Αφηρημένο

Ο μεταβολισμός των καρκινικών κυττάρων με πυροσταφυλική κινάση Μ2 (PKM2) στο επίκεντρο της έχει αναλάβει μια προνομιακή σημασία στην έρευνα του καρκίνου τα τελευταία χρόνια. το μεταβολισμό των κυττάρων του καρκίνου, που χαρακτηρίζεται από αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης, παραγωγή γαλακτικού και αναβολισμού θεωρείται ιδανικός στόχος για θεραπευτικές παρεμβάσεις. Έκφραση PKM2 διακόπτες μεταβολισμό υπέρ των καρκινικών κυττάρων, επομένως, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει την μέχρι τώρα άγνωστη επίδραση της ρεσβερατρόλης, ενός phytoalexin, επί της έκφρασης PKM2 και προκύπτουσα επιπτώσεις στο μεταβολισμό του καρκίνου. Παρατηρήσαμε ότι η ρεσβερατρόλη κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση PKM2 με αναστολή της σηματοδότησης mTOR και κατέστειλε το μεταβολισμό του καρκίνου, κριθεί από μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης, παραγωγή γαλακτικού (αερόβια γλυκόλυση) και μειωμένη αναβολισμός (σύνθεση μακρομόριο) σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Μια ενδεχόμενη μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων της ριβόζης-5-φωσφορικό άλας (R5p), ένα κρίσιμο ενδιάμεσο του μονοπατιού φωσφορικής πεντόζης, αντιπροσώπευε ένα μειωμένο αναβολισμός. Κατά συνέπεια, η κατάσταση του κατέστειλε το μεταβολισμό του καρκίνου οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Είναι ενδιαφέρον, shRNA μεσολάβηση αποσιώπηση των PKM2 πρόσληψης ανέστειλε γλυκόζης και γαλακτικού οξέος στην παραγωγή, παρέχοντας στοιχεία για τον κρίσιμο ρόλο της PKM2 και διαμεσολάβησης της στις παρατηρούμενες επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στον μεταβολισμό του καρκίνου. Περαιτέρω, μια υπερ-έκφραση της PKM2 κατάργησε τις παρατηρούμενες επιδράσεις της ρεσβερατρόλης, που σηματοδοτεί το ρόλο του PKM2 αρνητική ρύθμιση ως κρίσιμη λειτουργία της ρεσβερατρόλης. Η μελέτη αναφέρει ένα μυθιστόρημα PKM2 μεσολάβηση επίδραση της ρεσβερατρόλης στον μεταβολισμό του καρκίνου και παρέχει μια νέα διάσταση στις θεραπευτικές δυνατότητες της

Παράθεση:. Iqbal MA, Bamezai RNK (2012) Η ρεσβερατρόλη Αναστέλλει Cancer Cell Metabolism από κάτω ρύθμιση πυροσταφυλική κινάση Μ2 μέσω αναστολής της στόχο θηλαστικού της ραπαμυκίνης. PLoS ONE 7 (5): e36764. doi: 10.1371 /journal.pone.0036764

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Ιούλη, 2011? Αποδεκτές: 6 Απρίλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου 2012

Copyright: © 2012 Iqbal, Bamezai. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο Επιχορηγήσεις της Επιτροπής, η κυβέρνηση της Ινδίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα βασίζονται στη διαδικασία του μεταβολισμού μετασχηματισμού για τη διατήρηση του πολλαπλασιασμού. Αυτά τα κύτταρα παρακάμπτουν μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση, η οποία channelizes γλυκόζη για την παραγωγή ΑΤΡ (καταβολισμός), και αντ ‘αυτού χρησιμοποιούν γλυκόζη για τη σύνθεση μακρομόριο (αναβολισμός) για θυγατρικά κύτταρα [1]. Τα καρκινικά κύτταρα μετατρέπουν επίσης πιο πυροσταφυλικού (τερματικός προϊόν της γλυκόλυσης) σε γαλακτικό, μέσα σε μεγάλο βαθμό άγνωστο μηχανισμό? και ως εκ τούτου εμποδίζουν τη θέση του σε μιτοχόνδρια [2]. Η αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και την παραγωγή γαλακτικού οξέος είναι το σήμα κατατεθέν του μεταβολισμού του καρκίνου (φαινόμενο Warburg ή αερόβια γλυκόλυση) [2], παρέχοντας τα καρκινικά κύτταρα ένα πλεονέκτημα να αναπτυχθούν ακόμη και σε περιοχές με πολύ χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου [1], [2]. αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση που διαμεσολαβείται από στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) κινεί το μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση της έκφρασης των βασικών ενζύμων σε μεταβολικά μονοπάτια [3]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι μεταλλάξεις που προκαλούν υπερ-ενεργοποίηση του mTOR είναι κοινά σε καρκίνους [4], [5].

