Αφηρημένο

Η αγγειογένεση και τον καρκίνο εισβολής συμβάλλουν σημαντικά στην κακοήθεια του καρκίνου.

ARF6 και τελεστές της, AMAP1, συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού, και αποτελούν ένα κεντρικό μονοπάτι για να προκαλέσει την εισβολή και μετάσταση. Σε αυτή την οδό, ARF6 ενεργοποιείται από EGFR μέσω GEP100. ARF6 εκφράζεται έντονα επίσης σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) και εμπλέκεται στην αγγειογένεση. Εδώ, βρήκαμε ότι HUVECs επίσης εξαιρετικά ρητή AMAP1, και ότι αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα του υποδοχέα-2 (VEGFR2) στρατολογεί GEP100 να ενεργοποιήσετε ARF6. AMAP1 λειτουργίες με σύνδεση προς cortactin σε εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Έχουμε αποδείξει ότι η ίδια GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin οδός είναι απαραίτητη για τις δραστηριότητες της αγγειογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης των κυττάρων και σωληνοειδή διαμόρφωση, καθώς επίσης και για την ενίσχυση της διαπερατότητας των κυττάρων και VE-cadherin ενδοκυττάρωση του VEGF διεγείρεται HUVECs. Συστατικά αυτού του μονοπατιού είναι εντόνως εκφρασμένη σε παθολογική αγγειογένεση και μπλοκάρισμα αυτής της οδού αναστέλλει αποτελεσματικά VEGF- ή προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση και νεοαγγείωση του χοριοειδούς. Η GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι, που ενεργοποιείται από υποδοχέα κινασών τυροσίνης, φαίνεται να είναι κοινά στην αγγειογένεση και τον καρκίνο εισβολή και μετάσταση, και παρέχει νέες θεραπευτικές τους στόχους

Παράθεση:. Hashimoto Α, Hashimoto S, Ando R, Noda Κ, Ogawa Ε, Kotani H, et al. (2011) GEP100-ARF6-AMAP1-Cortactin δρόμος χρησιμοποιείται συχνά σε Καρκίνο εισβολή ενεργοποιείται από VEGFR2 να προάγουν την αγγειογένεση. PLoS ONE 6 (8): e23359. doi: 10.1371 /journal.pone.0023359

Επιμέλεια: Toru Ouchi, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Απριλίου του 2011? Αποδεκτές: 13 Ιουλ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 15 του Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Hashimoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (MESSC), το Ίδρυμα Takeda Επιστημών, και το Ίδρυμα της Mitsubishi. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αγγειακά ενδοθηλιακά παράγοντες ανάπτυξης (VEGFs) είναι σημαντικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην αγγειογένεση [1] – [4]. Ένα μέλος της οικογένειας του VEGFs, δηλαδή VEGF-A, αρχικά ανακαλύφθηκε ως παράγοντας αγγειακής διαπερατότητας [5]? και η κύρια λειτουργία της σηματοδότησης VEGF περιλαμβάνει ενίσχυση της διαπερατότητας ενδοθηλιακού κυττάρου και αγγειακή διαρροή [6]. Ένα μικρό ΟΤΡάσης, ARF6, έχει ενοχοποιηθεί σε VEGF σηματοδότησης και της αγγειογένεσης. Έχει δειχθεί ότι η έκφραση της δεσπόζουσας-αρνητική μορφή του ARF6, ARF6 (T27N), σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) αναστέλλει αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα του υποδοχέα-2 (VEGFR2) μεσολάβηση ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, όπως ενεργοποίηση Rac1 [ ,,,0],7]. Σταθερά, η καταστολή της δραστηριότητας ARF6 μέσω του Slit2-Robo4 οδό παρεμποδίζει την αγγειογένεση και προωθεί την αγγειακή σταθερότητα [8]. Ωστόσο, ο μηχανισμός για το πώς VEGFR2 ρυθμίζει δραστικότητα ARF6, καθώς και τους μηχανισμούς με τους οποίους λειτουργεί ARF6 στην αγγειογένεση, αλλά και σε άλλες πτυχές της σηματοδότησης VEGF, παραμένει σε μεγάλο βαθμό ασαφείς.

Ένα μικρό ΟΤΡάσης, ARF6, ρυθμίζει κυρίως την ανακύκλωση των συστατικών μεμβράνης πλάσματος και παίζει πλειοτροπικές ρόλους, συμπεριλαμβανομένων προεξοχή μεμβράνη και την αναδιαμόρφωση [9], [10]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι διαφορετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού υπερεκφράζουν τόσο ARF6 και τελεστή του, AMAP1? και ότι υπερεκφράζεται ARF6 και AMAP1 αποτελούν τότε ένα ισχυρό άξονα σηματοδότησης για να προκαλέσει την εισβολή και τη μετάσταση [11] – [15]. Σε εισβολή και μετάσταση, GEP100, ένα νουκλεοτίδιο γουανίνης εναλλάκτη για ΑΠΦ GTPases, είναι κυρίως υπεύθυνη για την ενεργοποίηση ARF6, και αυτή η ενεργοποίηση απαιτεί τη σύνδεση της GEP100 με υποδοχέα ρίζας συνδέσεως-ενεργοποιημένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [15]. Παθολογική αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα συστατικά αυτής της οδού είναι εντόνως εκφρασμένη σε 40-80% των πρωτογενών όγκων του ανθρωπίνου στήθους [12], [15]. AMAP1 λειτουργίες με σύνδεση προς cortactin σε εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Ο αποκλεισμός της GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι με siRNAs ή αναστολείς εμποδίζει αποτελεσματικά τον καρκίνο του μαστού εισβολή και τη μετάσταση [11] – [13], [15]. Διαβάστε-άουτ της παρούσας ARF6 οδού περιλαμβάνουν τη διάσπαση των συμφύσεων Ε-καδερίνης με βάση κυττάρου-κυττάρου [15], επάγοντας ενδοκύτωση Ε-καδερίνης (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα μας).

