Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στις τρέχουσες χημειοθεραπευτικά σχήματα, εν μέρει λόγω των μεταβολών στην ρ53 ογκοκατασταλτικό οδού. ρ53 ομόλογο ρ63 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής απαραίτητη για την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των επιθηλιακών επιφανειών. Ωστόσο η λειτουργία του στον καρκίνο είναι αμφιλεγόμενη και ο ρόλος του στην PDAC δεν είναι γνωστή. Ανακαλύψαμε ότι ΔNp63α ήταν το κυρίως εκφρασμένη παραλλαγή ρ63 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. ΔNp63α πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA ήταν υψηλά σε Τ3Μ4, BxPC3 και COLO-357 κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος και χαμηλή σε ASPC-1 και κύτταρα PANC-1. Η υπερέκφραση του ΔNp63α σε PANC-1 κύτταρα και shRNA μεσολάβηση knockdown σε κύτταρα Τ3Μ4 έδειξε ότι ΔNp63α προωθείται αγκύρωση-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την ανάπτυξη, την κινητικότητα και την εισβολή, και αυξημένη αντοχή στη σισπλατίνη απόπτωση. υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) οδών σηματοδότησης συνεισφέρουν στη βιολογική επιθετικότητα του PDAC, και βρήκαμε ότι οι επιδράσεις του μιτογονική ΔNp63α είχαν αυξηθεί παρουσία του EGF. Η έκτοπη έκφραση του ΔNp63α οδήγησε σε προς τα πάνω ρύθμιση του EGFR και β1-ιντεγκρίνης σε κύτταρα PANC-1. Αντιστρόφως, ΔNp63α knockdown είχε αντίθετο αποτέλεσμα στα κύτταρα Τ3Μ4. ΔNp63α ενισχύεται EGF-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΕΚΚ, Akt και σηματοδότηση JNK. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση και λειτουργικές δοκιμασίες δημοσιογράφος απέδειξε ότι ΔNp63α ενεργοποιηθεί η μεταγραφή του EGFR. 14-3-3σ μεταγραφή επίσης θετικά ρυθμίζονται από ΔNp63α και έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι 14-3-3σ συμβάλλει στην χημειοαντίσταση σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Αντιστρόφως, shRNA μεσολάβηση knockdown του 14-3-3σ οδήγησε σε κατάργηση των επιδράσεων ΔNp63α επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή. Έτσι, ρ53 ομόλογο ΔNp63α ενισχύει την ογκογόνο δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος μέσω trans-ενεργοποίηση του EGFR και 14-3-3σ

Παράθεση:. Danilov AV, Neupane D, Nagaraja AS, Feofanova EV, Humphries LA, DiRenzo J, et al. (2011)

DeltaNp63alpha-

διαμεσολαβείται Πρόκληση υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντας προάγει τον καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη των κυττάρων και χημειοαντίσταση. PLoS ONE 6 (10): e26815. doi: 10.1371 /journal.pone.0026815

Επιμέλεια: Toru Ouchi, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιούλη 2011? Αποδεκτές: 3 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Danilov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα Τμήμα Ιατρικής Νέων Βραβείο Σχολής (Dr. Danilov), ένα Κέντρο Καρκίνου Prouty Βραβείο Έργου Νόρις βαμβάκι Pilot (Δρ Danilov), ένα βραβείο Χίτσκοκ Ιδρύματος (Δρ Danilov), και από το National Cancer Institute Grant ΟΑ R37-075059 (Δρ Korc). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σπουδές στην ανθρώπινη ασθένεια δείχνουν ότι οι περισσότεροι εγκατεστημένων όγκων μεταφέρουν περισσότερους από ένα γενετικό ελάττωμα. Παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) προκύπτει από τη διαδοχική συσσώρευση των μεταλλάξεων του γονιδίου [1]. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο K-Ras ογκογονίδιο και αδρανοποίηση των καταστολείς όγκων CDKN2A, ρ53 και Smad4 εμπλέκονται σε PDAC ανάπτυξη και την πρόοδο [2]. Γενετικά μοντέλα ποντικού έχουν υποστηρίξει την «διπλό χτύπημα» υπόθεση όπου εισαγωγή είτε μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ρ53 ή διαλληλικό διαγραφή ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ στα αποτελέσματα ποντικούς σε πρόοδο της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασματικών βλαβών με την τοπική εισβολή και μετάσταση [3], [4]. Οι μεταλλάξεις p53 βρέθηκε σε 60 έως 70% του PDAC. Αντίθετα, p63, ένα αρχέγονο μέλος της οικογένειας p53, σπάνια μεταλλάσσεται σε καρκίνο.

