Αφηρημένο

XB130, μια νέα πρωτεΐνη προσαρμογέα, προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων με τον έλεγχο της έκφρασης πολλών σχετικών γονιδίων. Τα microRNAs (miRNAs), οι οποίες είναι συχνά κακή που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, ρυθμίζουν την έκφραση των στοχευόμενων γονιδίων. Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να διερευνήσει την ογκογόνο μηχανισμό XB130 μέσω της ρύθμισης miRNAs. Αναλύσαμε έκφραση miRNA σε XB130 σύντομο φουρκέτα RNA (shRNA) σταθερά επιμολυσμένα WRO καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων με μια δοκιμασία συστοιχία miRNA, και 16 miRNAs ήταν επάνω ρυθμισμένη και 22 miRNAs ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά σε αυτά τα κύτταρα, σε σύγκριση με μη-επιμολυσμένα ή αρνητικός έλεγχος shRNA επιμολυσμένων κυττάρων. Εμείς επιλέξαμε τρεις από τις up-ρυθμίζονται miRNAs (miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ) και να επικυρωθεί από πραγματικό χρόνο qRT-PCR. Έκτοπη υπερέκφραση της XB130 καταστέλλονται αυτά τα 3 miRNAs σε κύτταρα ΠΚΑ, μια κυτταρική γραμμή με πολύ χαμηλή έκφραση του XB130. Επιπλέον, επιμολυσμένα miR μιμείται αυτών των 3 miRNAs σε κύτταρα WRO. Θα ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση των ογκογονιδίων (miR-33a: MYC, miR-149: FOSL1, miR-193a-3P: SLC7A5), στοχεύοντας 3 ‘αμετάφραστη περιοχή τους, και μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι XB130 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση της έκφρασης του όγκου κατασταλτικής miRNAs και στοχευμένα γονίδια τους

Παράθεση:. Τακέσιτα Η Shiozaki Α, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et al. (2013) XB130, μια πρωτεΐνη Νέα Adaptor, ρυθμίζει την έκφραση των όγκων Κατασταλτικός Τα microRNAs στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10.1371 /journal.pone.0059057

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 6, Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 11 Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Τακέσιτα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR) λειτουργικές επιχορηγήσεις MOP-13270, MOP-42546 και MOP-119514. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Actin νήμα συνδέεται πρωτεΐνη (AFAP) είναι ένα μικρό οικογένεια πρωτεϊνών προσαρμογέα που εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος, οργάνωση του κυτταροσκελετού, κυτταρική κινητικότητα και άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Περιλαμβάνει AFAP [1], AFAP1L1 (ακτίνης συνεργάτης πρωτεΐνη 1, όπως 1) [2], και XB130 (επίσης γνωστή ως ακτίνης πρωτεΐνη που συνδέεται με 1-σαν 2, AFAP1L2) [3]. Έχουν αποδειχθεί ότι συμμετέχουν στη ρύθμιση των διαφόρων σηματοδότησης οδών με σχηματισμό πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή /και σύμπλοκα πρωτεΐνης-λιπιδίου [1], [4], και υπό ορισμένες περιστάσεις αυτές οι πρωτεΐνες προσαρμογέας μπορεί να εμπλέκονται στην ογκογένεση [5], [ ,,,0],. 6]

XB130 είναι ένα υπόστρωμα κινάσης τυροσίνης, η οποία μπορεί να είναι τυροσίνης φωσφορυλιώνονται από Src και άλλες κινάσες τυροσίνης [7] – [9], και να αλληλεπιδρούν με Src μέσω Ν-τερματικού SH2 και SH3 μοτίβα περιοχή δέσμευσης , και μεσολαβεί Src σχετίζονται διενεργοποίησης του SRE και ΑΡ-1 [7]. Το Ν-άκρο της XB130 περιέχει επίσης ένα μοτίβο ΥχχΜ που μπορεί να συνδέονται προς το p85α υπομονάδα φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ), μέσω του SH2 περιοχές, και στη συνέχεια ενεργοποιούν Akt [2], [8]. XB130 μεσολαβεί κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό μέσω πολλαπλών σημάτων κατάντη από Akt [9]. XB130 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς ρυθμίζει την ανάπτυξη του όγκου, όπως φαίνεται σε ένα ζωικό μοντέλο με γυμνούς ποντικούς, μέσω της προώθησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η αναστολή της απόπτωσης. Επιπλέον, knockdown του XB130 μειώνει την έκφραση πολλών γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και /ή την επιβίωση [10]. XB130 είναι επίσης εμπλέκονται στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης [11]. Η αλλοίωση της εκφράσεως XB130 έχει παρατηρηθεί σε ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς [10], καρκίνο του οισοφάγου [12], και γαστρικού καρκίνου [13]. Ως εκ τούτου, οι μελέτες αυτές απαιτούν περαιτέρω εξέταση για τη λειτουργία της XB130 στην ογκογένεση.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs (περίπου 22 νουκλεοτιδίων μήκους), τα οποία μπορούν να αλληλεπιδρούν ειδικά με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) στοχευμένων mRNA, αναστέλλει τη μετάφραση του mRNA, ή να οδηγήσει σε διάσπαση του mRNA και την υποβάθμιση [14]. Ο αριθμός των αναφερόμενων ανθρωπίνων miRNAs υπερβαίνει 2000 (miRBase, Release 18 στο Ινστιτούτο Sanger), και miRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους στον έλεγχο βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, του μεταβολισμού και του πολλαπλασιασμού [15] – [18]. Μερικά miRNAs είναι συχνά κακή που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, και πρόσφατα έχουν ταυτοποιηθεί ως νέοι παράγοντες που σχετίζονται με ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου [19] – [22]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες εστιάζουν στην ρύθμιση της έκφρασης miRNA και λειτουργία στον καρκίνο [23] – [26], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς [27] – [29].