πυροσταφυλική κινάση Μ2 (PKM2) φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για το μεταβολισμό του καρκίνου και κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου [6]. Από τις τέσσερις ισομορφές της πυροσταφυλικής κινάσης L, R, Μ1 και Μ2 [7], [8], πολλαπλασιαζόμενα εμβρυϊκά και όγκου κύτταρα εκφράζουν κατά κύριο λόγο Μ2 [1]. Αυτός ο διακόπτης ισομορφή είναι μια προϋπόθεση για να συμβεί αερόβια γλυκόλυση [9].

PKM2, μια αλλοστερική ισομορφή της κινάσης πυροσταφυλικού, καταλύει το τελευταίο βήμα στη γλυκόλυση, δηλαδή τη μετατροπή της phosphoenol-πυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό [10], [11]. Από PKM2 έχει χαμηλότερη δραστικότητα σε σύγκριση με τα ιδιοσυστατικά ενεργών ισομορφών [1], η καταστολή της στην δραστηριότητα προκαλεί συσσώρευση των ανάντη γλυκολυτικών ενδιάμεσων. Μια επακόλουθη αποτέλεσμα είναι αυξημένη διαθεσιμότητα γλυκολυτικών ενδιαμέσων για βιοσυνθετικών οδών όπως πεντόζης φωσφορικό οδού (ΡΡΡ), η οποία επιταχύνει μακρομόριο βιοσύνθεση (ριβόζη-5-φωσφορική? R5p) και την ανάπτυξη του όγκου [1]. R5p είναι ένα σημαντικό ενδιάμεσο της οδού της φωσφορικής πεντόζης και χρησιμεύει ως πρόδρομος για σύνθεση μακρομορίων [12]. Η έκφραση του PKM2 σε όγκους είναι αρκετά υψηλή για να αξιοποιηθεί ως δείκτης για την πρόγνωση του καρκίνου [13], [14], [15]. Το εργαστήριο μας έχει αναφέρει φυσικές μεταλλάξεις σε PKM2 σχετίζεται με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και πολυπλοειδία [16]? τονίζοντας το ρόλο της PKM2 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ως εκ τούτου, η διαλογή φαρμάκων τα οποία αναστέλλουν αποτελεσματικά την έκφραση PKM2 και την πρόληψη μεταβολικού μετασχηματισμού γίνεται σχετική [17].

Η ρεσβερατρόλη (3, 4 ‘, 5-τριϋδροξυστιλβένιο) είναι ένας phytoalexin, που υπάρχουν στο δέρμα των κόκκινων σταφυλιών και άλλων φρούτων [18]. Η ρεσβερατρόλη έχει αναφερθεί ότι εξασκεί αντικαρκινική δράση σε διάφορα στάδια της έναρξης του όγκου, την προώθηση και την εξέλιξη [19]. Αυτό επιβεβαιώνεται από τις εκθέσεις της χημειο-προληπτική επίδραση της ρεσβερατρόλης σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως, HeLa, Α549 και MCF-7 [20], [21], [22]. Διάφοροι μηχανισμοί για την αντι-πολλαπλασιαστική δράση της ρεσβερατρόλης έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένων της αύξησης των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών όπως ρ53 [22], BRCA 1 &? 2 [23], η φωσφορυλίωση της Rb πρωτεΐνης και παράγοντες μεταγραφής όπως ΝΡ-κΒ και ΑΡ-1 [24 ]. Σε μια πρόσφατη έκθεση, η ρεσβερατρόλη έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της SIRT1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση ΑΜΡΚ [25]. Η ρεσβερατρόλη έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει μονοπάτι ΡΙ3Κ και επηρεάζει τη γλυκόλυση για να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε λεμφώματα Β κυττάρων [26]. Η ρεσβερατρόλη μεσολάβηση αναστολή της mTOR είναι επίσης γνωστό [27]. Ωστόσο, αυτά τα ευρήματα δεν εξηγούν το ρόλο της ρεσβερατρόλης στον μεταβολικό μετασχηματισμό, ειδικά όταν συνδυάζεται με την έκφραση PKM2. Αναφέρουμε σε αυτή τη μελέτη, η επίδραση της ρεσβερατρόλης στην έκφραση PKM2 με επακόλουθες επιπτώσεις στο μεταβολισμό του καρκίνου. Για πρώτη φορά, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν νέα PKM2 μεσολάβηση επίδραση της ρεσβερατρόλης επί του μεταβολισμού του καρκίνου που επιβεβαιώνουν με θεραπευτικό δυναμικό της.

