Αφηρημένο

Σε αντικαρκινική θεραπεία διαμεσολαβείται από ένα σύστημα χορήγησης φαρμάκων νανοσωματιδίων με βάση (DDS), η συνολική αποτελεσματικότητα εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα απελευθέρωσης φορτίων από τα νανοσωματίδια στα καρκινικά κύτταρα, καθώς και την εξειδίκευση της παράδοσης στον ιστό του όγκου. Ωστόσο, τα συμβατικά DDS λιποσώματα με βάση δεν έχουν κανένα μηχανισμό για την αποδέσμευση των ειδικώς έγκλειστα φορτία μέσα στα καρκινικά κύτταρα. Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, αναπτύξαμε τα νανοσωματίδια που περιέχουν ένα πεπτίδιο αποσταθεροποίηση νέα λιποσωματική μεμβράνη (LMDP) που μπορούν να αποσταθεροποιήσουν μεμβράνες με διάσπαση με ενδομεμβρανικό πρωτεάσες on /σε καρκινικά κύτταρα. Calcein ενθυλακωμένο σε λιποσώματα τροποποιημένο με LMDP (LMDP-λιπο) ήταν αποτελεσματικά απελευθερώθηκε παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης που περιέχει ένα LMDP διασπωμένη πρωτεάσης. Η απελευθέρωση ανεστάλη με αναστολέα πρωτεάσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι LMDP-Lipo θα μπορούσε να απελευθερώσει αποτελεσματικά το φορτίο του σε κύτταρα σε απόκριση σε έναν καρκίνο-ειδικής πρωτεάσης. Επιπλέον, όταν LMDP-Lipo περιείχε συντηξογονικές λιπίδια, η απελευθέρωση του φορτίου επιταχύνθηκε, υποδηλώνοντας ότι η σύντηξη του LMDP-λιπο με κυτταρικές μεμβράνες ήταν το αρχικό στάδιο στην ενδοκυτταρική διανομή. μικροσκοπικές παρατηρήσεις time-lapse έδειξε ότι η απελευθέρωση του φορτίου από LMDP-Lipo συνέβη αμέσως μετά την ένωση των LMDP-λιπο με τα κύτταρα-στόχους. Κατά συνέπεια, LMDP-lipo θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο νανοσωματίδιο ικανό αποτελεσματική απελευθέρωση των φορτίων ειδικά σε στοχευμένες καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Itakura S, Χάμα S, Ohgita Τ, Kogure K (2014) Ανάπτυξη Νανοσωματίδια Ενσωματώνοντας ένα μυθιστόρημα λιποσωμικής μεμβράνης αποσταθεροποίηση πεπτιδίων για την αποτελεσματική απελευθέρωση φορτίων σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (10): e111181. doi: 10.1371 /journal.pone.0111181

Επιμέλεια: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Πορτογαλία

Ελήφθη: 23 Ιούλη, 2014? Αποδεκτές: 26 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Itakura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τους αριθμούς JSPs KAKENHI Grant 25860030, 26 έως 9314, και από το Ταμείο του Πανεπιστημίου του Κιότο Φαρμακευτικές για την Προώθηση της Επιστημονικής Έρευνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στη θεραπεία του καρκίνου, ένα σύστημα παροχής φαρμάκου (DDS), η οποία μπορεί να αποδώσει συγκεκριμένα διαφόρων θεραπευτικών παραγόντων στον ιστό του όγκου είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την επίτευξη κυττάρου-ειδική θεραπεία του καρκίνου χωρίς δυσμενή αποτελέσματα. Η ταχεία πρόοδος σε γονιδιωματική και πρωτεομική έρευνα έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση μορίων που μεσολαβούν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Έτσι, έχει καταστεί δυνατόν να σχεδιαστούν πιο συγκεκριμένα θεραπευτικά ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Σε γενικές γραμμές, πολύ ειδικά φάρμακα όπως πεπτίδια, αντισώματα, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα είναι το μοριακό βάρος (HMW) παράγοντες υψηλό. Ωστόσο, η κλινική εφαρμογή των πολλών παραγόντων HMW είναι περιορισμένη λόγω της ταχείας αποικοδόμησης τους από ένζυμα στο αίμα, καθώς και ανεπαρκής παράδοσή τους σε κύτταρα σε στόχευση θέσεις τους [1]. Για την επίλυση αυτών των προβλημάτων, HMW παράγοντες πρέπει να είναι έγκλειστα σε νανοσωματίδια, όπως λιποσώματα ή πολυμερή μικκύλια ικανή να προστατεύσει τα φορτία από ενζυματική διάσπαση και την επίτευξη αποτελεσματικών ενδοκυτταρική παράδοση. Στην τρέχουσα DDS νανοσωματιδίων με βάση, τροποποίηση με πολυαιθυλενογλυκόλη (ΡΕΟυλίωση) είναι ένα απαραίτητο στρατηγική για την παράδοσή τους στον ιστό του όγκου μέσω ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR) επιδράσεις ως ΡΕΟυλιωμένο φορείς μπορούν να κυκλοφορούν για μεγάλες χρονικές περιόδους [2], [3]. Ωστόσο, μόνο ~ 10% των μορίων με ένεση φθάσει στον ιστό του όγκου [4]. Ως εκ τούτου, υπάρχει χώρος για βελτίωση της παροχής. Επιπλέον, η παράδοση του όγκου μέσω EPR επιδράσεις εξαρτάται από τον αριθμό των ανώριμων καρκινικών αγγείων. Κατά συνέπεια, η απόδοση παροχής σε καρκίνους με χαμηλή αγγειακή πυκνότητα, όπως ο καρκίνος του παγκρέατος, είναι λιγότερο αποτελεσματική [5].

