Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος έχει βρεθεί με την ανώμαλη έκφραση ή μετάλλαξη στο Ras πρωτεϊνών. ενεργοποίηση ογκογονικών ras εκμεταλλεύεται εκτεταμένο φθάνουν σηματοδότηση τους να επηρεάζουν πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες, στις οποίες η σηματοδότηση που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) ασκεί σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. Θεραπειών που στοχεύουν Ras είναι επομένως σημαντικό όφελος για τον καρκίνο του παγκρέατος. Αν και μικρό μόριο APY606 έχει επιτυχία πήρε από την εικονική διαλογής φαρμάκων με βάση υποδοχέα-στόχο Ras, ο μηχανισμός σε βάθος μένει να διευκρινιστεί. Εμείς εδώ αξιολόγησε την αντικαρκινική δράση του APY606 εναντίον ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου Capan-1 και κυτταρικές γραμμές και SW1990 διερευνηθεί η επίδραση της Ras-ΜΑΡΚ και την απόπτωση που σχετίζονται σηματοδοτικό μονοπάτι για τη δραστηριότητα των APY606. θεραπεία APY606 είχε ως αποτέλεσμα μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων του καρκίνου. Επιπλέον, APY606 παρουσίασαν ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα, όπως αποδεικνύεται όχι μόνο από τη μείωση των καρκινικών κυττάρων σε εισβολή, τη μετανάστευση και δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, αλλά και από μεταβολή σε αρκετές αποπτωτικά ευρετήρια. Επιπλέον, η θεραπεία APY606 απευθείας ανέστειλε Ras-GTP και ο μεταγενέστερος ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, που οδηγεί στην αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνών μονοπατιού που σχετίζονται με μιτοχονδριακή απόπτωση (Βαχ, κυτοσολική Κυτόχρωμα

γ

και κασπάσης 3) και εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάση 2 και κυκλίνη α, Ε Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αλλοιώνοντας Ras-ΜΑΡΚ σηματοδότηση είναι ένα νέο μηχανισμό δράσης για APY606 διάρκεια θεραπευτική παρέμβαση σε καρκίνο του παγκρέατος.

Παράθεση: Guo Ν, Liu Ζ, Zhao W, Wang Ε, Wang J (2016) μικρό μόριο APY606 Εμφανίζει Εκτεταμένες Αντικαρκινική Δραστηριότητα στο καρκίνο του παγκρέατος μέσω αλλοιώνοντας Ras-ΜΑΡΚ σηματοδότησης. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10.1371 /journal.pone.0155874

Επιμέλεια: Hiroyasu Nakano, Toho Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 29 Μαρτίου 2016? Αποδεκτές: 5 Μάη 2016? Δημοσιεύθηκε: May 25, 2016

Copyright: © 2016 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επιθυμούν να αναγνωρίσουν τις ακόλουθες πηγές χρηματοδότησης που στήριξαν αυτή την έρευνα: Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81573448, 11174105, 91227114 και 91430217), Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (MCB- 0947767) και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Τζιλίν (20150101009JC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια που οφείλεται σε παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα καταλαμβάνοντας την τέταρτη θέση μεταξύ των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται [1]. Η φύση αυτού του όγκου χαρακτηρίζεται από κακή έκβαση για όλα τα στάδια της νόσου και μόνο 1-4% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι ακόμα ζωντανοί στα 5 χρόνια από τη διάγνωση [2]. Διάφορα θεραπευτικά σχήματα απέτυχαν να βελτιώσουν σημαντικά την επιβίωση των ασθενών [3,4]. Η αποτυχία της χημειοθεραπείας στον καρκίνο του παγκρέατος είναι κυρίως λόγω της αντίστασης σε πολλά φάρμακα και περιοριστική της δόσης ανεπιθύμητες αντιδράσεις. Μέχρι σήμερα, παραμένει ασαφές το πώς ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης οδηγούν στις παρεκκλίνουσα βιολογικές ιδιότητες στον καρκίνο του παγκρέατος. Επιπλέον, παραμένει ελάχιστα γνωστή για το πώς φαρμακολογικές αναστολές των συγκεκριμένων οδών σηματοδότησης βελτιωθεί η ανταπόκριση των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με τη συμβατική χημειοθεραπεία [5]. Ως εκ τούτου, οι μελλοντικές προσπάθειες προς την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τη βελτίωση της επιβίωσης και της ποιότητας ζωής των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος θα πρέπει να περιλαμβάνει νέα στρατηγική για να διερευνήσει αποτελεσματικά αντικαρκινικά φάρμακα [6].

