Αφηρημένο

Η πρωτεΐνη αργινίνη μεθυλοτρανσφεράσης 5 (PRMT5) παίζει πολλαπλούς ρόλους σε ένα μεγάλο αριθμό κυτταρικών διαδικασιών και της υποκυτταρικός εντοπισμός είναι δυναμικά ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ποντικιού και κυτταρικής διαφοροποίησης. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις λειτουργικές διαφορές μεταξύ PRMT5 στο κυτταρόπλασμα και PRMT5 στον πυρήνα. Εδώ, αποδείξαμε ότι PRMT5 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Υποκυτταρικός εντοπισμός προσδιορισμοί έχουν σχεδιαστεί για να εκτείνονται σε ολόκληρο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης της πρωτεΐνης PRMT5 αποκάλυψε την παρουσία τριών σήματα πυρηνικού αποκλεισμού (Ness) στην πρωτεΐνη PRMT5. PRMT5 και ρ44 /MED50 /WD45 /WDR77 συν-εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, και οι δύο είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε ένα PRMT5 μεθυλοτρανσφεράσης-εξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση, PRMT5 στον πυρήνα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε ένα μεθυλοτρανσφεράσης-ανεξάρτητο τρόπο. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, PRMT5 εντοπισμένη στον πυρήνα σε καλοήθη επιθήλιο του προστάτη, ενώ εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα σε προ-κακοήθη καρκίνο του προστάτη και ιστούς. Βρήκαμε επίσης ότι PRMT5 μόνη μεθυλιωμένο τόσο της ιστόνης Η4 και πρωτεΐνες SmD3 αλλά PRMT5 σε σύμπλοκο με ρ44 και pICln μεθυλιωμένο SmD3 αλλά δεν ιστόνης Η4. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο PRMT5 ελέγχει την ανάπτυξη των κυττάρων και συμβάλλει στην ογκογένεση του προστάτη

Παράθεση:. Gu Ζ, Li Υ, Lee P, Liu Τ, Wan C, Wang Z (2012) Protein Αργινίνη μεθυλοτρανσφεράσης 5 λειτουργίες σε αντίθετους τρόπους στο κυτταρόπλασμα και πυρήνα των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (8): e44033. doi: 10.1371 /journal.pone.0044033

Επιμέλεια: Hari Κοαΐ, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Φεβ 2012? Δεκτές: 1 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Αυγούστου του 2012

Copyright: © Gu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορήγηση 1R01 DK065156 01 από το Εθνικό Ινστιτούτο διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα, Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) (σε ZW), από το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης (Πυρήνας) CA16672 επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου , ΝΙΗ για το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου, από NYUSOM Ουρολογικό Κέντρο της χρηματοδότησης αριστείας για την PL, και από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81171922) και το κλειδί του έργου του Ταμείου Έρευνας της Shaanxi Provincial Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προγράμματος, την Κίνα. (2008K27G01) για να ZP. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Protein αργινίνη μεθυλτρανσφεράση 5 (PRMT5) είναι μια πρωτεΐνη η αργινίνη μεθυλτρανσφεράση τύπου II που καταλύει την συμμετρική διμεθυλίωση των καταλοίπων αργινίνης εντός πρωτεϊνών στόχων [1]. PRMT5 είναι εξαιρετικά διατηρημένη μεταξύ ζύμη, τα ζώα και τα ανώτερα φυτά και έχει εμπλακεί σε διάφορες κυτταρικές και βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης μεταγραφική ρύθμιση [2], [3], [4], RNA μεταβολισμός [1], [5], ριβοσωμάτων βιογένεση 6], Golgi συντήρηση δομή συσκευή [7], και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [2]. PRMT5 συμμετέχει επίσης στον σχηματισμό των γεννητικών κυττάρων, οι προδιαγραφές, και συντήρηση [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Σε κύτταρα θηλαστικών, PRMT5 εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, και αυτό μεθυλιώνει πολλαπλές ιστόνης και nonhistone πρωτεΐνες [1]. Στο πυρήνα, PRMT5 έχει βρεθεί στα σύμπλοκα χρωματίνη αναδιαμόρφωση /SNF και NURD SWI [14], [15], όπου μεθυλιώνει ιστόνες, καθώς και παράγοντες μεταγραφής /ρυθμιστές [2], [3], [4]. Στο κυτταρόπλασμα, PRMT5 σχηματίζει ένα σύμπλοκο αργινίνης μεθυλτρανσφεράση πρωτείνης 20S, που ονομάζεται «methylosome,» που αποτελείται από πρωτεΐνες συρραφής snRNP Sm, PRMT5, pICln, και επαναλάβετε πρωτεΐνη WD (MEP50 /WD45) [16], [17], [18] . Σε αυτό το συγκρότημα, PRMT5 μεθυλιωμένη πρωτεΐνες Sm [16], [19], και τέτοια μεθυλίωση αυξηθεί ο συγγένεια δέσμευσης των πρωτεϊνών αυτών Sm για την κινητικού νευρώνα επιβίωση (SMN), ο νωτιαίος προϊόν μυϊκή γονίδιο ατροφία νόσου [20], [21] . Στη συνέχεια, η PRMT5- και ΔΠΕ-συγκροτήματα συνεργάζονται για να φορτώσει τις πρωτεΐνες Sm σε U snRNAs, σχηματίζοντας U snRNPs [22]. Παρά το γεγονός ότι

in vitro

βιοχημικές ενδείξεις έδειξαν ότι συμμετρική αργινίνη διμεθυλίωση είναι απαραίτητη για την προ-mRNA ματίσματος [23], σε ποιο βαθμό PRMT5 επηρεάζει μάτισμα

in vivo

παραμένει άπιαστο. PRMT5 είναι ζωτικής σημασίας για την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ποντικιού [8].