Έξι παραλλαγές του p63 παράγεται μέσω μεταγραφή από δύο διακριτές υποστηρικτές και εναλλακτικό μάτισμα. Ισομορφές που μεταγράφεται από Ρ1 περιέχει ένα πλήρους μήκους περιοχής τρανς-ενεργοποιήσεως (TAp63α, β και γ). Η μεταγραφή από Ρ2 δημιουργεί αμινο-καταληκτικώς διακλαδισμένη παραλλαγές (ΔNp63α, β και γ), των οποίων η ακριβής ρόλος στον καρκίνο δεν είναι σαφής. Η παραλλαγή ΔNp63 υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των όγκων πλακωδών κυττάρων προέλευσης (κεφαλής και λαιμού, του πνεύμονα), του μαστού και της ουροδόχου κύστης [5]. Στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και «triple-αρνητικό» κύτταρα καρκίνου του μαστού, ΔNp63 καταστέλλει ρ73-εξαρτώμενη απόπτωση και ως εκ τούτου προωθεί την επιβίωση του όγκου [6], [7]. Αντιθέτως, ρύθμιση προς τα κάτω του ΔNp63α σε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ουροθηλιακό προωθεί διεισδυτικότητα του καρκίνου [8], γεγονός που υποδηλώνει ότι η παραλλαγή ΔΝ μπορεί να λειτουργήσει σε ένα κύτταρο τύπου-ειδικό τρόπο.

Ο ρόλος της ρ63 σε PDAC είναι ελάχιστα κατανοητή. Εδώ αποδεικνύουμε ότι η παραλλαγή ΔNp63α εκφράζεται σε διάφορα επίπεδα σε κυτταρικές σειρές PDAC, και παρέχουν αποδείξεις ότι ΔNp63α προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων, μετανάστευση, εισβολή και χημειοαντίσταση. Μέσω απευθείας μεταγραφική ενεργοποίηση, ΔNp63α οδηγεί στο πάνω ρύθμιση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και 14-3-3σ, ευαισθητοποιώντας τα καρκινικά κύτταρα προς EGF και την ενίσχυση ογκογόνο δυναμικό τους.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ASPC-1, BxPC3 και PANC-1? εμβρυϊκά κύτταρα νεφρού ΗΕΚ293 του ανθρώπου και των κυττάρων καρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα Η1299 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 και Τ3Μ4 ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ήταν ένα δώρο από Dr.R.Metzgar (Πανεπιστήμιο Duke, Durham, NC). Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε RPMI ή DMEM (ΗΕΚ293) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (πλήρες μέσο).

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα

Η ανθρώπινη και ποντικού πλασμίδια έκφρασης ΔNp63α και (p53RE)

πλασμίδιο 5-tk-λουσιφεράση αναφέρθηκαν προηγουμένως [9]. πλασμίδιο έκφρασης TAp63α αγοράστηκε από την Open Biosystems (Huntsville, AL). ρΒν-14-3-3σ υποκινητή BDS 2 3 × (θέση σύνδεσης ρ53) -luc πλασμίδιο λήφθηκε από Addgene (Cambridge, ΜΑ). υποστηρικτής pGL3-EGFR (θέσεις δέσμευσης ρ53) -luc πλασμίδιο ήταν ένα δώρο από τον Dr. L. Pirisi [10]. τροποποιήσεις αλληλουχίας εντός μιας κωδικεύουσας ενός τομέα δέσμευσης DNA του πλασμιδίου έκφρασης ΔNp63α ανθρώπινη και εντός ρ53 υποκινητή EGFR θέση πρόσδεσης 1 εισήχθησαν χρησιμοποιώντας το Quick Change-τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση Kit (Stratagene, La Jolla, CA).

Ανοσοκηλίδωση

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1 mM NaF, 1 mM φωσφορικό νάτριο, 1 mM NaVo3, 1 ηΜ EDTA, 1 ηΜ EGTA, συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Indianapolis, ΙΝ) και 1 mM PMSF). Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται προηγουμένως [11]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: ρ63 (4A4? Millipore, Billerica, ΜΑ? 1:500)? TAp63γ (Li et al, 2006?. 1:1,000), 14-3-3σ (Abcam, Cambridge, ΜΑ? 1:500), ΕΚΚ-2 (C-14? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA? 1: 10.000), ρ53 (DO-1? Santa Cruz Biotechnology? 0.4 μg /mL), EGFR (Calbiochem? 1:2,000), που διασπάται πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), διασπασμένη κασπάση 3, ΕΚΚ-1/2 , φωσφο-ERK1 /2 [T202 /Y204], Akt, φωσφο-Akt [S473] (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ? 1:1,000), ενεργό JNK (Promega, Madison, WI), συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου αντι- αντισώματα ποντικού και αντι-κουνελιού (BioRad? 1:5,000).

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA ). cDNA συντέθηκε από 1 μα RNA με τυχαία έναρξη εξαμερούς χρησιμοποιώντας το Superscript RT III Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ημι-ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας πρόσθιο και αντίστροφο εκκινητές ειδικούς για ρ63 ισομορφές όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [12]. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες κύκλου PCR: 94 ° C για 3 λεπτά, 35 κύκλοι των 94 ° C για 40 sec, 55 ° C για 40 sec, και 72 ° C για 1.5 λεπτό? και 72 ° C για 4 λεπτά.

Για την ανάλυση των ΔNp63 και TAp63 έκφραση μεταγράφου ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (Q-PCR) διεξήχθη σε έναν ανιχνευτή 7300 Sequence χρησιμοποιώντας το Universal PCR Master Mix σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA), cDNA εκμαγείου και γονίδιο ειδικούς ανιχνευτές (Hs00978339_m1 [ΔNp63]? Hs00978349_m1 [TAp63]? Applied Biosystems). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν.