Ras πρωτεΐνες είναι βασικά συστατικά του κανονισμού που αφορούν στην κανονική κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τον κακοήθη μετασχηματισμό [7]. Εκτιμήθηκε ότι σχεδόν το 90% των καρκίνων του παγκρέατος έχουν βρεθεί με την ανώμαλη έκφραση ή μετάλλαξη στο Ras πρωτεΐνες [8]. ενεργοποίηση ογκογονικών ras εκμεταλλεύεται εκτεταμένο φθάνουν σηματοδότηση τους να επηρεάζουν πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της καταστολής της απόπτωσης και την προώθηση του πολλαπλασιασμού [9]. Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, ή απόπτωση, είναι μία κανονική φυσιολογική διαδικασία κατά την οποία μεμονωμένου κυττάρου πεθαίνει και απομακρύνεται από ένα δεδομένο πληθυσμό. Αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που ξεκίνησε εγγενώς μέσω των λειτουργιών της οδού μιτοχόνδριο μεσολάβηση ως ζωτικής σημασίας μηχανισμό άμυνας έναντι κακοήθειας, και τη διαφθορά του αποπτωτικών μηχανημάτων είναι μια καθοριστική υπογραφή των καρκινικών κυττάρων [10]. Ογκογονικών ras με γνώμονα τη διάβρωση της αποπτωτικής οδού και τη συμβολή της στην καρκίνους έχουν τεκμηριωθεί καλώς [11]. Μεταξύ των κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης Ras, ο (ΜΑΡΚ) καταρράκτη που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση έχει αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνων [12-14]. Ένας από τους βασικούς ρόλους, η οδός της Ras-ΜΑΡΚ σε μια ευρεία ποικιλία κυττάρων θηλαστικών, είναι η ρύθμιση της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου [15]. Τα πολλαπλασιαστικά σήματα που παράγονται από ογκογόνους Ras κορυφωθεί με την επάνω ρύθμιση αρκετών παραγόντων μεταγραφής που ενεργοποιεί την έκφραση των κυκλινών που αποδίδουν στην ενεργοποίηση της οδού της Ras-ΜΑΡΚ. Ογκογονικών ras μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω αναστολής εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών (CDKs). Η κατασταλτική δράση διαμεσολαβείται από πολλαπλές οδούς τελεστή Ras συμπεριλαμβανομένης της οδού της Ras-ΜΑΡΚ [16,17]. Με την κατανόηση μας, η συμβολή των ογκογόνων Ras σε αυτές τις διαδικασίες θα είναι αναμφίβολα μια συναρπαστική λεωφόρο της έρευνας για τον καρκίνο στο προσεχές μέλλον.

Είναι γνωστό ότι τα μικρά μόρια έχουν ζωτικό ρόλο στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Ένας αναστολέας μικρού μορίου, APY606, πάρθηκε από την εικονική διαλογής φαρμάκων με βάση Ras στόχο υποδοχέα στο πρόσφατο έργο μας [18]. Ωστόσο, υποκείμενος μηχανισμός της αντικαρκινικών ιδιοτήτων είναι ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, οι έρευνες σε βάθος εκτελέσθηκαν για να αξιολογήσουν τον καρκίνο φύση του έναντι του καρκίνου του παγκρέατος Capan-1 και κυτταρικές SW1990 γραμμές. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι APY606 επαγόμενη απόπτωση οφείλεται στην ενεργοποίηση της εγγενούς μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι και την πρόληψη της οδού καταρράκτη Ras-ΜΑΡΚ. Παράλληλα, APY606 περαιτέρω βρέθηκε ότι επάγει τη σύλληψη φάση S και επιβραδύνει τη μετάσταση στις δύο κυτταρικές σειρές, αλλοιώνοντας την ενεργοποίηση Ras. Κατά συνέπεια, η έρευνά μας θα θέσει τα θεμέλια για στοχευμένη ανακάλυψη φαρμάκων Ras και για APY606 θεραπευτική εφαρμογή στον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM), L-15 μέσο καλλιέργειας κυττάρων και ορό εμβρύου μόσχου (FBS) λήφθηκαν από την Gibco (Grand Island, ΝΥ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). APY606 ευγενική παροχή από NCI /DTP Open Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov) και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με HPLC και ESI-MS. Πρωτογενή αντισώματα κατά της ανθρώπινης κασπάσης-3, κασπάσης-9, κυτόχρωμα

γ

, Bcl-2, Βαχ, c-Raf, ΕΚΚ, pERK, ΜΕΚ, pMEK, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και CDK2 αγοράστηκαν από την Santa Cruz και BD Bioscience, αντίστοιχα. Τα αντισώματα κατά της ανθρώπινης GAPDH και β-ακτίνης ελήφθησαν από την Santa Cruz.