Εμείς καθαριστεί και να κλωνοποιηθεί ένα νέο υποδοχέα ανδρογόνων (AR) -interacting πρωτεΐνη, που ορίζεται p44 [24], [25]. Η πρωτεϊνική αλληλουχία του ρ44 είναι ταυτόσημη με εκείνη ενός συστατικού (MEP50) του συμπλόκου methylosome [18] και μια υπομονάδα (WD45) του συμπλόκου ΔΠΕ [17]. Η πρωτεΐνη ρ44 περιέχει 342 υπολείμματα αμινοξέων και επτά θεωρούμενων WD-40 επαναλήψεις και ορίζεται επίσης WDR77 στην τράπεζα γονιδίων (Προσχώρησης: AAH9411.1). Αλληλεπιδρά με AR και ρυθμίζει την έκφραση ενός συνόλου ανδρογόνων γονιδίων στόχων στον αδένα του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη [24], [25], [26], [27]. Η πρωτεΐνη ρ44 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη ποντικών ηλικίας μικρότερης των 28 ημέρες? ρ44 πυρηνική μετατόπιση αρχίζει στην ηλικία των 28 ημέρες και ολοκληρώνεται στην ηλικία των 45 ημερών [28]. Πυρηνική μετατόπιση του ρ44 συσχετίζεται με μια δραματική μείωση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων [28] και με λειτουργικά κυτταροδιαφοροποίησης του αυλού κυττάρων, που συμβαίνουν με την έκφραση των ειδικού προστατικού εκκριτικών πρωτεϊνών [29], [30], [31] , [32]. Έτσι, ρ44 κυτταροπλασματική εντόπιση σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη, ενώ πυρηνικό εντοπισμό του συνδέεται με διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων. Ανοσοϊστοχημική χρώση των δειγμάτων του προστάτη έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ρ44 εντοπίζεται στον πυρήνα των επιθηλιακών κυττάρων καλοήθους και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [25]. Η μετατόπιση του ρ44 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα συμβαίνει σε προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία και βλαβών του καρκίνου του προστάτη [25], [26]. Εξαναγκασμένη πυρηνικό εντοπισμό του ρ44 ανέστειλαν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε καλλιέργεια ιστού [25] και καταργήθηκε πλήρως την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου του προστάτη σε γυμνούς ποντικούς [26]. Αυτή η αναστολή της ανάπτυξης συνδέθηκε με την προς τα πάνω ρύθμιση του

p21

και

έκφραση p27

γονιδίου? ρύθμιση προς τα κάτω των

κυκλίνης Α

,

κυκλίνη Β

, και

CDK2

γονιδιακής έκφρασης? και διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο G

1 /G

0 φάση [25], [26]. Έτσι, η λειτουργία ρ44 ρυθμίζεται από υποκυτταρική εντόπιση της.

(Α) και PC3 LNCaP κύτταρα ανοσοϊστοχημικά χρωματίστηκαν με αντι-PRMT5 και -p44 αντισώματα (πάνελ AG) ή αντι-PRMT5 συν -coilin αντισώματα (πίνακας h ). Τα σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό με ένα κόκκινο φίλτρο (για την ανίχνευση PRMT5) ή πράσινο φίλτρο (για την ανίχνευση ρ44 ή coilin). Δικαίωμα πάνελ δείχνουν συγχωνευθείσας εικόνες PRMT5 και χρώση p44 ή coilin. Λευκό και πράσινο αιχμές βελών δείχνουν PRMT5 και σήματα ρ44 ή coilin στον πυρήνα, αντίστοιχα. (Β) στύπωμα Western των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλάσματα LNCaP και PC3 κυττάρων με αντι-PRMT5, -p44, -HSP90, ή αντίσωμα αντι-λαμίνης Β. C, κυτταρόπλασμα? Ν πυρήνα.

Η

PRMT5 σχηματίζει ένα στοιχειομετρικό σύμπλοκο με ρ44 /MEP40 /WD45 /WDR77 σε διάφορα κύτταρα [33], [34], [35], και υποκυτταρικός εντοπισμός του είναι δυναμικά ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του ποντικιού ανάπτυξη [8]. Ο λειτουργικός ρόλος του PRMT5 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα και τη σχέση του υποκυτταρικού εντοπισμού της για τον καρκίνο του προστάτη δεν έχουν διερευνηθεί. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι κυτταροπλασματική PRMT5 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, ενώ η πυρηνική PRMT5 αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, PRMT5 εντοπίζεται στον πυρήνα σε καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη και, αντίθετα, εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα σε προ-κακοήθη και καρκινικούς ιστούς του προστάτη. Ως εκ τούτου, η λειτουργία PRMT5 ρυθμίζεται από υποκυτταρικό εντοπισμό του, και αυτό πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφορά μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση του προστάτη.