Αν και XB130 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική πολλαπλασιασμός [10], και προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση μέσω ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι [9], λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που διέπουν ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν XB130 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση ορισμένων από αυτά τα γονίδια μέσω ρύθμισης προς τα κάτω των miRNAs καταστολής όγκου. Εξετάσαμε επίπεδο έκφρασης miRNA χρησιμοποιώντας XB130 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) σταθερά επιμολυσμένα WRO καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα, σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα ή κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο shRNA. Από την άλλη πλευρά, εμείς επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα MRO που έχουν πολύ χαμηλή έκφραση του XB130 με πλασμίδιο XB130 για να ενισχύσει την έκφραση του. Τρεις όγκου κατασταλτικά miRNAs εντοπίστηκαν και περαιτέρω μελετήθηκαν, από την άποψη της έκφρασης στοχευμένων γονιδίων τους, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και την απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινα θυρεοειδούς καρκίνωμα κυττάρων WRO και τα κύτταρα ΠΚΑ ήταν από τον Dr. S. Asa (Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Τορόντο, Καναδάς) [30], οι οποίοι λαμβάνονται αυτά τα κύτταρα από τον Dr. J. Fagin (Memorial Sloan-Kettering, στη Νέα Υόρκη, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% FBS, 1 mmol /L πυροσταφυλικού και μη βασικά αμινοξέα (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA), και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Έχουμε ήδη συσταθεί κύτταρα WRO που είναι σταθερά επιμολυσμένα με shRNA πλασμίδια για XB130. (C3-1 και C3-4 καθιερώθηκαν από τον φορέα C3? C4-3 και C4-11 καθιερώθηκαν από τον φορέα C4) και αρνητικό μάρτυρα shRNA πλασμίδιο (NC1, NC9 και NC12) ιδρύθηκαν στο παρελθόν [10]. G418 (0.25 mg /ml) προστέθηκε σε μέσο καλλιέργειας των επιμολυσμένων κυττάρων για τη διατήρηση της επιλογής. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2.

Μελέτες πρωτεΐνης και κηλίδωση Western

κηλίδος Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις διαδικασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],31], [32]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν με τροποποιημένο ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσο καταβύθιση (50 mmol /L Tris-HCl, ρΗ 7.5? 150 mmol /L NaCl? 2 mmol /L EGTA? 2 mmol /L EDTA? Και 1% Triton Χ-100) που περιέχουν 10 μg /ml καθένα από aprotinin, leupeptin, pepstatin, 1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mmol /L Na

3νο

4 και 10 mmol /L NaF. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με Protein Assay Pierce® BCA Kit (Thermo, Rockford, IL, USA).

κυτταρολύματα που περιέχει ίσες ποσότητες των συνολικών πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Πρωτεΐνες αποκαλύφθηκαν από SuperSignal West Dura Extended Διάρκεια υποστρώματος (Θέρμο). Οι εντάσεις των ζωνών πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Μονοκλωνικό αντίσωμα XB130 δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Αντισώματα για την β-ακτίνη, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Αντι-PCNA αντίσωμα προήλθε από Abcam (Toronto, ON, Καναδάς). Anti-Ki-67 (κλώνος Ki-S5) προήλθε από Cedarlane (Burlington, ON, Καναδάς).

