευτές miRNA βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά (ρ & lt? 0,01) μεταξύ του καρκίνου και του ελέγχου δειγμάτων μας. Από αυτούς, 33 ήταν πάνω-ρυθμίζονται και 9 κάτω-ρυθμίζονται στο CEPI σε σχέση με τον ΟΣΕ, συμπεριλαμβανομένων των 12 προηγουμένως σχολιασμένο ανθρώπινα miRNAs (9 έως ρυθμιζόμενα και 3 κάτω-ρύθμιση). Μια χάρτη θερμότητας από τα 42 διαφορικά εκφραζόμενων ανιχνευτές miRNA παρουσιάζεται στην Εικόνα 2a (οι αλληλουχίες miRNA αυτών 42 ανιχνευτών, log

2 διαφορά μεταξύ CEPI και ΟΣΕ, και ρ-τιμές από t-test παρέχονται στον Πίνακα S1). Για να ελέγξετε ανεξάρτητα την εγκυρότητα των προτύπων έκφρασης των miRNAs απόκλιση καθορίζεται από μικροσυστοιχιών, πραγματοποιήσαμε μετρήσεις των επιπέδων των miRNAs χρήση ποσοτικών (σε πραγματικό χρόνο) αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR). Πέντε (

miR-141, miR-429, miR-205, miR-383 και miR-320

) των 12 προηγουμένως σχολιασμένο ανθρώπινα miRNAs φαίνεται να εκφράζεται διαφορετικά από μικροσυστοιχιών επιλέχθηκαν για ανάλυση qPCR σε τρεις καρκίνο και τρία δείγματα ελέγχου. Τα αποτελέσματα qPCR επιβεβαίωσε τις διαφορές διαπιστώθηκαν στη μελέτη των μικροσυστοιχιών (Σχήμα 2β).

Ένα από ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση των δειγμάτων CEPI και ΟΣΕ διεξήχθη χρησιμοποιώντας όλα ανιχνεύονται probesets στη συστοιχία Ambion miRChip, ανεξαρτήτως της διαφορικής έκφρασης. Probesets με τυπική απόκλιση & lt? 0.5 σε όλα τα δείγματα αφαιρέθηκαν πριν από την ομαδοποίηση. Η ομαδοποίηση δείχνει ότι τα δείγματα CEPI και ΟΣΕ συγκεντρώνονται σε ξεχωριστές ομάδες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διακύμανση μεταξύ των ομάδων είναι μεγαλύτερη από ότι εντός των ομάδων.

Η

(Α) Ιεραρχική ομαδοποίηση των φυσιολογικών και ασθενή με καρκίνο δείγματα με βάση για διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ των κυττάρων CEPI και τα κύτταρα του ΟΣΕ (p & lt? 0,01, ≥2fold αλλάξει). Το δενδρόγραμμα στα αριστερά δείχνει ότι οι ανιχνευτές συγκεντρώνονται σε δύο ομάδες που αντιστοιχούν στα επάνω ρυθμισμένη και ρυθμισμένα προς τα κάτω miRNAs εκφράζονται διαφορικά μεταξύ της κανονικής και του καρκίνου. Οι ταυτότητες των επιλεγμένων ανιχνευτών δίνεται στη δεξιά (συμπεριλαμβανομένων των σχολιασμένη ανθρώπινα miRNAs, βλέπε πίνακα S1 για μια πλήρη λίστα). Κλειδί: HSA-miR-x: σχολιασμένο ανθρώπινα miRNAs? HSA-ASG /υποψ-x: προέβλεψε υποψήφια ανθρώπινα miRNAs? ppy-:

Pongo pygmaeus

miRNA? αντιπροσωπει- ών:

