Abstract

Η θνησιμότητα από καρκίνο του προστάτη (PCA) οφείλεται στο σχηματισμό της μεταστατικής νόσου. Η κατανόηση του πώς αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι ενδογλίνη, ένας τύπος III αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (ΤΟΡβ) υποδοχέα υπεροικογένεια, καταστέλλει την ανθρώπινη εισβολή PCa κυττάρων και τη μετάσταση. ΕηάοβΗη μεσολάβηση καταστολή της εισβολής καταδείχθηκε επίσης από εμάς να εξαρτάται από την Ι ΤΟΡβ υποδοχέα, ακτιβίνη υποδοχέα-όπως κινάση 2 (Alk2), και ο καθοδικός τελεστής, Smad1 τύπου. Σε αυτή τη μελέτη αποδεικνύει για πρώτη φορά ότι οι δύο υποδοχείς τύπου II ΤΟΡβ που απαιτούνται για ενδογλίνη μεσολάβηση καταστολή της εισβολής: ακτιβίνη Α υποδοχέα τύπου ΙΙΑ (ActRIIA) και οστικής μορφογενετικής υποδοχέα τύπου II πρωτεΐνης (BMPRII). Οι μεταγενέστεροι σηματοδότηση μέσω αυτών των υποδοχέων κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από Smad1. ActRIIA διεγείρει την ενεργοποίηση Smad1 κατά τρόπο που εξαρτάται από την κινάση, και αυτό που απαιτείται για την καταστολή της εισβολής. Σε αντίθεση BMPRII ρυθμίζει Smad1 με διφασικό τρόπο, προωθώντας Smad1 σηματοδότηση μέσω του πεδίου κινάσης της, αλλά την καταστολή μέσω κυτταροπλασματική ουρά του. Smad1-ρυθμιστικές επιδράσεις BMPRII είναι εξαρτάται από το επίπεδο έκφρασης του. Περαιτέρω, η ικανότητά του να καταστέλλει την εισβολή είναι ανεξάρτητη από είτε λειτουργία κινάσης ή τον τομέα της ουράς. Έχουμε αποδείξει ότι ActRIIA και BMPRII αλληλεπιδρούν φυσικά, και ότι κάθε αλληλεπιδρά επίσης με ενδογλίνη. Τα τρέχοντα ευρήματα δείχνουν ότι τόσο BMPRII και ActRIIA είναι απαραίτητες για την ενδογλίνη μεσολάβηση καταστολή της ανθρώπινης εισβολής των κυττάρων του προστάτη, ότι έχουν διαφορετικές επιδράσεις στις Smad1 σηματοδότησης, που κάνουν ξεχωριστές συνεισφορές σε ρύθμιση της εισβολής, και ότι λειτουργικά και φυσικά αλληλεπιδρούν.

Παράθεση: Breen MJ, Moran DM, Liu W, Huang Χ, Vary CPH, Bergan RC (2013) ΕηάοβΗη διαμεσολαβείται καταστολή του καρκίνου του προστάτη εισβολή ρυθμίζεται από υποδοχείς Ακτιβίνης και Μορφογενετικής οστών πρωτεΐνη τύπου II. PLoS ONE 8 (8): e72407. doi: 10.1371 /journal.pone.0072407

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Αύγ 2013

Copyright: © 2013 Breen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας για RCB, CA122985. Το έργο αυτό υποστηρίζεται εν μέρει από τις Malkin μελετητές Προγράμματα από το Robert H. Lurie Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Northwestern μέσω ανάθεσης σε MB. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας του καρκίνου για τις ΗΠΑ άνδρες [1], με ουσιαστικά όλες οι θάνατοι που προκύπτουν από μεταστατική νόσο [2]. Η μετάσταση είναι μια πολύ αναποτελεσματική διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα πρέπει να ξεπεραστούν πολλά εμπόδια, μια αρχική ένας εκ των οποίων είναι να ξεφύγουν από τον τόπο της καταγωγής από την εξαγορά της επεμβατικής φαινότυπο [3]. Σηματοδότηση μέσω του ΤΟΡβ υπεροικογένεια και τους αντίστοιχους υποδοχείς του είναι ένας βασικός ρυθμιστής αυτής της διαδικασίας σε πολλές μορφές καρκίνου του [4], συμπεριλαμβανομένων προστάτη [5]

TGFβ είναι το πρωτότυπο μέλος της οικογένειας των εξωκυτταρικών συνδετήρων -. Εκ των οποίων υπάρχουν 33 στα θηλαστικά – που ρυθμίζουν πολλές αναπτυξιακές και ομοιοστατική διαδικασίες, και το κάνει μέσω ενός σχετικά συντηρημένο μηχανισμό σηματοδότησης [6]. Με κανονική σηματοδότηση TGFβ, σύνδεσης συνδετήρα επάγει ολιγομερισμό των διμερών τύπου Ι κινάσης σερίνης /θρεονίνης και οι υποδοχείς ΙΙ (RIS και Riis, αντίστοιχα) τύπου, όπου ουσιαστικά δραστική Riis συνέχεια φωσφορυλιώνει ΥΠΕΝ. Αυτά τα ενεργοποιημένα ΥΠΕΝ συνέχεια φωσφορυλιώνει μεταγενέστερος Smads σχετίζεται με τον υποδοχέα (R-Smads). Το φωσφορυλιωμένο R-Smad συνδέεται ακολούθως προς το κοινό μεσολαβητή, Smad4, και τα προκύπτοντα σύμπλοκα επηρεάζουν την γονιδιακή μεταγραφή. Σε γενικές γραμμές, η σηματοδότηση μέσω αυτής της υπεροικογένειας μπορεί να υποδιαιρεθεί σε ΤΟΡβ-σαν συνδέτες του οποίου συγγενές RIS τείνουν να είναι ακτιβίνη υποδοχέα όπως κινάση (ALK) 4, 5, ή 7, που τείνει να ενεργοποιήσει R-Smads Smad2 ή 3, και οστική μορφογενετική πρωτεΐνη (ΒΜΡ) -όπως συνδετήρες σηματοδότησης μέσω συγγενών RIS ALK1, 2, 3, ή 6, και το R-Smads Smad1, 5 ή 8.