Μικροσκοπίας και ανοσοφθορισμού Ανάλυση

Για χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες προ- αγωγή με 50 μg /mL πολυ-L-λυσίνη. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα ταχέως καθοριστεί από 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και πλύθηκαν με PBS. Τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0.1% ΤπΙοη-Χ-100 για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν με 1% BSA για 1 ώρα. Οι καλυπτρίδες ακολούθως επωάζονται με πρωτογενές αντίσωμα έναντι XB130 για 2 ώρες, ακολουθούμενη από πλύση και επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για 1 ώρα. Οι καλυπτρίδες επίσης χρωματίστηκαν για F-ακτίνης με Oregon Green 488 Φαλλοϊδίνη (Invitrogen) για 1 ώρα και για πυρήνα με χρωστική Hoechst 33342 (Invitrogen) για 10 λεπτά. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS και στερεώθηκαν σε γυάλινα πλακίδια χρησιμοποιώντας τοποθέτησης φθορισμού μέσου Dako (Dako, Mississauga, ΟΝ, Canada). Η χρώση οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus IX81.

microRNA Array και ανάλυση δεδομένων

Τέσσερις XB130 shRNA σταθερά επιμολυσμένων κλώνων (C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11) χρησιμοποιήθηκαν ως XB130 knockdown κυττάρων. κύτταρα WRO και τρεις αρνητικές έλεγχο shRNA σταθερά επιμολυσμένων κλώνων (NC1, NC9 και NC12) χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Ambion, Austin, ΤΧ, USA). Ο αριθμός ακεραιότητα του RNA προσδιορίζεται από την Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σαν ένα μέτρο της ποιότητας του RNA. προφίλ έκφρασης των miRNAs πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος miRNA μικροσυστοιχιών του Ανθρώπου της Agilent (Agilent Technologies) με G3 SurePrint 8 × 60 πλατφόρμα v16 Κ για 1.205 ανθρώπινα miRNAs (miRBase απελευθερώσει 16.0). Εν συντομία, 100 ng του συνολικού RNA σημάνθηκαν με Κυανίνη 3-pCp και υβριδοποιήθηκαν επί των συστοιχίες στους 55 ° C για 20 ώρες. Διαφάνειες σαρώθηκαν με G2505C Agilent Technologies σαρωτή, και οι σαρωμένες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent Feature Extraction έκδοση 10.7.3. Ανάλυση διαφορικής έκφρασης και ιεραρχική ανάλυση συστάδων έγινε χρησιμοποιώντας GeneSpring GX 11.5 (Agilent Technologies).

Στόχος Πρόβλεψη των miRNAs

TargetScan 6.0 (https://www.targetscan.org/), microRNA .org (https://www.microrna.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), και DIANA-μΤ v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) χρησιμοποιήθηκαν για να ψάξετε προβλεπόμενη στόχους της miRNAs.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR για XB130

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA), και cDNA συνετέθη από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας κιτ High Capacity cDNA RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ποσοτική RT-PCR για XB130 εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green Ι κύριο PCR επί LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. SDHA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό γονίδιο αναφοράς για τις αναλύσεις. Οι εκκινητές PCR για XB130 και SDHA είναι: 5′-XB130_forward AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 ‘, 5′-XB130_reverse GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3′, 5’-SDHA_forward CGGCATTCCCACCAACTAC-3 ‘και 5′-SDHA_reverse GGCCGGGCACAATCTG-3’. Έκφραση των XB130 ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT σε σχέση με SDHA. Η ΔCt υπολογίστηκε αφαιρώντας τις τιμές Ct των SDHA από τις τιμές Ct του XB130. Φορές αλλαγή στο γονίδιο υπολογίστηκε από την εξίσωση 2-ΔCt [33]. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η μέση της έκφρασης του λόγου XB130 /SDHA σε κύτταρα WRO ορίστηκε σε 1 και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος και τυπική απόκλιση φορές των μεταβολών XB130.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR για pri-miRNAs και ώριμη miRNAs

Για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του pri-miRNAs και ώριμη miRNAs, ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας mirVana ™ miRNA Kit Απομόνωση (Ambion). Όσο για τον ποσοτικό προσδιορισμό των pri-miRNAs, το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA RT kit (Applied Biosystems). Real-time PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα TaqMan® Οικουμενική Master Mix ΙΙ και τα TaqMan® pri-miRNA Αναλύσεις ειδικά για έχει-mir-33α, έχει-mir-149 και έχει-mir-193a-3ρ σε 7900 σε πραγματικό χρόνο σύστημα PCR (Applied Biosystems).

Όσον αφορά τον ποσοτικό προσδιορισμό των ώριμων miRNAs, ένα TaqMan® microRNA RT Kit και TaqMan® microRNA δοκιμασίες ειδικά για HSA-miR-33a, έχει-miR-149 και έχει-ΜΙΚ 193a-3ρ (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για αντιδράσεις RT. Real-time PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα TaqMan® καθολική Master Mix II και τους προσδιορισμούς TaqMan® microRNA σε ένα σύστημα PCR 7900 πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems). Και στις δύο ποσοτικοί προσδιορισμοί, RUN6B (U6) αξιολογήθηκε ως ενδογενή έλεγχο, καθώς και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT ίδιο όπως σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR για XB130.