Protein έκφραση του ARF6 είναι σημαντικά επαυξημένη σε HUVECs όταν καλλιεργήθηκαν με VEGF, και σε ένα μοντέλο ισχαιμίας οπίσθιων άκρων ποντίκι στο οποίο αγγειογένεση εξαρτάται πρωτίστως από VEGF [7], [16]. Εδώ, βρήκαμε ότι HUVECs επίσης εξαιρετικά ρητή AMAP1, συγκρίσιμα με τα επίπεδα που παρατηρούνται σε υψηλά διηθητικού καρκίνου του μαστού κύτταρα. Βρήκαμε επίσης ότι GEP100 φυσικά συνεργάτες με συνδέτη-ενεργοποιημένα VEGFR2 να ενεργοποιήσετε ARF6, και ότι ARF6 στη συνέχεια προσλαμβάνει AMAP1. Όπως εισβολή καρκίνου και μετάσταση, λειτουργίες AMAP1 με σύνδεση προς cortactin στην αγγειογένεση. Αυτό GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι είναι απαραίτητη όχι μόνο για τον VEGF-επαγόμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό σωληνοειδούς, αλλά επίσης και για τον VEGF-επαγόμενη αύξηση της VE-cadherin ενδοκυττάρωση και της διαπερατότητας των κυττάρων. Συστατικά αυτού του μονοπατιού είναι εντόνως εκφρασμένα σε CD31-θετικά αγγεία με την παθολογική αγγειογένεση και αποκλεισμού της οδού αυτής αναστέλλει αποτελεσματικά την παθολογική αγγειογένεση. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι η GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι, ενεργοποιούνται από κινάσες τυροσίνης υποδοχέα παράγοντα ανάπτυξης, είναι κοινή στην αγγειογένεση και εισβολή και μετάσταση ορισμένων καρκινικών κυττάρων του μαστού, και ως εκ τούτου παρέχει νέους θεραπευτικούς στόχους για ανθρώπινη διαταραχών που χαρακτηρίζονται από υπερ-αγγειογένεση και κακοήθεις ανάπτυξη του καρκίνου

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

HUVECs αγοράστηκαν από την Iwaki και αναπτύχθηκαν σε μέσο ενδοθηλιακής ανάπτυξης-2 (EGM2? Lonza)., σύμφωνα με τον κατασκευαστή του εντολή. Σημειώστε ότι EGM2 περιέχει μια χαμηλή συγκέντρωση του VEGF, μια συγκέντρωση η οποία δεν είναι ανοικτή στο κοινό. MDA-MB-231 και MCF7 κύτταρα, που λαμβάνονται από την American Type Culture Collection, καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Cos-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Hyclone).

Η αγγειογένεση

Ποσοτικοποίηση των αγγειογόνων αποκρίσεων πραγματοποιήθηκε με κατευθυνόμενη

in vivo

δοκιμασία αγγειογένεσης (DIVAA, Trevigen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 20 μΙ VEGF (500 ng ml

-1) ή MDA-MB-231 κύτταρα (5 × 10

6 ml

-1) εγχύθηκε σε σωλήνες angioreactor, τα οποία ήταν γεμάτα με υπόγειο μεμβράνη εκχυλίσματα? και σωλήνες στη συνέχεια εμφυτεύονται υποδορίως εντός της ραχιαίας περιοχών γυμνών ποντικών. Εννέα ημέρες αργότερα οι σωλήνες συλλέχθηκαν και οι ποσότητες των ισολεκτίνη Β4 συσσωρευτεί εντός των εκχυλισμάτων βασικής μεμβράνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πολύδισκος φθορισμού αναγνώστη (ARVO, Perkin Elmer), μετά πρωτεολυτική πέψη της βασικής μεμβράνης. Για τη θεραπεία siRNA, RNA διπόλων αναμίχθηκαν με AteloGene (Koken), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή? και 200 ​​μΐ του μίγματος εγχύθηκε μέσα στα κάτω πλευρές των σωλήνων angioreactor εμφυτευμένων σε ποντίκια, την ημέρα 0 και την ημέρα 4. Ρ4-ΤΑΤ πεπτίδιο και το πεπτίδιο ελέγχου SC προστέθηκαν στους σωλήνες angioreactor πριν από την εμφύτευση. Αυτές οι μελέτες έγιναν σε Osaka Bioscience Ινστιτούτο, και τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για πειράματα σε ζώα σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Ερευνών του Animal Osaka Bioscience Ινστιτούτου (αριθμός άδειας: 07-103).

λέιζερ που προκαλείται από CNV

CNV διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18]. Μία ημέρα πριν από τη χορήγηση λέιζερ, 5 mg kg

-1 P4-ΤΑΤ ή πεπτίδιο SC εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε 2-μηνών αρσενικά C57BL /6 ποντίκια (CLEA Japan). Οι επόμενες ποντίκια μέρα αναισθητοποιούνται με πεντοβαρβιτάλη (0,05 mg g

-1 σωματικού βάρους) και οι μαθητές τους διεσταλμένες με 0.5% φαινυλεφρίνης και 0,5% τροπικαμιδίου (Santen). CNV προκλήθηκε με ένα nm λέιζερ 532 (Lumenis Novus Spectra). Τέσσερα σημεία λέιζερ (200 mW ισχύς, 75 μm μέγεθος επιτόπου, 100 msec) τοποθετήθηκαν σε κάθε οφθαλμό, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απελευθέρωσης με σχισμοειδή λυχνία και ένα γυάλινο κάλυμμα ως ένα φακό επαφής. Παραγωγή μιας φυσαλίδας κατά το χρόνο της θεραπείας με λέιζερ, που δείχνει ρήξη της μεμβράνης του Bruch, αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την απόκτηση CNV? Ως εκ τούτου, μόνο καίει στην οποία μια φυσαλίδα παρήχθη συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Αμέσως μετά τη θεραπεία με λέιζερ, 5 mg kg