(Α) Διαγράμματα των αποκοπές PRMT5 εκφράζονται ως πρωτεΐνες GFP-σύντηξης. Τα ποσοστά των κυττάρων με αποκοπές GFP-PRMT5 στο κυτταρόπλασμα (C), πυρήνα (Ν), ή κυτταρόπλασμα συν τον πυρήνα (C /N) φαίνονται στα δεξιά. (Β) Υποκυτταρικός εντοπισμός των απομονωμένων σήματα πυρηνικής εξαγωγής. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), -PRMT5 (500-560), -PRMT5 (576-637), ή pcDNA-GFP και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλάσματα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), PRMT5 (500 με 560), ή PRMT5 (576-637) με αντι-FLAG, -HSP90, ή το αντίσωμα -lamin Β.

η

Υλικά και Μέθοδοι

η έρευνά μας δεν περιελάμβανε την ανθρώπινη συμμετέχοντες και τα ζώα, μόνο με τη χρήση ανθρώπινων ιστών καρκίνου του προστάτη. Οι ασθενείς δεν μπορεί να προσδιοριστεί, άμεσα ή έμμεσα, μέσω αναγνωριστικά που συνδέονται με τα θέματα. Έτσι, το ερευνητικό πρόγραμμα ήταν απαλλάσσονται δυνάμει Απαλλαγή 4 (45 CFR Part 46) και μια δήλωση ηθική δεν είναι απαραίτητη.

(Α) Διαγράμματα των αποκοπές PRMT5. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-GFP-ρ44 και ροϋΝΑ-PRMT5 ή αποκοπές pcDNA-PRMT5, και τα ποσοστά των κυττάρων με GFP-ρ44 σε κυτόπλασμα (C) ή κυτταρόπλασμα συν τον πυρήνα (C /N) εμφανίζονται στη δεξιά πλευρά. (Β) Κυτταροπλασματικά μετατόπιση της GFP-p44 οδηγείται από PRMT5. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-GFP-ρ44 μόνη της ή μαζί με pcDNA-f: PRMT5, -f: PRMT5 (91-637), ή f: PRMT5 (325-637), και το GFP-ρ44 υποκυτταρική εντόπιση παρατηρήθηκε υπό ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλάσματα των κυττάρων Cos 7 που περιγράφεται στο Β με αντι-ρ44, -HSP90, ή αντίσωμα -lamin Β.

Η

Καρκίνος του προστάτη δείγματα και ανοσοϊστοχημεία

οι καλοήθεις και καρκινικούς ιστούς του προστάτη προήλθαν από ριζική προστατεκτομή δείγματα από 19 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη αντιμετωπίζονται στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του. ταυτότητες των ασθενών απομακρύνθηκαν από όλα τα δείγματα και η απαλλαγή από την ανάγκη για τη χορήγηση αδείας που χορηγείται από την επιτροπή δεοντολογίας της Νέας Υόρκης Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, έτσι δεν χρειάστηκε ενημερωμένη συγκατάθεση. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε επί των δειγμάτων 19 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, όπως περιγράφεται προηγουμένως [36], [37]. Αντισώματα (αντίσωμα αντι-ρ44, δύο παρα δέκα? Αντίσωμα αντι-PRMT5 1:20? Από BD Transduction Laboratories) εφαρμόστηκαν στις τομές ολίσθησης και επωάζονται όλη τη νύκτα. Ένα σύστημα ανίχνευσης υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (ϋΑΚΟ Α /δ, Grostrup, Δανία).

(Α) Μεταλλάξεις στο ρ44 καταργηθεί PRMT5 γνώμονα ρ44 κυτταροπλασματική μετατόπιση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-GFP-ρ44 (WT) ή pcDNA-GFP-ρ44 (ΜΤ) μόνη ή μαζί με pcDNA-PRMT5. Ο πυρήνας χρωματίστηκε με Far-κόκκινο, και το υποκυτταρική εντόπιση του GFP-ρ44 παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. (Β) Οι μεταλλάξεις στο p44 κατάργησε την αλληλεπίδραση της ρ44 με PRMT5. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-f: ρ44 (WT) (λωρίδα 1) ή pcDNA-f: ρ44 (ΜΤ) (λωρίδες 2-5), και ολικού κυττάρου προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν για ανοσοκαταβύθιση με αντι-FLAG αντίσωμα (αγαρόζη Μ2) . κηλίδα Western με αντι-PRMT5 διεξήχθη για την ανίχνευση της καταβυθισθέν PRMT5 (κάτω πίνακας). Επάνω πίνακας δείχνει την έκφραση του φυσικού τύπου (WT) ή μεταλλαγμένες (ΜΤ) ρ44 στα προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκατακρήμνιση.

Η

Τα καλλιεργημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου και στερεώνονται με ψυχρή μεθανόλη (-20 ° C) για 10 λεπτά. Η μη ειδική πρωτεΐνες είχαν μπλοκαριστεί σε 4% ζελατίνη ψαριού σε PBS για 20 λεπτά. Ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα εκτελέστηκε ακολουθούμενο από ένα 1-h επώαση με αντι-ποντικού ή αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού επισημασμένο με Alexa 595 (1:500? Invitrogen) σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια αντίθετα με TOPRO 3, Far-κόκκινο, ή Sytox πράσινο (Molecular Probes) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τοποθετούνται σε Histogel (Linaris Histogel), και αναλύθηκαν απευθείας με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Για διπλή χρώση, αντι-PRMT5 και αντι-ρ44 ή αντι-PRMT5 και αντι-coilin (1:100, Proteintech) επωάστηκαν με κύτταρα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα δευτερεύοντα αντισώματα (αντι-κουνελιού IgG σημασμένο με DyLight 488, 1:1,000, και IgG αντι-ποντικού σημασμένο με DyLight 649, 1? 1000) χρησιμοποιήθηκαν

