Αφηρημένο

Το cetuximab είναι ένα χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα ανθρώπου-ποντικού που στοχεύει τον υποδοχέα του παράγοντα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR). Ωστόσο, η έκφραση EGFR καθορίζεται με ανοσοϊστοχημεία δεν προβλέπουν κλινικές εκβάσεις καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με cetuximab. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του EGFR ανιχνεύεται από cetuximab και φάρμακο ευαισθησίες των κυτταρικών σειρών CRC (Caco-2, WiDr, SW480, HCT116 και) και η κυτταρική γραμμή καρκινώματος Α431 επιδερμοειδούς. Χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής (FCM) για την ανίχνευση EGFR πρόσδεσης του βιοτινυλιωμένου cetuximab στην κυτταρική επιφάνεια. Υποκλωνοποιήθηκε κυτταρικές σειρές δείχνουν τα υψηλότερα και χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης EGFR επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Κυτταροτοξικά δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί η διαφορική αποκρίσεις στο cetuximab. Ξενομόσχευμα μοντέλα που έλαβαν θεραπεία με cetuximab ενδοπεριτοναϊκή να αξιολογήσει την ευαισθησία στο cetuximab. Ισχυρές αντιδράσεις στο cetuximab ήταν ειδικά εκτεθεί από υποκλωνοποιημένα κύτταρα με τα επίπεδα έκφρασης υψηλή EGFR. Επιπλέον, το cetuximab ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης του EGFR κατά 35% και 10% -20%, αντίστοιχα. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ανίχνευση της έκφρασης EGFR με cetuximab υπόσχεται να δώσει μία νέα, ευαίσθητη και ειδική μέθοδος για την πρόβλεψη της ευαισθησίας της CRC στο cetuximab

Παράθεση:. Shigeta K, Hayashida Τ, Hoshino Υ, Okabayashi Κ, Endo Τ, Ishii Υ, et al. (2013) Έκφραση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα Εντοπίστηκε από το cetuximab Υποδεικνύει την αποτελεσματικότητα του να αναστέλλει

In Vitro

και

In Vivo

πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (6): e66302. doi: 10.1371 /journal.pone.0066302

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 23 Φεβ 2013? Αποδεκτές: 3 Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Shigeta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το ιαπωνικό Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) (# 23791559 KS, # 23791499 TH και # 25293292 YK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα μέλος της ανθρώπινης οικογένειας EGFR κινασών τυροσίνης πρωτεΐνης υποδοχέα. Είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο στον μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (mCRC), και αυξημένη έκφραση του EGFR είναι το σήμα κατατεθέν πολλών ανθρώπινων όγκων [1], [2]. Η ενεργοποίηση των αποτελεσμάτων μονοπατιού σηματοδότησης EGFR σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των όγκων, αγγειογένεση, μετάσταση, και η εισβολή όγκου μέσω της σύνδεσης ενός αριθμού διαφορετικών συνδετών, συμπεριλαμβανομένων δίκην EGF μόρια, μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα-α (ΤΟΡα), και νεουρεγκιουλίνες να εξωτομέα του υποδοχέα [3]. Αποτελέσματα ενεργοποίηση EGFR στην έναρξη των δυνητικά ογκογόνο ενδοκυτταρικής καταρρακτών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του RAS-ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt, φωσφολιπάση C, μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT), και μονοπάτια SRC /FAK [4] – [6].

Η ανάπτυξη μονοκλωνικών αντισωμάτων βελτίωσε τις στρατηγικές για την αναστολή της δραστηριότητας της αναστολής EGFR στη θεραπεία του καρκίνου. Cetuximab (Erbitux, Merck-Serono, Darmstadt, Γερμανία) είναι ένα χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα (lgG1) που δεσμεύεται με τον εξωτερικό τομέα του ανθρώπινου EGFR και ανταγωνιστικά αναστέλλει τη δέσμευση να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό του όγκου συνδετήρα. Η αποτελεσματικότητα του cetuximab εκτιμήθηκε σε συνδυασμό με ιρινοτεκάνη για τη θεραπεία ασθενών mCRC των οποίων οι όγκοι είναι θετικοί για έκφραση EGFR (που αξιολογείται με ανοσοϊστοχημεία) και είναι ανθεκτικά σε FOLFOX ή FOLFIRI αγωγές [7] – [10].

Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί για να προσδιοριστούν οι παράγοντες που μπορεί να προβλέψει την ανταπόκριση στη θεραπεία και CRC με μεταλλαγμένα

KRAS

αναγνωρίστηκε ως ένας κανόνας δεν ανταποκρίνεται στην αντι-EGFR θεραπείας. [11], [12]. Σε αντίθεση, παράγοντες όπως EGFR υπερέκφραση, ενίσχυση του γονιδίου και οι μεταλλάξεις ρ53 του συσχετίζεται με την απόκριση στο cetuximab? Ωστόσο, δεν είναι απόλυτα αποτελεσματική στην πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία με cetuximab [13], [14]. Πειραματικές μελέτες έχουν προτείνει ένα συσχετισμό μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του EGFR και την αποτελεσματικότητα του cetuximab [15]. Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή φαίνεται να είναι κερδοσκοπικές σε κλινικό περιβάλλον, ενώ κάποιες μελέτες αναφέρουν ότι καμία σχέση δεν έχει βρεθεί μεταξύ της έντασης της ανοσοϊστοχημική χρώση για EGFR και το ποσοστό ανταπόκρισης [αξιολόγηση έγινε με βάση κριτήρια απόκρισης αξιολόγησης σε συμπαγείς όγκους (RECIST) ], προοδευτική επιβίωση χωρίς ή συνολική επιβίωση σε κλινικές δοκιμές [8], [16] – [18].

μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι μια μετάλλαξη εντός του εξωτομέα EGFR προσδίδει αντοχή στην cetuximab εμποδίζοντας πρόσδεσης της [ ,,,0],19]. Ως εκ τούτου, εικάζεται ότι η ανίχνευση του EGFR χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση με τη χρήση μη-ειδικό αντίσωμα IgG 1 διαφέρει από την ανίχνευση από cetuximab. Υποθέσαμε περαιτέρω ότι τα επίπεδα έκφρασης EGFR κυτταρικής μεμβράνης-ειδική, η οποία μπορεί να ανιχνευθεί με cetuximab, μπορούν να επηρεάσουν την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επινοήσει μια μέθοδο, στην οποία χρησιμοποιήσαμε βιοτινυλιωμένα cetuximab ως το πρωτογενές αντίσωμα για κυτταρομετρία ροής (FCM) για την ανίχνευση άμεσα την έκφραση EGFR από κυτταρικές σειρές CRC. Χρησιμοποιώντας την τεχνική αυτή αξιολογήσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων του EGFR ανιχνεύεται από cetuximab-ευαισθησίες των κυτταρικών σειρών CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Προετοιμασία Βιοτινυλιωμένη Το cetuximab

Ο μηχανισμός με τον οποίο βιοτινυλιωμένο cetuximab δεσμεύεται με EGFR φαίνεται στο Σχήμα 1α. Η βιοτίνη συζεύχθηκε με cetuximab χρησιμοποιήσεως μιας προσαρμογής της μεθόδου που περιγράφεται από Medical & amp? Biological Laboratories Co, Ltd

(Α) Βιοτινυλιωμένο cetuximab χρησιμοποιείται ως πρωτεύον αντίσωμα για την ανίχνευση EGFR, και ένα δευτερεύον αντίσωμα αβιδίνη-ΡΙΤΟ χρησιμοποιείται κατά FCM για την ανίχνευση συμπλόκων αντιγόνου-αντισώματος. (Β: βιοτίνη, Α: αβιδίνη) (Β) ανάλυση FCM της έκφρασης EGFR από κύτταρα Α431. Οι έλεγχοι με αντιανθρώπινο, μη ειδική IgG 1 αντίσωμα σημασμένο με FITC περιγράφεται στο κόκκινο και το cetuximab-biotylated αντισώματος σε μπλε χρώμα. ένταση φθορισμού είναι περίπου 5 φορές υψηλότερη σε σχέση με το αντίσωμα ελέγχου.

Η

Καρκίνος του παχέος εντέρου Γραμμές κυττάρων και ταυτοποίηση του EGFR εξωτερικός τομέας μεταλλάξεις,

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

η

Τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, Caco-2, WiDr, SW480, HCT116, και επιδερμικό καρκίνωμα Α431 κυτταρική γραμμή ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , USA) και καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται. Ταυτότητας όλων των κυτταρικών σειρών έγινε με τη διερεύνηση της κατάστασης μετάλλαξης του κάθε κυτταρική σειρά CRC χρησιμοποιώντας τα Scorpion όπλα ή άμεσες μεθόδους ακολουθία (που διεξήχθη από SRS Co., Ιαπωνία).

KRAS

(κωδικόνια 12 και 13),

BRAF

(εξόνιο 15), PIK3CA (εξόνια 9 και 20), και εξωτερικό τομέα του EGFR (S492) μεταλλάξεις προσδιορίσθηκαν σε ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών και τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον πίνακα 1.

Η

Caco-2, WiDr, SW480, και Α431 αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 5% 0,1 mM πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, και HCT116 αναπτύχθηκε σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS και 5% 0,1 mM πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

EGFR-σύνδεση βιοτινυλιωμένου Cetuximab και Αξιολόγησης των επιπέδων έκφρασης του EGFR χρησιμοποιώντας FCM

Χρησιμοποιήσαμε βιοτινυλιωμένο cetuximab σαν το πρωτογενές αντίσωμα για FCM. Για την επιβεβαίωση σύνδεση με EGFR cetuximab, FCM διεξήχθη χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή Α431, που εκφράζει υψηλά επίπεδα του EGFR. Α431 κύτταρα ρυθμίστηκαν σε 1 χ 10

6 κύτταρα /σωλήνα και πλύθηκε δύο φορές με 2 mL παγωμένου αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS), και μπλοκάρισμα εκτελέσθηκε για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια μπλοκαρίσματος N102 (NOF Co., Tokyo , Ιαπωνία). Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι και στη συνέχεια βιοτινυλιώθηκε cetuximab προστέθηκε για 1 ώρα σε κύτταρα που διατηρήθηκαν σε πάγο. Μια αντιανθρώπινο, μη ειδική IgG 1 αντίσωμα επισημασμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από πλύση των κυττάρων με παγωμένο PBS, ένα αντίσωμα αβιδίνη-ΡΙΤΟ (Streptavidin, Alexa Fluor® 488 συζυγούς, Molecular Probes®), ένα δευτερογενές αντίσωμα, προστέθηκε για 15 λεπτά σε πάγο. Τέλος, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων.