Αν και η ανάπτυξη αντικαρκινικών DDS έχει ραγδαία πρόοδο, δεν υπάρχει εναλλακτική στρατηγική ικανή να ενισχύει την παράδοση των νανοσωματιδίων από EPR αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να μεγιστοποιηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των ενθυλακωμένων αντικαρκινικών παραγόντων για την αντιστάθμιση χαμηλή αποτελεσματικότητα παράδοση σε ιστό όγκου. Όταν αντικαρκινικών παραγόντων έγκλειστα σε νανοσωματίδια, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα εξαρτάται από την ποσότητα του ελεύθερου παραγόντων που απελευθερώνονται από τα νανοσωματίδια. Ως εκ τούτου, η αποδοτικότητα απελευθέρωση των φορτίων από τα νανοσωματίδια είναι ένα βασικό βήμα για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Για την επίτευξη των καρκινικών κυττάρων-ειδική τοξικότητα χωρίς ανεπιθύμητες παρενέργειες, οι φορτία έγκλειστα σε νανοσωματίδια πρέπει να απελευθερωθεί μόνο όταν τα νανοσωματίδια παραδίδονται σε καρκινικό ιστό, όχι κατά τη διάρκεια της κυκλοφορίας τους. Στο παρελθόν, για την επίτευξη του όγκου-ειδική απελευθέρωση φορτίων, διάφορα νανοσωματίδια έχουν σχεδιαστεί για να κάνουν χρήση του περιβάλλοντος του όγκου. Για παράδειγμα, τα νανοσωματίδια που μπορεί να απελευθερώσει σε όξινα περιβάλλοντα εξωκυτταρικού όγκου-ειδικά έχουν αναπτυχθεί [6] – [8]. Ωστόσο, όταν ένα νανοσωματίδιο ανταποκρίνεται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, το φορτίο απελευθερώνεται έξω από τα κύτταρα. Αυτός ο σχεδιασμός δημιουργεί ένα νέο τεχνικό πρόβλημα επειδή πολλοί παράγοντες HMW όπως νουκλεϊκά οξέα και πρωτεΐνες πρέπει να παραδοθεί και απελευθερώνεται στο εσωτερικό των κυττάρων του όγκου. Επιπλέον, ειδικές απελευθέρωση ενός χαμηλού μοριακού βάρους (LMW) αντικαρκινικός παράγοντας στο εσωτερικό των κυττάρων του όγκου έδειξε πιο αποτελεσματική αντικαρκινική δραστικότητα από εξωκυτταρικό απελευθέρωση [9].

Σε αυτό το πλαίσιο, ένα φορέα DDS ικανά να απελευθερώνουν ένα φορτίο σε καρκινικά κύτταρα έχει αναπτυχθεί. Για παράδειγμα, ένας φορέας νουκλεϊκού οξέος εξαρτάται από την πρωτεϊνική κινάση Οα (ΡΚΟα), το οποίο υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα [10], [11]. Αυτός ο φορέας είναι ένα συγκρότημα από νουκλεϊκά οξέα και κατιονικά πολυμερή που ενσωματώνουν μια αλληλουχία υπόστρωμα που μπορεί να στοχεύονται από ΡΚΟα. ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση τους μειώνεται από την φωσφορυλίωση της ακολουθίας υποστρώματος επί του πολυμερούς με ΡΚΟα, μετά την οποία απελευθερώνεται το νουκλεϊκό οξύ. Μια διαφορετική προσέγγιση εκμεταλλεύεται την αυξημένη συγκέντρωση ΑΤΡ στα καρκινικά κύτταρα. Δηλαδή, ένα παράγοντα ενθυλακωμένο σε σαπερονίνης απελευθερώνεται μετά από ΑΤΡ μεσολάβηση σκανδάλη [12]. Ωστόσο, σε αυτά τα συστήματα απελευθέρωσης, η παράδοση των παραγόντων είναι περιορισμένος και

in vivo

εφαρμογή είναι δύσκολη. Έτσι, απαιτούνται περαιτέρω βελτιώσεις στην φαρμακοκινητική και ενδοκυτταρική δυναμική που απαιτείται. Από αυτή την άποψη, τα λιποσώματα μπορούν να εγκλείουν HMW φάρμακα και παράγοντες LMW. Υδρόφοβες παράγοντες μπορούν να μεταφέρονται στο λιπιδική μεμβράνη και υδρόφιλες παράγοντες μπορούν να διατηρούνται στην υδατική φάση [13]. Έτσι, η ευελιξία των λιποσωμάτων καθιστά ενδιαφέρουσα για το σχεδιασμό νέων DDSs.

Όσον αφορά την απελευθέρωση φορτίων από τα λιποσώματα, πολλά συστήματα έχουν αναπτυχθεί για να επάγει την σύντηξη των μεμβρανών λιποσφαιρίων με ενδοσωμική-λυσοσωμική μεμβράνες στο όξινο περιβάλλον του ενδοσώματος-λυσόσωμα [14]. Ωστόσο, όταν η απόδοση της διαφυγής από το ενδόσωμα είναι χαμηλή, τα φάρμακα μπορούν να υφίστανται αποικοδόμηση λυσοσωματική και ενδοκυτταρική ανακύκλωση [15]. Ως εκ τούτου, οι βελτιώσεις στην απελευθέρωση του φαρμάκου μέσω σύντηξη μεμβράνης απαιτείται. Προς το σκοπό αυτό, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα που αποσταθεροποιεί την λιποσωμική μεμβράνη κατά την διάρκεια της σύντηξης με τις καρκινικές κυτταρικές μεμβράνες. Εμείς επικεντρώθηκε στην μεμβράνη εγγενή πρωτεΐνη γ-σεκρετάσης των καρκινικών κυττάρων. Αυτό ενδομεμβρανικό πρωτεάση μπορεί να διασπάσει το διαμεμβρανικό τομέα της πρωτεΐνης υποστρώματος Notch [16], [17]. Για να χρησιμοποιήσετε το μηχανισμό αυτό, ενσωματώσαμε πεπτίδια που μιμούνται την διαμεμβρανική περιοχή του Notch στην λιπιδική μεμβράνη των λιποσωμάτων. Έτσι, όταν η μεμβράνη λιποσώματος ασφάλειες μερικώς με την κυτταρική μεμβράνη, έγκλειστα φορτία θα απελευθερώνεται μέσα στα κύτταρα με την αποσταθεροποίηση των λιποσωμικών μεμβρανών με ενδομεμβρανικό γ-σεκρετάσης. Χρησιμοποιώντας αυτή την έννοια, ενσωματώσαμε ένα πεπτίδιο αποσταθεροποίηση λιποσωμικής μεμβράνης (LMDP) σε λιποσώματα (LMDP-λιπο) που μιμούνταν την διαμεμβρανική περιοχή του Notch. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η απελευθέρωση των φορτίων από LMDP-Lipo είχε ανταποκρίνεται σε γ-σεκρετάσης σε καρκινικές κυτταρικές μεμβράνες.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