(Α) Η shRNA μεσολάβηση αποσιώπηση του PRMT5. ή έκφραση ρ44 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου κατασκευασμένο από κύτταρα LNCaP μολυσμένα με φακοϊό που εκφράζουν το μη στόχους (ΝΤ) shRNA (διαδρομές 1, 5), PRMT5 (διαδρομές 2-4), ή ρ44 (λωρίδα 6) Τα siRNAs. Η shRNA ανθεκτικό PRMT5 (λωρίδα 3) ή PRMT5 R368A μεταλλαγμένο (λωρίδα 4) εκφράστηκε στα PRMT5 κύτταρα που εκφράζουν LNCaP. (Β) Οι καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν NT shRNA, PRMT5 Τα siRNAs, ρ44 shRNA, PRMT5 Τα siRNAs συν PRMT5, ρ44 shRNA συν ρ44, ή PRMT5 Τα siRNAs συν PRMT5mt.

Η

Cell Culture και Δοκιμασία Ανάπτυξης

LNCaP, κύτταρα PC3, και Cos 7 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Cellgro) με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (HyClone). Για τον προσδιορισμό της κυτταρικής ανάπτυξης, κύτταρα (5.000 ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων, και οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν καθημερινά για 7 ημέρες.

(Α) σίγαση της έκφρασης PRMT5 μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης ρ44 στο κυτταρόπλασμα . LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με ΝΤ-shRNA ή PRMT5 shRNA και ανοσοχρώση με αντι-PRMT5 ή -p44 αντίσωμα. Ο πυρήνας ήταν αντίθετα με Sytox πράσινο (μεσαίο πάνελ, πράσινο). Τα δείγματα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. (Β) στύπωμα Western κυτταροπλασματικών (C) και πυρηνική (Ν) κλάσματα των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν ΝΤ-shRNA, PRMT5 shRNA, ή ρ44 shRNA με αντι-ρ44 ή αντι-PRMT5 αντίσωμα.

Η

DNA Κατασκευάσματα και παροδική επιμόλυνση

Τα θραύσματα PRMT5 cDNA ενισχύθηκαν από το pcDNA-PRMT5 κατασκεύασμα [24] και υποκλωνοποιήθηκε στον pcDNA-f: κατασκεύασμα GFP [28] για να εκφράσουν το Ν-τερματικό f: πρωτεΐνες GFP-σύντηξης της αποκοπές PRMT5. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με πέψη ενζύμου περιορισμού και με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Το ισχυρό σήμα πυρηνικού εντοπισμού (RKKKRKV) συντήχθηκε στο Ν-τερματικό άκρο του PRMT5 να εκφράσει την πρωτεΐνη σύντηξης NLS-PRMT5. κατασκευάσματα DNA (1 μικρογραμμάριο για κάθε κατασκεύασμα) επιμολύνθηκαν παροδικά σε LNCaP, PC3, ή Cos 7 κύτταρα (1 χ 10

5) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή (-20 ° C) μεθανόλη για 10 λεπτά, χρωματίστηκαν με TO-PRO 3 (10 μικρογραμμάρια /ml) (Molecular Probes), τοποθετημένο σε Histogel (Linaris), και αναλύθηκαν απευθείας με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού.

(Α) Η πρωτεΐνη PRMT5 στα κύτταρα LNCaP που εκφράζουν PRMT5, PRMT5mt, NLS-PRMT5, ή NLS-PRMT5mt έγινε ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-PRMT5. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. (Β) στύπωμα Western κυτταροπλασματικών (C) και πυρηνική (Ν) κλάσματα των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν PRMT5, f: PRMT5mt, NLS-PRMT5, ή NLS-PRMT5mt με αντι-PRMT5, -p44, -lamin Β, ή -HSP90 αντίσωμα . (C) καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν PRMT5, στ:. PRMT5mt, NLS-PRMT5, ή NLS-PRMT5mt

Η

παρεμβολή RNA

P44 shRNA (p44-shRNA) (αλληλουχία στόχος: 5′-GGGAACTAGATGAGAATGA-3 ‘), PRMT5 shRNA (αλληλουχία στόχος: 5′-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3′), και ένα nontargeting shRNA (ΝΤ-shRNA) (αλληλουχία στόχος: 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘) ήταν σχεδιαστεί με φουρκέτα και κολλώδη άκρα (Clal και ΜΙυΙ). Τα ολιγονουκλεοτίδια ανασυνδέθηκαν στην λεντοϊού φορέα μεταφοράς γονιδίων, pLVTHM, χρησιμοποιώντας τις θέσεις ενζύμου περιορισμού Clal και ΜΙυΙ. Τα κατασκευάσματα DNA αλληλουχήθηκαν για τη δοκιμή για τη σωστή εισαγωγή και το μήκος των ενθεμάτων. Η lentivirus ακολούθως παράγεται με επιμόλυνση ανθρώπινων εμβρυϊκών νεφρικών κυττάρων (293FT? Invitrogen) με την αλληλουχία-επαλήθευσε φορέα PLVTHM, το πλασμίδιο συσκευασίας (MD2G), και το πλασμίδιο του φακέλου (ΡΑΧ2), τα οποία απαιτούνται για την ιική παραγωγή. Τρεις ημέρες αργότερα, το ιικό υπερκείμενο συλλέχθηκε και διηθήθηκε για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων. LNCaP κύτταρα (1 χ 10

5) τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες έξι φρεατίων και μετάγονται με τα σωματίδια φορέας λεντοϊού. Μετά από 16 ώρες, το μέσο που περιέχει ιό απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο ανάπτυξης. Τρεις ημέρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα χωρίζονται σε 1:06 και αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων (5 μικρογραμμάρια πρωτεΐνης) κατασκευασμένο από τα μολυσμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδα Western.