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος Capan-1 και κυτταρικές SW1990 γραμμές ελήφθησαν από την Τράπεζα Κυττάρων του Τύπου Culture Collection κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ και L-15 μέσο που περιέχει 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, αντίστοιχα. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με

2 επωαστήρα 5% CO. Κατά τη διαδικασία της κυτταρικής καλλιέργειας, δεν υπήρχε καμία επίδραση από μυκοπλασμάτων στις δύο κυτταρικές σειρές, η οποία επιβεβαιώθηκε με φθορόχρωμα δοκιμή χρώσης DNA. APY606 διαλύθηκε σε DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο), και προσφάτως αραιωμένο στην επιθυμητή συγκέντρωση με διπλά αποσταγμένο νερό αμέσως πριν από τη χρήση. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στο μέσο καλλιέργειας είναι 0,1% (ν /ν). Τα κύτταρα μάρτυρες έλαβαν το όχημα που αποτελείται από διπλά απεσταγμένο νερό που περιείχε 0.1% DMSO μόνο, η οποία δεν επηρεάζει σημαντικά τα κύτταρα.

Growth δοκιμασία αναστολής

Ο Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8 ) (Dojindo, Japan) δοκιμασία εκτελέστηκε για να εξεταστεί το αποτέλεσμα APY606 επί κυτταροτοξικότητας. Εν συντομία, Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε όγκο 100 μL. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις APY606 για 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε 10 μι CCK-8 αντιδραστήριο για 3 ώρες? η οπτική πυκνότητα στα 450 nm μετρήθηκε με ένα M200 PRO NanoQuant αυτοαναγνώστη (TECAN, Ελβετία). Σε αυτή τη δοκιμασία, CCK-8 δεν παρεμβαίνει APY606 και να προκαλέσει μια θετική απάντηση. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον πέντε φορές.

σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

Για να δοκιμαστεί η επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με APY606, Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων ( 200-300 κύτταρα ανά φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει APY606 με τις συγκεντρώσεις των 2, 4, 6, 8 και 10 μg /mL για 6 ημέρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 5% Giemsa και οι αποικίες (πάνω από 50 κύτταρα) μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (AMG EVOs, Life).

Πυρηνική χρώση ανιχνεύσεως

APY606 που προκαλείται από την πυρηνική συμπύκνωση και μορφολογική αλλαγή ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας DAPI (4,6-διαμινο-2-φαινυλινδόλη). κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990 (5 × 10

6 κύτταρα ανά πλάκα) αναπτύχθηκαν σε γυάλινες πλάκες πυθμένα σε 50% συρροή και κατόπιν καλλιεργήθηκαν στο μέσο υπό την παρουσία 6,25, 12,5 και 25,0 μg /mL APY606 για 24 h, αντίστοιχα. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 3.5% παραφορμαλδεΰδη και κατόπιν επωάστηκαν σε ένα υγρό που περιέχει 2 mg /mL DAPI για 20 λεπτά. Η πυρηνική μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού (AMG EVOs, Life).

Η ποσοτικοποίηση της κυτταρικής απόπτωσης

Νωρίς στην απόπτωση, φωσφατιδυλοσερίνη (PTS) μετατοπίζεται προς την εξωτερική κυτταρική μεμβράνη και μπορεί να να ταυτοποιηθεί με δέσμευση αννεξίνης V, ένα πρόσδεμα για PTS. Τα αποπτωτικά Capan-1 και τα κύτταρα SW1990 ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την αννεξίνη ισοθειοκυανικό (FITC) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-φλουορεσκεΐνη (Abcam, UK) μετά από τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με APY606 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (6,25 και 12,5 μg /mL) για 24 ώρες. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, και στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /mL σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (10 mM HEPES /NaOH, ρΗ 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM ΟαΟ

2). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μL αννεξίνη V-FITC και 5 μL ΡΙ στο σκοτάδι για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και υποβλήθηκε σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACSAria, BD Biosciences). Συνολικά, 10.000 συμβάντα αναλύθηκαν σε κάθε δείγμα. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με λογισμικό Diva 6.0 (BD Biosciences).

Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

Η διακοπή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) είναι ένα χαρακτηριστικό υπογραφή της απόπτωσης σε ένα μονοπάτι που σχετίζονται με μιτοχονδριακές . ΔΨπι μπορεί να μετρηθεί χρησιμοποιώντας φθορίζοντα ανιχνευτή JC-1. Εν συντομία, Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (5 χ 10

5 κυττάρων ανά φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με APY606 σε συγκέντρωση του 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν σε μι διάλυμα εργασίας 500 JC-1 στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μι ρυθμιστικού διαλύματος επώασης, ακολουθούμενη από οπτικοποίηση χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (CLSM, Leica, TCS SP2). JC-1 διεγείρεται από το φως λέιζερ 488 nm και εκπομπής συνελήφθη στα 530 nm [19]. Η μείωση του κόκκινο πράσινο αναλογία /ένταση φθορισμού δείχνει την απώλεια ΔΨm σε καρκινικά κύτταρα.