C. elegans

miRNA. (Β) Επικύρωση των προτύπων έκφρασης για επιλεγμένες miRNAs με qPCR. Η σχετική έκφραση του κάθε miRNA σε λογαριθμική μονάδες σε κύτταρα από 3 ασθενείς με καρκίνο παρουσιάζεται σε σύγκριση με κύτταρα από 3 φυσιολογικές ωοθήκες μετά από κανονικοποίηση προς RNU6B (μέθοδος ΔΔCt). Αυτές βρέθηκαν να είναι στατιστικά σημαντική από Εργαλείο Software σχετική έκφραση (REST®) με μία μέθοδο τυχαίας επιλογής. Η τυχαιοποίηση έγινε 5.000 φορές. Συνεπής με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, miR-141, miR-205 και miR-429 επιβεβαιώθηκαν να είναι σημαντικά επάνω ρυθμισμένη στον καρκίνο, ενώ miR-320 και miR-383 βρέθηκαν να είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Σε αντίθεση με ορισμένες προηγούμενες μελέτες [15], [16], [18], [19], [20], τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η πλειοψηφία των miRNAs εμφανίζει σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ CEPI και ΟΣΕ είναι up-ρυθμίζονται στον καρκίνο των ωοθηκών. Η βάση αυτής της διαφοράς είναι άγνωστη, αλλά μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στον τύπο δείγματος (π.χ., χύδην δείγματα ιστού έναντι μικρο-ανατομή κύτταρα, κ.λ.π.) και /ή βιολογικά μεταβλητότητα μεταξύ των μεμονωμένων δειγμάτων ασθενών. Η ανακάλυψή μας ότι η πλειονότητα των miRNAs είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκίνο των ωοθηκών είναι σύμφωνη με το γεγονός ότι οι στόχοι miRNA εμπλουτίζονται σημαντικά (υπεργεωμετρική κατανομή, σ & lt? 0,05) μεταξύ των mRNAs κάτω-ρυθμίζονται σε δείγματα καρκίνου του μας, ενώ up-ρυθμιζόμενα γονίδια έχουν σχετικά λίγοι στόχοι miRNA (Σχήμα S1? χάρτες θερμότητα που δείχνει ιεραρχική συσταδοποίηση των δειγμάτων χρησιμοποιώντας όλα probesets παρουσιάζεται στο σχήμα S2 και χρησιμοποιώντας μόνο διαφορικά εκφρασμένων mRNAs στο Σχήμα S3? ένας κατάλογος όλων των διαφορικά εκφραζόμενων mRNAs παρουσιάζεται στον πίνακα S2). Μια πιθανή βιολογική εξήγηση του γιατί miRNAs είναι πάνω ρυθμισμένα σε CEPI μπορεί να έγκειται στο γεγονός ότι, σε αντίθεση με άλλους καρκίνους [27], [28], η μετάβαση από τον ΟΣΕ προς CEPI Υποτίθεται να συνεπάγεται αλλαγές από ένα λιγότερο διαφοροποιημένο σε ένα πιο διαφοροποιημένη κατάσταση [29], [30], [31].

Μεταξύ των 12 προηγουμένως σχολιασμένο miRNAs εμφανίζοντας μια σημαντική αλλαγή στα επίπεδα στα δείγματα CEPI, miR-205, miR-141 και miR-429 είναι όλα σημαντικά επάνω ρυθμισμένη συνεπής με προηγούμενες μελέτες που συνδέουν αυτά τα miRNAs με τη διατήρηση των κυττάρων στο διαφοροποιημένα επιθηλιακά κατάσταση [32]. Των miRNAs που ρυθμίζονται προς τα κάτω σε σχέση με CEPI ΟΣΕ, miR-320 και miR-383 βρίσκονται σε περιοχές που σχετίζονται με τις συχνές DNA απώλειες αριθμό αντιγράφων στον καρκίνο των ωοθηκών [19]. miR-320 προηγουμένως έχει ταυτοποιηθεί ως ένας αναστολέας του πολλαπλασιασμού του καρκινώματος των πνευμόνων [33]. κάτω ρύθμιση του σε CEPI υποδεικνύει ότι μπορεί να δρα ως καταστολέας όγκων σε καρκίνους των ωοθηκών, καθώς και.

Μόνο ~ 11% των προβλεπόμενων στόχων mRNA του miRNAs διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ της CEPI και ΟΣΕ εμφανίζει την αναμενόμενη μορφή αντίστροφης της αλλαγής στην έκφραση γονιδίου