Υλικά και Μέθοδοι

Α) κυτταρικής καλλιέργειας, φαρμακευτική αγωγή, PKM2 knockdown , επιμολύνσεις και μελέτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού

κυτταρικές σειρές MCF-7 κύτταρα HeLa, HepG2 και είχαν αγοραστεί από το Εθνικό Κέντρο για την Επιστήμη των κυττάρων, Pune, Ινδία. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο Eagle του Dulbecco (DMEM? Sigma, ΜΟ, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Biowest, Γαλλία), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma) στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστιβάδα και περάστηκαν ρουτίνας 2-3 φορές την εβδομάδα. Για φαρμακευτική αγωγή, η ρεσβερατρόλη (Sigma) και ραπαμυκίνη (Sigma) διαλύθηκαν σε αιθανόλη και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αντίστοιχα? Κλάσματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πυκνότητα σε 0,1-0,2 εκατομμύρια ευρώ /φρεάτιο σε έξι φρεατίων. Πριν από τη φαρμακευτική αγωγή, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με ρεσβερατρόλη περιέχουν μέσα, που ακολουθείται από 48 ώρες επώασης. Η αιθανόλη και τα κύτταρα DMSO-αγωγή χρησιμοποιήθηκαν ως εικονικές ελέγχου. Λεντοϊού pGIPZ (Open Biosystems, USA) χρησιμοποιήθηκε για shRNA μεσολάβηση αποσιώπηση των PKM2. Για υπερέκφραση μελέτες PKM2, pCDNA-myc και pCDNA-myc-PKM2 ετικέτα χρησιμοποιήθηκαν φορείς. Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) χρησιμοποιήθηκε σαν ένα αντιδραστήριο επιμόλυνσης. Για τις μελέτες του πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα μετρήθηκαν, σπόρους και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη σε διαφορετικά χρονικά σημεία που ακολουθείται από επανάληψη μέτρηση για την εκτίμηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού.

απομόνωση RNA Β), cDNA προετοιμασία και σε πραγματικό χρόνο ανάλυση

Το συνολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Sigma) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ποιότητα RNA αναλύθηκε με Α

260 /Α

280 απορρόφηση ισορροπία και με ηλεκτροφόρηση σε 1,2% γέλη αγαρόζης φορμαλδεΰδης. 1-2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε μονοκλωνικό DNA με χρήση κιτ απλό παρασκεύασμα cDNA (Applied Biosystems, USA). Εμπορικά διαθέσιμα δοκιμασία γονιδιακής έκφρασης Taqman (Applied Biosystems) με αριθμό εξαρτήματος Hs00987621_g1 χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA του PKM2. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος (Part Νο 4333762F, Applied Biosystems, USA). Primer ανιχνευτές επιλέχθηκαν για να αποφευχθεί η μόλυνση γονιδιωματικού ενίσχυση του DNA. Real Time PCR διεξήχθη επί ΑΒΙ Prism 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, USA). ΔΔC μέθοδος

t (κατώφλι κύκλου) της σχετικής ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου με SDS 1,1 λογισμικό RQ (Applied Biosystems, USA).