(Α) SDS-PAGE των συμπλοκών PRMT5 παράγονται με συν-έκφραση σε

E. coli

. (Β) Μεθυλίωση SmD3 και υποστρωμάτων Η4 ιστόνης από PRMT5 και PRMT5 περιέχουν σύμπλοκα. Επάνω: αυτοραδιογραφία του πηκτώματος. Κάτω:. Coomassie μπλε χρώση του πηκτώματος

Η

Nontargetable PRMT5 και ρ44 Έκφραση

Για να δημιουργήσετε nontargetable φορείς PRMT5 και έκφραση ρ44, οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων στόχαστρο Τα siRNAs μεταλλάχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ολιγο- άμεση κιτ μεταλλαξιγένεσης. Η GGATAAAGCTGTATGCTGT αλληλουχία στόχος της PRMT5 shRNA μεταλλάχθηκε σε GGATAAAattaTATGCTGT. Η GGGAACTAGATGAGAATGA αλληλουχία στόχος της p44 μεταλλάχθηκε σε GGGAAtTgGAtGAGAATGA. Το μεταλλαγμένο PRMT5 ή ρ44 cDNA υποκλωνοποιήθηκε στον βραδέος ιού φορέα έκφρασης (DsRed-OG2). Η ανασυνδυασμένη φακοϊού παρήχθη με 293Τ όπως περιγράφεται παραπάνω. Για τη διάσωση PRMT5 ή έκφραση ρ44, LNCaP PRMT5-shRNA ή κύτταρα ρ44-shRNA απλώθηκαν πάνω σε πλάκες έξι φρεατίων και μεταγωγή με τον ιό που περιέχει είτε το nontargetable φορέα PRMT5 ή την έκφραση ρ44 ή κενό φορέα. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα επανα-plated, και η έκφραση PRMT5 ή ρ44 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western.

. Ανοσοϊστοχημική χρώση του p44 και PRMT5 στην ανθρώπινη καλοήθη (άνω πάνελ), του προστάτη επιθηλιακή υπερπλασία (PIN, μεσαίο πάνελ), και κακοήθεις του προστάτη (PCA, Gleason βαθμού 4, κάτω πάνελ) ιστούς.

Η

Cytoplasmic και πυρηνικό εκχύλισμα Παρασκευή

Κυτταροπλασματικά και πυρηνικά κλάσματα παρασκευάστηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση του πυρηνικού εκχυλίσματος Kit (# καταλόγου 40010 και 40410, Active Motif) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]

Ανάλυση. Western Blot

PRMT5 και ρ44 ανιχνεύθηκαν συνολικά εκχυλίσματα κυττάρων (5 μικρογραμμάρια) κατά 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη μεταφοράς Immobilon-Ρ (Millipore). Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween 20 (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8, 150 mM NaCl, και 0,05% Tween 20) και αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween 20 για 1 ώρα . Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε αραιώσεις 1:2,000 (αντι-ρ44), 1:1,000 (αντι-PRMT5), 1:1000 (αντι-HSP90, Santa Cruz Biotechnology), 1? 500 (αντι-λαμίνη Β, Santa Cruz Biotechnology), και 1:1,000 (αντι-β-ακτίνης, Sigma-Aldrich). Μετά από 1,5 ώρα επώασης με χρένο δευτερεύον αντίσωμα υπεροξείδιο-συζευγμένο, ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ECL σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (GE Healthcare). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford (Bio-Rad).

συνανοσοκαθίζησης

κύτταρα PC3 (3.6 × 10

6) επιμολύνθηκαν με 6 μικρογραμμάρια pcDNA- στ: ρ44, -f: ρ44 (26-27AAA), -f: ρ44 (29-31AAA), -f: ρ44 (35-37AAA), ή -f: ρ44 (42-44AAA) με Lipofectamine 2000. Το σύνολο β-κυττάρων προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από τα επιμολυσμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και επωάζονται με 15 μικρολίτρα Μ2 αγαρόζης (Sigma) για 2 ώρες στους 4 ° C σε ένα τελικό όγκο 0.5 ml που περιέχει 20 mM HEPES (ρΗ 7,9), 0,2 mM EDTA , 20% γλυκερόλη, 2 mM DTT, 300 mM ΚΟΙ, και 0,1% ΝΡ40. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές (1 ml το καθένα) με το ρυθμιστικό διάλυμα επώασης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 30 μικρολίτρα πεπτίδια FLAG (0,2 mg /ml) για 30 λεπτά στους 4 ° C και αναλύθηκαν με στύπωμα Western με αντίσωμα αντι-PRMT5.