Ένα σύστημα διαχωρισμού κυττάρων BD FACS Aria ™ III (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), χρησιμοποιήθηκε για την FCM. EGFR επίπεδα έκφρασης αξιολογήθηκαν με υπολογισμό της έντασης του σήματος FITC. Μετά την αξιολόγηση της πρόσδεσης του βιοτινυλιωμένου cetuximab σε κύτταρα Α431, τα επίπεδα έκφρασης του EGFR από τα υπόλοιπα τέσσερα κυτταρικές σειρές CRC αξιολογήθηκαν με την ίδια μέθοδο. Επιπλέον, cytograms (σύγκριση του FITC και ΡΕ σήματος) και ιστογράμματα για κάθε κυτταρική σειρά CRC συγκρίθηκαν με εκείνα για τα κύτταρα Α431 χρησιμοποιώντας ένα BD FACSDiva 6.0 (BD Biosciences).

Καθιέρωση υποκλώνοι με υψηλό και χαμηλό επίπεδα έκφρασης EGFR

περιοριστική αραίωση των κυτταρικών καλλιεργειών διεξήχθη σε πλάκες 96 φρεατίων ιστοκαλλιέργειας σπάρθηκαν σε 0.8 κύτταρα /φρεάτιο σε ρυθμισμένα μέσα (DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 5% 0,1 mM πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη) συλλέχθηκαν από υγιείς (& gt ? 1 × 10

6 κύτταρα /mL και & gt? 95% βιωσιμότητα) κυτταροκαλλιέργειες CRC. Είκοσι υποκλώνους του κάθε κυττάρου γραμμών CRC απομονώθηκαν, και τα επίπεδα έκφρασης του EGFR προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο cetuximab όπως περιγράφεται παραπάνω. Κυττάρων είτε με την υψηλότερη ή τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης EGFR επιλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν για δοκιμασίες πολλαπλασιασμού και χρησιμοποιούνται στο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Η κατάσταση μετάλλαξης του κάθε υποκλωνοποιήθηκε κυτταρικές σειρές CRC ερευνήθηκαν και πάλι για να διαπιστωθεί αν υπάρχει οποιαδήποτε διαφορά μεταξύ άγριων και υποκλώνος κυττάρων.

Ανάπτυξη καταστολή Δοκιμασία

Cells (1.000 και 3.000 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν αμέσως μετά την αξιολόγηση των FCM σε φρεάτια μιας πλάκας 96 φρεατίων σε ϋΜΕΜ ή RPMI μέσο όπως αναφέρθηκε παραπάνω συμπληρωμένο με 0,5% FBS και 5% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις cetuximab μετά από 24 ώρες και επωάστηκαν για 6 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, δοκιμασία βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο, και ο σχηματισμός της φορμαζάνης μετρήθηκε με την απορρόφηση της στα 550 nm. Ο σχετικός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων για κάθε κυτταρική σειρά συνυπολογίζονται στην ανάλυση αφαιρώντας την απορρόφηση σε χρόνο 0 από εκείνες των ομάδων ελέγχου και θεραπείας.

Μοντέλα Ξενομοσχεύματος και θεραπεία με cetuximab

Όλα τα ζωικά πειράματα σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων και Χρήση του Πανεπιστημίου Keio. Υποκλωνοποιημένα κυτταρικές σειρές που προέρχονται από WiDr και SW480 (2.0 × 10

6 κύτταρα) ενέθηκαν υποδορίως στην δεξιά και αριστερή πλευρά της πλάτης του 5 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών. Το επίπεδο έκφρασης του EGFR αυτών υποκλωνοποιήθηκαν κυττάρων εκτιμήθηκε με FCM σε κάθε στιγμή του πειράματος και τα κύτταρα αμέσως με ένεση. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο, και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Όγκος = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 mg /kg cetuximab χορηγούνται ενδοπεριτοναϊκώς τις ημέρες 0, 7, 14, και 21 ή με τον έλεγχο του οχήματος PBS (ίδια ποσότητα όπως το cetuximab). Η θεραπεία ξεκίνησε όταν το μέγεθος του όγκου ήταν περίπου 100 mm

3. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές κάθε εβδομάδα μέχρι την ημέρα 28, και η αναλογία των όγκων του όγκου σε εκείνους προσδιορίζεται την ημέρα 0 υπολογίσθηκε.