φωσφατιδυλοχολίνη αυγού ελήφθη από NOF Corporation (Τόκιο, Ιαπωνία). 1,2-διελαϋλ-3-τριμεθυλαμμώνιο προπάνιο (ϋΟΤΑΡ) και 1,2-διολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαμίνη (ϋΟΡΕ) αγοράστηκαν από την Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). ΟβΙΙ Tracker CM-με Dil ελήφθη από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Χοληστερυλεστέρος ημιηλεκτρικό (CHEMS) και καλσεϊνη αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Bio-Beads SM-2 προσροφητικών αγοράστηκαν από ΒΙΟ-RAD (Hercules, CA, USA). HUEhT-2 κύτταρα, μία (HUVEC) γραμμή αθανατοποιημένα ανθρώπινα ομφάλιας φλέβας ενδοθηλιακού κυττάρου ιδρύθηκε με ηλεκτροδιάτρηση του pIRES-hTERT-hyg ‘, κύτταρα HeLa, ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος επιθηλιοειδή κυτταρική γραμμή, και τα κύτταρα MCF-7, μία ανθρώπινη μαστική κυτταρική γραμμή όγκου, ελήφθησαν από την JCRB Τράπεζας κυττάρων (Osaka, Japan). Κύτταρα Α549, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος πνεύμονα, δόθηκαν από την Riken Τράπεζας Κυττάρων (Saitama, Japan). Το πεπτίδιο αποσταθεροποίηση λιποσωμική μεμβράνη (LMDP), LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRR, συνετέθη με ράγκμπι (Tokyo, Japan). Ένα πεπτίδιο υπόστρωμα φθορισμού-απόσβεσης, Nma-GGVVIATVK (DNP) RRR-ΝΗ

2 και ένας αναστολέας της γ-σεκρετάσης, Ν- [Ν- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-αλανυλ] -S-φαινυλγλυκίνης βουτυλεστέρας (DAPT), ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Peptide, Inc. (Osaka, Japan). 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλ) διμεθυλαμμώνιο] -2-hydroxypropanesulfonate (CHAPSO) αγοράστηκε από Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)

απομόνωση μεμβρανών από κύτταρα

Το κλάσμα μεμβράνης παρασκευάστηκε σύμφωνα. σε προηγούμενες εκθέσεις [18]. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε πάγο. Καλλιεργημένα κύτταρα HeLa, κύτταρα Α549, κύτταρα MCF-7 και κύτταρα HUEhT-2 (περίπου 1 × 10

8 κύτταρα) σφαιροποιήθηκαν. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mM Hepes, ρΗ 7.5, 50 mM KCl, 2 mM EGTA, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, Complete Mini (Roche Applied Science), και ομογενοποιείται χρησιμοποιώντας 15 κινήσεις ενός ομογενοποιητή Dounce με ένα στενό γουδοχέρι. Τα κυτταρικά ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στις 800 χ

g

για 10 λεπτά και επανα-ομογενοποιείται όπως παραπάνω. Τα υπερκείμενα φυγοκεντρούνται στις 100,000 χ

g

για 1 ώρα και επαναιωρήθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και recollected με φυγοκέντρηση στα 100.000 χ

g

για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα Optima XL-90 (Beckman Coulter) . Οι μεμβράνες επαναιωρήθηκαν σε 20 mM HEPES, ρΗ 7.0, 150 mM ΚΟΙ, 2 mM EGTA, 1% (w /v) CHAPSO, και πλήρης μίνι και διαλυτοποιήθηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα με από άκρου σε άκρο περιστροφή. Οι διαλυτοποιημένες μεμβράνες φυγοκεντρήθηκαν στα 100.000 χ

g

για 1 ώρα, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific).

γ-σεκρετάσης μέτρηση δραστικότητας

Για να μετρηθεί γ-σεκρετάσης, παρασκευάσματα διαλυτοποιημένη μεμβράνη (15 μg ολικής πρωτεΐνης) επωάστηκαν με οκτώ μΜ φθορισμού-βαφής υπόστρωμα πεπτιδίου στους 37 ° C όλη τη νύκτα και φυγοκεντρήθηκε στα 16.100 χ

g

για 15 λεπτά. Ο φθορισμός των υπερκειμένων μετρήθηκε με Plate Άπειρο M200 (TECAN) με μήκος κύματος διέγερσης 355 nm και μήκος κύματος εκπομπής 440 nm.

Προετοιμασία LMDP-λιπο

Λεπτές ταινίες λιπιδίων αποτελούμενο από EPC , EPC /DOPE /ϋΟΤΑΡ (4/4/1), EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS (4,5 /4,5 /2) σε ένα γυάλινο σωλήνα ενυδατώθηκαν σε PBS (-) ή 30 mM διάλυμα calcein σε PBS (-) για 10 λεπτά , που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους για 5 λεπτά σε ένα λουτρό υπερήχων τύπου (NEY). Τα λιποσώματα αναμίχθηκαν με 1% Triton Χ-100 και επωάστηκαν άκρο σε άκρο για 1 ώρα. Ένα mM LMDP διαλυμένο σε 1% Triton Χ-100 προστέθηκε στο διάλυμα λιποσωμάτων (3-5 mol%) και επωάζεται επί τέλος τέλος για 1 ώρα. Στη συνέχεια, SM-2 Βίο-σφαιρίδια προστέθηκαν στο διάλυμα λιπιδίων LMDP-απορρυπαντικό για 1 ώρα σε αναλογία σφαιριδίων προς απορρυπαντικό του 30 (β /β) με σκοπό την απομάκρυνση του απορρυπαντικού. Το προκύπτον διάλυμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 16,000 χ