Προηγούμενες μελέτες απέδειξαν ότι η ανθρώπινη miRNAs καταστέλλουν έκφραση γονιδίου με ζευγάρωμα με συμπληρωματικές αλληλουχίες που βρίσκονται εντός του 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (3’ UTR) στοχευμένων mRNAs που προκύπτουν στη μεταγραφική καταστολή και mRNA αποικοδόμηση [6 ], [7]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του miRNAs γενικά προβλέπεται να συσχετίζεται αντιστρόφως με μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης στοχευμένων mRNAs τους [10], [11], [12], [13], [14]. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, στο πλαίσιο των κυττάρων που απομονώνονται από δείγματα ασθενών, συγκρίναμε αλλαγές στα επίπεδα των προηγουμένως σχολιασμένο ανθρώπινα miRNAs με τα επίπεδα της προβλεπόμενης mRNAs στόχο τους στα δείγματα μας CEPI σχέση με τους ελέγχους OSE. Οι πιθανούς στόχους του mir αυτών προηγουμένως σχολιασμένο ανθρώπινα miRNAs αρχικά προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Miranda [34], [35], [36]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μόνο το ~ 11% των αλλαγών στην έκφραση του mRNA μεταξύ CEPI και ΟΣΕ συσχετίζονταν αντίστροφα (IC) με τις παρατηρούμενες αλλαγές στα επίπεδα miRNA (Πίνακες 2 & amp? S3). Προγενέστερες μελέτες των επιπέδων των miRNAs και στοχευμένη mRNAs τους σε μία σειρά κυτταρικών σειρών που αναφέρθηκαν παρόμοια ευρήματα [13], [37], [38]. Η έκφραση της πλειοψηφίας (Καμία αλλαγή, NC: ~79%) των προβλεπόμενων στόχων mRNA δεν διέφερε σημαντικά (p & gt? 0.005 ή /και διπλώστε την αλλαγή του & lt? 2) μεταξύ των δειγμάτων CEPI και ΟΣΕ, ενώ το ~ 10% της στοχευμένες mRNAs εμφανίζεται αλλαγές θετική συσχέτιση (PC) με υποθετικά miRNAs ρυθμίζουν τους.

η

για να προσδιορίσετε αν το απροσδόκητα χαμηλό ποσοστό των αλλαγών IC μπορεί να είναι μια υπολογιστική τεχνούργημα από μας χρήση του αλγορίθμου Miranda να προβλέψει στοχευμένες mRNAs , επαναλάβαμε την ανάλυση ανεξάρτητα χρησιμοποιώντας τα PicTar (www.pictar.org) και TargetScan (www.targetscan.org) miRNA αλγορίθμων πρόβλεψης στόχου. Και στις δύο περιπτώσεις, τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με την αρχική διαπίστωσή μας ότι μόνο μια μειοψηφία των αλλαγών στην έκφραση του mRNA μεταξύ CEPI και ΟΣΕ είναι αντιστρόφως ανάλογα (IC) με τις παρατηρούμενες αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs (PicTar: IC 9,4%, PC 10,1%, NC 80,5%? TargetScan: IC 10,4%, PC 10,3%, NC 79,3%? βλέπε πίνακες 3, S4 & amp? S5). Για να αυξηθεί η αυστηρότητα των προβλέψεων στόχου, εμείς αναλύονται πάλι τα δεδομένα χρησιμοποιώντας μόνο miRNA στόχους που συνήθως προβλέπεται και από τα τρία αλγορίθμους (διασταύρωση). Βρήκαμε ότι με επικάλυψη των τριών ανεξάρτητων αλγορίθμων πρόβλεψης, το καθένα miRNA είχαν λιγότερες προβλέψει στόχους, αλλά με τη χρήση αυτών των κοινώς προέβλεψε στόχους, μόνο ~ 7% από τις αλλαγές mRNA μεταξύ CEPI και ΟΣΕ βρέθηκαν να είναι αντιστρόφως ανάλογη (IC) με τις παρατηρούμενες αλλαγές σε miRNA επίπεδα (Πίνακας 4). Αναλύσαμε επίσης δεδομένα μας χρησιμοποιώντας διασταυρώσεις των προβλέψεων από δύο αλγορίθμων σε έναν χρόνο (Miranda + TargetScan, Miranda + PicTar, και PicTar + TargetScan), και πάλι βρήκαμε ότι οι αλλαγές στα επίπεδα της μόνο 6-9% των προβλεπόμενων στόχων mRNA ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τις αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs (πίνακες S6, S7 και S8).

η

Πειραματική επικύρωση θεωρείται σήμερα η πιο αυστηρή μέθοδο για την επικύρωση των στόχων των miRNAs [39], [40]. Έτσι, για να δοκιμαστεί περαιτέρω η πιθανότητα ότι η χαμηλή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στα επίπεδα miRNA και mRNAs που παρατηρείται στα δείγματα των ιστών ήταν απλώς μια αντανάκλαση της περιορισμένης ακρίβειας των αλγορίθμων πρόβλεψης στόχου, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας δύο miRNAs που ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη σε CEPI (mIR-7 και miR-128) για τον προσδιορισμό πειραματικά επικυρωμένη στόχων αυτών miRNAs σε CEPI.