ΕηάοβΗη (που αναφέρεται επίσης ως CD105) είναι μία ομοδιμερής διαμεμβρανική πρωτεΐνη που δρα ως ένα βοηθητικό υπεροικογένεια υποδοχέα ΤΟΡβ, και θεωρείται ένας υποδοχέας τύπου III [7] – [9]. ΕηάοβΗη διαμορφώνει τη σηματοδότηση κατάντη του ΤΟΡβ και ΒΜΡ συνδετήρες, που τείνει να προωθήσει σηματοδότηση κατά προτίμηση μέσω ΒΜΡ-όπως μονοπάτια, ενώ αναστέλλει ΤΟΡβ-όπως οδοί [10] – [14]. Επιπλέον, ενδογλίνη ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες μέσω μη-Smad εξαρτάται από μονοπάτια. Των σχετικών με κυτταρική εισβολή, ενδογλίνη αλληλεπιδρά μέσω κυτταροπλασματική περιοχή του με τα LIM-τομέα που περιέχουν πρωτεΐνες zyxin και zyxin πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1 για τη ρύθμιση της εστιακής σύνθεση προσκόλληση και τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης [15], [16]. Επιπλέον, ενδογλίνη ρυθμίζει την ενεργοποίηση ιντεγρίνης και σηματοδότηση σε έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών [17] – [21]. ΕηάοβΗη μπορεί επίσης να ρυθμίζουν το δυναμικό μετασχηματισμού του H-Ras [22].

Ο ρόλος της ενδογλίνης στον καρκίνο είναι πολύπλοκη, δεδομένου διαφορική έκφραση και η λειτουργία σε όλους τους τύπους κυττάρων [23], [24]. Οι περισσότερες μελέτες της λειτουργίας ενδογλίνης έχουν διεξαχθεί σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Βλαστικές μεταλλάξεις σε ενδογλίνη προκαλέσει την γενετική ασθένεια κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειεκτασία [25], τονίζοντας το ρόλο ενδογλίνη ως βασικός ρυθμιστής ενδοθηλιακών κυττάρων κινητικότητα, εισβολή και εξάπλωση. Σε πολλαπλά καρκίνους συμπεριλαμβανομένων PCa, ενδογλίνη υπερεκφράζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα του μικροαγγειακού και σχετίζεται με την αγγειογένεση [26] – [28]. Είναι επίσης ιδιαίτερα εκφράζεται στο μικροπεριβάλλον στρωματικών [29]. Έτσι, στο συνολικό επίπεδο ιστού, ενδογλίνη συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο. Σε αντίθεση και μεγάλη σημασία, σε επιθηλιακά κύτταρα πολλών συμπαγών όγκων – και επιθήλιο προστάτου ειδικότερα – εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι η έκφραση ενδογλίνη χάνεται με την εξέλιξη της νόσου [30], [31]. Έχουμε δείξει ότι η απώλεια αυτή προάγει κυτταρική αποκόλληση [31], κύτταρο εισβολή [14], [32] και τη μετάσταση [33]. Μηχανιστικά, έχουμε δείξει ότι καταστέλλει ενδογλίνη εισβολή κατά τρόπο που εξαρτάται από τη RI Alk2 και κατάντη R-Smad Smad1 [14]. Ωστόσο, οι Riis που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία παραμένουν άγνωστες.

Δεδομένου του ρόλου του Alk2 και Smad1 στην ενδογλίνη μεσολάβηση καταστολή της εισβολής (EMSI) στο ΣΕΣ, υποθέσαμε ότι μία ή περισσότερες Riis που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Στην έκθεση αυτή έχουμε εντοπίσει ότι ActRIIA και BMPRII απαιτούνται. Είναι ενδιαφέρον, έχουν αντίθετες επιπτώσεις στην κατάντη σηματοδότησης Smad1. ActRIIA προωθεί την προηγουμένως εντοπιστεί άξονα σηματοδότησης, ενώ BMPRII έχει δικόρυφη λειτουργία, την προώθηση Smad1 εξαρτώμενη από τη σηματοδότηση μέσω της δραστηριότητας κινάσης της ενώ αναστέλλοντας μέσω μεγάλων του κυτταροπλάσματος τομέα ουρά του. Μαζί αυτά τα ευρήματα είναι η πρώτη για τον εντοπισμό ActRIIA και BMPRII ως σημαντικοί ρυθμιστές της EMSI και να αποδείξουν ότι λειτουργούν μέσω διακριτών ακόμη αλληλεξαρτώμενες μηχανισμούς. Τα αποτελέσματα αυτά ανοίγουν νέες λεωφόρους για φαρμακολογική στόχευση του προστάτη μεταστατικό δυναμικό

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture & amp.? Επιμόλυνση

Η προέλευση και οι συνθήκες καλλιέργειας για τα ανθρώπινα κύτταρα PC3-Μ προστάτη έχουν περιγραφεί [34]. Η γραμμή PC3-M είναι ένα εξαιρετικά μεταστατικό PC3-παράγωγο κυτταρική σειρά. Αυτά διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 2 mM L-γλουταμίνη, 10 mM ρυθμιστικού HEPES, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Life Technologies, Grand Island ΝΥ). κύτταρα DU145 είναι ανθρώπινα κύτταρα προστάτη που προέρχονται από μετάσταση στον εγκέφαλο και ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με τα προαναφερθέντα προϊόντα εκτός από 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Life Technologies). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% διοξειδίου του άνθρακα και 95% αέρα κάτω από υπο-συρρέουσα εκθετική συνθήκες ανάπτυξης με ανά τρείς εβδομάδας αλλαγές του μέσου, και αντικαταστάθηκαν με σταθερό πέρασμα κυττάρων σε τακτική βάση.