g

για 10 λεπτά και το υπερκείμενο διάλυμα λιποσωμάτων συλλέχθηκε. Για λιποσώματα που περιέχουν καλσεϊνη, ελεύθερη καλσεϊνη απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας μια στήλη Sephadex G-50 εξισορροπημένη με PBS (-). Η συγκέντρωση των λιπιδίων των λιποσωμάτων προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο της οξειδάσης της χολίνης-DAOS (φωσφολιπίδια C-test kit Wako). το μέγεθος των σωματιδίων και το δυναμικό της επιφάνειας των έτοιμοι λιποσωμάτων μετρήθηκαν με ένα Zetasizer nano (Malvern Ins. Ltd.).

δραστηριότητα διάσπασης LMDP από γ-σεκρετάσης

Για τη μελέτη διάσπαση LMDP από γ-σεκρετάσης, η ανταγωνιστική ανασταλτική δράση του LMDP ή LMDP-λιπο για τη διάσπαση του πεπτιδικού υποστρώματος (το ίδιο με εκείνο που χρησιμοποιείται στην 2.2) εκτιμήθηκε. Τα παρασκευάσματα διαλυτοποιημένης μεμβράνης Α549 (16,5 μg ολικής πρωτεΐνης) επωάστηκαν με πεπτίδιο υποστρώματος 5 μΜ και 0, 5, 10, 50 ή 100 μΜ LMDP ή LMDP-λιπο ως η συγκέντρωση LMDP παρέμεναν σταθερές στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, η ένταση του φθορισμού μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο 2.2.

Η διάσπαση του LMDP αξιολογήθηκε επίσης με δοκιμασία HPLC. Τα παρασκευάσματα διαλυτοποιημένης μεμβράνης Α549 (16,5 μg ολικής πρωτεΐνης) επωάστηκαν με 100 μΜ LMDP ή LMDP-λιπο στους 37 ° C για 1 ώρα. LMDP σε μια συγκέντρωση 100 μΜ είχε ανασταλτικά αποτελέσματα σε μελέτες ανταγωνιστικής αναστολής και το χρόνο επώασης (1 h) συνδυάζεται με τον όρο αντίδραση στη δοκιμασία απελευθέρωσης calcein. LMDP-Lipo διαλυτοποιήθηκε με 1% Triton Χ-100, και ο LMDP παραμένει στο διάλυμα ανιχνεύθηκε με υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (HPLC) χρησιμοποιώντας σύστημα Alliance (Waters, Milford, ΜΑ, USA) που συνδέεται με μία στήλη Sunfire C18 ( 5 μm, 4.6 χ 150 mm, Waters, Milford, ΜΑ, USA). Η κινητή φάση συνίστατο από 0.1% TFA σε H

2O (κινητή φάση Α) και /ακετονιτρίλιο σε 0,1% TFA (κινητή φάση Β). Η βαθμίδωση ξεκίνησε με αρχική αναλογία 80% κινητή φάση Α και 20% κινητή φάση Β, ακολουθούμενη από μία γραμμική βαθμίδωση από 80 σε 10% κινητή φάση Α για 20 λεπτά. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 mL /min και το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 220 nm.

Καλσεϊνη δοκιμασία απελευθέρωσης

Για να μελετήσουμε την απελευθέρωση των φορτίων από τα λιποσώματα, Control-λιπο ή LMDP-lipo που περιέχουν καλσεΐνη ήταν επωάστηκαν με διαλυτοποιημένο μεμβράνες (λιπίδιο /πρωτεΐνη = 2,0 (β /β)) ή PBS ή 1% Triton Χ-100 στους 37 ° C για 1 ώρα με την παρουσία ή απουσία του αναστολέα DAPT γ-σεκρετάσης. Οι διαλυτοποιημένες μεμβράνες προεπωάστηκαν με DAPT αναστολέα γ-σεκρετάσης (10 μΜ) στους 37 ° C για 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία με λιποσώματα. Η απελευθερωμένη καλσεΐνης προσδιορίστηκε με μέτρηση της έντασης φθορισμού χρησιμοποιώντας μια πλάκα άπειρο M200 (TECAN) με μήκος κύματος διέγερσης στα 490 nm και μήκος κύματος εκπομπής στα 515 nm. Το ποσοστό απελευθέρωσης calcein υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο:

ΟβΙοβίη Τύπου (%) = [(F-F

0) /(F

100-F

0)] × 100, όπου F, F

0 και F

100 ήταν οι εντάσεις φθορισμού καλσεΐνης μετά την επώαση παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης, σε PBS και σε 1% Triton, αντίστοιχα.