Μια σειρά ανεξάρτητων πειραμάτων διαμολύνσεως διεξήχθη με miR-7, miR-128 και ένα ταιριαστό σύνολο των αρνητικών miRNAs ελέγχου σε μια καθιερωμένη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (hey) [41]. Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα των επιμολύνσεων μας (θετικοί έλεγχοι), παρακολουθήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των δύο προηγουμένως επιβεβαιωθεί στόχους mRNA του miR-7 (υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, EGFR [42] και miR-128 (Β λέμφωμα Μο-MLV περιοχής εισαγωγής 1 ομόλογο .., BMI1 [43]) ρύθμιση τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την αποτελεσματικότητα και των δύο επιμολύνσεων (Σχήμα S4) RNA συλλέχθηκε από τα κύτταρα μετά την επιμόλυνση και τα σχετικά επίπεδα των mRNAs παρούσας προσδιορίστηκαν με Affymetrix microarray αναλύσεις (HG-U133 Plus 2.0? πίνακες S9 και S10).

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από δείγματα ιστών CEPI, μόνο μια μειοψηφία των προβλεπόμενων στόχων mRNA βρέθηκε να μειώνεται σημαντικά (IC) μετά miR-7 ή miR-128 επιμόλυνση (Πίνακας 5). Η προέβλεψε στόχους mRNA που ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε αυτά τα πειράματα επιμόλυνσης ελήφθησαν ως «πειραματικά επικυρωμένη» στόχους mRNA του miR-7 και miR-128, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας μόνο αυτούς τους στόχους, μπορούμε να αναλύονται τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από τα δείγματα ιστού και διαπίστωσε ότι μόνο ~ 8% (εύρος 0-18%) από τα «πειραματικά επικυρωμένη» στόχους mRNA που εμφανίζεται αλλαγές στην έκφραση IC με τις αλλαγές στο miR-7 και την έκφραση του miR-128 στο CEPI (Πίνακας 6). Συλλογικά τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η χαμηλή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στα επίπεδα miRNAs και τα mRNA στόχο τους

in vivo

δεν είναι απλώς ένα κατασκεύασμα της ανακριβείς προβλέψεις στόχο, αλλά μάλλον μια αντανάκλαση της πολυπλοκότητας της λειτουργίας miRNA σε καρκινικά κύτταρα.

η

Συζήτηση

είναι γνωστό ότι τα γονίδια και τα προϊόντα mRNA τους υπόκεινται σε ένα ευρύ φάσμα των ρυθμιστικών ελέγχων. Η σχετική συμβολή των δυσλειτουργιών αυτών των ελέγχων για την εμφάνιση και την εξέλιξη των ασθενειών, όπως ο καρκίνος, μπορεί να μεταβάλλεται και σύμπλοκο [44]. miRNAs και άλλα μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs έχουν πρόσφατα δειχθεί ότι είναι σημαντικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, και διαταραχή της έκφρασης miRNA έχει εμπλακεί σε πολλές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. Ενώ είναι καλά τεκμηριωμένο ότι miRNAs μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα βιοδείκτες για τη διάγνωση και σταδιοποίηση μίας ποικιλίας ανθρώπινων καρκίνων (π.χ., [2], [49], [50]), ο τρόπος και η έκταση στην οποία miRNAs συμβάλει στις διαδικασίες υποκείμενου καρκίνου είναι μόλις τώρα αρχίζουν να γίνει κατανοητό [2], [45]. Για παράδειγμα, η ρυθμιστική λειτουργία του miRNAs αρχικά πιστεύεται ότι λειτουργούν αποκλειστικά στο μεταφραστικό επίπεδο [51], [52], αλλά πιο πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι αυτές οι μικρές RNAs ρυθμίσεως παίζουν επίσης ρόλο στη ρύθμιση της σταθερότητας του mRNA και ότι αυτά δύο τρόποι ελέγχου μπορεί να συνδέονται μεταξύ τους [7], [53]. Εμείς ακόμα δεν αποκλείει το ενδεχόμενο ότι η ρύθμιση ορισμένων γονιδίων στόχων μπορεί να συμβεί στο μεταφραστικό επίπεδο, χωρίς σημαντικές αλλαγές στο επίπεδο του mRNA, και ως εκ τούτου μπορεί να έχουν αγνοηθεί στις αναλύσεις μας.