κυττάρων Η επιμόλυνση

Παραγωγή πλασμιδίου του GFP-alone, GFP-tagged XB130 (GFP-XB130) και μετάλλαγμα εξάλειψης Ν-άκρο του (GFP-XB130ΔN) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [11]. κύτταρα MRO επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας 60 μλ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε ένα πιάτο 100 mm, όπως περιγράφεται στις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μέσο που περιέχει το πλασμίδιο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και GFP θετικά κύτταρα απομονώθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) Άρια II (BD Biosciences, San Jose, CA) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. GFP θετικά κύτταρα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τη Δυτική δοκιμασίες αποτύπωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

mirVana ™ miRNA Μιμούνται του miR-33a, miR-149 και miR-193a και mirVana ™ miRNA Μιμούνται αρνητικού ελέγχου # 1 ελήφθησαν εμπορικά (Ambion ). κύτταρα WRO επιμολύνθηκαν με 50 pmol miR μιμούνται χρησιμοποιώντας 5 μL Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε 6-φρεατίων σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το μέσο που περιέχει το πλασμίδιο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο 24 ώρες μετά την διαμόλυνση και ολικό RNA και πρωτεΐνη εκχυλίστηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Luciferase Assay Reporter

αλληλουχίες Seed του miR-33a, miR -149 και miR-193a-3ρ και την αντιστοίχιση 3’UTR ακολουθίες MYC, FOSL1 και SLC7A5 είχαν προβλεφθεί από TargetScan. 3’UTR αλληλουχίες κλωνοποιήθηκαν κατάντη προς λουσιφεράση πυγολαμπίδας της Έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Vector και επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας (Promega, Madison, WI, USA). Η pmirGLO κατασκευή και ΜΙΚ μιμούνται ή ελέγχου miR μιμητικό συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα WRO καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, πυγολαμπίδας και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα προσδιορισμού Luciferase Reporter Διπλή (Promega). Firefly λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με renilla δραστηριότητα λουσιφεράσης. Η μέση δραστικότητας λουσιφεράσης της αναλογίας Firefly /Renilla σε κύτταρα WRO συν-επιμολύνθηκαν με κάθε ένα από τα pmirGLO κατασκευάσει και να ελέγχουν miR μιμητικό ορίστηκε σε 1. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

κυττάρων πολλαπλασιασμό και την απόπτωση Δοκιμασίες

WRO κύτταρα τοποθετήθηκαν σε Πεντάκλινο φρεάτια πλακών μικροτίτλου 96 φρεατίων (100 μΐ /φρεάτιο) για προσδιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 12 φρεατίων (ml καλά 1 /) για μέτρηση κυττάρων δοκιμασίας, και σε 6-πηγαδιών πλάκες μικροτίτλου (2 ml /φρεάτιο) για προσδιορισμό απόπτωσης, σε 5 × 10

4 κύτταρα /ml και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με miRNA μιμητικό, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας CellTiter 96® Υδατικό One Λύση Κυττάρου Πολλαπλασιασμού Δοκιμασία (Promega) σε κάθε χρονικό σημείο (0, 24, 48, και 72 ώρες) μετά την επιμόλυνση. Μετά αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο, ​​20 μΐ αντιδραστηρίου Διαλύματος CellTiter 96® υδατική προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες σε υγροποιημένη, 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 490 nm με αυτόματο αναγνώστη πλάκας (Thermo). Η απορρόφηση υποβάθρου των μεσαίων και μόνο αφαιρέθηκε. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε ως η μέση απορρόφηση των κυττάρων στον υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο διαιρούμενη με την μέση απορροφητικότητα των κυττάρων σε 0 h μετά την επιμόλυνση και εκφράζονται ως μέσος όρος και τυπική απόκλιση. Στην δοκιμασία αριθμός των κυττάρων, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από τις φιάλες με ένα διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ και μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο σε κάθε χρονικό σημείο. Ο αριθμός των κυττάρων εκφράστηκε ως μέση τιμή και την τυπική απόκλιση

δοκιμασία απόπτωσης, τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και χρωματίστηκαν με ισοθειοκυανική φθορεσκεϊνη-συζευγμένη αννεξίνη V και φωσφατιδυλινοσιτόλη (ΡΙ), με τη χρήση αννεξίνης V. – FITC Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και αναλύθηκαν από BD AccuriTM C6 Κυτταρομετρητής ροής (BD Biosciences, San Jose, CA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός XB130 shRNA σταθερά διαμολυσμένα WRO κύτταρα

Για τη μελέτη των ρόλων των XB130 στη ρύθμιση των δραστηριοτήτων των κυττάρων WRO, είμαστε σταθερά επιμολυσμένα τα κύτταρα με shRNA στόχευση XB130. Η έκφραση του XB130 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε αυτούς τους κλώνους (C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11) από ότι στις μη επιμολυσμένα κύτταρα WRO και άλλοι τρεις κλώνοι σταθερώς επιμολυσμένα με ένα αρνητικό μάρτυρα shRNA (NC1, NC9, NC12), όπως προσδιορίζεται με στύπωμα Western (Εικ. 1Α) και με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (Σχ. 1Β). Η έκφραση του mRNA SDHA χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο οικοκυρική για qRT-PCR (Εικ. 1Β), επειδή η έκφραση της δεν μεταβάλλεται κάτω από διαφορετικές πειραματικές συνθήκες [10], [34], [35]. Είναι ενδιαφέρον, XB130 knockdown κυττάρων έδειξε επιμήκη μορφολογία όταν εξετάζονται με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Επιπλέον, η χρώση ανοσοφθορισμός έδειξε ότι η έκφραση του σε κύτταρα XB130 C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη, και χρώση F-ακτίνης έδειξε επίσης επιμήκη μορφολογία σε επίπεδα μόνο κύτταρο (Σχ. 1 C, Εικ. S1)