Confocal σάρωσης με λέιζερ μικροσκοπικές παρατηρήσεις του LMDP-λιπο

κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε 0,002% πολυ-L-λυσίνη (PLL) επικαλυμμένο 96 φρεατίων πλάκες απεικόνισης (BD Falcon) σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο για 24 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Μετά από έκπλυση με PBS (-), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Control-λιπο ή LMDP-λιπο που περιέχει 0,2 mol% CM-ΟίΙ και 30 mM καλσεϊνης για 1 ώρα σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό. CM-με Dil και καλσεϊνη ήταν ενθουσιασμένος με Ο /Ne (543 nm) και Ar (488 nm) λέιζερ, αντίστοιχα. Μια σειρά από εικόνες που ελήφθησαν από το μικροσκόπιο συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (CLSM) (LSM 510 META, ο Carl Zeiss & ΣΙΑ ΕΠΕ, Jena, Germany) εξοπλισμένο με έναν αντικειμενικό φακό εμβάπτισης σε λάδι (Plan-Αχρωματικός 63 /NA1.4). Για την αναστολή γ-σεκρετάσης και ενδοκυτταρικής οδού, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν ως ανωτέρω και τα κύτταρα προ-επωάστηκαν σε ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ που περιέχει 50 μΜ DAPT ή 0,4 Μ σακχαρόζης σε 37 ° C ή 30 λεπτά, 2.5 mM αμιλορίδη στους 37 ° C για 10 λεπτά και 5 μg /mL FilipinIII στους 37 ° C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από κατεργασία με λιποσώματα σε 37 ° C για 1 ώρα και παρατηρήθηκε από CLSM, όπως περιγράφεται παραπάνω. Για μια λεπτομερή μελέτη της απελευθέρωσης καλσεΐνης, λιποσώματα παρατηρήθηκαν από time-lapse απεικόνιση των λιποσωμάτων σε ζωντανά κύτταρα Α549. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί PLL επικαλυμμένα γυάλινο πυθμένα δίσκους των 35 mm (IWAKI) σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο για 24 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (-) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με LMDP-λιπο που περιέχει 0,2 mol% CM-ΟίΙ και 30 mM καλκεΐνη στους 4 ° C για 10 λεπτά σε DMEM χωρίς ορό. Μετά την απομάκρυνση των λιποσωμάτων, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS (-) που ακολουθείται από προσθήκη φρέσκου DMEM χωρίς ορό. απεικόνισης πάροδο του χρόνου απέκτησε χρησιμοποιώντας μια Nikon Α1 CLSM (Nikon Instruments Inc., Melville, ΗΠΑ) εξοπλισμένο με ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό (Σχέδιο Apo VC 60X 1.4 Ν.Α.). Τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 κατά τη διάρκεια όλων των πειραμάτων απεικόνισης. φωτός λέιζερ στα 488 nm και 561 nm χρησιμοποιήθηκαν για να διεγείρουν καλσεΐνης και με Dil, αντίστοιχα. απόκτηση time-lapse έχει ρυθμιστεί να λαμβάνει εικόνες του ίδιου πεδίου κάθε 30 δευτερόλεπτα πάνω από 30 λεπτά. Το χρονικό διάστημα απεικόνισης των περίπου 3 τελείες /κύτταρο για 5 κύτταρα της κάθε δείγμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ΝΑΚ-Στοιχεία (Nikon Instruments Inc., Melville, ΗΠΑ).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-τεστ του Student και Tukey-Kramer HSD-tests. Διαφορές με Ρ-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός του συστήματος:. Απελευθέρωση φορτίων εντός κυττάρων μέσω γ-σεκρετάσης εξαρτώμενη διάσπαση του LMDP ενσωματωθεί στη λιποσωματική μεμβράνη

επινοήσει ένα σύστημα στο οποίο ένα πεπτίδιο υπόστρωμα του γ-σεκρετάσης ενσωματώθηκε λιποσωμικές μεμβράνες. Τέτοια λιποσώματα θα πρέπει να είναι ικανό να μεταφέρει ένα φορτίο και αποτελεσματικά απελευθερώνει σε καρκινικά κύτταρα. Το πεπτίδιο, όπως φαίνεται στο Σχ. 1, αποτελούνταν από υπολείμματα 29 αμινοξέων που περιελάμβανε ένα υδρόφιλο θέση μέσα στο κύτταρο και ένα υδρόφοβο αλληλουχία της διαμεμβρανικής περιοχής του Notch. Ήταν ονομάζεται «λιποσωμικής μεμβράνης Αποσταθεροποίηση Peptide» (LMDP). Η δευτερεύουσα δομή του LMDP είχε προβλεφθεί χρησιμοποιώντας λογισμικό SOSUI [19]. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1, δείχθηκε ότι το 23 κατάλοιπα της Ν-τελικό άκρο υποτίθεται μία ελικοειδή δομή και διείσδυσαν τη μεμβράνη, και 6 υπολείμματα του πλευρικού Ο-τερματικού ήταν εξαιρετικά υδρόφιλες και βρίσκονταν εκτός της λιπιδικής μεμβράνης. Ως εκ τούτου, η LMDP σχεδιάστηκε για να διαπεράσουν το διπλοστιβάδα λιπιδίων. Επιπλέον, η LMDP μπορούσε να διασπαστεί σε 3 σημεία με γ-σεκρετάσης [17]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η ειδικότητα του LMDP για γ-σεκρετάσης, πραγματοποιήσαμε μια αναζήτηση ομολογίας LMDP από το BLAST. Δεν υπήρξε καμία πρωτεΐνη που έχει υψηλή ομολογία με LMDP. Έτσι, LMDP δεν μπορεί να είναι ένα υπόστρωμα για τις πρωτεάσες υψηλής έκφρασης από καρκινικά κύτταρα όπως μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας. Ετσι, όταν ενσωματώνονται σε λιποσώματα (LMDP-λιπο), η διάσπαση του LMDP πρέπει να αποσταθεροποιήσει την λιπιδική διπλοστοιβάδα πυροδοτώντας σύντηξη μεμβράνης, που ακολουθείται από απελευθέρωση των φορτίων εντός του κυττάρου.

Αυτή η εικόνα απεικονίζει την έννοια των φορέων που ενσωματώνουν LMDP στην λιποσωμική μεμβράνη (LMDP-λιπο). Η μεμβράνη λιπιδική διπλοστοιβάδα της LMDP-λιπο αποσταθεροποιείται από διάσπαση LMDP ως έναυσμα για τη σύντηξη μεμβράνης. Η αποσταθεροποίηση προωθεί φορτία απελευθέρωση στο κύτταρο.

