Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών, η πιο θανατηφόρα γυναικολογικών καρκίνων, συνήθως δεν διαγιγνώσκεται μέχρι προχωρημένα στάδια. Παρά το γεγονός ότι η καρβοπλατίνη ήταν δημοφιλής για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών για δεκαετίες, οι ασθενείς τελικά αναπτύσσουν αντίσταση σε αυτό που περιέχουν λευκόχρυσο φάρμακο. Η έκφραση της νευρογενούς locus εγκοπή ομόλογο 3 (Notch3) σχετίζεται με χημειοαντίσταση και φτωχή συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του NICD3 (η ουσιαστικά δραστική μορφή Notch3) σε OVCA429 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (OVCA429 /NICD3) τα καθιστά αντίσταση στην καρβοπλατίνη θεραπεία σε σύγκριση με κύτταρα OVCA429 /pCEG εκφράζουν ένα άδειο φορέα. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι methylseleninic οξύ (MSeA) προκαλεί οξειδωτικό στρες και ενεργοποιεί μεταλλαγμένο αταξία-τηλαγγειεκτασία και DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση σε καρκινικά κύτταρα. Εδώ ελέγξαμε την υπόθεση ότι MSeA και καρβοπλατίνη ασκείται μια συνθετική θανατηφόρο επίδραση στην OVCA429 κύτταρα /NICD3. Συν-θεραπεία με MSeA συνεργικά ευαισθητοποιημένα OVCA429 /NICD3 αλλά δεν OVCA429 κύτταρα /pCEG με τη θανάτωση με καρβοπλατίνη. Αυτό συνέργεια συνδέθηκε με μια έξοδο του κυτταρικού κύκλου στην G2 /M φάση και την επαγωγή γονιδίου στόχου NICD3

HES1

. Θεραπεία του

Ν

ακετυλο κυστεΐνη ή αναστολείς των δύο παραπάνω κινάσες δεν έχουν άμεσο αντίκτυπο στην συνέργεια σε κύτταρα OVCA429 /NICD3. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αποτελεσματικότητα της καρβοπλατίνη στην αντιμετώπιση του υψηλού βαθμού καρκινώματος των ωοθηκών μπορεί να ενισχυθεί με μια συνδυαστική θεραπεία με MSeA

Παράθεση:. Tzeng TJ, Cao L, Fu Υ, Zeng Η, Cheng WH (2014) Methylseleninic οξύ ευαισθητοποιεί Notch3-Activated κύτταρα OVCA429 καρκίνου των ωοθηκών σε καρβοπλατίνη. PLoS ONE 9 (7): e101664. doi: 10.1371 /journal.pone.0101664

Επιμέλεια: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 24 Μάρ, 2014? Αποδεκτές: 10 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλ, 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το σταθμό του Μέριλαντ Γεωργικό Πειραματικό και το Μισισιπή Γεωργικών και Πειραματική Δασικό Σταθμό (σε W.-H. Cheng), καθώς και από Οι γυναίκες και τα παιδιά του Ινστιτούτου Ερευνών Υγείας με χρηματοδότηση δωρεά του Ιδρύματος Royal Alexandra Hospital, τον Καναδά (με το Υ Fu). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα αποτελέσματα από τη γεωγραφική, των ζώων και κλινικές μελέτες συνηγορούν σε μια θετική συσχέτιση μεταξύ του σεληνίου και χημειοπροφύλαξη [1] – [3]. Παρ ‘όλα αυτά, supranutritional πρόσληψη διαιτητικών σεληνίου με τη μορφή της σεληνομεθειονίνης δεν εμποδίζει τον καρκίνο του προστάτη [4]. Μεταξύ των πολλών ενώσεων σεληνίου, methylseleninic οξύ (MSeA) έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά αποτελεσματική στην καταπολέμηση καρκίνους του προστάτη, του παγκρέατος και του μαστού σε ποντίκια [5] – [8]. Η αποτελεσματικότητα του σεληνίου χημειοπροφύλαξη εξαρτάται επίσης από την αρχική κατάσταση του σεληνίου και το γενετικό υπόβαθρο [9]. MSeA μεταβολίζεται σε methylselenol, τελικά καταλήγοντας στον σχηματισμό του διοξειδίου του σεληνίου, ανιόν υπεροξειδίου, και υπεροξείδιο του υδρογόνου [10], [11]. Επιπλέον, MSeA μπορεί να ενεργοποιήσει αταξία-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και η καταλυτική υπομονάδα της DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ

cs), δύο κρίσιμα κινάσες απόκριση βλάβη στο DNA, σε καρκινικά κύτταρα [12] – [14].

Θηλαστικά εκφράζουν τέσσερις νευρογενούς τόπου εγκοπή ομόλογο (Notch) οικογένεια πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και της εμβρυογένεσης [15], [16]. Σε αντίθεση με πολλά άλλα μόρια σηματοδότησης, η ενεργοποίηση του μονοπατιού Notch δεν απαιτεί δευτερεύουσα αγγελιοφόροι για ενίσχυση [17]. Κατά τη σύνδεση με την Ν-τερματική περιοχή EGF επανάληψης προσδέματος, ο υποδοχέας Notch διαμεμβρανική υποβάλλεται σε μια σειρά από πρωτεολυτικές διασπάσεις με παράγοντα νέκρωσης όγκων-α-μετατρεπτικού ενζύμου, μεταλλοπρωτεάση, και γ-σεκρετάσης [18]. γ-σεκρετάσης απελευθερώνει το Notch intraceullular τομέα (NICD) σε κυτταρόπλασμα, ακολουθούμενη από μετατόπιση προς τον πυρήνα για μετενεργοποίηση ενός φάσματος γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την πρόοδο [19] όγκων – [21]. Έτσι, με στόχο Notch θεωρείται πολλά υποσχόμενη για τη βελτίωση της με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [22].