Προσδιορισμός της Ras-GTP

κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για τη διάρκεια της νύχτας, πεινασμένο για 8 ώρες σε μέσο που περιείχε 1% FBS και στη συνέχεια κατεργάζεται επί 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις APY606. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με EGF (10 ng) επί 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν και το κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα κιτ δοκιμασίας ενεργοποίησης Ras (Upstate, Millipore). Η συνολική Ras και οι ενεργές πρωτεΐνες Ras ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western δοκιμασίας όπως περιγράφεται παρακάτω.

κυτταρομετρίας ροής ποσοτικοποίηση pERK

Η ποσότητα έκφραση του φωσφορυλιωμένου εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (pERK) ήταν ανάγνωση των Ras-ΜΑΡΚ οδού καταρράκτη. Για να μετρηθεί η έκταση αναστολής με ERK ενεργοποίηση πειραματικά, ροής κυτομετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί ποσοτική μέτρηση μονοκύτταροι του ποσού της pERK. Εν συντομία, Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με APY606 σε συγκέντρωση του 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 ώρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας Cytofix /Cytoperm κιτ (Becton Dickinson, Mountain View). Μετά από φυγοκέντρηση, 0,05 μg αντισώματος ανά φρεάτιο σε 100 μι μίγματος αντισώματος για ένα Alexa Fluor 488 συζευγμένο 2 αντίσωμα ERK1 /(αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡ κινάσης, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε πάγο . Μετά την πλύση, τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ενεργοποιημένο με φθορισμό διαλογέα κυττάρων FACSAria (BD Bioscience) και το ποσοστό των χρωσμένων κυττάρων σε κάθε τεταρτημόριο ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Diva 6,0 λογισμικού (BD Bioscience). Συνολικά, 10.000 συμβάντα αναλύθηκαν σε κάθε δείγμα. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για να δοκιμαστεί η ισχυρό μηχανισμό για APY606 επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, η επίδραση της θεραπείας APY606 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου διερευνήθηκε με ροή κυτταρομετρία. Εν συντομία, Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν (1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων) και κατεργάστηκε με APY606 σε συγκέντρωση του 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 h, αντίστοιχα. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 70% (ν /ν) αιθανόλης στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS που περιέχει 50 μg /mL ΡΙ και 1 mg /mL RΝάση Α σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Συνολικά, 10.000 γεγονότα αναλύθηκαν αμέσως σε κάθε δείγμα με κυτταρόμετρο ροής (FACSCalibur, Βϋ Biosciences). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασία

Για να διερευνηθεί η επίδραση του APY606 στην ικανότητα κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, την επούλωση πληγών δοκιμασία διεξήχθη για να αξιολογηθεί η κυτταρική κινητικότητα του APY606 κύτταρα κατεργασμένα. κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990 απλώθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 24-φρεατίων και στη συνέχεια βαθμολογούνται χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας. Το μέσο αντικαταστάθηκε με 12,5 μg /mL APY606 στο πλήρες μέσο, ​​και η μετάβαση των κυττάρων παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας CLSM για 24 ώρες. Εικόνες συλλήφθηκαν, και η πληγή απόσταση κλεισίματος (σε σύγκριση με τον έλεγχο σε 0 h) μετρήθηκε σε τρία ανεξάρτητα θέσεις τραύματος ανά ομάδα. Σχετική κινητικότητα των κυττάρων συγκρίνεται ως η διαφορά πλάτους πληγής μεταξύ 0 ώρες και σε 24 ώρες.

Trans-φρεατίων δοκιμασία θαλάμου

Για να εξεταστεί περαιτέρω η επίδραση της APY606 στην ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων , δοκιμασία θάλαμος trans-φρεατίων Matrigel διεξήχθη. Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Αφού τα κύτταρα στερήθηκαν για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 12.5 μg /mL APY606. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 1 × 10

5 κύτταρα αραιώνονται με μέσο χωρίς ορό καλλιεργήθηκαν σε trans-φρεατίων μονάδες με πολυανθρακικά φίλτρα (Cambridge, ΜΑ) που περιέχουν 8-μm πόρους. Η μεμβράνη πολυανθρακικού προ-επικαλυφθεί με 250 μg /mL Matrigel (BD Biosciences). Οι κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με 600 μL μέσου που περιέχει 5% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη και χρωματίστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης (AO, Dingguo, Κίνα). Η άνω επιφάνεια της μεμβράνης απαλά τριφτεί με μπατονέτα, και τα κύτταρα που εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης φίλτρα μετρήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας με γυάλινο πάτο, και οι εικόνες που αντιστοιχούν σε ολόκληρη την επιφάνεια της μεμβράνης συλλήφθηκαν από CLSM.