εξετάστηκαν τα ακόλουθα κύτταρα:. κύτταρα WRO (WRO), αρνητικός έλεγχος shRNA επιμολυσμένα κύτταρα WRO (NC1, NC9 και NC12) και XB130 shRNA επιμολυσμένα κύτταρα WRO (C3-1, C3-4 , C4-3 και C4-11). (Α) XB130 shRNA μειωθεί αποτελεσματικά XB130 επίπεδα της πρωτεΐνης. (Β) πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση του mRNA σε XB130 XB130 shRNA επιμολυσμένα κύτταρα WRO ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι τα κύτταρα WRO (* Ρ & lt? 0,05). (Γ) WRO, NC9 και C3-1 ήταν ανοσο-χρώση με ένα αντίσωμα XB130 και αντίθετη χρώση για Ρ-ακτίνη και πυρήνες με Oregon Green 488 φαλλοειδίνη και Hoechst 33342. Η έκφραση της πρωτεΐνης σε XB130 κυτταρόπλασμα εξαφανίστηκε στις XB130 shRNA επιμολυσμένα κύτταρα.

η

η έκφραση microRNA προφίλ στο XB130 shRNA Τα επιμολυσμένα κύτταρα

Για τον προσδιορισμό miRNAs ρυθμίζεται από XB130, πραγματοποιήσαμε ανάλυση προφίλ έκφρασης των miRNAs, συγκρίνοντας XB130 shRNA σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα WRO (C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11) με τους ελέγχους (WRO, NC1, NC9 και NC12) χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία σειρά microRNA. ανάλυση GeneSpring GX έδειξε ότι 38 miRNAs μεταβλήθηκαν σημαντικά από τη σταθερή knockdown του XB130 σε κύτταρα WRO (τιμή ρ & lt? 0,05), εκ των οποίων, 16 ήταν πάνω ρυθμισμένα (Πίνακας 1) και 22 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S1) σε XB130 shRNA επιμολυσμένα κύτταρα.

η

για να καθορίσει τους μηχανισμούς με τους οποίους XB130 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εστιάσαμε στην miRNAs καταστέλλεται από XB130 και επιλεγμένα miR-33a, miR-193a-3ρ και miR-149 για περαιτέρω ανάλυση , η οποία έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν λειτουργίες ογκοκατασταλτικού σε διάφορους καρκίνους [36] – [38]. Για να επαληθεύσετε τα αποτελέσματα της XB130 για miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ, έχουμε ποσοτικά επίπεδα αυτών των 3 miRNAs χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR. Τόσο το ώριμο miRNA (Εικ. 2Α) και τα επίπεδα pri-miRNA (Εικ. 2Β) αυτών των τριών miRNAs σε XB130 shRNA σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα WRO (C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι εκείνα των μη επιμολυσμένα κύτταρα WRO ή κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα shRNA (NC1, NC9 και NC12).

Οι ώριμες μορφές (Α) και πρωτογενών μεταγραφές (Β) του miR-33a, ΜΙΚ 149 και miR-193a-3ρ είναι σημαντικά υψηλότερες σε XB130 shRNA επιμολυσμένα κύτταρα WRO (C3-1, C3-4, C4-3 και C4-11) από ό, τι στο WRO (* P & lt? 0,05)

Η

έκτοπη έκφραση XB130 Καταστολής Πρωτοβάθμιας και ώριμες μορφές του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τις ρυθμιστικές επιπτώσεις των XB130 στην έκφραση του miR-33a, miR-149, και miR-193a-3ρ, πραγματοποιήσαμε μια «διάσωση» της μελέτης στα κύτταρα MRO, οι οποίες έχουν πολύ χαμηλή έκφραση XB130 όπως καθορίζεται από κηλίδωση western. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα MRO με πλασμίδια που εκφράζουν GFP-alone, GFP-XB130, ή Ν-άκρο μετάλλαξη διαγραφής του, GFP-XB130ΔN. GFP θετικά κύτταρα συλλέχθηκαν με FACS, και η έκφραση του GFP-XB130 και πρωτεϊνών GFP-XB130ΔN σε επιμολυσμένα κύτταρα ΠΚΑ καταδείχθηκε με κηλίδωση Western (Εικ. 3Α). Σε αντίθεση με τα κύτταρα WRO, κύτταρα MRO παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ, τόσο των ώριμων και πρωτογενείς μορφές. XB130-GFP υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω τόσο ώριμη miRNAs και pri-miRNAs, ενώ η υπερέκφραση της GFP-XB130ΔN δεν προκαλούν τέτοια αποτελέσματα (Σχ. 3Β και C). Δεδομένου ότι το Ν-άκρο της XB130 περιέχει λειτουργικά μοτίβα που μπορεί να αλληλεπιδράσει με Src [7] και p85α υπομονάδα ΡΙ3Κ [8], η έλλειψη αποτελεσμάτων της παρούσας μεταλλαγμένου υποδηλώνει ότι τα «διάσωσης» επιδράσεις της GFP-XB130 μπορεί να σχετίζεται με Src και /ή ΡΙ3Κ σχετίζονται μηχανισμούς. Το γεγονός ότι τόσο τα ώριμα και pri-miRNA επίπεδα αυτά ρυθμίζονται ομοίως από XB130 πρότεινε ότι XB130 επηρεάζονται αυτά τα τρία miRNAs τουλάχιστον εν μέρει στο μεταγραφικό επίπεδο.