Protein Expression and Purification

PRMT4, ρ44, pICln, ή SmD3 cDNA κλωνοποιήθηκε σε pET15d (Novagen) που πρόκειται να εκφραστεί ως ένα αμινο-τερματικό

6-tagged πρωτείνης του. Για PRMT5 συν-έκφραση με ρ44 ή pICln, PRMT5 κλωνοποιήθηκε σε pACYCDuet (Novagen) με ένα αμινο-τερματικό

6 ετικέτα His, και το ρ44 ή pICln κωδικοποιητική περιοχή κλωνοποιήθηκε στην δεύτερη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης του ίδιου φορέα με μια Ν-τερματική ετικέτα FLAG-επιτόπου. Για PRMT5 συν-έκφραση με ρ44 και pICln, PRMT5 κλωνοποιήθηκε σε pACYCDuet με μία αμινο-τερματική His

6 ετικέτα, η περιοχή κωδικοποίησης pICln κλωνοποιήθηκε στην δεύτερη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης του ίδιου φορέα, και την περιοχή κωδικοποίησης της ρ44 κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα ρΕΤ με μία Ν-τερματική FLAG ετικέτα-επιτόπου. Οι πρωτεΐνες που εκφράζονται σε BL21 (DE3) κύτταρα στους 30 ° C για 3 ώρες μετά την επαγωγή με 0.1 mM ισοπροπυλ 1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοσίδη. Τα κύτταρα λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους τρεις φορές για 5 λεπτά κάθε σε ρυθμιστικό λύσης (10 mM HEPES, ρΗ 7.9, 0.3 Μ KCl, 0,1% ΝΡ40, 0,1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 2 βΟ /ml πεπστατίνη Α, και 2 μg /ml λευπεπτίνη). Οι πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας Νί-ΝΤΑ αγαρόζης (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με έκλουση ιμιδαζόλης και στη συνέχεια καθαρίζεται με την αγαρόζη Μ2 (Sigma-Aldrich) με πεπτίδιο FLAG έκλουσης για PRMT5 περιέχουν σύμπλοκα. Οι ιστόνες καθαρίστηκαν από κύτταρα HeLa όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

μεθυλοτρανσφεράσης Δοκιμασία

αντιδράσεις μεθυλίωσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάχιστες τροποποιήσεις [24]. Αντιδράσεις που περιέχει 6 fmol του PRMT5 ή συμπλοκών PRMT5 που περιέχει 1 μικρογραμμάριο SmD3 ή ιστόνες, και 1 microCi του S- [μεθυλ-

3Η] adenosymethionine (PerkinElmer) επωάστηκαν σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 1 mM EGTA, και 1 mM EDTA στους 30 ° C για 1 ώρα. Οι αντιδράσεις έβρασαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 15%. Οι γέλες σταθεροποιήθηκαν για 30 λεπτά σε 40% μεθανόλη-10% οξικό οξύ, επωάστηκαν σε 20 ml Amplify (Amersham Life Science) για 10 λεπτά, ξηραίνεται και εκτίθεται σε φιλμ ακτίνων Χ στους -80 ° C.

Αποτελέσματα

PRMT5 και ρ44 συν-εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

Η υποκυτταρική εντόπιση της PRMT5 δυναμικά ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ποντικιού [8]. Είναι εντοπίζεται στον πυρήνα κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης και βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των πολυδύναμων επιβλάστιο κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας από εμβρυϊκή ημέρα 6.5. PRMT5 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα σε σωματικά κύτταρα όπως 293Τ, Cos-1, U2OS, και φυσιολογικών Β-κύτταρα [35], [38], [39]. Στην τρέχουσα μελέτη μας, ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-PRMT5 έδειξαν ότι PRMT5 είναι κυρίως στο κυτταρόπλασμα των PC3 καρκίνου του προστάτη και των κυττάρων LNCaP (Εικ. 1Α, πάνελ Α και D).

Western blot των κυτοπλασμικών και πυρηνικών κλάσματα επιβεβαίωσε υποκυτταρική εντόπιση της (σχ. 1Β, άνω πλαίσιο). PRMT5 ανιχνεύθηκε επίσης στους πυρήνες των PC3 και LNCaP κύτταρα ως ξεχωριστά πυρηνικά σωματίδια (Σχ. 1Α, πάνελ c, f και g, που υποδεικνύεται με λευκά βέλη).

Ο πυρήνας περιέχει πολλές δυναμικές πυρηνικές δομές, συμπεριλαμβανομένων Cajal φορείς [40]. Αν και η λειτουργία του σώματος Cajal παραμένει άγνωστη, υπάρχουν σημαντικά στοιχεία που δείχνουν ότι μπορεί να εμπλέκεται στην ωρίμανση snRNA /βιογένεση, την επεξεργασία προ-mRNA ιστόνης, και η συναρμολόγηση των transcriptosomes [41], [42]. Το σώμα Cajal περιέχει πολλά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων coilin (ο δείκτης των φορέων Cajal), snRNPs, και ΔΠΕ. PRMT5, MEP50, pICln και Sm πρωτεΐνες αποτελούν το συγκρότημα methylosome που μεσολαβεί το συγκρότημα της συρραφής snRNP [18], [20]. ΔΠΕ-συγκρότημα, που περιέχουν τις πρωτεΐνες Sm και PRMT5, είναι αναγκαία και επαρκής για τη συναρμολόγηση UsnRNA [21], [43]. Εμείς ανοσοχρωματίστηκε LNCaP κύτταρα χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-coilin και αντίσωμα αντι-PRMT5 ποντικού. Η συγχωνευμένη εικόνα έδειξε ότι PRMT5 δεν είναι συν-εντοπίζεται με φορείς Cajal στον πυρήνα (Εικ. 1Α, πάνελ h).

Σε συμφωνία με προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα μας [25], πρωτεΐνη ρ44 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα του καρκίνου του προστάτη PC3 και LNCaP κύτταρα (Σχήμα 1Α, πάνελ b και e?. Το Σχ. 1Β, 2η πάνελ). Οι συγχωνευμένες εικόνες έδειξαν μια καλή συν-εντοπισμό των PRMT5 με ρ44 στο κυτταρόπλασμα, ενώ αυτή η συν-εντοπισμό δεν παρατηρήθηκε στον πυρήνα του PC3 και LNCaP κύτταρα (Εικ. 1Α, πάνελ c, f και g).