παρασκεύασμα C) κυτταρόλυμα, εκτίμηση πρωτεϊνών και Western Λεκιάζοντας

Ολόκληρο κυτταρικό λύμα παρασκευάστηκε με επώαση των κυττάρων επί πάγου επί 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 50 mM Tris ρΗ 7,2, 150 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100, 0,1 % SDS, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 5 mM φθοριούχο νάτριο (NaF), 1 mM βαναδικό νάτριο (NAV), αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Sigma), 4 μg /ml απροτινίνη, 4 μg /ml λευπεπτίνης και 4 μg /ml πεπστατίνη (Sigma). Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm σε φυγόκεντρο ψύξης (CM 12, Remi, Ινδία) για 15 λεπτά και το υπερκείμενο συλλέχθηκε σε φρέσκο ​​σωλήνες παγωμένο. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Pierce BCA (δικιγχονινικού οξύ) δοκιμασίες πρωτεΐνης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (MDI, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C (υγρό μεταφοράς), και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα. Η μεμβράνη επωάστηκε με κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια κιτ από Thermo Scientific, USA. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-PKM2, αντι-myc, αντι-ρ-p70S6K, αντι-p70S6K και αντι-β-ακτίνης (Cell Technology, USA σηματοδότηση)

D) Η πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού δοκιμασία παραγωγής.

Media συλλέχθηκε από φρεάτια και η πρόσληψη γλυκόζης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας γλυκόζη kit (Εξοκινάσης) δοκιμασία (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παραγωγή γαλακτικού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας γαλακτικό δοκιμασίας (BioVision, USA) ακολουθώντας τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Όλες οι μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν σε αριθμούς κυττάρων.

Ε) εκχύλιση μεταβολίτη και εκτίμηση με LC-MS

Ο μεταβολίτης εκχύλισμα παρασκευάστηκε από 5 εκατομμύρια κύτταρα με τη χρήση 0,5 ml 90% αιθανόλης ψύξη που περιέχει 0.5% μυρμηκικό οξύ και φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά σε υψηλή ταχύτητα σε μία ψυχόμενη φυγόκεντρο. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο ξηράνθηκε χρησιμοποιώντας ροή αζώτου και ανασυστάθηκε εντός 0,2 ml ύδατος MilliQ. LC-MS διεξήχθη σύμφωνα με τις προδιαγραφές που περιγράφονται προηγουμένως [28]. Ποσοστιαία μεταβολή στο σήμα (ένταση) υπολογίστηκε λαμβάνοντας παρωδία αντιμετωπίζονται ελέγχου ως αναφορά? αρνητική μεταβολή στο σήμα απεικονίζεται η μείωση των επιπέδων των μεταβολιτών.

F) Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE.

σ

τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t test

μαθητή και

p & lt?. 0.05

θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η ρεσβερατρόλη μειώνει PKM2 mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης μέσω mTOR αναστολής

PKM2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν, χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western, σε ρεσβερατρόλη θεραπεία HeLa, HepG2 και τα κύτταρα MCF-7. Επιλέξαμε 50 μΜ ρεσβερατρόλης για έκθεση 48 ωρών αφού αυτή η θεραπεία αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων μπλοκαριστεί στην φάση S. [20]. Έχει διαπιστωθεί επίσης ότι η έκφραση PKM2 είναι στο μέγιστο στην S φάση [29]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ρεσβερατρόλη κάτω ρυθμισμένα PKM2 mRNA και πρωτεΐνης με περίπου 2 φορές σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν (Σχήμα 1Α-D). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη απόδειξη της έκφρασης PKM2 να επηρεάζεται από τη ρεσβερατρόλη

θεραπεία ρεσβερατρόλη μειώνει PKM2 mRNA σε (Α), HeLa.? (Β), HepG2 και (C), MCF-7? από περίπου δύο πτυχώσεις. β-ακτίνη ελήφθη ως ενδογενής έλεγχος και ομαλοποιήθηκε ως προς PKM2 mRNA. Σχετική ποσοτική ανάλυση έγινε με τη χρήση SDS 1,1 λογισμικό RQ. δείχνει κηλίδα Western μειώθηκε πρωτεΐνη PKM2 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ ρεσβερατρόλη (D).

C- Mock αγωγή ελέγχου και R- ρεσβερατρόλη αντιμετωπίζεται.

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SE.

* p & lt?. 0.05

Η

Για να διερευνήσουν πώς η ρεσβερατρόλη είναι προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης PKM2, κοιτάξαμε μέσα στο μονοπάτι του mTOR σηματοδότησης, η οποία συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνους [30], [31], [32], [33]. οδός mTOR είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση των διαφόρων γλυκολυτικών ενζύμων συμπεριλαμβανομένων PKM2 [3], [34]. Κατά την θεραπεία ρεσβερατρόλη, παρατηρήσαμε αναστολή της σηματοδότησης mTOR σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν (Σχήμα 2Α). Αναστολή της mTOR από γνωστούς ραπαμυκίνη αναστολέα του (20 ηΜ για 24 ώρες) επίσης μείωσε την έκφραση PKM2 (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση PKM2 με αναστολή mTOR.