κύτταρα MRO επιμολύνονται και μόνο με φορέα GFP, ή GFP-XB130 , GFP-XB130ΔN (XB130 Ν-τελικό άκρο διαγραφή μεταλλαγμένο). GFP θετικά κύτταρα συλλέχθηκαν με FACS. (Α) κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι τα κύτταρα MRO εκφράζουν πολύ χαμηλά XB130. Επιμόλυνση της GFP-XB130 (MRO-XB130) ή GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) έδειξε XB130 έκφραση στα κύτταρα ΠΚΑ. Οι ώριμες μορφές (Β) και πρωτογενείς μεταγραφές (C) του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ εξετάστηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. Αυτά τα miRNAs και pri-miRNAs στα κύτταρα ΠΚΑ ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι σε κύτταρα WRO, και μείωσε σημαντικά από υπερέκφραση του GFP-XB130, αλλά όχι από GFP-XB130ΔN. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα WRO

Η

Η υπερέκφραση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ Μειωμένη Down-stream Στοχευμένες Πρωτεΐνες Σχετικά με κυτταρικού πολλαπλασιασμού

έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι σε XB130 shRNA επιμολυσμένα σταθερώς κύτταρα WRO, 57 γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση ήταν σημαντικά αλλοιωθεί, και τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια κάτω-ρυθμίζονται από XB130 shRNA [10]. Έχουμε σκεφτεί ότι μεταξύ αυτών των γονιδίων, μερικά είναι οι στόχοι του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ. Χρησιμοποιώντας TargetScan 6.0, microRNA.org, PicTar και DIANA-μΤ v4 /TarBase 5.0, εντοπίσαμε MYC και CEBPG ως υποψήφιοι των γονιδίων στόχων για miR-33a, CEBPG και FOSL1 για miR-149, SLC7A5, DECR1 και SETD8 για ΜΙΚ 193a-3ρ. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτά τα miRNAs ρυθμίζουν στην πραγματικότητα έκφραση των υποψήφιων στόχων, θα επιμολυνθεί miR μιμούνται σε κύτταρα WRO. Η επιμόλυνση αυτών των τριών μιμείται miR αύξησε σημαντικά τα επίπεδα των αντίστοιχων miRNAs (Σχ. 4Α), αλλά δεν επηρέασε τα επίπεδα πρωτεΐνης XB130 (Εικ. 4Β). Σε σύγκριση με κύτταρα WRO, τα επίπεδα πρωτεΐνης του MYC, FOSL1 και SLC7A5 ήταν χαμηλότερες στην XB130 shRNA σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα (C3-1 ως ένα παραδείγματα) (Σχ. 4C-E). Η υπερέκφραση του miR-33a οδήγησε σε μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης MYC (Εικ. 4C). Ομοίως, η υπερέκφραση του miR-149 ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα πρωτεΐνης FOSL1 (Εικ. 4D), και η υπερέκφραση του miR-193-3p ρυθμισμένα προς τα κάτω τα επίπεδα πρωτεΐνης SCL7A5 (Εικ. 4Ε). Ο αρνητικός έλεγχος μιμούνται (Cont-m) δεν επηρέασε αυτά τα τρία πρωτεΐνες (Εικ. 4C-E). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του CEBPG, DECR1 και SETD8 δεν άλλαξαν από υπερέκφραση αυτών των μιμητικών miR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Επιμόλυνση των miR μιμείται (33α-m, 149 m και 193a-m) σημαντικά αυξημένη αντίστοιχη έκφραση των miRNAs, ενώ ο έλεγχος του miR μιμούνται (συν-m) δεν είχε τέτοιο αποτέλεσμα, όπως ποσοτικοποιείται με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. (Β) κηλίδωση Western δείχνει ότι η επιμόλυνση του miR μιμούνται δεν άλλαξε XB130 επίπεδα πρωτεΐνης. (Γ-Ε) MYC, FOSL1 και SCL7A5 είναι προβλεπόμενο στόχο του miR-33a, miR-149 και miR-193-3p, αντίστοιχα. Άνω πάνελ δείχνει παραδείγματα που η έκφραση της προβλεπόμενης πρωτεΐνης-στόχου μειώθηκε από τις αντίστοιχες miR μιμούνται τις επιμολύνσεις, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western. Κάτω πίνακας δείχνει την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης με πυκνομετρία.