Western λέκιασμα ανάλυση

για να διευκρινιστούν οι υποκείμενοι μηχανισμοί για APY606 επαγόμενη κυτταρική απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε μοριακό επίπεδο, εξετάστηκαν Western αναλύσεις κηλίδωσης. Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 πλύθηκαν με ψυχρό PBS μετά από 24 ώρες αγωγή με APY606 σε συγκέντρωση του 6,25 και 12,5 μg /mL. Μετά κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά, ίση ποσότητα πρωτεΐνης σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πήκτωμα SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ). Στη συνέχεια, μεμβράνη PVDF ανιχνεύτηκε με την υποδεικνυόμενη πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και περαιτέρω στυπώθηκαν με κατάλληλες κρένου δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανιχνευτή χημειοφωταύγειας (DNR, Kiryat Anavim, Ισραήλ). επίπεδο πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GAPDH ή β-ακτίνης ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± SD πειραμάτων εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση SPSS 11.5 στατιστικό λογισμικό.

Αποτελέσματα

1. APY606 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990

Για να διερευνηθεί η δυνατότητα αναστολής της ανάπτυξης των APY606 στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου, οι εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ανασταλτική δράση της APY606 στην ανάπτυξη των Capan-1 και SW1990 κυτταρική γραμμές αξιολογήθηκαν ως δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Όταν τα κύτταρα Capan-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με APY606 σε συγκέντρωση 12,5, 25,0 και 50,0 μg /mL για 24 ώρες, το ποσοστό της αναστολής της ανάπτυξης πάνω από τα κύτταρα ελέγχου (100%) ήταν σχεδόν 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% και 93,3 ± 0,6%, αντίστοιχα. Κατά συνέπεια, το ποσοστό των κυττάρων που ανέστειλε SW1990 πάνω από τα κύτταρα ελέγχου (100%) ήταν 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% και 90,0 ± 1,0%, αντίστοιχα. Όταν τα κύτταρα Capan-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με APY606 στις ίδιες συνθήκες για 48 ώρες, το ποσοστό της αναστολής της ανάπτυξης πάνω από τα κύτταρα ελέγχου (100%) ήταν περίπου 50.0 ± 1.7%, 90.0% και 93.0%, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, το ποσοστό των κυττάρων που ανέστειλε SW1990 πάνω από τα κύτταρα ελέγχου (100%) ήταν 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% και 87,3 ± 2,3%, αντίστοιχα. Το IC

50 τιμή για APY606 ήταν 14.3 ± 1.3 μg /mL (24 ώρες) και 9,5 ± 0,6 μg /mL (48 ώρες) σε κύτταρα Capan-1, καθώς και 10,3 ± 1,1 μg /mL (24 ώρες) και 6,8 ± 2,3 μg /mL (48 ώρες) σε κύτταρα SW1990, αντίστοιχα. Επιπλέον, έχουμε επίσης μελετήσει την επίδραση της APY606 επί του ρυθμού επιβίωσης των Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. θεραπεία APY606 οδήγησε σε σημαντική αναστολή του σχηματισμού αποικιών στις δύο κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Β). Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι APY606 επάγεται εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ανασταλτικά αποτελέσματα στην αύξηση και επιβίωση των δύο κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις APY606 για 24 και 48 ώρες και στη συνέχεια αξιολογούνται με CCK-8 (Α) και σχηματισμού αποικιών (Β) προσδιορισμού, αντίστοιχα. Παρουσιάζονται δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. εικόνες πυρηνική χρώση (C) ελήφθησαν από μικροσκόπιο φθορισμού με 10 × στόχο. Το μπαρ κλίμακα ήταν 20 μm.

Η

Επιπλέον, η πυρηνική μορφολογία των κυττάρων ανιχνεύθηκε με DAPI που είναι μια μπλε χρωστική φθορισμού ειδικά δεσμευτική Α-Τ πλούσιες περιοχές στο DNA. ΫΑΡΙ μπορεί να περάσει μέσα από ένα άθικτο κυτταρική μεμβράνη, επομένως, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη χρώση τόσο ζωντανά και στερεωμένα κύτταρα, αν και διέρχεται μέσω της μεμβράνης λιγότερο αποτελεσματικά σε ζώντα κύτταρα και ως εκ τούτου η αποτελεσματικότητα του λεκέ είναι χαμηλότερη. Το μπλε ένταση φθορισμού σε Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 σε επεξεργασία με APY606 σε συγκέντρωση 6,25, 12,5, και 25,0 μg /mL για 24 ώρες ήταν ισχυρότερη από ότι στις ομάδες ελέγχου σε αγωγή με φορέα όπως φαίνεται στο Σχ 1Γ. Επιπλέον, είναι σαφές ότι οι συνοπτικές και κατακερματισμένη πυρήνες αυξήθηκαν με την αγωγή APY606 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο.