Αξιολογήσαμε την έκφραση EGFR σε όγκους μετά την αγωγή με ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο , αντίσωμα EGFR φυσικού τύπου και όχι cetuximab. Η επεξεργασία των δειγμάτων ιστού έγινε χρησιμοποιώντας επεξεργαστή ιστών (Sakura RH-12DM-ΙΙ, Ιαπωνία). Εν συντομία, τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία σε σειρά αύξουσα αιθανόλης και ακολούθως εκκαθαρίζονται με ξυλόλιο και ενσωματώνονται σε παραφίνη. Τα δείγματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε τομές σε πάχος 4 μm χρησιμοποιώντας μια μικροτόμο (YAMATO ROM-380, Japan). Οι τομές τοποθετήθηκαν σε starfrost /σιλανίου με επικάλυψη διαφάνειες (Muto Pure Chemicals NewSilane ΙΙ, Ιαπωνία) και ξηραίνεται στον αέρα. Την ημέρα της χρώσης τα πλακίδια βυθίστηκαν σε ξυλόλιο για 10 λεπτά πριν την επανυδάτωση σε σειρά αιθανόλης. Οι τομές επωάστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου για 10 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Προεπεξεργασία deparaffiinized τομές ιστού με ανάκτηση θερμότητας επίτοπο που προκαλείται είναι απαραίτητη. Τα βέλτιστα αποτελέσματα λαμβάνονται με προ-κατεργασία με ιστούς με θερμότητα προκαλούμενη ανάκτηση επιτόπιου χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ, ρΗ 9,0. Μετά την οποία, οι τομές επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινης EGFR φυσικού τύπου (Dako, USA) πρωτογενούς αντισώματος (1:50) για 4 όλη την νύκτα βαθμό. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της δέσμευσης, η κανονική IgG ορού ποντικού χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος, αντί του πρωτογενούς αντισώματος. Μετά από εκτεταμένη πλύση, οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα στη δευτερογενή βιοτινυλιωμένο αντίσωμα που ακολουθείται από DAB Chromogen (Dako REAL EnVision Σύστημα Ανίχνευσης, USA) για 8 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Mayer και αφυδατώθηκαν σε αύξουσα ποιότητες αιθανόλης πριν από την εκκαθάριση σε ξυλένιο και τοποθέτηση υπό μία καλυπτρίδα. EGFR θετικότητα κυτταροπλασματική μεμβράνη θεωρήθηκε θετική χρώση EGFR. Ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (καμία χρώση), 1+ (ασθενής), 2+ (μέτρια) και 3+ (ισχυρή).

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Stata Έκδοση λογισμικού 11.0. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή ενός αταίριαστο του Student και

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Ανίχνευση του EGFR. με βιοτινυλιωμένο το cetuximab

η ικανότητα του βιοτινυλιωμένου cetuximab για την ανίχνευση EGFR χρησιμοποιώντας FCM αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την Α431 κυτταρική γραμμή, η οποία εκφράζει υψηλά επίπεδα του EGFR [20]. Βιοτινυλιωμένο cetuximab χρησιμοποιήθηκε σαν το πρωτογενές αντίσωμα και FCM διεξήχθη για την ανίχνευση του σήματος FITC. Ισχυρή FITC ένταση ανιχνεύθηκε σε σύγκριση με τον έλεγχο FITC-επισημασμένο IgG (Εικ. 1Β). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι ο EGFR εκφράζεται από την Α431 κυτταρική γραμμή μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο cetuximab.

Μετάλλαξη Κατάσταση του

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, και EGFR S492 εξωτομέα

Η κατάσταση μετάλλαξης του κάθε κυτταρική γραμμή CRC φαίνεται στον πίνακα 1.

KRAS

μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13, οι οποίες προβλέπουν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας με cetuximab, δεν είχαν ανιχνευτεί σε Caco-2 και WiDr. Αντίθετα, η μετάλλαξη κωδικονίου G13D ανιχνεύθηκε σε SW480 και HCT116. Η μετάλλαξη κωδικόνιο 12 δεν ανιχνεύθηκε στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές CRC. Το εξόνιο 15 μετάλλαξη στο

BRAF

ανιχνεύθηκε μόνο σε WiDr. Επιπλέον,

PIK3CA

μεταλλάξεις στα εξόνια 9 ή 20 ανιχνεύθηκαν σε SW480 και HCT116, αντίστοιχα. Τέλος, EGFR S492 μετάλλαξη εξωτομέα δεν ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

Από τα αποτελέσματα αυτά, εμείς επιλέξαμε Caco-2 ως την κυτταρική σειρά επειδή δεν έχει καμία μετάλλαξη σε οποιοδήποτε από τα τρία γονίδια και αναμένεται να είναι ευαίσθητος στο cetuximab. HCT116 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, διότι έχει τη μετάλλαξη PIK3CA στο εξόνιο 20, η οποία έχει ήδη δειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε cetuximab [21], [22]. Από την άλλη πλευρά, επιλέχθηκε SW480 με μια μετάλλαξη KRAS σε p.G13D, αφού είναι γνωστό ότι οι όγκοι p.G13D μεταλλαγμένη είναι πιο ευαίσθητα στην cetuximab σύγκριση με άλλους όγκους KRAS μεταλλαγμένο [23]. Είχαμε ένα έντονο ενδιαφέρον σε αυτή την μετάλλαξη και ήθελε να αξιολογήσει εάν η υπόθεση μας και το πειραματικό μοντέλο θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε όγκους p.G13D-μεταλλαγμένα. Επιπλέον, ήμασταν επίσης ενδιαφέρονται για την επίδραση του cetuximab με μετάλλαξη BRAF, επειδή η ευαισθησία στο cetuximab στο παρελθόν παρατηρήθηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκων BRAF-μεταλλαγμένα [24].

Αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης EGFR σε CRC Γραμμές κυττάρων

EGFR επίπεδα έκφρασης σε κάθε κυτταρική σειρά CRC αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας FCM με βιοτινυλιωμένο cetuximab. Ένταση FITC και ΡΕ δείχνονται στον cytogram, και ο φθορισμός του FITC ανιχνεύθηκε εύκολα σε όλες τις τέσσερις CRC κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι αυτά τα CRC κυτταρικές σειρές εκφράζουν EGFR, στην οποία cetuximab δεσμεύεται στην επιφάνεια των κυττάρων). Όπως υποδεικνύεται από τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα. 2Β, κυτταρικές σειρές WiDr και SW480 εξέφρασαν τα υψηλότερα επίπεδα του EGFR.