Η

Από υπερ-έκφραση της GFP-XB130 στα κύτταρα ΠΚΑ κατασταλεί η έκφραση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ ( Εικ. 3Α-3Β), ελέγξαμε επίσης αν θα μπορούσε να επηρεάσει στη συνέχεια στοχευμένες πρωτεΐνες προς τα κάτω-ροή τους. Στυπώματα Western έδειξαν ότι σε σύγκριση με GFP-alone επιμολυσμένα κύτταρα MRO, GFP-XB130 επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν υψηλότερη MYC, FOSL1 και SLC7A5. Σε σύγκριση με GFP-XB130ΔN επιμολυσμένα κύτταρα, τα επίπεδα FOSL1 και SLC7A5 ήταν επίσης σαφώς υψηλότερη σε GFP-XB130 επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα miRNA μιμούνται δεδομένα στα κελιά WRO.

MiR-33α, miR-149 και miR-193a-3ρ Άμεσα Στοχευμένες Binding Site στην 3’UTR του MYC, FOSL1 και SLC7A5, αντίστοιχα

στη συνέχεια χρησιμοποιείται το σύστημα δημοσιογράφος pmirGLO Dual-Luciferase να καθοριστεί αν η μείωση του MYC, FOSL1 και τα επίπεδα SLC7A5 από υπερέκφραση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ miR μιμούνται ήταν μέσα από την 3’UTR της στοχευμένες mRNAs τους. Ένα σημαντικό συμπληρωματικότητα ταυτοποιήθηκε, με τη χρήση των αλγορίθμων σε TargetScan μεταξύ αλληλουχιών εντός των περιοχών του σπόρου miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ και αλληλουχίες στο 3’UTR του MYC, FOSL1 και SLC7A5, αντίστοιχα (Σχ. 5Α ). Τα κατασκευάσματα pmirGLO τα οποία περιέχουν ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης και η 3’UTR καθενός από αυτά τα 3 γονίδια δημιουργήθηκαν. κύτταρα WRO συν-επιμολύνθηκαν με τα κατασκευάσματα pmirGLO και κάθε ένα από τα μιμείται miR ή αρνητικός έλεγχος miR. Η υπερέκφραση του miR-33a σημαντικά μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης της pmirGLO κατασκεύασμα με κλωνοποιημένες αλληλουχίες 3’UTR του MYC (Εικ. 5Β). Ομοίως, η υπερέκφραση του miR-149 και miR-193-3p μείωσε σημαντικά τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης όταν τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με το κατασκεύασμα λουσιφεράσης που περιέχει τα 3’UTRs του FOSL1 και SCL7A5 (Σχ. 5C και D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτά τα 3 miRNAs θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκφραση των σχετικών γονιδίων στόχων με σύνδεση προς 3’UTRs τους.

(Α) αλληλουχιών Σπόρος του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ και αντιστοίχιση 3’UTRs ακολουθία myc, FOSL1 και SLC7A5 όπως προβλέπεται από TargetScan φαίνονται. Η pmirGLO κατασκευάσει με τα κλωνοποιημένα 3’ΙΙΤΡ ακολουθίες (Luc-MYC, Luc-FOSL1 και Luc-SLC7A5) και το miR μιμούνται (33α-m, 149 m και 193a-m) ή τον έλεγχο του miR μιμούνται (συν-m) ήταν συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα WRO. (Β) Η υπερέκφραση του miR-33a μείωσε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης της pmirGLO κατασκεύασμα με κλωνοποιημένα 3’UTR αλληλουχίες του MYC (luc-MYC). Ομοίως, η υπερέκφραση του miR-149 και miR-193-3p σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης του Luc-FOSL1 (C) και του Luc-SCL7A5 (D), αντίστοιχα.

Η

Μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού από υπερέκφραση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ

MYC, FOSL1 και SLC7A5 είναι γνωστό ότι συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από την επιμόλυνση του καθενός από αυτά μιμείται miR κάτω ρυθμισμένα αντίστοιχες στοχευμένες πρωτεΐνες, εξετάσαμε έπειτα τα αποτελέσματα αυτών των μιμητικών miR επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων WRO μειώθηκε με την επιμόλυνση του miR μιμούνται του miR-33a, miR-149 ή miR-193a-3ρ, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 6Α), ή με μέτρηση των κυττάρων (Εικ. 6Β), σε σύγκριση με έλεγχο miR μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα σε 72 h μετά την κυτταρική σπορά. Επιπλέον, η έκφραση των δεικτών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Ki-67 και PCNA, μειώθηκαν από καθένα από αυτά τα τρία μιμείται miR σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα WRO ή κύτταρα επιμολυσμένα με μιμητικό ελέγχου (Εικ. 6C). Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του GFP-XB130, και σε λιγότερο επεκτείνουν του GFP-XB130ΔN αυξημένη έκφραση στα κύτταρα Κί67 MRO (Εικ. S2).

Οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκαν με δοκιμασία MTS (Α) και καταμέτρηση κυττάρων (Β) σε 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του ελέγχου μιμούνται (cont-m) και των ειδικών miR μιμούνται (33α-m, 149 m και 193a-m). Η υπερέκφραση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. (Γ) δείκτες πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τα επίπεδα PCNA Ki-67 και, επίσης μειώθηκαν σε miR μιμούνται κατεργασμένα κύτταρα (33α-m, 149 m και 193a-3ρ). (Δ) Η απόπτωση προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ΡΙ /διπλή χρώση αννεξίνης V. Η υπερέκφραση του miR-193a-3A σημαντικά που προκαλείται τόσο πρώιμη απόπτωση (αννεξίνης V θετική /αρνητική PI) και αργά απόπτωση (αννεξίνη V /PI διπλό θετικό) στα κύτταρα WRO. *: P & lt? 0,05

Η

Για να καθοριστεί αν η μείωση του αριθμού των κυττάρων οφείλεται σε απόπτωση, πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής με PI /διπλή χρώση αννεξίνης V.. Αννεξίνης V θετικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν πρώιμη απόπτωση, ενώ αννεξίνης V και ΡΙ διπλά θετικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν αργά απόπτωση [10]. Η υπερέκφραση του miR-193a-3a (αλλά όχι άλλες δύο miRNAs) που επάγεται σημαντικά τόσο νωρίς και αργά απόπτωση σε κύτταρα WRO (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση των αριθμών των κυττάρων σε miR-33a και miR-149 μιμείται οφείλονται κυρίως στην αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ miR-193a-3ρ μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να προκαλέσουν απόπτωση.

Συζήτηση

σε προηγούμενη μελέτη μας, η ανάλυση μικροσυστοιχιών εντοπίστηκαν 246 γονίδια αλλάξει σημαντικά από σταθερά χτυπήσει κάτω των XB130 στο WRO καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα. Ειδικά, 57 από τα 246 γονίδια είναι συνδεδεμένα με τον πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων πολλών ρυθμιστών μεταγραφής [10]. Έχει εκτιμηθεί ότι περίπου το 30% όλων των ανθρώπινων γονιδίων μπορεί να ρυθμίζεται από miRNAs [39]. Οι αλλαγές στην επεξεργασία miRNA συμβάλλει στην ογκογένεση [40]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι XB130 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του miRNAs ανάπτυξης που σχετίζονται με τον έλεγχο και στη συνέχεια γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Για την αξιολόγηση αυτή την υπόθεση, αναλύσαμε την έκφραση των miRNAs στην XB130 νοκ ντάουν κύτταρα WRO. ανάλυση δεδομένων συστοιχία microRNA έδειξε ότι το 38 miRNAs ήταν διαφορετικά εκφράζεται σε XB130 νοκ ντάουν κύτταρα. Μεταξύ αυτών, εστιάσαμε στην miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ που έχουν αναφερθεί ως miRNAs καταστολής όγκων σε διάφορες μορφές καρκίνου. MiR-33α επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που δρουν μέσω αναστολής του πρωτο-ογκογονιδίου Pim-1 στο λέμφωμα και ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα [36]. έκφραση του miR-149 έχει άμεση συσχέτιση με KCNMA1 και LOX ογκογονίδια με σαφείς καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [37]. Παρομοίως, miR-193-3p στοχεύει JNK1 και αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό στον καρκίνο του μαστού [38]. Εμείς επικυρωθεί up-ρύθμιση του miR-33a, miR-149 και miR-193a-3ρ στην XB130 νοκ ντάουν κύτταρα σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR.

Στις διαδικασίες έκφραση microRNA, RNA πολυμεράση ΙΙ παράγει μεγάλο πρωτογενές μεταγραφές miRNA ονομάζεται pri-miRNAs, τα οποία είναι κομμένα και διασπάται από ένα σύμπλεγμα πολλών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων DROSHA και DICER1 να παράγουν ώριμα λειτουργικά miRNAs [41]. Πώς η έκφραση των miRNAs ρυθμίζεται είναι ακόμα ασαφής, αλλά διάφοροι μηχανισμοί έχουν προταθεί. Έχει αποδειχθεί ότι η p53 ήταν υπεύθυνη για τη μετα-μεταγραφική ωρίμανση του miR-16-1, miR-143 και miR-145, ενώ η έκφραση των σχετικών pri-miRNAs δεν επηρεάστηκε από p53 [25]. Όπως αναφέρεται στο σχ.