-1 P4-ΤΑΤ ή ελέγχου κωδικοποιημένο πεπτίδιο εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά κάθε μέρα για 7 ημέρες. Στις πειραματικές ημέρα 8, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και διαποτίστηκαν μέσω της αριστερής κοιλίας με 5 ml PBS που ακολουθείται από 2 ml 0.5% FITC-επισημασμένο δεξτράνης (Mr 2.000 kDa, Sigma) σε 1% ζελατίνη. Οι οφθαλμοί εκπυρηνίστηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Το πρόσθιο τμήμα και αμφιβληστροειδή στη συνέχεια απομακρύνθηκαν από την προπέτεια της οπτικής θηλής. Περίπου 4 έως 6 χαλάρωση ακτινικές τομές έγιναν, και το υπόλοιπο επιθήλιο του αμφιβληστροειδούς χρωστική ουσία (RPE) -choroidal-σκληρού χιτώνα συγκρότημα flatmounted με Vectashield Τοποθέτηση Medium (Dako) και καλύφθηκαν. Flatmounts εξετάστηκαν με ένα μικροσκόπιο (BIOREVO? Keyence) και οι εικόνες κάθε CNV ψηφιακά αποθηκευμένα. Μάτια με αιμορραγικές επιπλοκές όπως αιμορραγία του υαλώδους ή υπαμφιβληστροειδική αιμορραγία που προκαλείται από την ακτινοβολία λέιζερ εξαιρέθηκαν από την αξιολόγηση. Το μέσο μέγεθος των βλαβών CNV μετά μετρήθηκε, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. με

n

όπως υποδεικνύεται. Τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με την Ένωση για την Έρευνα στον Όραμα και Οφθαλμολογίας Δήλωση για τη χρήση ζώων σε οφθαλμολογικό και Όραμα Έρευνα και την επιτροπή των Ζώων χρήση και τη συντήρηση του Πανεπιστημίου Χοκάιντο.

VE-cadherin ενδοκύτωση

VE-cadherin ενδοκυττάρωση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της VE-καντερίνης αντίσωμα δέσμευσης, όπως περιγράφεται [19]. Εν συντομία, HUVECs, εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα συρροής, είχαν prestarved με EGM2 χωρίς ορό για 4 ώρες, και στη συνέχεια επώαση με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα BV6 (10 mg ml

-1), η οποία είναι κατά της εξωκυτταρικής περιοχής του VE-cadherin, στους 4 ° C για 1 ώρα. Μετά την έκπλυση του μη δεσμευμένου αντισώματος με έκπλυση των κυττάρων με παγωμένο EGM2, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά παρουσία ή απουσία VEGF (50 ng ml

-1). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 25 mM γλυκίνη (ρΗ 2.5) που περιέχει 3% αλβουμίνη βόειου ορού για 15 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για την απομάκρυνση της επιφάνειας-συνδεδεμένα αντισώματα, και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100, και υποβλήθηκαν για την επισήμανση των μορίων εσωτερικοποιούνται BV6 με χρήση ενός αντισώματος έναντι IgG ποντικού συζευγμένο με Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). Για τη θεραπεία siRNA, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με διπλά RNA για 48 ώρες, πριν από την επίστρωση. Για τη θεραπεία του πεπτιδίου ΤΑΤ, τα κύτταρα επωάστηκαν με πεπτίδια ΤΑΤ για 30 λεπτά στους 37 ° C μεταξύ της 4 ώρες ασιτία και την επισήμανση με BV6. Ο αριθμός των κυττάρων που εμφανίζουν τουλάχιστον μία ομάδα από πέντε ή περισσότερες οξύ ανθεκτικά VE-cadherin-θετικών κυστίδια όπως δομές μετρήθηκε (n & gt? 300). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, και στατικά ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ANOVA.

Άλλες μέθοδοι

GST-GGA αναπτυσσόμενο, ανοσοκαθίζηση, ανοσοστύπωση, αντισώματα και τα χημικά, cDNA, siRNAs, επιμολύνσεις, σωληνοειδή διαμόρφωση, χημειοτακτική Transwell μετανάστευση, δισδιάστατο κυτταρική μετανάστευση δραστηριότητα ανοσοϊστοχημική χρώση, διαπερατότητα κυττάρου, μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, δεσμευτική GST-PH, βιωσιμότητα και RT-PCR περιγράφονται στις Βοηθητικές Υλικά και Μέθοδοι S1.

Αποτελέσματα

Ο VEGF ενεργοποιεί ARF6 μέσω GEP100 στα ενδοθηλιακά κύτταρα

αν και ARF6 δραστηριότητα εμπλέκεται σε VEGF σηματοδότησης και αγγειογένεση, αυτό δεν έχει ακόμη αποδειχθεί αν VEGF ενεργοποιεί ARF6. Βρήκαμε ότι η διέγερση του πρωτογενούς καλλιέργειας του HUVECs με VEGF πράγματι επαγόμενη ενεργοποίηση του ενδογενούς ARF6 (Σχήμα 1Α). Η ενεργοποίηση αυτή ήταν παροδική, έφτασε στο 1 λεπτό και στη συνέχεια μειώθηκε, όπως παρατηρείται με άλλα μικρά GTPases [20]. HUVECs εκφράζουν κυρίως VEGFR2 μεταξύ των μελών VEGFR-οικογένειας. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης του VEGFR2 εμφανίστηκε εντός 1 λεπτού, κορυφώθηκε σε 3 λεπτά και μειώθηκε κατά 10 λεπτά μετά την διέγερση (Σχήμα 1Α).