οι κυτταρικές γραμμές επικυρωμένο σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφονται στην American Type Culture Collection Technical Bulletin Νο 8, Cell Συστάσεις Γραμμή δοκιμή επαλήθευσης [35]. Ειδικά, κύτταρα από χαμηλή διέλευση (δηλαδή, & lt?. 15 διελεύσεις) κατεψυγμένων αποθεμάτων χρησιμοποιήθηκαν και αναπληρώνονται μετά από 20 περάσματα? κύτταρα υποβλήθηκαν ρουτίνας μικροσκοπική εξέταση για να επιβεβαιωθεί ομοιόμορφη και τυποποιημένη κυτταρική αρχιτεκτονική και καμία μικροβιακή μόλυνση? και τα κύτταρα ελέγχθηκαν (εντός τριών μηνών) και βρέθηκαν αρνητικά για μόλυνση του μυκοπλάσματος.

Παροδική διαμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Εν συντομία, 24 ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με διαμετακόμιση-LT1 Επιμόλυνσης Αντιδραστήριο (Mirus Bio LLC, Madison, WI) για δοκιμασίες εισβολή που περιλαμβάνουν μόνο DNA πλασμιδίου, με Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) για δοκιμασίες εισβολή συνεπάγεται ταυτόχρονη παράδοση πλασμιδιακού DNA και siRNA, ή με Dharmafect2 (Thermo Scientific, πρώην Dharmacon) για πειράματα εισβολή και λουσιφεράσης που αφορούν την παράδοση των siRNA μόνο. Για πειράματα ανοσοκαθίζησης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο DNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX (Life Technologies). Τα κύτταρα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες υποδεικνυόμενες 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όλα τα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε μερικά πειράματα, όπως υποδεικνύεται, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, άνευ ορού σε μέσα που περιέχουν 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού για 3 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 ng /ml ΤΟΡβ, 5 ng /ml BMP7, ή 20 ng /ml ΒΜΡ9 για 30 λεπτά πριν από την λύση

Αντιδραστήρια

εξουδετέρωσης αντισώματος σε ActRIIA, Ρο-ActRIIA και παγίδες συνδέτη Ρο-BMPRII, και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΤΟΡβ αγοράστηκαν από Κ &?. D Systems (Minneapolis ΜΝ) . Αντισώματα για τις ακόλουθες πρωτεΐνες αγοράστηκαν: φωσφο-Smad1 /5, φωσφο-Smad1 /5/8, με Smad1, και Myc-tag από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ), ενδογλίνη από BD Biosciences (San Jose, CA), GAPDH από Enzo Βιοεπιστημών (Farmingdale ΝΥ), FLAG-tag και Myc-tag από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ), α-τουμπουλίνης από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Η + L) F (ab ‘) 2 θραύσμα από KPL (Gaithersburg, MD), και ολόκληρο αντίσωμα γαϊδάρου ECL αντι-κουνελιού από την GE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, ΡΑ). Τα siRNA που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν όλοι οι πισίνες των τεσσάρων επιμέρους siRNAs, διέταξε από Thermo Scientific ως ON-TARGETplus SMARTpools

πλασμίδια

Οι ακόλουθοι φορείς έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν:. PCDNA3 άδειο φορέα που αγοράζονται από τη ζωή Technologies, ενδογλίνη σε ένα φορέα pCDNA3, κατασκευάστηκε και περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [31], ρΟΜν-β-γαλακτοσιδάσης (β-gal) που αγοράστηκε από την Agilent Technologies (Santa Clara, CA), pCDNA3-ActRII, pCDNA3-ActRIIA-ΔKD- 5myc, pCDNA3-ActRIIB και pCDNA3-ActRIIB-ΔKD-5myc ήταν γενναιόδωρα παρέχεται από Wylie Vale (Salk Institute, La Jolla, CA) [37], [38], pCDNA3-ActRIIA-myc δημιουργήθηκε από pCDNA3-ActRIIA από Προσαρμοσμένο DNA κατασκευάσματα (University Heights, ΟΗ), ρΟΜν5-BMPRII, -BMPRII-ΚΙ και -BMPRII-Δtail κατασκευάσματα γενναιόδωρα παρέχεται από Liliana Αίίΐδαηο (Πανεπιστήμιο Toronoto, Καναδάς) [39], pGL3-MLP-BRE

2-λουσιφεράσης ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από Peter δέκα Dijke (Πανεπιστήμιο Leiden Ιατρικό Κέντρο, Κάτω Χώρες) [40], pRL-ΤΚ

Renilla

λουσιφεράσης αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI).