Η ρεσβερατρόλη (50 μΜ) ανέστειλε mTOR σηματοδότησης σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν όπως είναι προφανές από μειωμένη φωσφορυλίωση του ρ-p70S6K κατά την κατεργασία ρεσβερατρόλη (Α) ?

C- Mock αντιμετωπίζονται ελέγχου και R- ρεσβερατρόλη αντιμετωπίζονται

. αναστολή mTOR από 20 nM ραπαμυκίνη μειωμένη έκφραση PKM2 σε όλες τις πειραματικές κυτταρικές σειρές (Β)?

C- Mock αντιμετωπίζονται ελέγχου και Rapa- 20 nM ραπαμυκίνη

.

Η

Μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού οξέος στην παραγωγή για τη θεραπεία ρεσβερατρόλη

κυττάρων

Καρκίνος απαιτούν μια μεγάλη και συνεχή παροχή της γλυκόζης για αναβολικές διαδικασίες. Η παραγωγή γαλακτικού από τα καρκινικά κύτταρα εμποδίζει την είσοδο του πυροσταφυλικού σε μιτοχόνδρια [2]. Έτσι, η αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και παραγωγής γαλακτικού είναι το σήμα κατατεθέν του μεταβολισμού του καρκίνου. Επίδραση της ρεσβερατρόλης επί του μεταβολισμού του καρκίνου μελετήθηκε με την αξιολόγηση των μεταβολών στην πρόσληψη της γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγής. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή για θεραπεία ρεσβερατρόλη (Σχήμα 3Α-Β), αποδεικνύοντας ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει αερόβια γλυκόλυση, η οποία είναι ενδεικτικά της καταστέλλεται μεταβολισμό του καρκίνου.

Μια σημαντική μείωση στην πρόσληψη της γλυκόζης (Α) και παραγωγή γαλακτικού (Β), παρατηρήθηκε σε HeLa και HepG2 (

* ρ & lt? 0,05

), μετά 48 ώρες επίδρασης ρεσβερατρόλη. Ωστόσο, σε MCF-7 αερόβια γλυκόλυση δεν έδειξε σημαντικά σημάδια της αναστολής (

p & gt? 0,05

). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SE.

Η

Η σίγαση του PKM2 καταλήγει σε μειωμένη αερόβια γλυκόλυση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

δεδομένο ότι η παρατηρούμενη μείωση στην αερόβια γλυκόλυση οφειλόταν εν μέρει στη μειωμένη έκφραση PKM2. Για να δοκιμάσετε αυτή την υπόθεση, θα σιγήσει PKM2 χρήση shRNA. PKM2 γκρεμίσουμε επιτευχθεί (~60-70%) εκτιμήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Εικόνα 4Α). Μετά knockdown, η πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή μετρήθηκε. Κύτταρα με σιγήσει PKM2 έδειξαν μια σημαντική μείωση στην πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή, γεγονός που υποδηλώνει ότι PKM2 απαιτείται για αερόβια γλυκόλυση (Σχήμα 4Β-C). Μειωμένη αερόβια γλυκόλυση οδήγησε σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι PKM2 είναι κρίσιμη για το μεταβολισμό του καρκίνου και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει το μεταβολισμό του καρκίνου μέσω PKM2

PKM2 χτυπήθηκε κάτω (σχεδόν το 60% – με τη χρήση φορέα λεντοϊού pGIPZ περιέχει PKM2 shRNA) όπως αναλύεται από:. Πραγματικού χρόνου PCR (Α), μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης (Β) , γαλακτικό παραγωγής (C), και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (D) μετά γκρεμίζω. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SE.

* p & lt?. 0.05

Η

Η ρεσβερατρόλη μειώνει τον αναβολισμό σε καρκινικά κύτταρα

ριβόζη-5-φωσφορικό άλας, ένα αναβολικό δείκτη, είναι απαραίτητη για τη σύνθεση μακρομορίων. Είναι ένα ενδιάμεσο σε μονοπάτι φωσφορικής πεντόζης [12]. Για να εξεταστεί εάν η ρεσβερατρόλη επηρεάζει αρνητικά αναβολισμό σε καρκινικά κύτταρα, μετρήσαμε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του R5p σε κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με ρεσβερατρόλη. Οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν από αγωγή κυτταρικές σειρές που ακολουθείται από ανάλυση LC-MS. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μείωση των ~20-25% βρέθηκε σε επίπεδα R5p σε κύτταρα κατεργασμένα ρεσβερατρόλη, υποδηλώνοντας ανέστειλαν αναβολισμός (Σχήμα 5). MCF 7 κύτταρα έδειξε μια σχετικά μικρή μείωση στα επίπεδα R5p δείχνει ένα ασθενώς καταστέλλεται αναβολισμός.