PRMT5 περιέχει τρία σήματα πυρηνικού αποκλεισμού

το Ν-τερματικό ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ταμπέλα σήμα PRMT5 (GFP-PRMT5) εκφράστηκε παροδικά σε PC3, LNCaP, και τα κύτταρα Cos 7, και το προκύπτον πρωτεΐνη σύντηξης GFP-PRMT5 είχε ένα κυρίαρχο κυτταροπλασματική εντόπιση (Σχήμα 2Β, πάνελ α και ε?. δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα για τα κύτταρα PC3) σε αυτά τα κύτταρα, παρόμοια με εκείνη της ενδογενούς πρωτεΐνης PRMT5 (Σχήμα 1Α, πάνελ d.). Η πρωτεΐνη GFP εντοπίζεται τόσο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 2Β, πάνελ Ι και J). Για τον προσδιορισμό του μοριακού ορίζουσα για υποκυτταρική εντόπιση του PRMT5, επικαλυπτόμενα θραύσματα που καλύπτουν ολόκληρο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του PRMT5 (Σχήμα 2Α.) Κλωνοποιήθηκαν σε πλαίσιο για να δημιουργήσει pcDNA-f: κατασκευάσματα σύντηξης GFP-PRMT5. Αυτές οι κατασκευές επιμολύνθηκαν σε Cos 7 κύτταρα για τον προσδιορισμό των κρίσιμων περιοχών των PRMT5 είναι απαραίτητες για την πυρηνική εξαγωγή ή εισαγωγή.

Δύο θραύσματα πρωτεϊνών, PRMT5 (1-324) και PRMT5 (325-637), βρέθηκαν εντός της κυτταρόπλασμα στο 100% των επιμολυσμένων κυττάρων (Εικ. 2Α), προτείνοντας ότι αυτά τα θραύσματα περιέχουν σήματα που απαιτούνται για κυτταροπλασματική εντόπιση. Η διαγραφή των καταλοίπων 144 ή 234 αμινοξέων από το C-τερματικό άκρο της PRMT5 (1-324) κομμάτι δεν επηρέασε κυτταροπλασματική εντόπιση της. Περαιτέρω εξαλείψεις έξι ή επτά κατάλοιπα αμινοξέων από το Ν-τερματικό ή Ο-τερματικό οδήγησε σε πλήρη απώλεια της κυτταροπλασματικής εντοπισμού, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα υπολείμματα αμινοξέων είναι κρίσιμη για την κυτταροπλασματική εντόπιση αυτού του θραύσματος. Η PRMT5 περιοχή (1-90) βρέθηκε μέσα στο κυτταρόπλασμα στο 100% των επιμολυσμένων κυττάρων (Σχήμα 2Α?. 2Β, πάνελ b) και είναι μία νέα NES, που ορίζεται NES1. NES1 δεν μοιάζουν με τα συμβατικά πλούσιες σε λευκίνη NES [44].

Περαιτέρω ανάλυση διαγραφής εντόπισε τα άλλα δύο NES αλληλουχίες στο C-τερματικό τμήμα της PRMT5. Η περιοχή που εκτείνεται υπολείμματα αμινοξέων 500 έως 560 που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα στο 100% των επιμολυσμένων κυττάρων (Σχήμα 2Α?. 2Β, πάνελ C). Έτσι, η PRMT5 (500-560) θραύσμα είναι επίσης ένα λειτουργικό NES, που ορίζεται NES2. Η περιοχή που εκτείνεται υπολείμματα αμινοξέων 576 έως 637 που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα στο 98% των επιμολυσμένων κυττάρων (Σχήμα 2Α?. 2Β, πάνελ δ) και είναι ένα άλλο λειτουργικό NES, που ορίζεται NES3. Η ανάλυση αλληλουχίας έδειξε ότι αυτές οι δύο αλληλουχίες NES είναι νέες και επίσης δεν μοιάζουν με τα κλασικά πλούσιες σε λευκίνη NES [44]. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλάσματα των επιμολυσμένων κυττάρων επιβεβαίωσε την κυτταροπλασματική εντόπιση των πρωτεϊνών PRMT5 πλήρους μήκους και προσδιόρισε Ness (Σχ. 3C, άνω πλαίσιο). Δεν σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLSs) ανιχνεύθηκαν στην πρωτεΐνη PRMT5 με αυτή την ανάλυση. Το ταυτοποιημένο Ness λειτούργησε παρομοίως σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 2Β, μεσαίο πάνελ) και τα κύτταρα PC3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