2. APY606 επάγει την απόπτωση των Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990

Για την αξιολόγηση της επαγωγής απόπτωσης επίδραση της APY606 επί Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά για αννεξίνη V-FITC και αρνητικά για ΡΙ υφίστανται απόπτωση? κύτταρα χρωματίζονται θετικά τόσο για αννεξίνη V-FITC και ΡΙ είτε στο τελικό στάδιο της απόπτωσης που υποβάλλονται σε νέκρωση ή ήδη νεκρός? κύτταρα χρωματίζονται αρνητικά τόσο για αννεξίνη V-FITC και ΡΙ είναι ζωντανοί χωρίς να υποβάλλονται σε απόπτωση [20]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ήταν αμελητέα (0.4-1.0%) στα κύτταρα ελέγχου των δύο κυτταρικών σειρών που έλαβαν θεραπεία με όχημα. Ενώ το ποσοστό της πρόωρης αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε 21,3 ± 3,5% και 50,4 ± 5,5% αφού τα κύτταρα Capan-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με APY606 στο 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 h, αντίστοιχα. Για 48 ώρες θεραπείας, οι τιμές αυξήθηκαν σε 22.0 ± 2.3% και 54.4 ± 6.2%, αντίστοιχα. Παρομοίως, υπό τις ίδιες συνθήκες, οι τιμές ήταν 23,4 ± 2,4% και 63,9 ± 7,2%, καθώς και 49,9 ± 3,5% και 75,1 ± 6,3% αφού τα κύτταρα SW1990 εκτέθηκαν σε APY606 για 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι APY606 διήγειρε χρόνο και τη συγκέντρωση εξαρτώμενη απόπτωση σε Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990.

Ποσοστά των αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών στις δύο κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με 6,25 και 12,5 μg /mL του APY606 για 24 και 48 ώρες προσδιορίσθηκαν με τη χρήση κυτταρομέτρου ροής (Α). Παρουσιάζονται δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Επίδραση της θεραπείας APY606 επί των πρωτεϊνών που σχετίζονται με αποπτωτικό μονοπάτι μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blotting. εκτέθηκαν Εκπρόσωπος κηλίδες των αντίστοιχων πρωτεϊνών (Β). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (C):. Σχετική πυκνότητα της πρωτεΐνης στόχου ποσοτικοποιήθηκε και χαράσσεται

Η

Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός που ευθύνεται για APY606 απόπτωση, αξιολογήσαμε τα επίπεδα του Bax, Bcl-2, κυτοσολική κυτοχρώματος

c

, και η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 σε Capan-1 και κυτταρικές σειρές SW1990 σε επεξεργασία με APY606 σε συγκέντρωση του 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 ώρες χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blotting. Οι επιδράσεις της αγωγής APY606 στα επίπεδα έκφρασης του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax και αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη πειραματικά εξετάστηκαν Bcl-2. Κατεργασία κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του Βαχ αλλά μειώθηκε εκείνη του Bcl-2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Σχήμα 2Β). Το κυτόχρωμα

c

είναι ένα από τα κεντρικά μεσολαβητές της μιτοχονδριακής ή ενδογενή αποπτωτικό μονοπάτι. Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από χώρο των μιτοχονδρίων είναι η πρώιμη εκδήλωση κατά τη διάρκεια της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [21]. Ως τέτοιες, οι επιδράσεις της θεραπείας APY606 σχετικά με την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

στις δύο κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν. Η έκθεση των κυττάρων σε APY606 παρατηρήθηκε να αυξάνει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από μιτοχόνδρια σε κυτοσόλιο σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ 2C). Κατά αποπτωτικών διέγερση, κυτόχρωμα

γ

απελευθερώνεται συνεργάτες με procaspase-9 για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο επεξεργασίας κασπάσης-9 από ανενεργό προένζυμο στην ενεργό μορφή του, τελικά προκαλώντας κασπάσης-3 ενεργοποίησης και την απόπτωση [21]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β και 2C, APY606 επαγόμενη αξιοσημείωτα εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 και τελικά οδήγησε σε αποπτωτικό θάνατο σε Capan-1 και SW1990 κυτταρικές σειρές.