εισβολή Αναλύσεις

δοκιμασίες Invasion πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [41], με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη DNA και β-gal, με ή χωρίς siRNA όπως υποδεικνύεται. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 8.0 μm πόρου Growth Factor-Μειωμένη εισβολής σε Matrigel Chambers (BD Biosciences) σε μέσο χωρίς ορό που περιέχει 0,1% BSA, σε επαναλήψεις των Ν = 4 φρεάτια για κάθε πειραματική συνθήκη. Ελεύθερα ορού ΝΙΗ-3Τ3 ρυθμισμένα μέσα τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκυστικό, και τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 24 ώρες. Κύτταρα στην κορυφή της μεμβράνης αφαιρέθηκαν από τρία φρεάτια ανά συνθήκη (επιτρέποντας την ποσοτικοποίηση του εισέβαλαν κύτταρα) ενώ το τέταρτο αφέθηκε ανενόχλητη (σύνολο ελέγχων κυττάρου). Μετά τον καθορισμό των κυττάρων και χρώση για έκφραση β-gal χρησιμοποιώντας μια In Situ β-Γαλακτοσιδάση χρώσης Kit (Agilent Technologies), εννέα μικροσκοπικά πεδία (100χ) ανά καλά απεικονίστηκαν σε ένα μικροσκόπιο Olympus CKX41 εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή CCD QImaging RETIGA 1300 και λογισμικό απεικόνισης QCapture. β-gal θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε τομέα χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J και ομαλοποιήθηκε εισβολή προσδιορίστηκε για κάθε φρεάτιο ως βαβΙ

+ κύτταρα σε εισβολή καλά /β-gal

+ κύτταρα σε συνολικό καλά. Σχετική εισβολή υπολογίστηκε ως ένα κλάσμα του κατάσταση ελέγχου (π.χ. με κενό φορέα /siNeg).

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia , CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase ελεύθερη DNase και η ποιότητα και η ποσότητα των αξιολογούνται με οπτική πυκνότητα. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας είτε TaqMan Reverse Transcription Αντιδραστήρια (Life Technologies) ή qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD), και qPCR εκτελούνται χρησιμοποιώντας TaqMan καθολική PCR Master Mix και TaqMan ζεύγη εκκινητών-ανιχνευτών σε 7500 Real Time PCR System (όλα από την Life Technologies), όλα όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [33]. RT μείον ελέγχου αντιδράσεις λειτουργεί ως αρνητικός μάρτυρας. Οι επικυρωμένες γονίδιο ειδικό εξόνιο που εκτείνονται σε σύνολα εκκινητών /ανιχνευτών για ACVR2A, ACVR2B, BMPRII, ΤΟΡβΚΙΙ, ενδογλίνη, Smad1, Smad5, Smad8, και GAPDH ήταν από την Applied Biosystems. Οι δοκιμασίες τρέχουν σε επαναλήψεων των 2 και των προκυπτόντων μέση κύκλους κατωφλίου (Ct) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Οι προσδιορισμοί επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά σε ένα ξεχωριστό χρόνο, επίσης σε επαναλήψεις 2. Η Ct για μεμονωμένες αντιδράσεις αναγνωρίστηκε μέσω της Applied Biosystems 7500 λογισμικό Real Time PCR System. Η γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε με εκείνη του GAPDH, και η σχετική έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε από το 2

-ΔΔCt μέθοδο [42].

λουσιφεράσης

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pGL3 BRE

2-λουσιφεράσης (επαγώγιμη) και ρΡΙ_-ΤΚ (συστατική) πλασμίδια σε αναλογία 20:01, με επιπλέον πλασμίδια ± siRNAs όπως υποδεικνύεται, όπως περιγράφεται προηγουμένως από εμάς [14]. Εν συντομία, μετά από 48 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). Οι μετρήσεις έγιναν είτε σε αναγνώστη πλάκας Synergy ΗΤ (BioTek, Winooski, VT) ή ένα φωτόμετρο Monolight 2010 (Analytical Luminescence Laboratory, San Diega CA). Μετά την αφαίρεση του σήματος υποβάθρου, η δραστικότητα της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως λόγος της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας /

Renilla

λουσιφεράσης.

Western Blotting

κυτταρόλυση και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [ ,,,0],14]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: PBS (137 mM NaCl, 10 mM φωσφορικό, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton Χ-100, 1 mM EDTA, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό με την προσθήκη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (# P8340,) κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης 1 και 2, 10 mM φθοριούχο νάτριο, και 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο (όλα από την Sigma-Aldrich), και τα προϊόντα λύσης διαυγάζονται με φυγοκέντρηση, όλα σε 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), ίσες ποσότητες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE υπό μετουσιωτικές και αναγωγικές συνθήκες, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη (Bio-Rad), και χρωματίστηκαν με Ponceau S (Sigma-Aldrich ) να ελέγξει ακόμη και τη φόρτωση και μεταφορά. Οι μεμβράνες είτε μπλοκαριστεί και ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές (4 ° C όλη τη νύχτα) και δευτερεύον αντίσωμα (1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) σε 5% γάλα σε ΤΒδ-Τ (25 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) ή μπλοκαριστεί και ανιχνεύθηκαν με 0,5% γάλα /ΤΒδ-Τ χρησιμοποιώντας SNAP id πολλαπλή κενού (Millipore), ανά υποδείξεις του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ECL Western Blotting Ανίχνευσης Αντιδραστήρια και εκτέθηκαν σε Amersham Hyperfilm ECL (και τα δύο από την GE Healthcare). Ταινίες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας έναν επεξεργαστή φιλμ SRX-101A (Konica Minolta, Wayne, NJ). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν σε 62,5 mM Tris (ρΗ 6.8), 2% SDS, και 100 mM β-μερκαπτοαιθανόλης για 20 λεπτά στους 50 ° C, πλύθηκαν εν συντομία σε ΤΒδ-Τ, και την εκ νέου ανιχνεύθηκαν όπως παραπάνω. Όλοι οι λεκέδες Western επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά, σε διαφορετική στιγμή.