R5p είναι μια πεντόζη φωσφορικό ενδιάμεσο μονοπάτι, ένας σημαντικός δείκτης για αναβολισμός (βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων). Περίπου 20-25% μείωση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα R5p σε HeLa και HepG2 παρατηρήθηκε μετά 50 μΜ θεραπεία ρεσβερατρόλη. Ωστόσο, υπήρξε μια ασήμαντη μείωση της τάξης του 5% στα κύτταρα MCF-7 (βλέπε κείμενο). Τα αποτελέσματα έδειξαν ανέστειλε αναβολισμού μετά τη θεραπεία ρεσβερατρόλη. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SE.

* p & lt?. 0.05

Η

Καταστολής μεταβολισμό του καρκίνου αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

Για να μελετήσουν πώς ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των διαφόρων κυτταρικών σειρών επηρεάζεται μετά από θεραπεία με ρεσβερατρόλη, που αντιμετωπίζονται HeLa, HepG2 και MCF7 κυττάρων με 50 μΜ ρεσβερατρόλη για 0, 24, 48, 72 και 96 ώρες και μετρήθηκαν τα κύτταρα. Επίδραση ήταν εμφανής σε HeLa και HepG2, αλλά ήταν αδύναμη σε MCF7 (Εικόνα 6Α-C) κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, η ρεσβερατρόλη ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, προτείνοντας ότι η καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων επιβραδύνεται ο μεταβολισμός του καρκίνου, καθώς και.

Για να εξετάσει πώς η αναστολή του μεταβολισμού του καρκίνου επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών, έχουμε επεξεργασία με θρυψίνη και μετρήθηκαν τα κύτταρα σε 0, 24, 48, 72 και 96 ώρες. Υπήρξε μια μείωση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν με εξέχοντα μείωση στην HeLa (Α), HepG2 (Β) και τουλάχιστον προεξέχων σε MCF -7 (C). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SE.

* p & lt?. 0.05

Η

Η υπερέκφραση του PKM2 αντιστρέφει τις επιδράσεις της ρεσβερατρόλης

Για την επιβεβαίωση των ευρημάτων μας της ρεσβερατρόλης στον μεταβολισμό του καρκίνου και κατά συνέπεια τον πολλαπλασιασμό με στόχευση PKM2, έχουμε παροδικά υπερεκφράζονται PKM2 σε κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε μέσα που περιέχουν 50 μΜ ρεσβερατρόλη. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με pcDNA-myc (Mock επιμόλυνση) ή με pCDNA-myc-PKM2 (PKM2 επιμόλυνση). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης (και ταυτόχρονη θεραπεία ρεσβερατρόλη), κύτταρα μετρήθηκαν, συγκομίζονται και υποβάλλονται σε λύση για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Η επιμόλυνση επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας αντι-myc και αντι-PKM2 αντισώματα (Σχήμα 7Α)? έτσι ήταν η αναστολή της mTOR (Σχήμα 7Α). Όπως αναμενόταν, η υπερ-έκφραση του PKM2 οδήγησε σε αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα ακόμη και με την παρουσία 50 μΜ ρεσβερατρόλης (Σχήμα 7Β). Επιπλέον, PKM2 υπερ-έκφραση που προκαλείται επαυξημένης πρόσληψη γλυκόζης και γαλακτικού παραγωγή (Σχήμα 7C και D) σε κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε ρεσβερατρόλη? αντιμετώπιση των αρνητικών επιπτώσεων της ρεσβερατρόλης. Αυτά τα αποτελέσματα περαιτέρω τεκμηρίωση ότι PKM2 είναι ένα κρίσιμο στόχο της ρεσβερατρόλης και η έκφραση της καθορίζει τον μεταβολισμό του καρκίνου και, κατά συνέπεια, το κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Η υπερέκφραση του PKM2 χρησιμοποιώντας myc ετικέτα φορέα pCDNA (βλέπε κείμενο) επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας αντι myc και αντισώματα αντι PKM2 (Α). Αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε PKM2 επιμολυσμένα κύτταρα, σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα, σε συνεχή παρουσία ανασταλτικών συγκεντρώσεων της ρεσβερατρόλης (Β). Η πρόσληψη γλυκόζης (C) και παραγωγή γαλακτικού (D) ουσιαστικά βελτιωμένη σε PKM2 επιμολυσμένα κύτταρα υποδεικνύοντας ότι PKM2 υπερέκφραση καταργεί επιδράσεις της ρεσβερατρόλης επί του μεταβολισμού του καρκίνου και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν περαιτέρω PKM2 ως κρίσιμο στόχο της ρεσβερατρόλης. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE.