Εκτεταμένη

in vitro

και

in vivo μελέτες

προηγουμένως έχουν καταδείξει ότι τα ανθρώπινα miRNAs μπορούν καταστέλλουν έκφραση γονιδίου με ζευγάρωμα με αλληλουχίες που βρίσκονται εντός του 3 ‘αμετάφραστες περιοχές του στοχευμένο αγγελιαφόρο RNA (mRNAs) με αποτέλεσμα μεταγραφική καταστολή και την επακόλουθη mRNA αποικοδόμηση [1 ], [6], [7]. Μέχρι στιγμής, υπάρχουν λίγα παραδείγματα miRNAs αύξηση της μεταγραφής ή μετάφρασης των γονιδίων στόχων [54], [55], με αποτέλεσμα θετικές συσχετίσεις μεταξύ miRNAs και mRNAs στόχου. Ως εκ τούτου, ένα γενικά πραγματοποιήθηκε προσδοκία είναι ότι οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των mRNAs θα συσχετίζεται αντιστρόφως με μεταβολές στα επίπεδα των miRNAs στοχεύουν τους [56]. Ωστόσο, το γεγονός ότι η ατομική miRNAs μπορούν να στοχεύουν πολλαπλές mRNAs και ότι οι μεμονωμένες mRNAs μπορούν να απευθύνονται από πολλούς miRNAs δημιουργεί τη δυνατότητα για ένα περίπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων σε καρκινικά κύτταρα γεμάτη με μια ποικιλία των θετικών και αρνητικών βρόχους ανάδρασης [57], [58] . Επιπλέον, το γεγονός ότι miRNAs είναι καλά γνωστές για τη στόχευση mRNAs που κωδικοποιούν μια ποικιλία κυτταρικών παραγόντων μεταγραφής και άλλων ρυθμιστικών πρωτεϊνών αυξάνει την πιθανότητα ότι οι άμεσες ρυθμιστικές επιδράσεις των miRNAs μπορεί να διαμορφώνεται με έμμεση ή «κατάντη» φαινόμενα μέσα στο πλαίσιο της τα καρκινικά κύτταρα. Αυτό δεν είναι να πούμε ότι οι μηχανισμοί αποδειχθεί ότι αποτελούν τη βάση του κανονισμού miRNA

in vitro

είναι εκτός λειτουργίας

in vivo

, αλλά μάλλον ότι οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των μηχανισμών μπορεί να καλυφθεί ή /και διαμορφώνεται από το ρυθμιστικές πολυπλοκότητες που χαρακτηρίζουν τα καρκινικά κύτταρα. Ο βαθμός στον οποίο αυτές οι περιπλοκές μπορούν να μετριάσουν την ικανότητά μας να προβλέψουμε με ακρίβεια τη μοριακή συνέπεια των αλλαγών στα επίπεδα των miRNAs στο πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων έχει σχέση με την πιθανή χρήση των miRNAs στη θεραπεία του καρκίνου.

Ο σκοπός μας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί ο βαθμός στον οποίο οι μοριακές συνέπειες των αλλαγών στα επίπεδα miRNA σε καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από ιστούς του ασθενούς μπορεί να προβλεφθεί από τα σημερινά μοντέλα της λειτουργίας miRNA. Το γεγονός ότι πριν από τις προσπάθειες για την απόκτηση προφίλ έκφρασης των miRNAs και τους στόχους του mRNA τους ήταν συνήθως πραγματοποιούνται σε δείγματα που λαμβάνονται από διαφορετικούς ασθενείς ή /και από μικτά (χύμα) ιστοί έχουν συμβάλει στην αντιφατικά ευρήματα (π.χ., [15], [16], [17], [18], [19], [20]). Σε μια προσπάθεια να μειώσει την πειραματική διακύμανση, προσδιορίσαμε αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs και στοχευμένη mRNAs τους σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που απομονώθηκαν από τους ίδιους ασθενείς με LCM. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μόνο ~ 11% των αλλαγών στα επίπεδα των mRNAs είναι IC με τις αλλαγές στα επίπεδα της ρύθμισης miRNAs τους στην ίδια καρκίνο των ωοθηκών (CEPI) κύτταρα. Για να εξαλειφθεί η πιθανότητα ότι τα αποτελέσματά μας είναι απλώς ένα κατασκεύασμα της λανθασμένα εντοπίστηκαν στόχους mRNA του κανονισμού miRNA, επαναλάβαμε τις αναλύσεις μας χρησιμοποιώντας στόχους προβλεφθεί από μια ποικιλία από αλγόριθμους πρόβλεψης, καθώς και οι στόχοι πειραματικά επικυρωθεί σε μια σειρά από πειράματα επιμόλυνσης διεξάγεται σε ένα καλά τεκμηριωμένη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (HEY). Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν με συνέπεια το συμπέρασμα ότι η αναμενόμενη IC μεταξύ των αλλαγών στα επίπεδα των miRNAs και τα επίπεδα των mRNAs στόχο τους συμβαίνει σχετικά σπάνια στη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που απομονώθηκαν από δείγματα ασθενών και ότι αυτό το χαμηλό αντίστροφη συσχέτιση δεν είναι απλώς ένα κατασκεύασμα της ανακριβείς προβλέψεις στόχο miRNA. Αντίθετα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η χαμηλή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στα επίπεδα των miRNAs και τα επίπεδα των mRNAs στόχος τους είναι η πιθανή συνέπεια της έμμεσης κυτταρικές διεργασίες που διαμορφώνουν ή να συγκαλύψουν τις ρυθμιστικές επιπτώσεις των miRNAs