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επιφανειακές πρωτεΐνες συνδέθηκαν σταυροειδώς με 2 mM υδατοπερατό αντιδραστήριο εγκάρσιας σύνδεσης 3,3′- διθειοδις (sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP? Thermo Scientific) σε PBS. Διασταύρωσης αντίδραση σβήστηκε με την προσθήκη Tris, ρΗ 7.5 έως 20 mM. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν όπως παραπάνω χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα αποτελούμενο από τα ακόλουθα: 10 mM Tris HCI, ρΗ 7.4? 145 mM NaCl? 10% γλυκερίνη? 0.5% ΝΡ-40? πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης όπως παραπάνω. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford όπως παραπάνω. Μία ίση ποσότητα πρωτεΐνης προδιαυγάστηκε με σφαιρίδια αγαρόζης συζευγμένα σε ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Α (Life Technologies? Χρησιμοποιούνται για IgG κουνελιού) ή πρωτεΐνης G Plus (Thermo Scientific? Χρησιμοποιούνται για IgG ποντικού) για 1 ώρα στους 4 ° C με περιστροφή. Προδιαυγασθέν λύματα μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες και επωάζονται με IgG όλη τη νύκτα στους 4 ° με περιστροφή. σύμπλοκα αντισώματος-αντιγόνου ανακτήθηκαν με 2 ώρες επωάσεως με πρωτεΐνη Α ή πρωτεΐνη G, σε συμφωνία με την βαθμίδα προηγούμενου προσδιορισμού. Τα σφαιρίδια ανακτήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και αποθηκεύτηκε. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα δείγματα εξισορροπήθηκαν σε ρυθμιστικό 1Χ Laemmli που περιείχε 5% β-μερκαπτοαιθανόλη (Sigma-Aldrich) και επωάστηκαν σε 95 ° C θερμαντική πλάκα για 6 λεπτά, μείωση και τη μετουσίωση των δειγμάτων και διάσπαση του μέσου διασύνδεσης. Τα δείγματα στυπώθηκαν Western όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική Ανάλυση

Για να αναλυθεί προσδιορισμούς εισβολής t-tests μονόπλευρο unpaired Student είχαν υπολογιστεί με βάση τον φαινότυπο αξιολογείται αντιστροφή καταστολή της εισβολής. Για λουσιφεράσης και qRT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν t-τεστ δύο-ουρά unpaired Student του Μαθητή. P values≤0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

ΕηάοβΗη διαμεσολαβείται καταστολή της Εισβολή Απαιτεί ActRIIA και BMPRII

ΕηάοβΗη μεσολάβηση καταστολή της εισβολής (EMSI) σε προστάτη απαιτεί RI, δηλαδή, Alk2 [14]. Επιπλέον, κανονική σηματοδότηση μέσω της υπεροικογένειας των υποδοχέων ΤΟΡβ απαιτεί εξαρτώμενη από συνδετήρα ενεργοποίηση του RI από [6] RII. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι EMSI θα απαιτεί μία ή περισσότερες Riis. Αξιολογήσαμε αυτό με την επιμόλυνση PC3-Μ και DU-145 ανθρώπινα κύτταρα προστάτη με ενδογλίνη, μαζί με siRNA ειδικά για ατομικές υποτύπους RII: ακτιβίνη Α υποδοχέα τύπου ΙΙΑ (ActRIIA), ακτιβίνη Α υποδοχέα τύπου ΙΙΒ (ActRIIB), τον τύπο του υποδοχέα της πρωτεΐνης των οστών μορφογενετικών II (BMPRII) ή αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β υποδοχέα τύπου II (ΤΟΡβΚΙΙ). Και για τα δύο PC3-M και DU-145 κύτταρα, ενδογλίνη καταστέλλει σημαντικά την εισβολή στο 60% και 50% των κυττάρων ελέγχου, αντίστοιχα, και αυτό καταργείται με siRNA ActRIIA στόχευσης ή BMPRII αλλά όχι ActRIIB ή ΤΟΡβΚΙΙ (Σχήμα 1Α). Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός της ActRIIA και BMPRII σε επηρεάζουν EMSI, οι μελέτες επικεντρώθηκαν στα ανθρώπινα κύτταρα PC3-Μ ΣΕΣΣ. Αποτελούν ένα μεταστατικό φαινότυπο [34] και είναι γνωστό ότι εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα κατά την έναρξη της ενδογλίνη [14].