(Α) Κάθε κυτταρική σειρά αξιολογήθηκε με FCM με βιοτινυλιωμένο cetuximab. Και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC διέφεραν σε EGFR επίπεδα έκφρασης. (Β) Ιστόγραμμα κάθε κυτταρικών σειρών CRC. Το επίπεδο έκφρασης του EGFR μετρήθηκε από την ένταση του φθορισμού FITC.

Η

Καθιέρωση Γραμμές κυττάρου που διαφορικά Express EGFR

EGFR μπορεί να είναι ένα από τα πιο σημαντικά γονίδια για τον προσδιορισμό του φαινοτύπου του τα κύτταρα. Συνεπώς, η μέθοδος για να ληφθούν διάφορες κυτταρικές σειρές που είχαν τις λιγότερες επιπτώσεις στο γενετικό υπόβαθρο και έδειξε μια ποικιλία έκφρασης EGFR ήταν επιθυμητή. Περιορισμός-αραίωση μέθοδος υποκλωνώσεως είναι η κύρια τεχνική για την εξαγωγή διαφόρων τύπων κυττάρων με το ίδιο γενετικό υπόβαθρο [25]. Μπορέσαμε να απομονώσουν υποκλώνους των κυτταρικών σειρών CRC χρησιμοποιώντας την τεχνική περιοριστικής αραίωσης και καθόρισε τα επίπεδα έκφρασης του EGFR σε κάθε μία. Στο Σχήμα 3Α, το αποτέλεσμα της FACS με WiDr υποκλωνοποιήθηκε κύτταρα καθώς και διάφορα EGFR εκφράσεις απεικονίζονται. Στη συνέχεια επιλέγονται τα κύτταρα από τις υποκλωνοποιημένο κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τα υψηλότερα και χαμηλότερα επίπεδα EGFR (Σχ. 3Β). Η κατάσταση μετάλλαξης του

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, και EGFR S492 εξωτερικός τομέας δεν αλλάζουν σε κάθε υποκλωνοποιημένο κυτταρικές σειρές.

(Α) ιστόγραμμα WiDr υποκλωνοποιήθηκε κυτταρικές σειρές που εμφανίζουν διαφορές στην έκφραση του EGFR. Διάφορα EGFR εκφράσεις παρατηρήθηκαν σε υποκλωνοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές. (Β) επιλέχθηκαν υψηλής και χαμηλής υποκλώνους EGFR με υψηλή ή χαμηλή έκφραση EGFR βάσει των αποτελεσμάτων FCM. Υποκλώνοι που προέρχεται από τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC αναλύθηκαν, και επιλέχθηκαν οι υποκλώνοι που παρουσιάζουν υψηλότερη (μπλε) και το χαμηλότερο (πράσινο) επίπεδα έκφρασης του EGFR για περαιτέρω μελέτες. Οι έλεγχοι που περιγράφονται στην κόκκινη γραμμή.

Η

Ευαισθησία της CRC κυττάρων Lines στο cetuximab

Θα διεξαχθεί δοκιμασίες για να προσδιοριστεί εάν το cetuximab αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών CRC. Η ανάπτυξη των Caco-2 και SW480 αναστέλλονται ισχυρά, ενώ ενδιάμεσα αναστολή WiDr και καμία αναστολή της HCT116 κυτταρικών σειρών στη μέγιστη δόση του cetuximab παρατηρήθηκαν. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον το επίπεδο έκφρασης του EGFR σχετίζεται με τις επιπτώσεις της αναστολής του πολλαπλασιασμού του cetuximab, χρησιμοποιήσαμε υποκλωνοποιημένο κυτταρικές γραμμές με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης του EGFR. Να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, υποκλώνοι του Caco-2, SW480, και WiDr, τα οποία εξέφρασαν τα υψηλότερα επίπεδα του EGFR, ήταν τα πιο ευαίσθητα στις επιδράσεις του cetuximab (Εικ. 4). Ωστόσο, η ανταπόκριση στο cetuximab δεν παρατηρήθηκε σε υποκλώνους από αυτές τις κυτταρικές σειρές που είχαν επίπεδα έκφρασης χαμηλά EGFR. Υποκλώνους του HCT116, η οποία με τη μαζική κουλτούρα έδειξε ελάχιστη ανταπόκριση στο cetuximab, δεν απάντησε στο cetuximab αν είχαν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης του EGFR.

Όταν το cetuximab χορηγήθηκε σε χαμηλή υποκλώνους CRC με χαμηλή έκφραση του EGFR, αδύναμη παρατηρήθηκε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Ωστόσο, η αύξηση των υποκλώνων με υψηλή EGFR ήταν έντονα αναστέλλεται σε σύγκριση.

Η

Ευαισθησία στο cetuximab σε ξενομοσχεύματα της υποκλωνοποιήθηκε CRC Γραμμές κυττάρων

Κάθε ένα από τα υποκλωνοποιημένο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από WiDr και SW480 υποδορίως εμβολιάζεται σε γυμνά ποντίκια (cetuximab, 30 mg /kg εβδομαδιαίως για 4 εβδομάδες), και η διαφορά της ευαισθησίας στο cetuximab εκτιμήθηκε

in vivo

. Το cetuximab ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων WiDr που εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του EGFR κατά 35% σε σύγκριση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια. Σε αντίθεση, το cetuximab θεραπεία ενός υποκλώνου WiDr που εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα EGFR ανεστάλη κατά 20% σε σύγκριση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια (Σχ. 5Α).