Η

Η διάσπαση των LMDP από γ-σεκρετάσης

Για να επιβεβαιώσετε ότι ο LMDP αποκόπηκε από γ-σεκρετάσης, επιλέξαμε Α549 (ανθρώπινου πνεύμονα καρκίνωμα), MCF-7 (ανθρώπινου καρκίνου του μαστού) και HeLa (ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας) κυτταρικές σειρές στις οποίες είχε αναφερθεί υψηλή δραστικότητα του γ-σεκρετάσης [20] – [22]. Η δραστικότητα γ-σεκρετάσης στο κλάσμα μεμβράνης των κυττάρων αυτών διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζοντες ανιχνευτές πεπτιδικού υποστρώματος που θα μπορούσε να διασπαστεί με γ-σεκρετάσης. Επιπλέον, HUEhT-2 (ένα ανθρώπινο αγγειακό ενδοθηλιακό κυτταρική γραμμή) Εξετάστηκε επίσης ως ένα κανονικό έλεγχο. Πριν από τη διάσπαση, φθορισμός των πεπτιδίων υποστρώματος διεκόπη λόγω φθορισμού μεταφοράς ενέργειας συντονισμού (FRET) μεταξύ μιας ομάδας σβέσης (DNP) και μία φθορίζουσα ομάδα (ΝΜΑ) στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου κατά μήκος της θέσης διάσπασης. Έτσι, ο φθορισμός θα εμφανιζόταν με εξάλειψη της FRET λόγω της διάσπασης των πεπτιδίων. Τέτοιες πεπτίδιο ανιχνευτές χρησιμοποιούνται συχνά για την αξιολόγηση της δραστικότητας γ-εκκριτάσης [18]. Βρήκαμε ότι οι δραστηριότητες γ-σεκρετάσης ήταν σχεδόν το ίδιο σε κύτταρα HeLa και φυσιολογικά κύτταρα HUEhT-2, αλλά ήταν σημαντικά υψηλότερες σε MCF-7 και κύτταρα Α549 (Σχ. 2α). Επιπλέον, η έκφραση του πρεσενιλίνη-1, το οποίο είναι ένα ενεργό κέντρο του γ-σεκρετάσης, εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1, η έκφραση της πρεσενιλίνης-1 παρατηρήθηκε στα ίδια επίπεδα σε όλα τα κύτταρα. Η ειδική δραστικότητα του γ-σεκρετάσης (γ-σεκρετάσης /πρεσενιλίνη-1 έκφραση) υπολογίστηκε και δραστικότητα γ-σεκρετάσης ήταν υψηλότερη σε MCF-7 και κύτταρα Α549 από ό, τι σε άλλες κυτταρικές σειρές. Δεδομένου ότι τα κύτταρα Α549 είχε μεγαλύτερες εκτάσεις μεμβράνης πλάσματος από τα κύτταρα MCF-7, αυτές που προτιμώνται για προσδιορισμούς ενδοκυτταρική απελευθέρωση.

(α) γ-σεκρετάσης σε καλλιεργημένα κύτταρα. Ο ανιχνευτής πεπτίδιο φθορισμός επωάστηκε με κλάσματα μεμβράνης από HUEhT-2, HeLa, MCF-7 και κύτταρα Α549. (Β) Η ανταγωνιστική αναστολή του LMDP. Ο ανιχνευτής πεπτίδιο και LMDP επωάστηκαν με τις αναγραφόμενες συγκεντρώσεις στο κλάσμα μεμβράνης των κυττάρων Α549 στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Αξίες και μπάρες αντιπροσωπεύουν τα μέσα και SD, αντίστοιχα. (Γ) Αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα του LMDP με ή χωρίς το κλάσμα μεμβράνης, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση HPLC από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001 έναντι HUEhT-2 (α), 0 μΜ LMDP (β), η = 3.

Η

Το κλάσμα μεμβράνης απομονώθηκε από κύτταρα Α549 και εκτιμήθηκε για δραστικότητα διάσπασης LMDP . Για να εκτιμηθεί η αλληλεπίδραση των LMDP με γ-σεκρετάσης, εξετάσαμε την ανταγωνιστική αναστολή του LMDP για την διάσπαση του φθορίζοντος ανιχνευτή πεπτιδικού υποστρώματος με ένα κλάσμα μεμβράνης που περιέχει το γ-σεκρετάσης. Η ένταση φθορισμού του ανιχνευτή υποστρώματος ήταν σημαντικά μειωμένη σε LMDP εξαρτάται από τη συγκέντρωση τρόπο (IC

50:29 μΜ) (Σχ. 2β). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η διάσπαση του φθορίζοντος υποστρώματος πεπτιδίου με γ-σεκρετάσης αποτράπηκε ανταγωνιστικά με LMDP. Μια σημαντική μείωση στην ένταση φθορισμού δεν παρατηρήθηκε όταν εξετάστηκε με τον ίδιο τρόπο χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό πολυπεπτίδιο που είχε ένα παρόμοιο μέγεθος (30 υπολείμματα) (Εικ. S2). Τα εν λόγω αποτελέσματα έδειξαν ότι η ακολουθία LMDP αναγνωρίστηκε ρητά από το γ-σεκρετάσης.

Η διάσπαση των LMDP από γ-σεκρετάσης ήταν εξετάστηκαν με HPLC επόμενο. Η περιοχή κορυφής του LMDP μειώθηκε περίπου 22,6 ± 10,5% παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης που έχει γ-σεκρετάσης (Πίνακας 1), επιβεβαιώνοντας έτσι την διάσπαση του LMDP. Σύκο. 2c δεικνύει ένα αντιπροσωπευτικό χρωματογράφημα LMDP αγωγή με ή χωρίς το κλάσμα μεμβράνης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα συνθετικά LMDP αποκόπηκε από ένα κλάσμα κυτταρικής μεμβράνης Α549 διαθέτουν υψηλή δραστικότητα γ-σεκρετάσης.