in vivo

. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν την πολυπλοκότητα των miRNA με τη μεσολάβηση κανονισμού

in vivo

και την ανάγκη για καλύτερη κατανόηση της βάσης των περιπλοκών αυτών στα καρκινικά κύτταρα προτού να μπορέσει να αξιοποιηθεί πλήρως το θεραπευτικό δυναμικό των miRNAs.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

δείγματα ωοθηκών όγκου συλλέχθηκαν σε Northside Νοσοκομείο (Atlanta, GA) κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο μέσα σε 1 λεπτό από την απομάκρυνση από τους ασθενείς. Όλα τα δείγματα των ωοθηκών των όγκων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν από ασθενείς με διάγνωση ορώδες θηλώδους επιθηλιακό καρκίνωμα ωοθηκών. Βουρτσίσματα των φυσιολογικών κυττάρων των ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακά (ΟΣΕ) διατηρήθηκαν αμέσως σε RNAlater (Ambion, Austin, TX). Ελήφθησαν συναίνεση του ασθενούς και την έγκριση από τις Institutional Review Boards του Georgia Institute of Technology και Northside Νοσοκομείο. Η γραπτή συγκατάθεση και το πρωτόκολλο μας (# H09227) εγκρίθηκαν από το IRB. Λεπτομερείς κλινικές πληροφορίες για κάθε ασθενή χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρέχονται στον Πίνακα 1.

σύλληψης λέιζερ μικρο-ανατομή (LCM)

Φρέσκα κατεψυγμένοι ιστοί από όγκους κόπηκαν σε τομές επτά μικρόν, εφαρμόστηκε για να μη χρεώνονται διαφάνειες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη για 30 δευτερόλεπτα, βάφονται και αφυδατωμένα χρησιμοποιώντας το HistoGene LCM Κατεψυγμένα τμήμα χρώσης Kit (Αρκτούρος, Mountain View, CA). LCM έγινε με το σύστημα καταγραφής μικροανατομίας AutoPix αυτοματοποιημένο λέιζερ χρησιμοποιώντας τις Macro Caps CapSure (Arcturus). Περίπου 10.000 κύτταρα συνελήφθησαν σε κάθε μία από 5-6 καπάκια ανά δείγμα. miRNA εξήχθη από κατέλαβε κύτταρα χρησιμοποιώντας την mirVana miRNA Kit Απομόνωση (Ambion). mRNA απομονώθηκε από κύτταρα από τους ίδιους ασθενείς χρησιμοποιώντας το PicoPure RNA κιτ απομόνωσης (Arcturus).

εκχύλιση RNA από κύτταρα επιθηλιακά επιφάνεια των ωοθηκών

Για miRNA qPCR και μικροσυστοιχιών, φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια ήταν φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης από την mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (για μικρές εμπλουτισμού RNA), ακολουθώντας το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Ambion). cDNA για qPCR συντέθηκε από RNA (10 ng) χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Για mRNA qPCR και μικροσυστοιχιών συνολική εκχύλιση RNA από τον ΟΣΕ διεξήχθη με τη χρήση του PicoPure RNA Κιτ απομόνωσης, ακολουθώντας το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Arcturus). Λόγω περιορισμένου αριθμού των κυττάρων που συλλέγονται από βουρτσίσματα επιφάνεια επιθηλιακά, ΟΣΕ RNA εκχυλίστηκε από 5 ασθενείς με μη κακοήθεις ωοθήκες για μικροσυστοιχιών mRNA και από τα δύο

διαφορετικά

σύνολα των τριών ασθενών με μη-κακοήθεις ωοθήκες για miRNA (μία οριστεί για miRNA μικροσυστοιχιών, ένα άλλο για qPCR) (Βλέπε πίνακα 1 για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με την ενημέρωση των ασθενών).