Παροδικές επιμολύνσεις, αδενοϊική δοκιμασίες μόλυνσης και λουσιφεράσης

PANC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ExGen 500

vitro

Μορφομετατροπή αντιδραστηρίου σε ( Fermentas Επιστήμες της ζωής, Glen Burnie, MD), χρησιμοποιώντας ίσες ποσότητες των πειραματικών ή τον έλεγχο πλασμίδιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες και η έκφραση της πρωτεΐνης επαληθεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Ο αδενοϊός ελέγχου και ΔNp63α εκφράζουν χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφεται [13]. ASPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 μολύνθηκαν με αδενοϊό σε ΜΟΙ ~ 5 σε πλήρες μέσο για 24 ώρες.

Για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης, PANC-1 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με πειραματικές πλασμίδιο ή τον έλεγχο και τη λουσιφεράση κατασκεύασμα αναφοράς (ρΒν-14-3-3σ υποστηρικτής BDS 2 3 × (ιστοσελίδα p53 σύνδεσης) -luc? ή pGL3-EGFR προαγωγός-Luc) μαζί με τον φορέα ρΟΜνβ (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Η ποσότητα του DNA ανά επιμόλυνση διατηρήθηκε σταθερή χρησιμοποιώντας κενό φορέα pcDNA3.1. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και λουσιφεράση δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). Σχετικές Μονάδες Φωτός προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (LMaxII

384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) για λουσιφεράση πυγολαμπίδας. β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα προσδιορίστηκε με χρωματομετρική μέθοδο για την κανονικοποίηση αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης [14].

λεντοϊών shRNA μεσολάβηση γονιδιακής σίγησης

Lentivirus περιέχουν shRNA στόχευσης α-ειδική, TAp63 ειδικές, όλα τα ισόμορφα ρ63 και έλεγχος sh περιγράφηκαν προηγουμένως [15]. Φακοϊό βασίζονται 14-3-3σ-στόχευση και τον έλεγχο shRNA επίσης περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [11]. Λεντοϊών σωματίδια παρήχθησαν με τέσσερις σύστημα πλασμιδίου διαμολύνσεως [11]. Knockdown των ισομορφών p63 και 14-3-3σ σε κύτταρα Τ3Μ4 και PANC-1 επιβεβαιώθηκε με στύπωση Western και Q-PCR.

3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5 -diphenyltetrazolium βρωμίδιο (ΜΤΤ)

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων (3000 κυττάρων ανά φρεάτιο, 6 φρεάτια ανά δείγμα) και καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία 10 μg /mL σισπλατίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 48 ώρες. ΜΤΤ (Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 0,55 μg /mL. Μετά από επιπλέον επώαση 4 ώρες, η απορρόφηση στα 570 nm προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών ακρίβειας Emax (Molecular Devices). Έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως ότι σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές η δοκιμασία ΜΤΤ συσχετίζεται με την κυτταρική ανάπτυξη, όπως ορίζεται στο διπλασιασμό και [

3Η] δοκιμασίες ενσωμάτωσης θυμιδίνης [16].

Soft δοκιμασίες άγαρ

Soft δοκιμασίες άγαρ στήθηκαν σε πλάκες δώδεκα φρεατίων, το κάθε φρεάτιο περιέχει ένα κάτω στρώμα 0,5% άγαρ Difco ευγενή (BD Biosciences), ένα μεσαίο στρώμα από 0,3% άγαρ, συμπεριλαμβανομένων 1.500 κύτταρα, και ένα άνω στρώμα από 0,3% άγαρ. Οι πλάκες επωάστηκαν για 14 ημέρες. Στη συνέχεια, 150 μλ των 5 mg /mL διαλύματος ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες πλάκες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν οι αποικίες.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

Η κυτταρική κινητικότητα αξιολογήθηκε σε

in vitro

επούλωση των πληγών και δοκιμασίες μετανάστευσης φρεατίων. Για επούλωσης πληγών δοκιμασίες, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων, και τον ορό επί 12 ώρες. Το προκύπτον κυτταρική μονοστοιβάδα αποξέσθηκε με ένα άκρο της πιπέτας 10 μι δημιουργώντας δύο παράλληλες πληγές και επωάστηκαν για 18 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού (SF? 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού) σε απουσία ή παρουσία 1 ηΜ EGF (Millipore). Οι φωτογραφίες ελήφθησαν από κάθε πηγάδι σε τέσσερις σημειωμένα σημεία κάτω των 40 × μεγέθυνση στο μηδέν και 18 ώρες μετά τον τραυματισμό. Η περιοχή του τραύματος του συμφωνημένα εικόνες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health). Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell, κύτταρο εναιωρήθηκαν σε 100 μL μέσου SF και τοποθετείται επί του άνω διαμέρισμα των θαλάμων Transwell (μέγεθος πόρων 8 μm, Corning Incorporated, Corning, ΝΥ). Για τις δοκιμασίες εισβολή, τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 500 μικρόλιτρα μέσου SF και τοποθετήθηκαν επάνω σε άνω διαμέρισμα του Matrigel επικαλυμμένων θαλάμους Transwell (μέγεθος πόρων 8 μm, Biocoat Matrigel Invasion Chambers? BD Biosciences? Franklin Lakes, NJ). Σε αμφότερες τις δοκιμασίες Transwell, το κάτω διαμέρισμα γεμίστηκε με 750 μί μέσου SF απουσία ή παρουσία 1 ηΜ EGF. Μετά από 18-20 ώρες, οι μεμβράνες στερεώθηκαν σε μεθανόλη, χρωματίστηκαν με μπλε τολουϊδίνης (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ) και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός.