3. APY606 επάγει ΔΨπι

Η εξάντληση των ΔΨm είναι ένα πρώιμο και ουσιαστικά αποπτωτική απόκριση σε θεραπεία κατά του καρκίνου. Μιτοχονδριακή διάσπαση εκκινεί τη διαδικασία της απόπτωσης, η οποία στη συνέχεια οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό APY606 επαγόμενη κυτταρική απόπτωση, προσδιορίσαμε την επίδραση της APY606 σε ΔΨm σε Capan-1 και κυττάρων SW1990 γραμμές. Η κατιονική χρωστική JC-1 είναι χρήσιμη για την ανίχνευση ΔΨm συμβαίνουν στο αρχικό στάδιο της απόπτωσης [22]. Σε ζωντανά κύτταρα, JC-1 εμφανίζει δυναμικό εξαρτώμενη συσσώρευση στα μιτοχόνδρια που οδηγεί στην εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση σχηματισμό των ερυθρών φθορισμού J-συσσωματώσεις [23] η οποία είναι ενδεικτική της παρουσίας του πολωμένου μιτοχονδρίων. Στις εκπόλωση, JC-1 μονομερούς δέσμευσης με μιτοχονδριακή μεμβράνη αποτελέσματα σε πράσινο φθορισμό και μείωση της χρώσης πορτοκαλί-κόκκινο. Έτσι, μιτοχονδριακή αποπόλωση υποδεικνύεται από μια μείωση στην αναλογία κόκκινο πράσινο /ένταση φθορισμού. Η αναλογία κόκκινο σε πράσινο φθορισμό εξαρτάται μόνο από το δυναμικό της μεμβράνης και όχι σε άλλους παράγοντες, όπως μιτοχονδριακό μέγεθος, το σχήμα και την πυκνότητα που μπορεί να επηρεάσουν τα σήματα ενός συστατικού φθορισμού.

Εδώ, ο έλεγχος και η αγωγή APY606 Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές χρωματίστηκαν με JC-1 παρακολουθήθηκαν με CLSM. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, ο σχηματισμός του κόκκινου-φθορισμού J-συσσωματώματα ήταν σημαντικά μειωμένη στις δύο κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με 6,25 και 12,5 μg /mL APY606 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Σε αντίθεση, η πράσινη φθορισμός αναφέρεται κυρίως σε κύτταρα APY606 αγωγή λόγω JC-1 μονομερούς δέσμευσης. Η αναλογία πράσινο σε κόκκινο φθορισμό αυξήθηκε σε APY606-επεξεργασμένα κύτταρα σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η αλλαγή φθορισμού ήταν ενδεικτική της ΔΨm. Απώλεια ΔΨπι παρατηρήθηκε υπό θεραπεία APY606, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα μιτοχόνδρια πλήττονται ιδιαίτερα νωρίς κατά τη διάρκεια της αποπτωτική διαδικασία.

Ο έλεγχος και η APY606 επεξεργασμένα κύτταρα βάφονται με JC-1 παρακολουθούνται από CLSM. Το J-συγκεντρωτική μορφή (ερυθρός φθορισμός) και J-μονομερές μόνο του (πράσινο φθορισμό) ήταν ενθουσιασμένοι με 568 και 480 nm, αντίστοιχα. Το μπαρ κλίμακα ήταν 20 μm.

Η

4. APY606 αναστέλλει Ras-ΜΑΡΚ μονοπάτι επάγοντας αποπτωτική απόκριση

Με στόχο την αξιολόγηση της πιθανώς στοχευμένη Ras θεραπευτική στρατηγική, εξετάσαμε πρώτα την αναστολή της δραστηριότητας της Ras-GTP σε δοκιμασία που βασίζεται σε κύτταρα. Θεωρητικά, APY606 θα ενεργήσει για να μειώσει το επίπεδο δραστηριότητας Ras-GTP. Για να ληφθεί υπόψη αυτή την πρόβλεψη, η επίδραση της APY606 επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία pull-down Raf1RBD. Όπως είχε προβλεφθεί, οι εκτάσεις της ενεργοποίησης Ras σε στέρηση ορού Capan-1 και SW1990 είχαν μειωθεί σημαντικά κατά την παρουσία του APY606 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο χωρίς σημαντική μείωση της συνολικής επίπεδο Ras (Σχήμα 4).

κύτταρα στερούνται ορού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του APY606 για 24 ώρες, και στη συνέχεια διεγείρονται με EGF για 10 λεπτά. APY606 εξασθενεί κυτταρική ενεργοποίηση Ras σε Capan-1 (Α) και κυτταρικές γραμμές SW1990 (Β). GTP-δεσμεύεται Ras απομονώθηκε με δοκιμασία pull-down RBD και ανιχνεύεται από το κιτ ενεργοποίηση Ras-GTP. Συνολικό ποσό της Ras ανιχνεύθηκε με ειδικό αντίσωμα αντι-Ras. Σχετική πυκνότητα της πρωτεΐνης-στόχου μετρήθηκε ποσοτικά και απεικονίζονται.