Ποσοτική (σε πραγματικό χρόνο) PCR

Το συνολικό RNA (10 ng) που προέρχονται από το LCM κατέλαβε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα ΟΣΕ μετατράπηκε σε ενισχυμένο cDNA για qPCR. TaqMan miRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) διεξήχθησαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για HSA-miR-141, HSA-miR-429, HSA-miR-205, HSA-miR-320, HSA-miR-383 και για RNU6B ενδογενή έλεγχο χρησιμοποιώντας το StepOnePlus real-Time PCR μηχάνημα (Applied Biosystems). Οι ιδιαιτερότητες αστάρι για αυτά τα miRNAs έχουν προηγουμένως αποδειχθεί [58] – [63] και RNU6B είναι μια προηγουμένως συσταθεί ελέγχου για ωοθηκικό ιστό του ανθρώπου (https://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html? https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο σχετική έκφραση Software (υπόλοιπο? [59])

Για mRNA qPCR, ολικό RNA (1-5 μα) που εξάγεται από τα κύτταρα μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας την σύνθεση Superscript III First Strand. σύστημα (Invitrogen). cDNA στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAGEN PCR (QIAGEN) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. πειράματα qPCR διεξήχθησαν για τον EGFR, BMI1 και GAPDH γονιδίων χρησιμοποιώντας iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). τα ειδικά αρχικά τεμάχια σειράς που χρησιμοποιείται για SYBR πράσινο δοκιμασίες έχουν ως εξής: EGFR-προς τα εμπρός: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-αντίστροφη: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH προς τα εμπρός: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-αντίστροφη: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, BMI1-προς τα εμπρός: ACTTCATTGATGCCACAACC, BMI1-αντίστροφη:. CAGAAGGATGAGCTGCATAA Η εκκινητές EGFR ήταν όπως σχεδιάστηκε από [60] και εκκινητές GAPDH ήταν όπως σχεδιάστηκε από [61]. BMI1 εκκινητές ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων qPCR εκκινητή RTPrimerDB [62]. Οι αποτελεσματικότητες εκκινητή GAPDH υπολογίστηκαν να είναι ~ 1. η εξειδίκευση του άλλου εκκινητές μπορούν να ληφθούν από την σχετική δημοσιεύσεις /βάσης δεδομένων. Όλες οι αντιδράσεις qPCR (για mRNA και miRNA) έχουν βελτιστοποιηθεί με ελέγχους μη-πρότυπο και -RT (μείον ανάστροφης μεταγραφάσης) ελέγχει πριν από το πείραμα. GAPDH επελέγη ως ενδογενής έλεγχος όπως εμφανίζεται ελάχιστη μεταβολή μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με miR-NC και miR-7/128 μικροσυστοιχίας.

Όλες οι αντιδράσεις qPCR διεξήχθησαν με τουλάχιστον 2 βιολογικών επαναλήψεις και για κάθε βιολογικό επαναληπτικές τουλάχιστον 3 τεχνικής επαναλήψεις.

καλλιέργειας κυττάρων και κυττάρων οι επιμολύνσεις

HEY κύτταρα που παρέχονται από τον Gordon Β Mills, Τμήμα Βιολογίας Συστημάτων, του Πανεπιστημίου του Τέξας, MD Anderson Cancer Κέντρο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% ν /ν ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θερμότητα (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM L-γλουταμίνη (Mediatech), 10 mM ρυθμιστικού HEPES (Mediatech ), πενικιλλίνη (100 U /ml), και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL). Περίπου 12 ώρες πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα αυτά (εις διπλούν ή εις τριπλούν ανά επιμόλυνση, 1.5 × 10

5 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν επί έξι φρεατίων σε μέσο αύξησης και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Την επόμενη ημέρα μετά από πλύση των φρεατίων με PBS και αντικατάσταση του μέσου ανάπτυξης με Opti-ΜΕΜ (Invitrogen), κύτταρα διαμολύνθηκαν με το miRNA [HSA-miR-7 miRIDIAN μιμούνται, miRIDIAN miRNA μιμούνται αρνητικό έλεγχο # 1 (MIR-NC, ένα