Α, η ενεργοποίηση του ARF6 και φωσφορυλίωση τυροσίνης του VEGFR2 κατόπιν VEGF διέγερση του HUVECs. Β, συγκαθίζηση GEP100 με VEGFR2 κατόπιν VEGF διέγερση του HUVEC, αναλύθηκαν με αντι-GEP100 ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και αντι-VEGFR2 ανοσοστυπώματος. ΡΙ, προ-άνοσο ορό. C-D, Δραστηριότητες ARF6 (C), και Erk και Akt (D) σε HUVECs επιμολυσμένα με τα siRNA για GEP100 ή άσχετη αλληλουχίες (IRR) κατά τη διέγερση του VEGF. Ε, συγκαταβύθιση VEGFR2-V5 και τυροσίνης της φωσφορυλίωσης ελλειμματικών μεταλλακτών (951F, 1175F και 1214F) με ΗΑ-GEP100 εκφράζονται σε κύτταρα Cos-7, αναλύθηκαν με αντι-ΗΑ (GEP100) ανοσοκατακρήμνιση και αντι-V5 (VEGFR2) ανοσοστυπώματος. F, Η ενεργοποίηση του ARF6-ΗΑ με VEGFR2-V5 ή μεταλλάξεις του (951F, 1175F και 1214F) κατά τη διέγερση VEGF σε κύτταρα Cos-7, στην οποία GEP100 cDNA μη-tagged ήταν ταυτοχρόνως επιμολυνθεί. Σε Α-Ρ, 10 ng ml

-1 VEGF χρησιμοποιήθηκε για διέγερση για 1 λεπτό (+) ή για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, ενώ έλεγχοι περιελάμβαναν κύτταρα χωρίς διέγερση (0 min ή -). δραστηριότητες ARF6 αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο GST-GGA κυλιόμενο (A, C, F). Total, συνολικά κυτταρολύματα (20 μα). In A-D, HUVECs καλλιεργήθηκαν σε χαμηλό ορό (0,5% FCS) μέσο για 16 ώρες πριν από τη διέγερση. Αυτές οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον δύο φορές και αντιπροσωπευτικά στοιχεία εμφανίζονται.

Η

Αν και οδών σηματοδότησης κατάντη του VEGFR2 έχουν μελετηθεί εκτενώς [21], κανένας από αυτούς δεν θα μπορούσε να ερμηνεύσει τους μηχανισμούς ενεργοποίησης ARF6. Επιπλέον, περισσότερο από το ένα μόνο τύπο GEF να ενεργοποιήσετε ARF6 [22], [23]. Στη συνέχεια προσπάθησε να εντοπίσει GEF (ες) κατά κύριο λόγο υπεύθυνη για αυτή την επαγόμενη από VEGF ενεργοποίηση ARF6. GEP100 δεσμεύεται με φωσφορυλιωμένη τυροσίνη EGFR [15]. Δοκιμάσαμε αν GEP100 συνδέεται επίσης με φωσφορυλιωμένη τυροσίνη VEGFR2, και βρήκαν ότι VEGFR2 συγκαταβυθίζεται με GEP100 σε HUVECs ενδογενώς, όταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν με VEGF (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια χτύπησε κάτω GEP100 με τη μέθοδο siRNA σε HUVECs, και βρήκαν ότι αυτή η knockdown καταργήθηκε σε μεγάλο βαθμό την επαγόμενη από VEGF ενεργοποίηση του ARF6 (Εικόνα 1C και Εικόνα S4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GEP100 είναι ο κύριος υπεύθυνος για την επαγόμενη από VEGF ενεργοποίηση ARF6 σε HUVECs.

σηματοδότηση VEGF είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν Erk και Akt [21]. Αποσιώπηση του GEP100 δεν επηρεάζει την ενεργοποίηση του Erk και Akt σε HUVECs (Εικόνα 1D). Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω, επιβεβαιώνουν την ιδιαιτερότητα της GEP100 στη σηματοδότηση του VEGF, και δείχνουν ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι του VEGF που ενεργοποιεί ARF6 είναι ανεξάρτητη από εκείνη την ενεργοποίηση Erk και Akt σε HUVECs. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του Erk και Akt τόσο συμβαίνουν 10 λεπτά μετά τη διέγερση του VEGF, η οποία είναι πολύ πιο αργή από την ενεργοποίηση του ARF6.

Τρόπος δέσμευσης GEP100 προς συνδετήρα-ενεργοποιημένη VEGFR2

Στη συνέχεια ερευνήσαμε ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ενεργοποιείται από συνδετήρα VEGFR2 απασχολεί GEP100. Η περιοχή ΡΗ του GEP100 συνδέεται με ορισμένες φωσφορυλιωμένη τυροσίνες του EGFR [15]. Εξετάσαμε πρώτα εάν αυτή η περιοχή ΡΗ συνδέεται επίσης με φωσφορυλιωμένη τυροσίνες του VEGFR2. Για το σκοπό αυτό, εκφράσαμε V5-tagged VEGFR2 σε κύτταρα Cos-7, και προϊόντα λύσης τους τραβήχτηκαν προς τα κάτω

in vitro

με την περιοχή ΡΗ του GEP100, συγχωνευμένο με γλουταθειόνη-

s

-transferase (GST). Βρήκαμε ότι η περιοχή ΡΗ GST-GEP100 γκρεμίζει συνδέτη-ενεργοποιημένα VEGFR2-V5, ενώ PH τομείς της ARNO ή φωσφολιπάση οδ όχι (Σχήμα S1). VEGFR2 έχει 6 μεγάλες τυροσίνες, φωσφορυλιωμένη μετά από διέγερση VEGF: Tyr951, Tyr996, Tyr1054, Tyr1059, Tyr1175 και Tyr1214 [21] (βλέπε σχήμα S2). Συνθέσαμε αυτά τα πεπτίδια τυροσίνης σε φωσφορυλιωμένη μορφή τους, και βρήκαν ότι ο τομέας ΡΗ GST-GEP100 προσδένεται στο πεπτίδιο φωσφορυλιωμένο Tyr951, αλλά όχι στα άλλα φωσφορυλιωμένα πεπτίδια (Σχήμα S3). Επιπλέον, η περιοχή ΡΗ GST-GEP100 δεν συνδέεται προς το μη φωσφορυλιωμένο Tyr951 πεπτίδιο (Σχήμα S3). Επιβεβαιώσαμε φωσφορυλίωση Tyr951 κατά τη διέγερση VEGF σε HUVECs (Σχήμα S5).

Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, τότε δημιουργείται μία μεταλλαγμένη μορφή της VEGFR2-V5, στην οποία Tyr951 αλλάχθηκε σε φαινυλαλανίνη (951F) και εξέφρασε την σε Cos-7 κύτταρα μαζί με αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) ταμπέλα σήμα GEP100, και βρήκαν ότι αυτό το μετάλλαγμα δεν συγκαταβυθίζεται με HA-GEP100 (Σχήμα 1 Ε). Ως μάρτυρας, μας επιβεβαίωσε ότι άγριου τύπου VEGFR2-V5 συγκαταβυθίζεται με HA-GEP100 (Σχήμα 1Ε). Επιπλέον, οι μεταλλάξεις των άλλων τυροσίνες, όπως Tyr1175 και Tyr1214, σε φαινυλαλανίνη (1175F και 1214F, αντίστοιχα) δεν επηρέασε την συνιζηματοποίηση (Σχήμα 1 Ε). Εμείς στη συνέχεια εκφράζονται VEGFR2-V5 ή μεταλλάκτες της μαζί με ARF6-ΗΑ και GEP100 σε κύτταρα Cos7, και μετρήθηκαν οι δραστηριότητες του ARF6-ΗΑ με χρήση της μεθόδου GST-GGA αναπτυσσόμενο [24]. Βρήκαμε ότι η 951F μετάλλαξη του VEGFR2-V5 δεν επάγει την ενεργοποίηση του ARF6-ΗΑ σε απόκριση σε VEGF, ενώ η 1175F και 1214F μεταλλάξεις, καθώς και άγριου τύπου VEGFR2-V5, επάγει ενεργοποίηση ARF6-ΗΑ (Σχήμα 1 F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι VEGFR2 φυσικώς συνδέεται με GEP100 να ενεργοποιήσει ARF6 κατά τη διέγερση VEGF: μια ένωση η οποία απαιτεί την πρόσδεση της φωσφορυλιωμένης Tyr951 του VEGFR2 και του χώρου ΡΗ του GEP100. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η Tyr951-φωσφορυλιωμένη μορφή της VEGFR2 συγκαταβυθίζεται με GEP100 από HUVECs ενδογενώς, κατά την διέγερση VEGF (Εικόνα S2).

Απαίτηση για ARF6 σε σωληνοειδή σχηματισμό επαγόμενη από VEGF και της μετανάστευσης

Tubular (ή τριχοειδή παρόμοια) σχηματισμός δίκτυο του HUVECs καλλιεργήθηκαν

in vitro

είναι ένα από τα σφραγίδα επεξεργάζεται αναγκαία για την αγγειογένεση [1], [2]. Για να εξεταστεί η συμμετοχή των ARF6 σε επαγόμενη από VEGF αγγειογένεση, μπορούμε στη συνέχεια εξέτασαν τα αποτελέσματα ARF6 siRNA. Knockdown του ARF6 εξασθενημένη σημαντικά την επαγόμενη από VEGF σωληνοειδή διαμόρφωση, σε σύγκριση με τον έλεγχο άνευ σημασίας δίπολα RNA (IRR) (Σχήμα 2Α και το Σχήμα S4), χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 2Β). κύτταρο μεταναστευτική δραστηριότητα που επάγεται με VEGF είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της αγγειογενετικής δραστηριότητας [25]. θεραπεία ARF6 siRNA καταργηθούν δραστηριότητες trans-μετανάστευση επαγόμενη από VEGF σχεδόν εντελώς, τα οποία αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τροποποιημένους θαλάμους Boyden [26] (βλέπε Σχήμα 2C). δραστηριότητες δισδιάστατη μετανάστευση επαγόμενη από VEGF, αξιολογείται από την επουλωτική των πληγών δοκιμασίας [27], επίσης σχεδόν εντελώς αποκλεισμένη από επεξεργασία ARF6 siRNA (Σχήμα 2D).

HUVECs, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με siRNAs για ARF6 ή άσχετη αλληλουχίες ( IRR), υποβλήθηκαν σε δοκιμασία σχηματισμού σωληνωτού δικτύου με την παρουσία 10 ng ml

-1 VEGF (Α), σε μια δοκιμασία βιωσιμότητας (Β), και σε μία δοκιμασία μετανάστευσης χρήση ενός τροποποιημένου θαλάμου Boyden (Γ) ή χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία επούλωσης πληγών (D) υπό την παρουσία και απουσία του VEGF (10 ng ml

-1). Σε Α και D, δοκιμασίες διεξήχθησαν περισσότερες από δύο φορές, και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες που εμφανίζονται. Στην Β, πάνω από 1 × 10

4 κύτταρα που θα σημειωθούν σε κάθε δοκιμασία. Στην C, τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο αριθμός των κυττάρων που παρατηρούνται ανά μικροσκοπικό πεδίο (χ 20), η οποία transmigrated το φίλτρο θαλάμου Boyden. Έξι πεδία μετρήθηκαν σε κάθε δοκιμασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± SEM, n = 3. * ρ & lt?. 0.05

Η

Υψηλά επίπεδα έκφρασης AMAP1 σε HUVECs και τη συμμετοχή των GEP100 και AMAP1 στην αγγειογενετική δραστηριότητα του VEGF-επαγόμενη

AMAP1 είναι ένας καθοδικός τελεστής για ARF6, και λειτουργεί σε εισβολή καρκίνου και μετάσταση [12]. Τα περισσότερα κακοήθη κύτταρα καρκίνου του μαστού με υψηλό επεμβατικές δραστηριότητες υπερεκφράζουν ασυνήθιστα τόσο ARF6 και AMAP1 πρωτεΐνες, ενώ του χαλαρά ή μη διηθητικού καρκίνου του μαστού κύτταρα εκφράζουν μόνο οριακά επίπεδα αυτών των δύο πρωτεϊνών [11], [12]. HUVECs είναι γνωστό ότι εκφράζουν ARF6 σε υψηλό επίπεδο [7], το οποίο βρέθηκε να είναι σχεδόν ισοδύναμη με εκείνη που παρατηρήθηκε με ιδιαίτερα επεμβατική MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού (Σχήμα 3Α). HUVECs εκφράζουν επίσης AMAP1 σε πολύ υψηλό επίπεδο, το οποίο είναι επίσης συγκρίσιμη με MDA-MB-231 κύτταρα (Εικόνα 3Α).