Α) Η επίδραση των υποδοχέων II για τη μεσολάβηση ενδογλίνη καταστολή της εισβολής (EMSI) τύπου. PC3-M (αριστερά) ή DU-145 (δεξιά) κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα (Vec) ή με ενδογλίνη μαζί με siRNA, όπως υποδεικνύεται. Οι ακόλουθες siRNAs χρησιμοποιήθηκαν: siNeg – μη στόχευση αρνητικού ελέγχου, si2A – στοχεύει ActRIIA, si2B – στόχους ActRIIB, siBMP – στόχους BMPRII, siTGF – στόχους ΤΟΡβΚΙΙ. Μετά από 48 ώρες, η κυτταρική εισβολή μετρήθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις 3. *, p ≤ 0,05 σε σύγκριση με Vec /siNeg. Μικρογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων που έχουν εισβάλλει μέσα Matrigel, χρωματίστηκαν για βgal, και απεικονίζεται (μεγέθυνση 100Χ). Β) ActRIIA και BMPRII siRNA είναι συγκεκριμένες. κύτταρα PC3-M επιμολύνθηκαν παροδικά με ενδογλίνη, μαζί με τις υποδεικνυόμενες siRNAs όπως στο (Α). Μετά την έκφραση του mRNA 48 ωρών εκτιμήθηκε μέσω qRT-PCR, κανονικοποιημένη προς GAPDH, και εκφράζεται σε σχέση με siNeg-επιμολυσμένα κύτταρα (κανονικοποιημένη σε 1,0). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από ένα μόνο πείραμα, πραγματοποιήθηκε σε επαναλήψεις Ν = 2? παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ένα ανεξάρτητο πείραμα (Ν = 2 αντίγραφα). *, P ≤ 0,05 σε σύγκριση με siNeg. Γ) ActRIIA και BMPRII siRNA καταστέλλει πρωτεΐνη-στόχο. κύτταρα PC3-M επιμολύνθηκαν με ActRIIA-myc (άνω πάνελ) ή BMPRII-σημαία (κατώτερο πάνελ), καθώς και με τις υποδεικνυόμενες siRNAs, που ακολουθείται από κηλίδα Western για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. Τα δεδομένα είναι από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (Ν = 2 ξεχωριστά πειράματα). Δ) Αποκλεισμός ActRIIA ή δέσμευση αναστέλλει EMSI συνδέτη BMPRII. κύτταρα PC3-M επιμολύνθηκαν παροδικά με άδειο φορέα ή ενδογλίνη όπως παραπάνω. Μετά από 2 ημέρες, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν για 5 ώρες συνδέτη παγίδες που αποτελείται από ActRIIA ή BMPRII εξωκυτταρικό πεδίο συντήκεται προς ανοσοσφαιρίνης Fc περιοχή (Fc-A2 ή Fc-B2 αντίστοιχα). Η θεραπεία συνεχίστηκε κατά τη διάρκεια της μετέπειτα συμπεριφορά των προσδιορισμών των κυττάρων εισβολής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα σε επαναλήψεις Ν = 3. *, p ≤ 0,05 σε σύγκριση με Vec /-.

Η

Υπάρχει στενή ομολογία μεταξύ ΤΟΡβ υπεροικογένεια υποδοχέων. Επομένως, είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την αντιμετώπιση ειδικότητα siRNA, τα οποία δείχνουμε στο σχήμα 1Β. Χρησιμοποιώντας ειδικά αρχικά τεμάχια σειράς για κάθε υποδοχέα, δείχνουμε με qRT-PCR ότι υποδοχέα ειδικό siRNA χτυπά σημαντικά τη στοχευμένη υποδοχέα με ≥60% σε κάθε περίπτωση, χωρίς σημαντική διαμόρφωση των υποδοχέων που δεν αποτελούν στόχο. Η αποτελεσματικότητα και η εξειδίκευση του siRNA που στοχεύει ActRIIA και BMPRII ήταν επόμενο καταδειχθεί με μέτρηση επιδράσεις στο επίπεδο πρωτεΐνης. Ένα ενδημικό πρόβλημα στο πεδίο σχετίζεται με το γεγονός ότι αντισώματα που εγείρονται κατά ενός συγκεκριμένου υποτύπου υπεροικογένεια υποδοχέα ΤΟΡβ τείνουν να έχουν σχετικά υψηλά επίπεδα διασταυρούμενης αντιδραστικότητας. Εξετάσαμε αυτό με συν-επιμόλυνση κυττάρων είτε με myc-tagged ActRIIA ή FLAG-tagged BMPRII, μαζί με siRNA σε μεμονωμένα Riis, που ακολουθείται από ετικέτα-ειδικό στύπωμα Western (Σχήμα 1 C). Με αυτό τον τρόπο δείχνουμε υποδοχέα-ειδικό siRNA μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης σε σχεδόν μη ανιχνεύσιμα επίπεδα τόσο για ActRIIA και BMPRII.

Η δέσμευση της εξωκυττάριας συνδετήρων προς ActRIIA και BMPRII αποτελεί κύριο καθοριστικό παράγοντα της λειτουργίας σηματοδότησης τους. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι εάν ActRIIA και BMPRII είναι πραγματικά σημαντικοί ρυθμιστές του EMSI, τότε διαμόρφωση τους της διαδικασίας αυτής θα πρέπει να εξαρτάται από συγγενή προσδέματα, τουλάχιστον εν μέρει. Έχουμε διαπιστώσει ότι αυτό είναι στην πραγματικότητα η περίπτωση με επιμόλυνση κυττάρων με ενδογλίνη, ακολουθούμενο με τη μέτρηση της επίδρασης επί εισβολή όταν εξωκυτταρικό συγγενών προσδετών αποκλείστηκαν από τον υποδοχέα δέσμευσης (Σχήμα 1 D). Αυτό επιτεύχθηκε με κατεργασία κυττάρων με ανασυνδυασμένα κατασκευάσματα πρωτεΐνη, Fc-A2 ή Ρο-Β2, που αποτελείται από το ActRIIA ή BMPRII εξωκυτταρικούς τομείς, αντίστοιχα, σε σύντηξη με μία σταθερή περιοχή ανοσοσφαιρίνης, έτσι χρησιμεύει ως παγίδα συνδετήρα. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 1Δ, το κλείδωμα της δέσμευσης συνδέτη είτε υποδοχέα αντιστρέφει EMSI. Αυτές οι μελέτες συνδέτη-blocking συμπληρώσουν τις σπουδές νοκ ντάουν μας. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας εμπλέκουν ActRIIA και BMPRII ως σημαντική φυσιολογική ρυθμιστές της EMSI.