Φορμαλδεΰδη διασταύρωσης, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) και ενίσχυση PCR

προς DNA-ιστόνης διασταύρωσης, 2 χ 10

6 κύτταρα επωάστηκαν με 1% φορμαλδεΰδη σε πλήρες μέσο για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS και λύθηκαν σε SDS ρυθμιστικού λύσης (Millipore) πλήρης με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε υπερήχους για να δώσει θραύσματα χρωματίνης των -500 bp όπως αξιολογείται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Μετά την προ-εκκαθάρισης, προϊόντα λύσης πρωτεΐνης επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με 2 μg p63α αντισώματα (H-129, Santa Cruz) ή με IgG κουνελιού ως αντισώματα ελέγχου ισοτύπου-ειδική (Santa Cruz). Ανοσοσύμπλοκα πλύθηκαν και DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το τσιπ Assay Kit (Millipore) και QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συνθήκες PCR και εκκινητές για θέσεις δέσμευσης 14-3-3σ συναίνεση 1 και 2 έχουν αναφερθεί προηγουμένως [17]. Οι ακόλουθοι εκκινητές και συνθήκες PCR χρησιμοποιήθηκαν για την θέση δέσμευσης EGFR p53 υποκινητή: πρόσθιος εκκινητής 5 ‘GGCCGCTGGCCTTGGGTC 3’? αντίστροφο εκκινητή 5 ‘GCCGTGCGCGGTGGTTG 3’? 1 κύκλος των 94 ° C για 5 λεπτά, 43 κύκλοι των 95 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 50 sec, ακολουθούμενη από 1 κύκλος των 72 ° C για 10 λεπτά. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ HotStarTaq πολυμεράση (Qiagen), με χρήση της Q-Solution στην δοκιμασία EGFR PCR.

Cisplatin-επαγόμενη απόπτωση

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο εν απουσία ή παρουσία 5 ή 10 μg /mL σισπλατίνης για την αρχική 2 ώρες, 6 ώρες ή ολόκληρο το 24 h. Αμφότερα τα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση.

Αποτελέσματα

ΔNp63α έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος

Βρήκαμε ότι p63 ήταν εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές . τα επίπεδα της πρωτεΐνης p63 ήταν υψηλότερη στα κύτταρα Τ3Μ4 και BxPC3, ενδιάμεσο COLO-357 και κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης σε ASPC-1 και κύτταρα PANC-1 (Εικ. 1Α). Δεδομένου ότι η ρ63 αντίσωμα (κλώνος 4A4) αναγνώρισε τα έξι γνωστές ισομορφές της ρ63, συγκρίναμε τα επίπεδα mRNA μεταγραφήματος ρ63 στις παραπάνω κυτταρικές σειρές. Όλες οι κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα TAp63 mRNA (σχ. 1Β). Αντίθετα, οι μεταγραφές ΔNp63 mRNA ήταν σχετικά αυξημένο σε BxPC3, Colo-357, και τα κύτταρα Τ3Μ4 (Εικ. 1Β).

Μια

, τα επίπεδα πρωτεΐνης του p63, 14-3-3σ, TAp63γ και p53 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

B

, η έκφραση του mRNA του TAp63 και ΔNp63 ισομορφές της ρ63 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές PDAC μεταγράφηκε αντίστροφα και υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου με ανιχνευτές ειδικούς για ΔΝ και TA ισομορφές ρ63. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε 18S επίπεδα, και εκφράζονται ως μέση τιμή δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις διπλούν στα οποία ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

C

, η έκφραση του mRNA των παραλλαγών ματίσματος ρ63 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Επίπεδα ομαλοποιήθηκαν σε αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης τιμές (GAPDH).