(Α) Ξενομοσχεύματα που προέρχεται από κύτταρα WiDr υποκλώνο που έλαβαν θεραπεία με cetuximab. Ισχυρή αναστολή ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε όγκους που προέρχονται από υποκλώνους με υψηλή έκφραση του EGFR σε σχέση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια? Ωστόσο, παρατηρήθηκε μόνο ελαφρά αναστολή της ανάπτυξης του όγκου που προκαλείται από ξενομοσχεύματα υποκλώνων με χαμηλή έκφραση EGFR. (Β) θεραπεία με cetuximab των όγκων που προέρχονται από ξενομοσχεύματα κυττάρων SW480 υποκλώνων. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε όγκους που προέρχονται από ξενομοσχεύματα SW480 δηλαδή, ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των όγκων που προέρχονται από υποκλώνους με υψηλή έκφραση του EGFR σε σύγκριση με υποκλώνους με χαμηλή έκφραση EGFR. (Γ) σύγκριση του μεγέθους του όγκου την ημέρα 28. Οι όγκοι που προέρχονται από υποκλώνους με υψηλή έκφραση του EGFR ήταν σημαντικά μικρότερες σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με cetuximab σε σύγκριση με όγκους που προέρχονται από υποκλώνους με χαμηλή έκφραση EGFR. (Δ) Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική χρώση της έκφρασης 3+ EGF-R (i? Α431), η έκφραση 2+ EGF-R (ii? WiDr Υψηλή και iii? SW480 High) και 1+ έκφραση EGF-R. (Iv? WiDr χαμηλό και ν? SW480 Low). Σε υποδόριο όγκο μεταμόσχευση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του κόλου

Η

Ξενομοσχεύματα που προέρχονται από υποκλώνους SW480 που εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του EGFR ανεστάλησαν κατά 35% σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ποντίκια. Ωστόσο, ξενομοσχεύματα που προέρχονται από sublcones SW480 που εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα EGFR ανεστάλησαν μόνο κατά 7% σε σχέση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια (Σχ. 5Β).

Για όγκων που διεγείρονται από υποκλώνων που προέρχονται από WiDr ή καλλιέργειες SW480, ο όγκος του όγκου των ομάδων που έλαβαν θεραπεία με cetuximab συγκρίθηκε με εκείνη των μη επεξεργασμένων ομάδων μετά από 28 ημέρες (Σχ. 5C). Ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μικρότερη στις ομάδες που έλαβαν cetuximab που μεταμοσχευμένα με κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του EGFR. Σε αντίθεση, το cetuximab αγωγή δεν προκάλεσε καμία σημαντική διαφορά στον όγκο του όγκου που προκαλείται από υποκλώνους που εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα του EGFR.

Με βάση την ανοσοϊστοχημική χρώση, υποδόρια μεταμόσχευση του όγκου του Α431, θετικός έλεγχος έδειξε 3+ εκφράσεις EGFR , ενώ υψηλή WiDr και SW480 είχε 2+ εκφράσεις EGFR. Σε αντίθεση, η χαμηλή WiDr και SW480 όγκων έδειξαν λιγότερη έκφραση EGF-R (σχ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι όγκοι μετά τη θεραπεία εξακολουθεί να εκφράζουν EGFR.

Συζήτηση

Το cetuximab, ένα χιμαιρικό αντίσωμα IgG 1 που στοχεύει EGFR, εισήχθη για την αντιμετώπιση mCRC. Για την αναγνώριση των ασθενών που θα ωφεληθούν περισσότερο από αυτή τη βιολογική θεραπεία, η ανίχνευση του

KRAS

μεταλλάξεις προτάθηκε ως κύριο βιοδείκτη [11], [26], [27]. Ογκογόνων μεταλλάξεων του

KRAS

παρατηρούνται σε περίπου 40% (20% -50%) των σποραδικών CRC [28] – [31]. Οι μεταλλάξεις προκαλούν συστατική ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Ras /Raf /ΜΑΡΚ, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση του EGFR με συνδέτη πρόσδεσης [32]. Karapetis

et al

. ανέφεραν σημαντική βελτίωση σε ασθενείς με άγριου τύπου

KRAS

στην ανταπόκριση στη θεραπεία με cetuximab [12].

Κατάσταση EGFR αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση θεωρείται μια άλλη βιοδείκτη για την αποτελεσματικότητα των αντι-EGFR θεραπείες . Έτσι, το επίπεδο έκφρασης EGFR αναμενόταν να συσχετίζεται με την ευαισθησία και την αποτελεσματικότητα του cetuximab. Παρά αυτήν την υπόθεση, τα αποτελέσματα από μια σειρά μελετών δείχνουν ότι το καθεστώς EGFR και το επίπεδο έκφρασης του προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση δεν μπορεί να αντιστοιχεί στην αποτελεσματικότητα του αντι-ΕΟΡΚ θεραπεία [8], [16] – [18]. Έτσι, μια απάντηση σε cetuximab ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με μη ανιχνεύσιμο έκφραση EGFR ογκο-ειδικά, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η απάντηση στην cetuximab είναι ανεξάρτητη της έκφρασης EGFR σε ιστό όγκου [18].