Α, Έκφραση ARF6 και AMAP1 πρωτεϊνών στο HUVECs και η σύγκριση της με εκείνες στην επεμβατική ( MDA-MB-231) και μη επεμβατική (MCF7) κύτταρα καρκίνου του μαστού, με ανοσοστύπωση 20 μg συνολικού κυτταρολυμάτων χρησιμοποιώντας αντισώματα όπως υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Β-Ε, HUVECs, κατεργάζεται με siRNAs για GEP100, AMAP1, cortactin ή άσχετες αλληλουχίες (IRR), υποβλήθηκαν σε δοκιμασία σωληνοειδή σχηματισμό (Β), τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden (C), τραύματος δοκιμασία (D) ή την κυτταρική βιωσιμότητα επούλωση δοκιμασία (Ε), όπως στο Σχήμα 2. AMAP2 siRNAs συμπεριλήφθηκαν ως άλλο έλεγχο (Β, Ε). Αυτές οι δοκιμασίες διεξήχθησαν τουλάχιστον δύο φορές, και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες που εμφανίζονται. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± s.e.m., n = 3. * ρ & lt?. 0.05

Η

εξεταστεί αν GEP100 και AMAP1 εμπλέκονται στην αγγειογενετική δραστηριότητα του VEGF-επαγόμενη

in vitro

. Εξόντωση GEP100 και AMAP1 κάθε επηρεάζεται σημαντικά την επαγόμενη από VEGF σχηματισμός σωληνοειδή, και σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη μεταναστευτικών δραστηριότητες που επάγεται με VEGF κυττάρων (Σχήμα 3Β-3D και το σχήμα S4), χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 3Ε). Ως μάρτυρας, μπορούμε επίσης γκρέμισε AMAP2 [28] (βλέπε σχήμα S4), μια στενή ισομορφή AMAP1, και δεν τήρησε μια ανασταλτική επίδραση στην σωληνοειδή σχηματισμό (Εικόνα 3Β).

Απαίτηση για cortactin και της σύνδεσης με AMAP1 σε αγγειογόνο δραστηριότητες που επάγεται με VEGF

AMAP1 λειτουργίες με σχηματισμό ενός συμπλόκου με cortactin σε διηθητικό καρκίνο του μαστού κύτταρα [12], [13]. Βρήκαμε ότι AMAP1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με cortactin επίσης σε HUVECs, και αυτό σχηματισμός συμπλόκου αυξήθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με VEGF (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, cortactin siRNAs αποτελεσματικά ανέστειλε την επαγόμενη από VEGF αγγειογενετική δραστηριότητα

in vitro

, χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 3Β και 3Ε).

Α, συγκαθίζηση cortactin με AMAP1 σε HUVECs καλλιεργήθηκαν παρουσία 10 ng ml

-1 VEGF, αναλύθηκαν με αντι-AMAP1 ανοσοκαταβύθιση και αντι-cortactin ανοσοαποτύπωμα, όπως υποδεικνύεται. ΡΙ, προ-άνοσο ορό. Β-D, HUVECs, καλλιεργούνται παρουσία του Ρ4-ΤΑΤ (Ρ4) ή μία διαπερατή κωδικοποιημένο κύτταρο πεπτίδιο (SC) στα 10 μΜ (C, D, F) ή σε συγκεντρώσεις όπως υποδεικνύεται (Β, Ε) για 1 ώρα πριν για ανάλυση, υποβλήθηκαν σε δοκιμασία σωληνοειδή σχηματισμό (Β), τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden (C), επούλωση δοκιμασία (D) και δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (Ε), θεραπεύοντας όπως στο σχήμα 2, με την παρουσία των πεπτιδίων. Συγκαταβύθιση cortactin με AMAP1 σε αυτά τα κύτταρα αναλύθηκε ως ανωτέρω (F). Total, συνολικά κυτταρολύματα (20 μα). Αυτές οι δοκιμασίες διεξήχθησαν τουλάχιστον δύο φορές, και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες που εμφανίζονται. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± sem, η = 3. * ρ & lt?. 0.05

Η

προηγουμένως Σχεδιάσαμε ένα κύτταρο-διαπερατό πεπτιδίου, δηλαδή P4-ΤΑΤ, που μπλοκάρει AMAP1 και cortactin δέσμευσης, και ως εκ τούτου αναστέλλει τον καρκίνο εισβολή και μετάσταση [13]. P4-ΤΑΤ, αλλά όχι ο έλεγχος περιπλεγμένο ΤΑΤ-πεπτίδιο (SC), μπλοκάρει την επαγόμενη από VEGF αγγειογενετική δραστηριότητα

in vitro

, όπως σωληνοειδή σχηματισμό και τη μετανάστευση των κυττάρων, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων ( Εικόνα 4Β-4Ε). Επιβεβαιώσαμε ότι Ρ4-ΤΑΤ, αλλά όχι SC, μπλοκ ενδογενή δέσμευση του AMAP1 με cortactin σε HUVECs (Σχήμα 4F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι λειτουργίες AMAP1 μέσω του σχηματισμού του συμπλόκου με cortactin σε HUVECs, και αυτό το σχηματισμό συμπλόκου είναι αναγκαία για τις αγγειογενετική δραστηριότητα του VEGF-επαγόμενη.