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω εάν μια συγκεκριμένη παραλλαγή ματίσματος του ρ63 εκφράζεται σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, χρησιμοποιήσαμε ημι-ποσοτική RT-PCR με p63 μάτισμα παραλλαγή-ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1). Επιβεβαιώσαμε ότι οι μεταγραφές TAp63α mRNA εκφράστηκαν σε σχετικά χαμηλά και παρόμοια επίπεδα σε όλες τις πέντε κυτταρικές σειρές. Αντίθετα, οι μεταγραφές ΔNp63α mRNA εκφράστηκαν μόνο σε BxPC3, Colo-357, και τα κύτταρα Τ3Μ4, ενώ ΔNp63γ mRNA ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στο BxPC3 και Τ3Μ4 κύτταρα (Εικ. 1Γ). Αν και p63α μπορεί να ανιχνευθεί σε μια συγκεκριμένη δοκιμασία PCR, απομονωμένες ανίχνευση p63β μεταγραφών mRNA είναι αναξιόπιστη αφού C-τελικό άκρο της δεν είναι μοναδική (Εικ. S1). Στα πειράματά μας, η έκφραση του mRNA μεταγραφήματος ΔNp63β συσχετίζεται με την έκφραση ΔNp63α, πιθανώς λόγω της μη-ειδική ενίσχυση των ΔNp63α. Από τη στιγμή που ανιχνεύθηκε μετανάστευση πρωτεΐνη p63 σε ~68 kDa, και ΔNp63β πρωτεΐνη μεταναστεύει σε ~52 kDa [18] – [20], καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ΔNp63α ήταν το κυρίως εκφράζεται παραλλαγή p63 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

ογκογεννετικές δράσεις. του ΔNp63α σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Για να μελετήσουμε τη βιολογική δράση του ΔNp63α σε PDAC, έχουμε χειριστεί την έκφρασή της σε PANC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα, τα οποία είχαν χαμηλά και υψηλά ενδογενή επίπεδα της ΔNp63α, αντίστοιχα (Σχ. 1) . κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα ΔNp63α-φορέα έκφρασης (PANC-1ΔN), ένα TAp63α εκφράζουν φορέα (PANC-1TA), ή τον έλεγχο πλασμιδίου. Λεντοϊών μεσολάβηση shRNA χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίζουν προς τα κάτω ισομορφές γονίδιο ρ63 σε κύτταρα Τ3Μ4. Δύο διαφορετικές ακολουθίες shRNA, ένας συμπληρωματικός προς μία αλληλουχία εντός ενός δεσμευτικού DNA-τομέα p63 (sh DBD) και ορίζοντας έτσι όλα τα ισόμορφα του ρ63, και ένα άλλο συμπληρωματικό προς μια αλληλουχία εντός αποστειρωμένου πεδίου άλφα μοτίβο (SAM) και η στόχευση έτσι TAp63α και ΔNp63α ( sh p63α) προσδιορίστηκαν για τη μείωση των επιπέδων ΔNp63α πρωτεΐνης και μεταγραφή σε κύτταρα Τ3Μ4 (Εικ. 2Α). Ενώ shRNA περιοχή στόχευσης trans-ενεργοποίησης (sh TAp63) είχε ως αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα TAp63 μεταγραφής, αυτό δεν μεταφράζεται σε μια αισθητή μεταβολή στα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης ρ63 (Εικ. 2Α), επιβεβαιώνοντας την παρατήρηση μας ότι ΔNp63α παραλλαγή κυριαρχεί σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές .

Μια

, τα κύτταρα Τ3Μ4 μολύνθηκαν με GFP που εκφράζουν τον ιό, ή p63-ειδικές shRNA συμπληρωματικά DBD, TA και α-συγκεκριμένους τομείς της ρ63. λύματα πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση (άνω πάνελ). Ολικό RNA απομονώθηκε, μεταγράφηκε ανάστροφα και υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου με ανιχνευτές ειδικούς για ΔΝ και TA ισομορφές ρ63. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα 18S (κάτω πίνακας). Knockdown ισομορφών p63 παρακολουθήθηκε κατά την διάρκεια των μετέπειτα πειράματα.

B

, ΔNp63α διεγείρει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων PANC-1 σε δοκιμασία μαλακού άγαρ (αριστερά και κάτω πάνελ) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε δοκιμασία ΜΤΤ (δεξί πάνελ). κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με ΔNp63α εκφράζουν φορέα, TAp63α ή φορέα ελέγχου. Κυττάρων απλώνονται σε μαλακό άγαρ σε πυκνότητα 1500 /φρεάτιο ενός 12 φρεατίων πλάκα, τέσσερα φρεάτια ανά δείγμα. Οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 14 ημέρες επώασης. Για ΜΤΤ τα κύτταρα δοκιμασίας τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, έξι φρεάτια ανά δείγμα. Προστέθηκε ΜΤΤ μετά από επώαση για 48 ώρες. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SE από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο.

C

, ρύθμιση προς τα κάτω της ΔNp63α επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ3Μ4 σε κλωνογονική δοκιμασία. Ανασύσταση του ΔNp63α αποκαθιστά μερικώς την πολλαπλασιαστική ικανότητα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 500 κύτταρα /φρεάτιο. 14 ημέρες αργότερα, οι πλάκες σταθεροποιήθηκαν σε 3:01 μεθανόλη: παγόμορφο οξικό οξύ και χρωματίζονται με 2% κρυσταλλικό ιώδες. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SE τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. *, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο (sh ctrl).