ActRIIA και BMPRII έχουν αντίθετες επιπτώσεις στη μεταγενέστερη Smad1 Σηματοδοσίας

Έχουμε ήδη αποδείξει ότι ενδογλίνη αυξάνει φωσφορυλίωση Smad1, ότι Smad1 καταστέλλει κύτταρο εισβολή, και ότι Smad1 είναι απαραίτητη για EMSI [14]. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την επίδραση της ActRIIA και BMPRII σχετικά με τη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης Smad1. Αυτό έγινε με χτυπήσει κάτω ActRIIA ή BMPRII μέσω επιμόλυνση των κυττάρων PC3-M με siRNA ενώ συνεπιμόλυνση με κενό φορέα ή ενδογλίνη. Η φωσφορυλίωση του Smad1 στη συνέχεια αξιολογήθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 2Α). Ανεξάρτητα από την κατάσταση ενδογλίνη, νοκ ντάουν της ActRIIA μειώνει τα επίπεδα φωσφο-Smad1. Παραδόξως, νοκ ντάουν της BMPRII έχει το αντίθετο αποτέλεσμα? αυξάνει φωσφο-Smad1. Όπως και με προηγούμενες μελέτες μας [31], η ενδογενής έκφραση ενδογλίνη σε κύτταρα PC3-M είναι τόσο χαμηλό ώστε να προσεγγίσει το όριο ανίχνευσης.

κύτταρα PC3-M επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα ή ενδογλίνη και την ένδειξη της siRNA όπως στο Σχήμα 1. Δύο ημέρες αργότερα τα κύτταρα λύθηκαν για στύπωμα Western (Α) ή δοκιμασία υποκινητή λουσιφεράσης (Β). Α) ActRIIA και BMPRII ρυθμίζουν διαφορικά πρωτεΐνη φωσφορυλίωσης Smad1. κηλίδα Western επί προκύπτον προϊόν λύσης κυττάρου διεξήχθη για Smad1, φωσφο-Smad1 /5 (pSmad1 /5), ενδογλίνη και GAPDH. Τα δεδομένα είναι από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (Ν = 4 πειράματα). Β) ActRIIA και BMPRII διαφορικά ρυθμίζει BRE ενεργοποίηση

2-λουσιφεράσης. Τα κύτταρα επιπλέον συν-επιμολύνθηκαν με BRE

2-λουσιφεράσης και

Renilla

λουσιφεράσης κατασκευάσματα, και δραστικότητα λουσιφεράσης (κανονικοποιημένη σε

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης) μετρήθηκε. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD από ένα μοναδικό πείραμα διεξήχθη σε επαναλήψεις Ν = 2, η οποία διεξήχθη τρεις ξεχωριστές φορές με παρόμοια αποτελέσματα (επίσης Ν = 2). *, P ≤ 0,05 μεταξύ των υποδεικνύεται ομάδων. Γ) BMP7- και ΒΜΡ9 διεγερμένα Smad1 φωσφορυλίωση ρυθμίζεται διαφορετικά από ActRII και BMPRII. Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν όπως παραπάνω, στέρηση ορού, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BMP7 ή ΒΜΡ9 όπως υποδεικνύεται. κηλίδα Western επί προκύπτον προϊόν λύσης κυττάρου διεξήχθη για φωσφο-Smad1 /5 (pSmad1 /5) και το συνολικό Smad1. Τα δεδομένα είναι από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα (Ν = 2 πειράματα).

Η

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν στο ίδιο σύστημα είμαστε σήμερα χρησιμοποιούν αυτή που επάγεται πρωτογενή αυξήσεις στην κατάσταση έκφρασης ενδογλίνη προκαλέσουν αυξήσεις τόσο Smad1 φωσφορυλίωση καθώς και όπως στην μεταγραφική δραστικότητα Smad1, όπως μετρήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το Smad1 αποκρίνεται BRE κατασκεύασμα ανταποκριτή

2-λουσιφεράσης [14]. Είναι σημαντικό ότι, σε αυτό το ίδιο το σύστημα, έχουμε επίσης καταδείξει πώς πολλές διαφορετικές διαταραχές έχουν ασύμφωνα αποτελέσματα επί φωσφορυλίωσης Smad1 και λειτουργική δραστικότητα μεταγραφικής του. Ωστόσο, σε όλες τις περιπτώσεις, οι αλλαγές στην μεταγραφική Smad1 λειτουργία αντανακλάται συγκλίνουσες αποτελέσματα επί βιολογική λειτουργία, όπως εκτιμήθηκαν από συνδεδεμένες knockdown μελέτες Smad1 καθώς και δοκιμασίες εισβολή [14], [32]. Αν και ο μηχανισμός στηρίζεται αυτό το φαινόμενο δεν είναι εντελώς σαφής, φαίνεται να αντανακλά το γεγονός ότι τα ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη περιέχουν πολύ υψηλά επίπεδα όξινης φωσφατάσης, και ότι κατά τη διάρκεια κυτταρικής λύσης που έχει πρωτεΐνη-ειδικές επιδράσεις που δεν μπορεί να ασκηθεί επαρκώς υπό έλεγχο, ακόμη και με υψηλό επίπεδα των αναστολέων φωσφατάσης [43]. Συνεπώς, θεωρούμε την αξιολόγηση της λειτουργίας της μεταγραφής Smad1 να είναι το ενημερωτικό δοκιμασία. Ως εκ τούτου, πήγαμε για να αξιολογηθεί η επίδραση των ActRIIA και BMPRII νοκ ντάουν για BRE ενεργοποίηση

2-λουσιφεράσης (Εικόνα 2Β). Και πάλι δείχνουμε ότι, ανεξάρτητα από την κατάσταση ενδογλίνη, νοκ ντάουν της ActRIIA μειώνει σημαντικά τη λειτουργία Smad1 ενώ νοκ ντάουν της BMPRII αυξάνει σημαντικά. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τα δεδομένα φωσφορυλίωσης Smad1 στο Σχήμα 2Α, και αποδεικνύουν ότι οι αλλαγές στην φωσφορυλίωση Smad1 σχετίζεται με αλλαγμένη Smad-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή. Ωστόσο, μπορούν επίσης να αποδείξουν ότι BMPRII αποτελέσματα που προκαλούνται κατά Smad1 μεταγραφική λειτουργία δεν είναι σύμφωνες με ισχύ BMPRII του κατά EMSI.