* p & lt? 0,05

.

PKM2 – δείχνει ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, ενώ PKM2 + δείχνει PKM2 επιμολυσμένα κύτταρα

Η

Συζήτηση

Η μεταβολική μετατροπή θεωρείται ως απαραίτητη αλλαγή που αποκτήθηκαν από τα καρκινικά κύτταρα να αναπτυχθούν. . Η έρευνα για τις μεταβολικές εθισμούς των καρκινικών κυττάρων έχει επιταχυνθεί τα τελευταία χρόνια. Μεταβολική φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων πιστεύεται να εμπλέκεται ενζύμων ως κατάλληλοι στόχοι για αντικαρκινικές στρατηγικές. Φάρμακα που αναστέλλουν τον μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση μία ποικιλία μορίων (συμπεριλαμβανομένων ενζύμων), άμεσα ή έμμεσα, είναι υπό κλινικές δοκιμές [17]. Είναι, συνεπώς, σκόπιμο να φάρμακα οθόνη με δυνατότητα να στοχεύσει κρίσιμα μόρια που εμπλέκονται σε μεταβολικό μετασχηματισμό.

Η ρεσβερατρόλη, αν και είναι γνωστό για αντικαρκινικές ιδιότητες του, δεν έχει ποτέ συνδέεται με σημαντικές μεταβολικές ένζυμα όπως PKM2. Η σχέση της με το μεταβολισμό του καρκίνου δεν είναι καλά κατανοητή. Έχουμε για πρώτη φορά παρουσιάζεται η ρεσβερατρόλη επιδρά κατάσταση PKM2, αναστέλλοντας έτσι το μεταβολισμό του καρκίνου.

Έχει αναφερθεί νωρίτερα ότι η ρεσβερατρόλη επηρεάζει το μεταβολισμό της γλυκόζης στα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών [35]. Faber

et al

έχουν δείξει μειωμένη έκφραση ορισμένων γλυκολυτικών ενζύμων για τη θεραπεία ρεσβερατρόλη [27], αλλά οι παρατηρήσεις τους δεν δείχνουν ρεσβερατρόλη μεταβολισμό του καρκίνου αλλοίωση επηρεάζοντας την κατάσταση των κρίσιμων μορίων όπως PKM2. Από PKM2 έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως βασικός παράγοντας για την προώθηση του μεταβολισμού του καρκίνου και την ανάπτυξη του όγκου [6], ήταν επιτακτική ανάγκη να διερευνηθεί αν η ρεσβερατρόλη θα μπορούσε να αλλάξει PKM2 να επηρεάζουν το μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων.

PKM2, λόγω της θέσης της σε γλυκόλυση, προωθεί βιοσυνθετικά μονοπάτια (π.χ. ΡΡΡ) που απαιτείται για μακρομοριακές σύνθεση [2], [6], [12]? και ως εκ τούτου η έκφραση της είναι υψηλότερο σε S (σύνθεση) φάση του κυτταρικού κύκλου [29]. Δείξαμε ότι κάτω ρύθμιση των PKM2, με ρεσβερατρόλη, αναστέλλει βιοσυνθετικά μονοπάτια που απαιτούνται για την σύνθεση των μακρομορίων (Σχήμα 5). Τα αποτελέσματα αυτά πιθανόν να εξηγήσει την παρατηρούμενη συσσώρευση κυττάρων σε Ο0 /G1 φάση σχετικά με τη θεραπεία ρεσβερατρόλη [26]? και δείχνουν πώς η ρεσβερατρόλη αναστέλλει το μεταβολισμό του καρκίνου με τη στόχευση PKM2.