D-F

, Επίδραση της p63 στην κινητικότητα των κυττάρων μετρήθηκε σε δοκιμασίες για επούλωση της πληγής σε PANC-1 (

D

) και τα κύτταρα Τ3Μ4 (

E, F

). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε συνθήκες (SF) χωρίς ορό, απουσία ή παρουσία 1 ηΜ EGF για 18 ώρες μετά την πραγματοποίηση μια γρατσουνιά. Διεξήχθη ποσοτική ανάλυση των εικόνων. Η έκτοπη έκφραση του ποντικού ΔNp63α σε sh p63α Τ3Μ4 κύτταρα οδήγησε σε μερική αποκατάσταση της κινητικότητας των κυττάρων (

F

)? αντίστοιχα επίπεδα πρωτεΐνης ΔNp63α φαίνεται παρακάτω. Τα δεδομένα είναι ο m ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Εκπρόσωπος εικόνες που παρουσιάζονται (μεγέθυνση × 40). *, P & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο (sh ctrl).

G και H

, Επίδραση της ΔNp63α για την εισβολή σε θαλάμους Matrigel. PANC-1 (

G

) ή Τ3Μ4 (

H

) κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θαλάμους Matrigel (5 × 10

4 /ml) και επωάστηκαν σε απουσία (SF) ή παρουσία 1 nM EGF για 18 ώρες. Επίδραση ομαλοποιήθηκε στην εισβολή του ελέγχου σε συνθήκες SF. *, P & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο (sh ctrl)

Η

Από αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των κακοήθων κυττάρων, μελετήσαμε αν ΔNp63α έχει επίδραση στην αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε PDAC. PANC-1ΔN, αλλά όχι τα κύτταρα PANC-1TA παρουσίασαν αυξημένη σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ και προσδιορισμούς αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε προσδιορισμούς ΜΤΤ (Εικ. 2Β). Δεδομένου ότι τα κύτταρα Τ3Μ4 είναι ανίκανα να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, πολλαπλασιασμός έχει μελετηθεί σε κλωνογονική δοκιμασία. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ3Μ4 μειώθηκε σε απάντηση Τα siRNAs που στοχεύουν την DBD ή το α-ειδικό C-τελικό άκρο και αμετάβλητες σε απάντηση sh TAp63 (Σχ. 2C). Παροδική υπερέκφραση ΔNp63α cDNA ποντικού, το οποίο φέρει μια σιωπηλή μετάλλαξη στην περιοχή στοχεύει το α-ειδικό shRNA, οδήγησε σε μερική διάσωση της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των sh p63α Τ3Μ4 κύτταρα, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα μάρτυρα (Σχ. 2C ).

ΔNp63α είναι γνωστό ότι ρυθμίζει το πρόγραμμα προσκόλληση σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού και κερατινοκύτταρα [15]. Δεδομένης της σημασίας της κυτταρικής πρόσφυσης σε εισβολή και την εξέλιξη του όγκου, μελετήσαμε τα αποτελέσματα του ΔNp63α επί της κινητικότητας και επεμβατικές δυνατότητες των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Στις δοκιμασίες επούλωση της πληγής, κύτταρα PANC-1ΔN καταδείξει ενισχυμένη κινητικότητα σε συνθήκες SF, ενώ η υπερέκφραση του TAp63α δεν είχε καμία επίδραση (Εικ. 2D). Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού EGFR σχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα του όγκου και μειωμένη επιβίωση σε PDAC [21], επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση του EGF επί της κινητικότητας. EGF διέγερση ενισχυμένη μετανάστευση στην PANC-1ΔN και τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 2D). Παρομοίως, κύτταρα που εκφράζουν Τ3Μ4 sh p63α, αλλά όχι sh TAp63, παρουσίασαν μειωμένη κινητικότητα, τόσο κατά την έναρξη και σε παρουσία EGF (Σχ. 2Ε). Παροδική υπερέκφραση του ΔNp63α ποντικού σε κύτταρα που εκφράζουν Τ3Μ4 sh p63α οδήγησε σε μερική διάσωση του φαινοτύπου κινητικότητα (Εικ. 2F). Η χειραγώγηση των επιπέδων έκφρασης ΔNp63α δεν είχε καμία επίδραση στην εισβολή των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε Matrigel θαλάμους σε συνθήκες SF (Σχ. 2G, Η). Ωστόσο, η διέγερση με EGF οδήγησε σε μια δραματική αύξηση της διεισδυτικής ικανότητας των κυττάρων PANC1-ΔΝ (εικ. 2G). Συνεπής με τις ανωτέρω διαπιστώσεις, shRNA μεσολάβηση καταστολή της ΔNp63α, αλλά δεν TAp63, μείωσε σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων Τ3Μ4 να εισβάλει μέσω Matrigel ως απόκριση σε διέγερση EGF (Σχ. 2Η).

Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΔNp63α ενισχύει την σχηματισμού αποικιών, πολλαπλασιαστική και διηθητική ικανότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

ΔNp63α απορυθμίζει EGFR και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος στα αποτελέσματα του EGF

σε σύγκριση με τις συνήθεις πάγκρεας, EGFR πρωτεΐνης και mRNA εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα σε καρκίνο του παγκρέατος [22]. έκφραση EGFR mRNA προβλέπει μειωμένη επιβίωση και η κακή απόκριση σε χημειοθεραπεία σε ασθενείς με PDAC [23]. Στην εργασία μας, ΔNp63α ενίσχυσε δραματικά παγκρέατος κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και επεμβατικές δυνατότητες με την παρουσία του ΕΤΠ. Για να εξηγήσουμε αυτό το φαινόμενο, μελετήσαμε την επίδραση της ΔNp63α στα επίπεδα EGFR. Διαπιστώσαμε ότι μηχανικής έκφραση ΔNp63α σε PANC-1 κύτταρα ενισχυμένη έκφραση EGFR, ενώ έκτοπη TAp63α δεν είχε καμία επίδραση (Εικ. 3Α). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση βρήκαμε ότι τα επίπεδα EGFR μειώθηκαν σε κύτταρα Τ3Μ4 σε απόκριση προς shRNA μεσολάβηση καταστολή της ΔNp63α (Σχ. 3Β), τεκμηριώνοντας έτσι μια άμεση συσχέτιση μεταξύ ΔNp63α και της έκφρασης EGFR σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της ΔNp63α υπερέκφραση σε σηματοδότηση EGFR, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση των κινασών κατάντη κατά τη διέγερση EGF. Η κατεργασία των κυττάρων PANC1-ΔΝ με EGF οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση της ERK, JNK και Akt (Σχ. 3C). Σε αυτά τα κύτταρα, και οι τρεις κινάσες παρουσίασαν αυξημένη επίπεδο ενεργοποίησης στο συντομότερο 10 λεπτά μετά την διέγερση των κυττάρων, και η δραστικότητα ERK επέμεινε για 60 λεπτά.

A

, έκτοπη έκφραση των αποτελεσμάτων ΔNp63α σε αυξημένη έκφραση του EGFR και β1-ιντεγκρίνης σε κύτταρα PANC-1. Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες, το σύνολο των προϊόντων λύσεως πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται.

B

, ρύθμιση προς τα κάτω του ΔNp63α σε Τ3Μ4 κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση του EGFR και β1-ιντεγκρίνης. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται.

C

, PANC-1ΔN και τα κύτταρα ελέγχου PANC-1 διεγέρθηκαν με EGF κατά τη διάρκεια συγκεκριμένες χρονικές περιόδους. Πρωτεϊνικά λύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται.

Η

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ένα αναστολέας της τυροσινικής κινάσης να ισχυρίζονται ότι τα αποτελέσματα της ΔNp63α έγιναν με τη μεσολάβηση της οδού EGFR. Η erlotinib είναι ένας αναστρέψιμος αναστολέας της σηματοδότησης EGF, η οποία συνδέεται με τη θέση δέσμευσης ΑΤΡ του υποδοχέα. Η επώαση των PANC-1 κύτταρα με 1 μΜ erlotinib εξασθένησε την ΔNp63α μεσολάβηση ενίσχυση σχηματισμού αποικίας, κινητικότητα και εισβολή (Εικ. S2), αποκλείοντας έτσι τη δυνατότητα ενός μη-ειδικό αποτέλεσμα. Αντίθετα, τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ63 δεν επηρεάστηκαν όταν τα κύτταρα επωάστηκαν είτε με EGF ή erlotinib (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Προηγούμενες αναφορές πρότειναν ότι ΔNp63α είναι σε θέση να ρυθμίζουν πρωτεΐνες κυτταρικής πρόσφυσης σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού [15]. Από ιντεγκρίνη μεσολάβηση των κυττάρων όγκου αλληλεπιδράσεις με την εξωκυτταρική μήτρα παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον προσδιορισμό της επεμβατικής φαινότυπο σε PDAC, ερευνήσαμε αν ΔNp63α είχε επίδραση στην έκφραση της ιντεγκρίνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Έκτοπη έκφραση ΔNp63α στα κύτταρα PANC-1 αυξημένη έκφραση β1-ιντεγκρίνης, ενώ η έκφραση των α3- και α5-ιντεγκρινών ήταν αμετάβλητη (Εικ. 3Α). Αντιστρόφως, shRNA μεσολάβηση καταστολή της ΔNp63α οδήγησε σε μείωση της β1-ιντεγκρίνης στα κύτταρα Τ3Μ4 (Σχ. 3Β).

Έτσι, ΔNp63α συμβάλλει στην ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση του EGFR και β1-ιντεγκρίνης.

ΔNp63α συμβάλλει στην αντίσταση χημειοθεραπεία σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