Συμμετοχή του μονοπατιού σηματοδότησης ARF6 στην αγγειογένεση

στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον η GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin οδός που εμπλέκονται στην παθολογική αγγειογένεση

in vivo

. Γι ‘αυτό, εμείς επιβεβαίωσε καταρχάς ότι CD31-θετικά παθολογικών αιμοφόρων [16] είναι έντονα θετικό για GEP100 και AMAP1 (Σχήμα 5Α). Αντισώματα έναντι ARF6 ισχύουν για ανοσοϊστοχημεία δεν ήταν διαθέσιμα. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε GEP100 siRNAs και Ρ4-ΤΑΤ. Για το σκοπό αυτό, οι σωλήνες angioreactor [29], φορτωμένο με VEGF ή MDA-MB-231 κυττάρων, εμφυτεύθηκαν σε γυμνά ποντίκια, και 9 ημέρες αργότερα μετρήθηκαν οι ποσότητες των ισολεκτίνη Β4 συσσωρευτεί μέσα στους σωλήνες. Τα MDA-MB-231 κύτταρα είναι γνωστό ότι παράγουν διάφορους αγγειογενετικούς παράγοντες [30]. Η χορήγηση GEP100 siRNAs, προ-αναμιγνύεται με AteloGene [31], σε ποντικούς εμφυτεύθηκαν με αυτές angioreactors ανέστειλε την αγγειογένεση τους σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ ένα άσχετο RNA duplex δεν είχε (Σχήμα 5Β και 5D). P4-ΤΑΤ, αλλά όχι SC, ανέστειλε επίσης την αγγειογένεση σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5C και 5Ε).

Α, ανοσοϊστοχημεία ιστού κοκκοποίησης και τομές ιστού ουλής με τη χρήση τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Μπαρ, 100 μm. Β-Ε, μετρήθηκαν Επιδράσεις GEP100 siRNAs και Ρ4-ΤΑΤ (Ρ4) επί της αγγειογένεσης χρησιμοποιώντας angioreactors εμφυτευμένων σε γυμνά ποντίκια, τα οποία περιείχαν εκχυλίσματα βασική μεμβράνη και VEGF (500 ng ml

-1) ή MDA-MB-231 (1 × 10

5 κύτταρα)? και τα ποσά των ισολεκτίνη Β4 συσσωρευτεί εντός των εκχυλισμάτων βασικής μεμβράνης μετρήθηκαν μετά από επώαση για 9 ημέρες. siRNAs, αναμιγνύεται με AteloGene σε συγκεντρώσεις όπως υποδεικνύεται, ενέθηκαν σε ποντικούς την ημέρα 0 και την ημέρα 4. ΤΑΤ-πεπτίδια προστέθηκαν σε angioreactors πριν την εμφύτευση, στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Ένα άσχετο διπλό RNA (IRR) ή ένα κωδικοποιημένο πεπτίδιο (SC) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχοι. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± S.E.M., η = 8. * ρ & lt? 0.05. F-G, Επίδραση της Ρ4-ΤΑΤ για σχηματισμό CNV. Εκπρόσωπος μικρογραφίες των βλαβών CNV σε χοριοειδούς flatmounts από ένα ζώο που έλαβαν θεραπεία με P4-ΤΑΤ ή SC. Κόκκινη διακεκομμένη γραμμή δείχνει την έκταση των βλαβών CNV γεμίζουν με ΡΙΤΟ-δεξτράνη. μπαρ κλίμακα, 100 μm. Ποσοτική ανάλυση του μέσου μεγέθους CNV φαίνεται στο G. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± sem, η = 70 έως 77. * Ρ & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε επιπλέον τις επιδράσεις της Ρ4-ΤΑΤ επί χοριοειδική νεοαγγείωση (CNV), η οποία είναι η κύρια αιτία της σοβαρής απώλειας της όρασης σε ασθενείς με ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας [32], με τη χρήση του λέιζερ προκαλείται χοριοειδική νεοαγγειοποίηση σε ποντικούς [17], [18]. P4-ΤΑΤ ή SC πεπτίδιο εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε ποντικούς καθημερινά από μια ημέρα πριν από τη θεραπεία με λέιζερ μέχρι το τέλος του πειράματος. Εμείς επιλέξαμε ενδο-περιτοναϊκή χορήγηση αντί απευθείας ένεση στα μάτια, για να αποτρέψει τον τραυματισμό τα μάτια από την τελευταία μέθοδο. P4-ΤΑΤ ήταν επίσης αποτελεσματική στην αναστολή CNV (Σχήμα 5F και 5G).

Συμμετοχή του μονοπατιού σηματοδότησης ARF6 σε ενδοθηλιακή διαπερατότητα και VE-cadherin ενδοκυττάρωση

Η πρωταρχική λειτουργία της σηματοδότησης VEGF περιλαμβάνει την προώθηση ενδοθηλιακή διαπερατότητα των κυττάρων και διαρροή των αγγείων. σηματοδότησης VEGF προκαλεί ενδοκυττάρωση της VE-cadherin, και αυτή η ενδοκύττωση είναι ζωτικής σημασίας για την ενίσχυση της ενδοθηλιακής διαπερατότητας [33], [34].