PRMT5 Προωθεί Κυτταροπλασματικά μετατόπιση του ρ44

PRMT5 αλληλεπιδρά φυσικά και σχηματίζει ένα σύμπλοκο με ρ44 /MEP40 /WD45 /WDR77 σε διάφορα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [33], [34], [35], και συν-εντοπισμένη με ρ44 στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (Σχ. 1Α). Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσο έκφραση PRMT5 επηρεάζει υποκυτταρικός εντοπισμός του p44. Cos 7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-GFP-ρ44 μόνη της ή μαζί με pcDNA-PRMT5. Συνεπής με τα προηγούμενα δημοσιευμένα αποτελέσματα [28], ισχυρά σήματα GFP-ρ44 ήταν εμφανείς στον πυρήνα σε επιμολυσμένα Cos 7 κύτταρα (Σχ. 3Β, πάνελ Α). Ωστόσο, η συν-έκφραση της PRMT5 οδήγησε σε αποκλειστική κυτταροπλασματική εντόπιση του GFP-ρ44 σε 100% των επιμολυσμένων κυττάρων (Σχήμα 3Α?. 3Β, πάνελ b). Η ανάλυση εξαλείψεων έδειξε ότι το τμήμα C-τερματικού (κατάλοιπα αμινοξέων 325-637) είναι απαραίτητη και επαρκής για την προαγωγή GFP-ρ44 κυτταροπλασματική μετατόπιση (Σχήμα 3Α?. 3Β, πάνελ D). Η PRMT5 γνώμονα κυτταροπλασματική μετατόπιση του ρ44 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western των κυτοπλασμικών και πυρηνικών κλάσματα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3C, άνω πλαίσιο). Παρόμοιες παρατηρήσεις ελήφθησαν με LNCaP και PC3 κύτταρα (Εικ. 3Β, δύο κάτω πλαίσια). Το συντηρημένο υπόλειμμα αργινίνης (R368) είναι απαραίτητη για την δραστικότητα μεθυλοτρανσφεράσης του PRMT5 [45]. Η μετάλλαξη του R368A για PRMT5 καταργηθεί μεθυλοτρανσφεράσης δραστηριότητά της [24], αλλά δεν επηρεάζει την ικανότητά του να προωθήσει ρ44 κυτταροπλασματική μετατόπιση (Εικ. S1). Έτσι, PRMT5 είναι η κύρια δύναμη στον καθορισμό της κυτταροπλασματικό εντοπισμό του συμπλόκου πρωτεΐνης PRMT5-ρ44.

Η Αλληλεπίδραση PRMT5-ρ44 απαιτείται για την PRMT5 με γνώμονα Η κυτταροπλασματική μετατόπιση του p44

ανάλυση Διαγραφή έδειξαν ότι τα κατάλοιπα αμινοξέων 26-45 στην πρωτεΐνη p44 ήταν κρίσιμη για την PRMT5 με γνώμονα την κυτταροπλασματική μετατόπιση του p44 (Εικ. S2). Εμείς μεταλλαγμένα τα υπολείμματα αμινοξέων (

26CME

28

29RQL

31

35RYR

37, ή

42LLL

44) για να alanines στην πρωτεΐνη ρ44 και εξέτασε τη συνέπεια αυτών των μεταλλάξεων επί PRMT5 γνώμονα κυτταροπλασματική μετατόπιση του GFP-ρ44 (Σχ. 4Α). Αυτές οι μεταλλάξεις δεν μεταβάλλουν την GFP-ρ44 υποκυτταρικού εντοπισμού σε Cos 7 κύτταρα (Σχ. 4Α, πάνελ g, m, s, y έναντι α). Ωστόσο, οι μεταλλάξεις (

35RYR

37 έως

35AAA

37 και

42LLL

44 έως

42AAA

44) καταργήθηκε PRMT5 με γνώμονα την κυτταροπλασματική μετατόπιση του GFP-ρ44 (Σχ. 4Α, πάνελ v, b ‘έναντι δ).

Αυτές οι μεταλλάξεις εκφράζονται ως FLAG επισύναψη επιτόπου πρωτεϊνών σε κύτταρα PC3. Οι μεταλλάξεις μειωμένα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ρ44 (Εικ. 4Β, το πινάκιο κορυφής, λωρίδες 2-5 έναντι λωρίδα 1). Ανοσοκαταβύθιση με το αντίσωμα αντι-FLAG ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια αγαρόζης (Μ2-αγαρόζη) έδειξε ότι οι μεταλλάξεις (

35RYR

37 έως

35AAA

37 και

42LLL

45 έως

42AAA

44) στο p44 κατάργησε την αλληλεπίδρασή του με PRMT5 (Εικ. 4Β, κάτω πάνελ, λωρίδες 4 και 5 έναντι λωρίδες 1-3). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ p44 και PRMT5 είναι απαραίτητη για την PRMT5 με γνώμονα την κυτταροπλασματική εντόπιση της p44.

Τόσο PRMT5 και ρ44 απαιτούνται για την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

Για να καθορίσει αν PRMT5 παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο του προστάτη, ελέγξαμε εάν φίμωση έκφραση PRMT5 σε κύτταρα LNCaP θα επηρεάσει την ανάπτυξή τους. Για να γίνει αυτό, σχεδιάσαμε ένα σύντομο RNA φουρκέτα-παρεμβολής (shRNA) στοχεύουν κατά την ακολουθία PRMT5. Για να ελεγχθεί αν η shRNA θα μπορούσε να καταστείλει έκφραση PRMT5, εμείς μολυσμένα κύτταρα LNCaP με τον φορέα λεντοϊού μεταγωγή ένα τμήμα DNA προσδιορίζοντας τέτοια αλληλουχία shRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, το shRNA δραματικά μειωμένη έκφραση του PRMT5 πρωτεΐνης σε κύτταρα LNCaP 4 ημέρες μετά την λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό (λωρίδα 2, άνω πλαίσιο) σε σύγκριση με την εν λόγω έκφραση από ένα μη-στόχο (ΝΤ) shRNA (διαδρομή 1, άνω πλαίσιο), του οποίου η αλληλουχία έκανε δεν ταιριάζει με κανένα γνωστό ανθρώπινο γονίδιο.