τον εντοπισμό πρόσθετων γενετικών καθοριστικούς παράγοντες της πρωτοβάθμιας αντίστασης σε EGFR-στοχευμένες θεραπείες στο CRC αποτελεί σαφώς προτεραιότητα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι το επίπεδο έκφρασης EGFR, το οποίο ανιχνεύεται με cetuximab συσχετίζεται με την αποτελεσματικότητα του cetuximab θεραπείας. Περαιτέρω, η εκτίμηση της έκφρασης του EGFR χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο μέθοδο cetuximab μπορεί να προβλέψει το κλινικό όφελος της θεραπείας με cetuximab. Εδώ έχουμε καταδείξει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών CRC ήταν ιδιαίτερα αναστέλλεται σε κύτταρα που εξέφραζαν EGFR σε υψηλά επίπεδα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα επίπεδα έκφρασης του EGFR ανιχνεύεται με cetuximab συσχετίζεται με την ευαισθησία των κυττάρων σε θεραπεία με cetuximab. Η αποτελεσματικότητα του cetuximab σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος εξετάστηκε επίσης με σύγκριση ξενομοσχευμάτων CRC κυτταρικές σειρές υποκλώνους που εξέφρασαν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα EGFR. Μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης των όγκων παρατηρήθηκε σε όγκο που προκαλείται από υποκλώνους με υψηλή έκφραση του EGFR σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή έκφραση EGFR. Ωστόσο, δεν είμαστε ενήμεροι για τυχόν αναφορές που δείχνουν ότι η ανίχνευση των EGFR με cetuximab συνδέεται με την ευαισθησία της CRC για θεραπεία με cetuximab. Παρά το γεγονός ότι περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να καθορίσει τη σχέση μεταξύ της έκφρασης του EGFR και την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στο cetuximab, το παρόν τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μέθοδός μας για την ανίχνευση της έκφρασης EGFR με cetuximab μπορεί να παρέχει ένα νέο βιοδείκτη.

Έχουμε επιλέξει τέσσερις CRC κυτταρικές σειρές, Caco-2, WiDr, SW480 και HCT116 για παρούσας μελέτης μας. Αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές άλλες προηγούμενες μελέτες για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του cetuximab θεραπείας. Ερευνήσαμε επίσης την παρουσία των μεταλλάξεων στο

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, και εξωτερικός τομέας EGFR (Πίνακας 1). Μια ισχυρή απόκριση στο cetuximab παρατηρήθηκε στα κύτταρα Caco-2, η οποία έλειπε ανιχνεύσιμη μεταλλάξεις σε αυτά τα τρία γονίδια? Ωστόσο, μια απόκριση ανιχνεύθηκε επίσης σε SW480 κύτταρα, που φιλοξενεί ένα

KRAS

και μετάλλαξης PIK3CA. Κατ ‘αρχάς, όσον αφορά την

KRAS

μετάλλαξη, η αποτελεσματικότητα του cetuximab συνδέεται με μεγαλύτερη συνολική και επιβίωση χωρίς εξέλιξη μεταξύ των ασθενών με χημειοθεραπεία πυρίμαχα καρκίνο του παχέος εντέρου με όγκους p.G13D μεταλλαγμένο από ό, τι με άλλους όγκους KRAS μεταλλαγμένο [23 ]. Δεύτερον, όσον αφορά μετάλλαξη PIK3CA, Ogino

et al.

Ανέφεραν ότι

PIK3CA

μεταλλάξεις που συνδέονται με μικρότερη καρκίνο ειδική επιβίωση σε ασθενείς με όγκους KRAS άγριου τύπου σε μια σειρά σταδίου Ι-ΙΙΙ του παχέος καρκίνων [21]. Ωστόσο, De Roock

et al.

Αναφέρθηκε για πρώτη φορά ότι οι PIK3CA εξόνιο 20 μεταλλάξεις που σχετίζονται με χειρότερα αποτελέσματα σε σύγκριση με τα άγρια ​​είδη, ενώ το εξόνιο 9 μετάλλαξη βρέθηκε να έχει καμία επίδραση [22]. Από αυτές τις προηγούμενες εκθέσεις, τα αποτελέσματά μας ήταν σύμφωνα με αυτά μιας άλλης μελέτης που δείχνει ότι το cetuximab αποτελεσματική σε SW480, η οποία έχει KRAS κωδικόνιο 13 μετάλλαξης και PIK3CA εξόνιο 9 μετάλλαξη, ενώ καμία θετική επίδραση παρατηρήθηκε σε HCT116 με PIK3CA εξόνιο 20 μετάλλαξη.

Μελετήσαμε επίσης τα κύτταρα WiDr και SW480 CRC να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του cetuximab αποτελεσματικότητα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι μια ισχυρή ή ήπια αντίδραση στο cetuximab σε ποντίκια μεταμοσχευμένα με είτε WiDr ή SW480. Caco-2, η οποία έδειξε ισχυρή απάντηση στο cetuximab, χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη δημιουργία μοντέλο ξενομοσχεύματος? ωστόσο απέτυχε να εμφυτευθούν τα ποντίκια. Η ανάπτυξη των όγκων που προέρχονται από τα ξενομοσχεύματα WiDr και SW480 ήταν ιδιαίτερα αναστέλλεται όταν υποκλώνους επέδειξαν υψηλή έκφραση του EGFR σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή έκφραση EGFR. Αυτό υποδηλώνει ότι η διαφορά στην ποσότητα του EGFR σχετίζεται με cetuximab ευαισθησία. Ωστόσο, ένας περιορισμός αυτής της μελέτης είναι ότι υπάρχει μια πιθανότητα μεταβολών στο επίπεδο έκφρασης EGFR κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου. Παρά το γεγονός ότι η νέα μέθοδος μας για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του EGFR χρησιμοποιώντας cetuximab απαιτεί περαιτέρω επικύρωση ως βιοδείκτη της αποτελεσματικότητας του αντι-EGFR θεραπείας, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του EGFR σχετίζεται με την ευαισθησία της CRC στο cetuximab.