Για να διερευνήσουν περαιτέρω BMPRII, εξετάσαμε αποτελέσματα μετά σηματοδότησης υπό συνθήκες μορφογενετική πρωτεΐνη οστού (ΒΜΡ) διέγερση συνδέτη . ActRIIA και BMPRII χτυπήθηκαν κάτω όπως στην Εικόνα 2Α, τα κύτταρα στερήθηκαν ορό, προσομοιώνεται είτε με BMP7 ή ΒΜΡ9, και Smad1 /5 φωσφορυλίωσης αξιολογήθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 2C). Είτε με BMP7 ή ΒΜΡ9, νοκ ντάουν της ActRIIA εξασθενίζει συνδέτη-διεγείρονται Smad1 /5 φωσφορυλίωση, ενώ νοκ ντάουν της BMPRII αυτό αυξάνει. Επιδεικνύοντας ένα παρόμοιο προφίλ απόκρισης σηματοδότηση υπό συνθήκες διέγερσης συνδέτη ΒΜΡ σε σύγκριση με εκείνη του προτύπου συνθήκες καλλιέργειας, η σημασία της ΒΜΡ ενισχύεται περαιτέρω. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν εκείνα στο σχήμα 1D, τα οποία αποδεικνύουν ότι BMP συνδετήρας είναι απαραίτητη για EMSI.

Ούτε η

σύστημα υποκινητή BRE 2-λουσιφεράσης, ούτε τα επί του παρόντος διαθέσιμα φωσφο-Smad αντισώματα είναι σε θέση να εντελώς διάκριση μεταξύ Smad1 , Smad5 και Smad8 ισομορφές. Ως εκ τούτου, αξιολογείται ο βαθμός στον οποίο αυτές οι άλλες Smad ισομορφές θα μπορούσαν να ευθύνονται για τα μέχρι τώρα αποτελέσματα που παρατηρούνται. Συγκεκριμένα, δεδομένου ότι BMPRII νοκ ντάουν απροσδόκητα οδήγησε σε αυτό που φαίνεται να είναι αυξημένη Smad1 σηματοδότησης, θελήσαμε να εξετάσουμε το ενδεχόμενο BMPRII νοκ ντάουν ήταν η αύξηση Smad5 ή Smad8 σηματοδότησης, ενδεχομένως καλύπτοντας μια λειτουργικά σημαντική μείωση στην Smad1 σηματοδότησης. Χρησιμοποιώντας το γονίδιο-ειδική ανάλυση qRT-PCR, πρέπει πρώτα να αποδείξει ότι siRNA στα μεμονωμένα Smad ισομορφές είναι εξαιρετικά ειδική και αποτελεσματική, αποσιώπηση σημαντικά τη στοχευμένη ισομορφή κατά ≥90% σε κάθε περίπτωση, ενώ δεν έχει σημαντική επίδραση επί ισομορφών μη στόχους (Σχήμα 3Α). Είμαστε δίπλα προσπάθησε να καθορίσει ποια Smads ενεργοποιήθηκαν κατά ενδογλίνη υπερέκφραση. Εξόντωση Smad1 οδηγεί σε σχεδόν ολική απώλεια του ειδικού σήματος από ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει το φωσφο-Smad1, 5, και 8 (Σχήμα 3Β). Έχουμε επαληθεύσει ότι η έκφραση Smad1 πρωτεΐνη καταστέλλεται αποτελεσματικά με siRNA να Smad1, αλλά δεν καταστέλλεται από siRNA που στοχεύει Smad5 ή Smad8. Χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τόσο φωσφορυλιωμένη Smad1 και Smad5, έχουμε αποδείξει ότι Smad5 επίσης φωσφορυλιώνεται παρουσία ενδογλίνης. Στη συνέχεια πήγε για να αποδείξει ότι knockdown του Smad1 προκαλεί μείωση κατά 90% της ενδογλίνης επαγόμενη αύξηση BRE

2-λουσιφεράσης (Σχήμα 3C). Σε αντίθεση, ενδογλίνη επαγόμενη αύξηση BRE

2-λουσιφεράσης δραστηριότητα μειώνεται μόνο κατά 30% μετά Smad5 knockdown, και καθόλου από Smad8 knockdown. Τέλος, όπως δείχνουμε στο σχήμα 2 ότι BMPRII knockdown αυξάνει την ενεργοποίηση Smad1, εξετάσαμε την επίδραση της καταστολής ισομορφής Smad στο πρόσωπο του BMPRII knockdown σε κορεσμένη κύτταρα ενδογλίνη (Σχήμα 3D). Παρόμοια με τα ευρήματα στο Σχήμα 3C, Smad1 νοκ ντάουν καταργεί σημαντικά την αύξηση της BRE

2-λουσιφεράσης δραστηριότητα επιτυγχάνεται με BMPRII νοκ ντάουν, ενώ Smad5 ή Smad8 νοκ ντάουν δεν έχουν καμία σημαντική επίδραση. Όλοι μαζί οι παραπάνω ευρήματα δείχνουν ότι ActRIIA αυξάνει φωσφορυλίωση και λειτουργία Smad1, ενώ BMPRII μειώνεται.