Στη συνέχεια, διερευνάται κατά πόσον η GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι εμπλέκεται επίσης σε ενδοθηλιακά διαπερατότητα και VE-cadherin ενδοκυττάρωση. VEGF ενισχύει την διαπερατότητα του ακέραιου HUVECs κατά δύο φορές, μετρήθηκαν με παρακυτταρικής κίνηση των μορίων δεξτράνης [19], [35] (βλέπε επίσης Σχήμα 6Α). Στη συνέχεια εξέτασαν τις επιδράσεις των siRNAs για GEP100, ARF6 και AMAP1 στην διαπερατότητα. Για siRNAs για να είναι αποτελεσματική σε αυτή τη δοκιμασία, η θεραπεία siRNA πρέπει να ξεκινήσει πριν από 36 ώρες τα κύτταρα επανα-επιστρώνονται επί θαλάμους για να σχηματίσουν συρρέουσες μονοστοιβάδες. Βρήκαμε ότι HUVECs, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυτά τα siRNAs ήδη εμφανίζουν υψηλά επίπεδα διαπερατότητας ακόμη και χωρίς VEGF, και δεν ανταποκρίνονται στη διέγερση VEGF να αλλάξουν τη διαπερατότητα τους, (Σχήμα 6Α). Εμείς επόμενη μετρώνται οι ρυθμοί ενδοκυττάρωση του VE-cadherin, από την μεμβράνη του πλάσματος μέσα στο κυτταρόπλασμα. Επιταχύνει VEGF VE-καντερίνη ενδοκυττάρωση από διάφορους πτυχώσεις σε άθικτα HUVECs [19] (βλέπε Σχήμα 6Β και 6C). Όπως και στην περίπτωση της διαπερατότητας, HUVECs κατεργάζεται με GEP100, ARF6 ή AMAP1 siRNAs, όλες εμφάνισαν υψηλά ποσοστά το VE-cadherin πρόσληψη ακόμη και χωρίς VEGF, και δεν ανταποκρίνονται σε VEGF (Σχήμα 6Β και 6C). Ακέραια HUVECs εμφανίζουν VE-cadherin που βασίζεται κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις με υψηλή ακεραιότητα, ενώ VEGF διέγερση προκαλεί ακανόνιστη, αποδιοργανωμένη μορφολογία τους [19] (βλέπε επίσης Σχήμα 6Β). Βρήκαμε ότι VE-cadherin που βασίζεται κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις γίνονται αποδιοργανωμένη ακόμη και χωρίς VEGF διέγερση, όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με αυτά τα siRNAs (Σχήμα 6Β). Σε αυτά τα πειράματα, άσχετο και AMAP2 siRNAs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η απώλεια αυτών των πρωτεϊνών διαταράσσει τα κύτταρα να σχηματίσουν άθικτο συμφύσεων μεταξύ κυττάρων τους, και τα κύτταρα με τέτοια αποδιοργανωμένη συμφύσεις μεταξύ κυττάρων δεν είναι πλέον ευαίσθητα σε ρύθμιση VEGF.

HUVECs, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με siRNAs για ARF6, GEP100, AMAP1 ή μία άσχετη αλληλουχία (IRR) (A-C), ή με P4-ΤΑΤ (Ρ4) ή πεπτίδιο SC (D-F), υποβλήθηκαν σε μία δοκιμασία διαπερατότητας με μέτρηση παρακυτταρικής κίνηση του FITC-δεξτράνης (Mr 40 μόρια δοκιμασία πρόσληψης kDa) (A, D), και σε μία VE-καντερίνης με την καταδίωξη ενδοκυττάρωση κυτταρικής επιφάνειας VE-cadherin (B, C, E, F). Στην Α-C, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με siRNAs για 36 ώρες πριν από την επίστρωση. Στην D-F, ΤΑΤ πεπτίδια προστέθηκαν στην καλλιέργεια συρρέουσες και επωάστηκε για 30 λεπτά πριν από την ανάλυση. VE-cad, πράσινο? πυρήνες, μπλε. Οι μπάρες κλίμακας αντιπροσωπεύουν 10 μm. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση τιμή ± s.e.m., n = 3. * P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια δοκιμάστηκε P4-ΤΑΤ. Σε αντίθεση με τα siRNA-θεραπείες που περιγράφονται ανωτέρω, Ρ4-ΤΑΤ μπορεί να προστεθεί απευθείας σε κυτταρικές καλλιέργειες οι οποίες είναι σε συρροή και αποτελούν ήδη το κανονικό, άθικτο συμφύσεων μεταξύ κυττάρων. Βρήκαμε ότι η προσθήκη 10 μΜ P4-ΤΑΤ στα μπλοκ συρρέουσα καλλιέργεια του VEGF με μεσολάβηση ενίσχυση της διαπερατότητας των κυττάρων, ενώ δεν επηρεάζει τη διαπερατότητα σε απουσία VEGF (Σχήμα 6D). Ομοίως, Ρ4-ΤΑΤ αποκλεισμένη επαγόμενη από VEGF ενδοκυττάρωση του VE-cadherin, ενώ δεν προκάλεσε εσωτερικοποίηση VE-καντερίνης στα κύτταρα καλλιεργούνται απουσία του VEGF (Σχήμα 6Ε και 6F). VEGF-επαγόμενη μορφολογικές μεταβολές των κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις επίσης μπλοκαριστεί από Ρ4-ΤΑΤ (Σχήμα 6Ε). Αυτές οι επιδράσεις της Ρ4-ΤΑΤ ήταν δοσοεξαρτώμενη, και το πεπτίδιο ελέγχου SC δεν εμφανίζουν τέτοια ανασταλτικά αποτελέσματα (Σχήμα 6D-6F). Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin οδός είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση του VEGF της διαπερατότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων και VE-cadherin ενδοκύτωση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι τα συστατικά της οδού αυτής μπορεί ουσιαστικά να εμπλέκεται στο σχηματισμό των ανέπαφων συμφύσεων ενδοθηλιακών κυττάρων-κυττάρων, όπως το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας περιέχει ήδη μία χαμηλή συγκέντρωση του VEGF.

Συζήτηση

αγγειογένεση και την εισβολή του καρκίνου του μετοχικού αρκετές κοινές ιδιότητες [36]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το GEP100-ARF6-AMAP1-cortactin μονοπάτι χρησιμοποιείται για την εισβολή και τη μετάσταση των πολλών καρκινικών κυττάρων του μαστού? και σε αυτό το έγγραφο, δείχνουμε ότι αυτή η οδός χρησιμοποιείται επίσης στην αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού που προκαλείται από αγγειογένεση και νεοαγγείωση του χοριοειδούς. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών ARF6 και AMAP1 είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική λειτουργία αυτής της οδού στην εισβολή και τη μετάσταση [11], [12]. Τόσο ARF6 και AMAP1 επίσης εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα σε ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως φαίνεται με υψηλής διηθητικό καρκίνο του μαστού κύτταρα.