Οι προφανείς διαφορές μεταξύ τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μας και αυτών που έχουν αναφερθεί προηγουμένως μπορεί να εξηγηθεί ως εξής: Πρώτον, EGFR εκφράζεται σε 40% -70% των καρκίνων του παχέος, και τα στοιχεία δείχνουν μια συσχέτιση με την επιβίωση [33] – [35]. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της ποσότητας των EGFR σε ορθοκολικούς καρκίνους περιλαμβάνουν ανοσοϊστοχημεία, δέσμευσης συνδέτη, ανοσοστύπωση, φθορισμός σε ανάλυση υβριδισμού επί τόπου και μία ποικιλία μοριακών τεχνικών [36]. Ωστόσο, η εκτίμηση της έκφρασης EGFR μπορεί να επηρεαστεί από ανοσοαντιδραστικότητα των φυσιολογικών ιστών, διαφορική EGFR αντιδραστικότητα νεοπλασμάτων από διαφορετικές περιοχές του εντέρου, και ετερογένεια της αντιδραστικότητας εντός του ίδιου του ορθοκολικού καρκινώματος [17], [37]. Δεύτερον, Scartozzi

et al.

Ανέφεραν ότι κατάσταση EGFR σε πρωτογενή ορθοκολικά νεοπλάσματα διαφέρει από εκείνη των μεταστατικών τόπων [38]. Τρίτον, Montagut

et al.

Ανέφεραν ότι EGFR S492R μετάλλαξη εξωτομέα αποτρέπει σύνδεση cetuximab και προσδίδει αντίσταση στην cetuximab [19]. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η ποσοτικοποίηση του EGFR χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοϊστοχημείας ανιχνεύει είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο EGFR που δεν δεσμεύουν cetuximab. Ως εκ τούτου, η νέα μέθοδος μας μπορεί να λύσει αυτό το πρόβλημα, διότι εξαρτάται από την ικανότητα του cetuximab για την ανίχνευση της έκφρασης EGFR.

Πολλές κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα της προσθήκης cetuximab σε θεραπεία για mCRC [7], [8], [39]. Van Cutsem

et al

. πραγματοποιήθηκε μια μελέτη φάσης III της θεραπείας πρώτης γραμμής, στην οποία το cetuximab προστέθηκε στον FOLFIRI και 5-FU χημειοθεραπεία βασισμένη σε πολλαπλά φάρμακα με ιρινοτεκάνη [40]. Η προσθήκη του cetuximab συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση στη διάμεση επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με το χωρίς cetuximab. Jonker

et al

., Σε μια άλλη μελέτη φάσης ΙΙΙ, σε σύγκριση με θεραπεία με αντι-EGFR αντισώματος με την καλύτερη υποστηρικτική φροντίδα σε ασθενείς [10]. Σε αυτή τη μελέτη, το cetuximab προστέθηκε μαζί με την καλύτερη υποστηρικτική φροντίδα και συνδέθηκε με σημαντικές βελτιώσεις σε σύγκριση μόνο με την καλύτερη υποστηρικτική φροντίδα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από την πλειοψηφία των μελετών δείχνουν μια τάση προς καλύτερη επιβίωση, αν η χημειοθεραπεία συνδυάστηκε με cetuximab, αλλά δεν αποκάλυψαν σημαντική επίδραση στη θεραπεία CRC.

Το ποσοστό ανταπόκρισης της θεραπείας με cetuximab για CRC είναι 30% -40 % [10]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι

KRAS

μεταλλάξεις είναι οι πιο αποτελεσματικές προγνωστικούς παράγοντες για την επιλογή των ασθενών που θα ωφεληθούν από τη θεραπεία? Ωστόσο, αυτές οι μεταλλάξεις, από μόνα τους, δεν εντοπίσει τα καλύτερα ανταποκρίθηκαν. παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι αυτή η νέα μέθοδος για την ανίχνευση EGFR χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο cetuximab μπορεί να παρέχει ένα μέσο για την ανίχνευση εξαιρετικά ευαίσθητους ασθενείς με άγριου τύπου

KRAS

. Παρά το γεγονός ότι περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να αξιολογήσει την υπόθεσή μας, η τεχνική που περιγράφεται εδώ μπορεί να παρέχει μια πιο συγκεκριμένη ένδειξη για την εφαρμογή της θεραπείας του CRC με cetuximab.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του EGFR, η οποία ανιχνεύθηκαν με cetuximab, μπορεί να συσχετίζεται με την ευαισθησία προς cetuximab μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να παρέχει μια νέα μέθοδο για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του EGFR, επιτρέποντας έτσι την πιο αποτελεσματική επιλογή των ασθενών CRC που θα ωφεληθούν από θεραπεία με cetuximab.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω H.