Η

Κατασκευή LMDP-λιπο

LMDP ενσωματώθηκε σε μεμβράνες λιποσωμάτων με ένα απορρυπαντικό μέθοδος αφαίρεσης. LMDP διαλυτοποιήθηκε με ένα επιφανειοδραστικό (1% Triton Χ-100) και αναμίχθηκε με φωσφολιπίδιο. Στη συνέχεια, το επιφανειοδραστικό στο μίγμα λιπιδίου /LMDP απομακρύνθηκε για την παρασκευή λιποσωμάτων που ενσωματώνουν LMDP με μια μέθοδο προσρόφησης σφαιριδίων όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Έχουμε προσδιορίσει ότι 2,3 ± 0,2% LMDP ενσωματώθηκε στα λιποσώματα με ανάλυση HPLC. Calcein χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο φορτίου και ενσωματώθηκε μέσα στα λιποσώματα. Αξιολογήσαμε τη διαρροή καλσεΐνης παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης κυττάρου Α549. Όταν ενσωματώνουν LMDP σε λιποσώματα που αποτελούνται από EPC, δεν υπήρχε διαφορά στο ποσοστό διαρροής καλσεΐνης σε σύγκριση με λιποσώματα χωρίς LMDP (Εικ. 3). Σε αυτό το σύστημα, η διαμεμβρανική του υποστρώματος πεπτιδίου στο λιποσωμικές μεμβράνες πρέπει να διασπάται από γ-σεκρετάση στην κυτταρική μεμβράνη. Επειδή ήταν αναγκαίο για τη βελτιστοποίηση της σύνθεσης των λιπιδίων των λιποσωμάτων, προσπαθήσαμε να δώσουμε τη δυνατότητα λιποσώματα σύντηξης μεμβράνης.

Control-Lipo αποτελούνταν από EPC ή EPC /DOPE /ϋΟΤΑΡ (ϋΟΤΑΡ), ή EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS (CHEMS). LMDP-Lipo περιείχε 5 mol% LMDP. Αυτά επωάστηκαν με το κλάσμα μεμβράνης από κύτταρα Α549 στους 37 ° C για 1 ώρα. Άσπρο και μαύρο στήλες δείχνουν Ελέγχου-Lipo και LMDP-Lipo, αντίστοιχα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Μπάρες αντιπροσωπεύουν SD. *, P & lt?. 0.05

Η

Έτσι, ϋΟΡΕ συμπεριλήφθηκε στη σύνθεση των λιπιδίων. Επιπλέον, δεδομένου ότι LMDP είχε ένα υδρόφοβο διαμεμβρανική περιοχή και μία υδρόφιλη περιοχή με βασικά αμινοξέα (αργινίνη και λυσίνη) (Σχ. 1), μπορούμε εικάζεται ότι η ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ του επιφανειακού φορτίου των λιποσωμάτων και του τέλους του υδρόφιλου θέση θα επηρέαζε τόσο η ενσωμάτωση της LMDP σε λιποσώματα και τη λειτουργικότητά τους. Έτσι, έχουμε ετοιμάσει λιποσώματα σύντηξης μεμβράνης με θετικά ή αρνητικά φορτία που περιέχουν ϋΟΤΑΡ ή CHEMS στο EPC /DOPE και ενσωμάτωσε την LMDP σε καθένα.

Η διαρροή του έγκλειστου καλσεΐνης από την αρνητικά φορτισμένη EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS λιποσώματα αυξημένη τριπλάσια παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης που περιέχει γ-σεκρετάσης. Από την άλλη πλευρά, όταν η σύνθεση περιελάμβανε την κατιονικού λιπιδίου ϋΟΤΑΡ, διαρροή καλσεΐνης δεν ήταν αυξημένα κατά LMDP (Εικ. 3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ένταξη της CHEMS και DOPE με EPC ήταν υποχρεωμένη να βελτιστοποιηθεί η λειτουργικότητα του LMDP. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των λιποσωμάτων και των συνθέσεων τους συνοψίζονται στον Πίνακα 2.

Η

Ο μηχανισμός αποδέσμευσης του φαρμάκου από LMDP-Lipo

Πρέπει πρώτα καθοριστεί αν LMDP αποκόπηκε από γ-σεκρετάσης όταν ενσωματώνονται σε λιποσώματα. Έτσι, εξετάσαμε την ικανότητα του LMDP-Lipo να αναστέλλει ανταγωνιστικά την διάσπαση ενός φθορίζοντος διερευνητή υποστρώματος με γ-σεκρετάση. Επαληθεύσαμε ότι η διάσπαση του φθορίζοντος ιχνηλάτη πεπτίδιο ανεστάλη σημαντικά ακόμη και όταν LMDP-Lipo προστέθηκε στο κλάσμα μεμβράνης που περιέχει το γ-σεκρετάσης (Εικ. 4α). Αν και η ανασταλτική επίδραση του LMDP-λιπο ήταν μικρότερη από LMDP μόνο, επιβεβαιώθηκε ότι LMDP σε λιποσωματική μεμβράνες θα μπορούσε να αντιδράσει με γ-σεκρετάσης. Η διάσπαση της LMDP σε λιποσωμικές μεμβράνες εκτιμήθηκε επίσης με HPLC με την παρουσία του κλάσματος μεμβράνης γ-σεκρετάσης που περιέχουν. Το εμβαδόν κορυφής της LMDP στα λιποσώματα μειώθηκε κατά περίπου 36,8 ± 7,0%, και η διάσπαση του LMDP φαίνεται στην παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης (Πίνακας 3). Σύκο. 4b δείχνει τις αντιπροσωπευτικές χρωματογραφήματα LMDP-λιποσώματος, με ή χωρίς το κλάσμα μεμβράνης.