Γ. elegans

miRNA, cel-miR-67, με επιβεβαιωμένη ταυτότητα ελάχιστη ακολουθία στον άνθρωπο), ή HSA-miR-128 miRIDIAN μιμούνται (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 παράγοντα επιμόλυνσης ( Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε μια τελική συγκέντρωση 25 ηΜ. Τα κύτταρα επωάστηκαν για τέσσερις ώρες σε αυτή τη μειωμένη ορού περιβάλλον για τη βελτιστοποίηση επιμόλυνση, πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 για 44 ώρες (σύνολο 48 ώρες) μετά την προσθήκη φρέσκου μέσου ανάπτυξης στα φρεάτια . αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εκτιμήθηκε από τη σχετική knock-down προηγουμένως επικυρωθεί στόχων (EGFR για miR-7 και ΔΜΣ-1 για το miR-128 [42], [43]), με βάση τις συστάσεις του κατασκευαστή του αντιδραστηρίου siRNA /miRNA (Thermo Fisher Επιστημονικός). Πειράματα καλλιέργειας κυττάρων διεξήχθησαν με τη χρήση τουλάχιστον δύο με τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις.

Microarray

μικροσυστοιχιών mRNA ιστού.

βιοτίνη σημασμένο cRNA συντέθηκε, υβριδοποιήθηκε με Affymetrix HG- U133 Plus 2.0 συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων και αναλύονται με ένα σαρωτή GeneChip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

HEY απομόνωση κυττάρων RNA και mRNA μικροσυστοιχιών.

το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini RNA κιτ απομόνωσης (QIAGEN, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα του RNA επαληθεύεται χρησιμοποιώντας ένα Agilent 2100 Bioanalyzer (1.8-2.0? Agilent Technologies, Palo Alto, CA). mRNAs μετατράπηκαν σε δίκλωνο (ds) -cDNA και ενισχύονται χρησιμοποιώντας Χειροκρότημα 3′-Amp System (NuGen, San Carlos, CA). Αυτό το cDNA στη συνέχεια βιοτίνη και κατακερματισμένη με τη χρήση Encode Βιοτίνη Module (NuGen). Το επισημασμένο cDNA υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix HG-U133 Plus συστοιχίες 2.0 ολιγονουκλεοτιδίων και αναλύονται με GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών

Ιστός miRNA ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών.

δείγματα για miRNA μας προφίλ μελέτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Asuragen Υπηρεσίες (Austin, TX), σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας της εταιρείας. Ένα έθιμο που κατασκευάζονται Affymetrix GeneChip® από Ambion σχεδιάστηκε για να miRNA ανιχνευτές που προέρχονται από το Sanger miRBase και δημοσιευμένες εκθέσεις [24], [25], [26], [63], [64], [65]. Το σήμα υποβάθρου εκτιμήθηκε από αντιγονιδιωματικό αλληλουχίες ανιχνευτή που παρέχεται από Affymetrix και προέρχονται από ένα μεγαλύτερο σύνολο ελέγχων που χρησιμοποιούνται στη συστοιχία ανθρώπινο εξόνιο Affymetrix. Spike-in εξωτερικούς ελέγχους αναφοράς που βασίζονται σε μη-miRNA ανιχνευτές ελέγχου που στερούνται ομολογία με το ανθρώπινο γονιδίωμα. Συστοιχίες μέσα σε ένα συγκεκριμένο πείραμα ανάλυση κανονικοποιήθηκαν σύμφωνα με την μέθοδο σταθεροποίησης διακύμανση που περιγράφεται στο [66]. Ένα τεστ rank-sum Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί κλήσεις ανίχνευση του σήματος αισθητήρα miRNA σε σχέση με τη διανομή των σημάτων από GC-περιεχόμενο ταιριάζουν αντι-γονιδιωματική ανιχνευτές.

Ένα t-test δύο δειγμάτων, με παραδοχή της ίσης διακύμανσης, εφαρμόστηκε για στατιστικός έλεγχος υποθέσεων. Η δοκιμή αυτή ορίζεται οποίες ανιχνευτές θεωρούνται σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων βασίζεται σε μια π-τιμή των 0,01 και συνδεθείτε

2 διαφορά ≥1. Οι εντάσεις του σήματος από αυτά τα διαφορικά εκφρασμένων ανιχνευτές z-score ομαλοποιηθεί πριν από την ιεραρχική ομαδοποίηση.

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Spotfire Decisionsite για Microarray Analysis (DSMA) με βάση την Z-score μετατραπεί τιμές σήματος της όλα τα probesets εκτός από εκείνα με τυπική απόκλιση & lt? 0.5.