Η μείωση στην πρόσληψη της γλυκόζης και παραγωγής γαλακτικού οξέος (αερόβια γλυκόλυση) με ρεσβερατρόλη διευρύνει το φάσμα χημειοπροληπτικές του και τονίζει θεραπευτική αξία του από αερόβια γλυκόλυση παρέχει μια γραμμή ζωής για τον καρκίνο κύτταρα. Αποδεικνύοντας ότι ο μεταβολισμός του καρκίνου ανασταλτική δράση της ρεσβερατρόλης που προκαλούνται από PKM2, τα αποτελέσματα μας δίνουν μια εικόνα της μοριακής βάσης της δράσης της ρεσβερατρόλης. Σε κύτταρα MCF-7, αν και η ρεσβερατρόλη μειωμένη έκφραση PKM2, ο μεταβολισμός καρκίνος ασήμαντο μεταβληθεί. Αυτή η παρατήρηση συσχετίστηκε με προηγούμενες αναφορές του κατώτερου αερόβια γλυκόλυση σε μη επεμβατικές MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού [36]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε άλλες υψηλής διηθητικού καρκίνου του μαστού κύτταρα σαν MDA-MB-231, υψηλή αερόβια γλυκόλυση επιβεβαιώνει ότι η παρατήρηση μας σε MCF-7 είναι κυτταρική γραμμή ειδική και δεν μπορεί να γενικευθεί για καρκίνους του μαστού [36]. Τα αποτελέσματά μας έχουν επίσης προστεθεί ένα μηχανιστικό εικόνα έκφρασης PKM2 κάτω ρύθμιση, αποδεικνύοντας ότι η αναστολή της σηματοδότησης mTOR είναι υπεύθυνο για τη διαδικασία (Σχήμα 2). Γκρεμίζω μελέτες έδειξαν ότι PKM2 είναι κρίσιμη για την αερόβια γλυκόλυση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Σχήμα 4), καθώς και. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις που δείχνουν ότι PKM2 είναι σημαντική για τον καρκίνο των κυττάρων γλυκόλυση και ανάπτυξη [6], [12]. Η παρατήρηση της μειωμένης ενδοκυτταρικά επίπεδα R5p επεκταθεί περαιτέρω την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην αναστολή της βιοσυνθετικής μεταβολισμού (αναβολισμός). Ουσιαστικά, αποδείξαμε ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, τα οποία με τη σειρά της επιβραδύνει την κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Η μείωση της έκφρασης PKM2 (Σχήμα 1), μετά από θεραπεία ρεσβερατρόλη, παρέχει ένα θεραπευτικό ρεσβερατρόλη άκρο [6]. Επιπλέον, η αντιστροφή των επιδράσεων της ρεσβερατρόλης στην PKM2 υπερέκφραση (Σχήμα 7) συνεπάγεται ότι PKM2 είναι ζωτικής σημασίας για τον καθορισμό μεταβολική μοίρα των καρκινικών κυττάρων και είναι ένα κρίσιμο στόχο της ρεσβερατρόλης.

Τα αποτελέσματά μας έχουν δημιουργήσει προηγουμένως άγνωστη σύνδεσμος μεταξύ ρεσβερατρόλη και PKM2? προσθέτοντας έτσι μια νέα διάσταση στην θεραπευτικό δυναμικό της ρεσβερατρόλης. Αποτελέσματα εγκρίνει επίσης τη ρεσβερατρόλη ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικό παράγοντα στην παρεμπόδιση προ-καρκινικές μεταβολισμό μέσω PKM2 ρύθμιση προς τα κάτω. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε κλινικές δοκιμές για contra επίδραση της επί του μεταβολισμού του καρκίνου μέσω PKM2. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι οι φυσικές ενώσεις θα πρέπει να ελέγχονται για το θεραπευτικό δυναμικό τους και εκείνων που είναι γνωστό ότι έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες θα πρέπει να διερευνηθούν για να περιέχει τις επιπτώσεις τους στο μεταβολισμό του καρκίνου.

Ευχαριστίες

RNKB αναγνωρίζει την υποστήριξη που παρέχεται από η Επιτροπή Πανεπιστήμιο Επιχορηγήσεις (UGC) στο Κέντρο (NCAHG) και MA Iqbal αναγνωρίζει την υποστήριξη της UGC, η κυβέρνηση της Ινδίας, για την ερευνητική υποτροφία.