Η

Raf κινάσες είναι ο πιο γνωστός ως κύριοι ρυθμιστές του καταρράκτη Ras-ΜΑΡΚ, και το μπλοκ των Ras-ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης έχει να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή του καρκίνου κυτταρικής απόπτωσης [24]. Για να ελέγξετε τον υποκείμενο μηχανισμό της επαγωγής απόπτωσης, αξιολογήσαμε την επίδραση της APY606 σε Ras-ΜΑΡΚ μονοπάτι και στις δύο κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990. Θεραπεία των δύο κυτταρικών σειρών με APY606 στο 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 ώρες μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση των ΜΕΚ και ERK σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5Α και 5Β). Ωστόσο, η έκθεση των δύο κυτταρικών σειρών προς APY606 δεν επηρέασαν τα συνολικά επίπεδα ΜΕΚ και ERK. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το επίπεδο έκφρασης του c-Raf μειώθηκε σημαντικά με την αύξηση της συγκέντρωσης του APY606 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι APY606 απόπτωση που επάγεται από το κλείδωμα των Ras-ΜΑΡΚ σηματοδοτική οδό.

Μετρήθηκαν

κυτταρολύματα αναλύθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με τις αντίστοιχες πρωτογενές αντίσωμα που ακολουθείται από το δεύτερο αντίσωμα και τις αντιπροσωπευτικές κηλίδες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Σχετική πυκνότητα της πρωτεΐνης στόχου ποσοτικοποιήθηκε και χαράσσεται. Ροή ανίχνευση με κυτταρομετρία φωσφο-ΕΚΚ διεξήχθη σε δύο Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές (C). Παρουσιάζονται δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Σε γενικές γραμμές, η έκταση της pERK θεωρήθηκε ως ένας δείκτης της ενεργοποίησης του Ras [25]. Με βάση αυτό, έχουμε ταυτοχρόνως εκτελείται μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την απόκτηση ποσοτική μέτρηση μονού κυττάρου. Όπως φαίνεται στο Σχ 5C, APY606 προκάλεσε παραγωγή μικρότερη pERK σε Capan-1 (76,7 ± 1,2%) και SW1990 (46,3 ± 2,6%) κυτταρικές σειρές σε 12,5 μg /mL δόση από ό, τι στα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα, αντίστοιχα, σε συμφωνία με την τάση των ανάλυση κηλίδωσης Western.

5. APY606 συλλαμβάνει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση S

Πολλοί κυτταροτοξικών παραγόντων διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1, S ή φάση G2-M [26]. Για να αξιολογηθεί ο μηχανισμός για APY606 επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, η επίδραση της APY606 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου εξερευνήθηκε για πρώτη φορά ποσοτικά σε Capan-1 και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας SW1990 ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Θεραπεία των δύο κυτταρικών σειρών με APY606 στο 6,25 και 12,5 μg /mL για 24 ώρες αισθητά επηρέασε τον αριθμό των κυττάρων σε G1 και τις φάσεις S σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά ο αριθμός των κυττάρων σε φάση G2 δεν περιφάνως αλλάξει σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 6Α). Μετά την επεξεργασία των Capan-1 κύτταρα με APY606 σε 12,5 μg /mL, ο αριθμός των κυττάρων που συνελήφθησαν στη φάση G1 ήταν 62,83% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου? Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση κατά 18,78% (p = 0,027). Ταυτόχρονα, το ποσοστό των κυττάρων που συνελήφθησαν στη φάση S ήταν 35,59%? Αυτό έδωσε μια αύξηση κατά 18,09% (p = 0,043) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με μόνο όχημα. Για την κατανομή των κυττάρων SW1990 σε φάσεις G1 και S, η έκθεση των κυττάρων σε APY606 οδήγησε σε μια πιο αξιοσημείωτη επίδραση. Κατεργασία κυττάρων με SW1990 APY606 σε 12,5 μg /mL μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που συνελήφθησαν στη φάση G1 κατά 32,84% (p = 0,002) και αύξησε τον αριθμό των κυττάρων σε φάση S με 33,57% (p = 0.042), αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι APY606 οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης που προκάλεσε μία εμφανή, παρατεταμένη συσσώρευση κυττάρων στη φάση S και τη μείωση των κυττάρων στη φάση G1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές Capan-1 και SW1990.

Capan-1 και SW1990 κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις APY606 για 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά ποσοστά κυτταρικών πληθυσμών σε G1, S, G2 και φάσεις του κυτταρικού κύκλου στις δύο κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Α). πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μετάβαση G1-S αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western δοκιμασίας (Β). Παρόμοια πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα, και παρουσιάστηκαν οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Σχετική πυκνότητα της πρωτεΐνης στόχου ποσοτικοποιήθηκε και χαράσσεται (C).

Η

εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται στενά από κυκλίνες και CDKs. Οι μειωμένες εκφράσεις της κυκλίνης Α, κυκλίνη Ε και CDK2 είναι τα κύρια χαρακτηριστικά της διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S. Για να εξεταστεί ποιοτικά το μηχανισμό για APY606 επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, συζητήσαμε την επίδραση της θεραπείας APY606 στα επίπεδα έκφρασης του κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και CDK2 σε Capan-1 και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας SW1990 Western blotting δοκιμασία.