από PDAC είναι εμφανώς ανθεκτικές σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, μελετήσαμε το ρόλο της ΔNp63α στην αντίσταση χημειοθεραπεία. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι επάγει σισπλατίνη αποικοδόμηση του ΔNp63α μέσω διέγερσης της ΙκΒ κινάσης [24]. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, η επώαση του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές με 10 μg /ml σισπλατίνης είχε ως αποτέλεσμα την υποβάθμιση του ενδογενούς ΔNp63α. Αυτή η επίδραση της σισπλατίνης ήταν εμφανής μετά από 6 ώρες επώασης και συνοδεύτηκε από αυξημένη απόπτωση σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Α). Στη συνέχεια ερευνήθηκε κατά πόσον έκτοπη έκφραση της ΔNp63α θα συμβάλει στην αντοχή στη σισπλατίνη απόπτωση σε PDAC. κύτταρα PANC-1 επωάστηκαν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 5 μg /mL σισπλατίνης για 2, 6, ή 24 ώρες. κύτταρα PANC-1ΔN εμφάνισαν μια ήπια εξασθένηση της απόπτωσης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, όπως εκδηλώνεται από τη μειωμένη PARP και διάσπασης κασπάσης (Εικ. 4Β). Αυτή η μείωση σε σισπλατίνη απόπτωση συσχετίζεται με μία αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων PANC-1ΔN όπως προσδιορίζεται σε μία δοκιμασία ΜΤΤ, ενώ τα κύτταρα PANC-1TA επέδειξε μία ελαφρώς μειωμένη επιβίωση (Σχ. 4C). Σε αντίθεση, τα κύτταρα που εκφράζουν το sh Τ3Μ4 p63α ευαισθητοποιήθηκαν προς σισπλατίνη απόπτωση, όπως καταδεικνύεται από μια αυξημένη διάσπαση της PARP και κασπάσης (Εικ. 4D). Έτσι, ΔNp63α μειώνει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος με σισπλατίνη.

Μια

, Επίδραση της σισπλατίνης για ΔNp63α στην PDAC. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /mL σισπλατίνης για τους αρχικούς 6 ή πλήρη 24 ώρες. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με παρακολούθηση διάσπασης PARP.

Β-D

, Επίδραση της ΔNp63α επί σισπλατίνη απόπτωση σε PANC-1 (

B, C

) και κύτταρα Τ3Μ4 (

D

). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μg /mL σισπλατίνης κατά την διάρκεια ενδεικνυόμενης χρονικές περιόδους. Τα κύτταρα σβωλοποιήθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης, οι πρωτεΐνες απομονώνονται και τρέχουν σε SDS-PAGE γέλη. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με παρακολούθηση PARP και διάσπαση της κασπάσης-3. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. κύτταρα PANC-1 επωάστηκαν με 10 μg /mL σισπλατίνης για τις πρώτες 12 ώρες ή πλήρη 48 ώρες. ΜΤΤ δοκιμασία έγινε όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

ΔNp63α απορυθμίζει 14-3-3σ σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Στη συνέχεια μελετήσαμε τους μηχανισμούς του ΔNp63α μεσολάβηση χημειοαντίσταση σε PDAC . Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι 14-3-3σ ενισχύει δραματικά την αντίσταση στη σισπλατίνη που προκαλείται από απόπτωση σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [11]. Westfall et al. απέδειξαν ότι ΔNp63α δρα ως μεταγραφικός καταστολέας του προαγωγού 14-3-3σ σε ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα [25]. Αντιθέτως, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του ΔNp63α συσχετίζεται με 14-3-3σ έκφραση πρωτεΐνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Εικ. 1Α). Επιπλέον, φίμωση ΔNp63α συνοδευόταν από μείωση του 14-3-3σ επίπεδο πρωτεΐνης σε κύτταρα Τ3Μ4 (Εικ. 2Α). 14-3-3σ είναι ένας στόχος μεταγραφικό ρ53, ακόμη BxPC3, οι PANC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα είναι γνωστό ότι φέρουν το μεταλλαγμένο ρ53 του οποίου η μεταγραφική δραστηριότητα είναι ελαττωματική [26], ενώ COLO-357 κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 (Εικ. 1Α) . Ως εκ τούτου, 14-3-3σ έκφραση είναι απίθανο να εξαρτάται από την p53 σε PDAC.

Για να προσδιορίσετε αν ΔNp63α διαμορφώνει 14-3-3σ έκφραση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, εισαγάγαμε ΔNp63α cDNA μέσω αδενοϊική μόλυνση στο ASPC- 1 και PANC-1 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα 14-3-3σ και ΔNp63α. Παρατηρήσαμε μια αύξηση στην 14-3-3σ επίπεδα πρωτεΐνης στα κύτταρα που υπερεκφράζουν ΔNp63α σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μολυσμένα (Εικ. 5Α). Αυτό ΔNp63α μεσολάβηση αύξηση 14-3-3σ δεν σχετίστηκε με μεταβολές των επιπέδων της πρωτεΐνης από τις άλλες ισομορφές 14-3-3 (Εικ. 5Α). Αντίθετα, ο χειρισμός 14-3-3σ επίπεδα σε PANC-1 και κύτταρα Τ3Μ4 δεν έχει επίδραση στις ΔNp63α (Εικ. 5Β και 5C).

Α, ASPC-1 και PANC-1 κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό που περιέχει είτε κενό φορέα ή πλήρους μήκους ΔNp63α, και λύμα ολόκληρο κυτταρικής πρωτεΐνης παρασκευάσθηκε 48 ώρες μετά την μόλυνση και ανιχνεύτηκαν με αντι-ΔNp63α και 14-3-3σ και άλλα 14-3-3 ισομορφών.

Β

, υπερέκφραση του 14-3-3σ δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα ΔNp63α. κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα (Sham) είτε με τον πλήρους μήκους ανθρώπινο cDNA 14-3-3σ που έχει επισημανθεί με ΗΑ.

C

, Σίγαση 14-3-3σ δεν επηρεάζει ΔNp63α.