(α) Ανταγωνιστική αναστολή της LMDP σε λιποσώματα. Ο ανιχνευτής πεπτίδιο φθορισμός επωάστηκε με Control-Lipo (EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS) ή LMDP-Lipo (EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS /3 mol% LMDP) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις LMDP παρουσία του κλάσματος μεμβράνης των κυττάρων Α549 σε 37 ° C όλη τη νύκτα. Άσπρο και μαύρο στήλες δείχνουν Control-λιπο ή LMDP-lipo, αντίστοιχα. (Β) Αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα του LMDP-λιποσωμάτων με ή χωρίς το κλάσμα μεμβράνης, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση HPLC από τρία ανεξάρτητα πειράματα. διανομής (γ) Μέγεθος λιποσωμάτων παρουσία του κλάσματος μεμβράνης που λαμβάνεται από κύτταρα Α549 με ή χωρίς αναστολέα γ-σεκρετάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το νανο Zetasizer. Στερεά γραμμή και διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει Ελέγχου-Lipo και LMDP-Lipo, αντίστοιχα. (Δ) δείκτη πολυδιασποράς (PDI) της κορυφής χρησιμοποιώντας Ελέγχου-λιπο ή LMDP-lipo. Λευκό, γκρι και μαύρες στήλες δείχνουν λιποσώματα μόνα, τα λιποσώματα υπό την παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης κυττάρου Α549 ή λιποσωμάτων παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης με 10 μΜ DAPT, αντίστοιχα. (Ε) κατανομή Αφθονία της κορυφής για τον Έλεγχο-λιπο (μαύροι κύκλοι) και LMDP-Lipo (μαύρα τρίγωνα) υπό τις ίδιες συνθήκες όπως (δ). (Οι τιμές και μπάρες αντιπροσωπεύουν τα μέσα και SD, αντίστοιχα *, P & lt?. 0,05 και ***, Ρ & lt? 0.001 έναντι 0 μΜ LMDP (α), Control-lipo (γ, δ), n = 3.

στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την αλλαγή του μεγέθους των σωματιδίων LMDP-Lipo παρουσία της γ-σεκρετάσης που περιέχει κλάσμα μεμβράνης. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση του μεγέθους σωματιδίων στην παρουσία του Ν- [Ν- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-αλανυλ] -S-φαινυλγλυκίνης τ-βουτυλεστέρα (DAPT), ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης. Η ανασταλτική δράση του DAPT επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενός ιχνηλάτη πεπτίδιο υπόστρωμα. Συγκεκριμένα, γ-σεκρετάσης ανεστάλη κατά περίπου 60% με την προσθήκη DAPT (Εικ. S3). Σχ. 4b δείχνει ότι η κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων του LMDP-λιπο είχε ευρεία σύγκριση με Control-Lipo παρουσία ενός κλάσματος μεμβράνης. Αυτή η ευρεία κατανομή αναστάλθηκε με κατεργασία με DAPT. Ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI) του LMDP-λιπο αυξήθηκε σημαντικά με την παρουσία του κλάσματος μεμβράνης σε σύγκριση με Control-Lipo, μια διαφορά που μειώθηκε με κατεργασία με DAPT. Επιπλέον, η PDI σε Control-Lipo επεξεργασία με το κλάσμα μεμβράνης ήταν ελαφρώς αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη σε Control-Lipo χωρίς το κλάσμα μεμβράνης. Ωστόσο, η αύξηση αυτή δεν άλλαξε με συν-κατεργασία με τον αναστολέα γ-σεκρετάσης, DAPT, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του PDI σε Control-Lipo οφειλόταν στην παρουσία του κλάσματος μεμβράνης. (Εικ. 4γ). Η κατανομή αφθονία της κύριας κορυφής των λιποσωμάτων συγκρίθηκε με την απουσία ή την παρουσία του κλάσματος μεμβράνης. Η αφθονία της κύριας κορυφής του LMDP-λιπο μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του κλάσματος μεμβράνης. Οι αλλαγές αυτές κατασταλεί από DAPT, και δεν παρατηρήθηκε στο Control-Lipo (Σχ. 4d). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η κατανομή μεγέθους μεταβλήθηκε επειδή LMDP διασπάστηκε με γ-σεκρετάσης, προκαλώντας την αποσταθεροποίηση της λιποσωμικής μεμβράνης και την αλλαγή του μεγέθους των σωματιδίων.

γ-σεκρετάσης εξαρτώμενη απελευθέρωση φορτίων από LMDP-Lipo

Θα εξεταστεί κατά πόσον απελευθέρωση των φορτίων εξαρτάται από τη δραστηριότητα γ-σεκρετάσης. Έτσι, LMDP-λιπο ενθυλάκωσης καλσεΐνης αναμίχθηκε με το κλάσμα μεμβράνης από κύτταρα Α549, κύτταρα HeLa, κύτταρα MCF-7 ή κύτταρα HUEhT-2. Όταν LMDP-Lipo αναμίχθηκε με κλάσματα μεμβράνης που απομονώθηκε από κύτταρα Α549 και MCF-7 κύτταρα με πολύ υψηλή δραστηριότητες γ-σεκρετάσης, η διαρροή καλσεΐνης αυξημένη σε σύγκριση του ελέγχου-Lipo. Η αυξημένη διαρροή κατεστάλη σημαντικά με επεξεργασία με DAPT. Από την άλλη πλευρά, η διαρροή καλσεΐνης δεν αυξήθηκε όταν τα κλάσματα μεμβράνης των κυττάρων HeLa και φυσιολογικά κύτταρα HUEhT-2 (ελαφρώς υψηλή ή χαμηλή γ-σεκρετάσης, αντίστοιχα) χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 5). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απελευθέρωση των φορτίων από LMDP-Lipo εξαρτάται από την υψηλή γ-σεκρετάσης σε καρκινικά κύτταρα.

Control-Lipo (EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS) ή LMDP-Lipo (EPC /ϋΟΡΕ /CHEMS /5 mol% LMDP) επωάστηκε με την παρουσία του κλάσματος μεμβράνης από κύτταρα HUEhT-2 (λευκές στήλες), κύτταρα HeLa (διακεκομμένη στήλες), MCF-7 κύτταρα (cross-διαγράμμιση στήλες), κύτταρα Α549 (μαύρες στήλες) , ή Α549 κυττάρων με 10 μΜ DAPT (γκρι στήλες) στους 37 ° C για 1 ώρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± S.D. (N = 3-7) *, Ρ & lt? 0,05, **, Ρ & lt? 0,01 και ***, Ρ & lt?. 0.001

Η

Η ενδοκυτταρική απελευθέρωση των φορτίων από LMDP-Lipo