Οι ενώσεις Platinum έχουν εγκριθεί από την αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου από το 1979. Με μειωμένες παρενέργειες, καρβοπλατίνη [

cis

-diammine (1,1-κυκλοβουτανοδικαρβοξυλατο) λευκόχρυσος (II)] είναι η πιο αποτελεσματική δεύτερης γενιάς ένωση λευκόχρυσου για θεραπεία των ωοθηκών και των όρχεων του καρκίνου [23], [24]. Η καρβοπλατίνη βάσεις αλκυλικά DNA και μορφές monoadducts, η πλειοψηφία των οποίων τελικά μετατρέπονται σε διασταυρωμένες συνδέσεις DNA [25], [26]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα πρόσληψη καρβοπλατίνη, κατά τρόπο ανάλογα με μεταφορέα χαλκού, CTR1 [27] – [29]

Οι περισσότεροι ωοθηκών ασθενείς με καρκίνο διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο λόγω της έλλειψης των επικυρωμένες δοκιμές προσυμπτωματικού ελέγχου.. Παρά του να είναι η πιο αποτελεσματική φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, η αντίσταση στην καρβοπλατίνη αναπτύσσεται σε ορισμένες υψηλής όγκους βαθμού. Ανώμαλη ενεργοποίηση Notch συνδέεται στενά με την αντίσταση στην καρβοπλατίνη [22], [30], [31]. Ειδικότερα, Notch3 υπερεκφράζεται στο 66% των υψηλής ποιότητας καρκίνωμα ωοθήκης [32], 22% των οποίων στα στάδια II-IV έκθεμα μεταβληθεί Notch σηματοδότηση [33]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτές οι διαπιστώσεις, οι μελέτες που αναφέρονται στο παρόν σχεδιάστηκαν για να διαπιστωθεί αν MSeA θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει Notch3-ενεργοποιημένα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών σε καρβοπλατίνη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και των χημικών ουσιών

κύτταρα OVCA429 απομονώθηκαν από έναν ασθενή με προχωρημένο στάδιο, καρκίνωμα των ωοθηκών ανθεκτικών σε σισπλατίνη. κύτταρα OVCA429 /pCEG μεταφέρουν μια πράσινη πρωτεΐνη φθορισμού άδειο φορέα και κυττάρων OVCA429 /NICD3 συστατικώς εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη με ετικέτα NICD3 ταξινομήθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογέα και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Mediatech Inc, Herndon, VA) συμπληρωμένο με 10 % θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό και 100 U /mL πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα [34].

N

ακετυλ κυστεΐνη (NAC) και MSeA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. NAC είναι ένα αντιοξειδωτικό που καταργεί κυρίως υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η καρβοπλατίνη (Enzo Life Sciences, Farmingdale, ΝΥ) διαλύθηκε σε νερό. KU 60,019 και NU 7026 (Tocris, Ellisville, ΜΟ) διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο, και ήταν ανταγωνιστικός της ΑΤΡ, επιλεκτική χημικοί αναστολείς της δραστικότητας κινάσης του ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ

cs [35], αντίστοιχα.

Κυτταρική βιωσιμότητα

Σουλφοροδαμίνη Β (SRB) χρωματομετρικές δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν (10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν όλη τη νύκτα για την προσκόλληση πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 10% τριχλωροξεικό οξύ για 1 ώρα στους 4 ° C, πλύθηκαν 5 φορές με νερό και ξηραίνεται στον αέρα, και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,4% SRB σε 1% οξικό οξύ για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Χωρίς περιορισμούς βαφή απομακρύνθηκε με ήπια έκπλυση των κυττάρων 5 φορές με 1% οξικό οξύ. Αφού ξηράνθηκε με αέρα, τα κύτταρα επωάστηκαν με 200 μL του τρις ​​(υδροξυμεθυλ) αμινομεθανίου ρυθμιστικό (ρΗ 10,5, 10 mmol /L) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε με αναγνώστη πλάκας (BMG Labtech, Cary, NC) στα 492 nm. βιωσιμότητα τοις εκατό των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο [36]:

% βιωσιμότητα των κυττάρων = [(meanOD

δείγματος – meanOD

ημέρα 0) /(meanOD

έλεγχος αρνητικά – meanOD

ημέρα 0)] χ 100% «

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε περαιτέρω με υπολογισμό δείκτη συνδυασμού (CI) τιμές με το λογισμικό CalcuSyn (Biosoft) με βάση την θεώρημα του Chou-Talalay. Η κλίμακα συνέργια CI είναι από 1 στο 0 και ο ανταγωνισμός είναι από 1 έως άπειρο [37].

ανοσοφθορισμού

ανοσοφθορισμού αναλύσεις φωσφορυλίωσης ΑΤΜ στο Ser-1981 (pATMS1981), DNA-PK

cs φωσφορυλίωση σε Ser -2056 (pDNA-ΡΚ

csS2056) και φωσφορυλίωση Η2ΑΧ σε Ser-139 (γH2AX) διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [38], [39]. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν κάτω από τις ίδιες παραμέτρους φωτεινότητας, αντίθεσης , και το χρόνο έκθεσης και την επεξεργασία από αποσυνέλιξη χρησιμοποιώντας AxioVision Τύπου 4.7.2.0 σε συνδυασμό με ένα Zeiss Axio Παρατηρητής Z1m μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss, Thornwood, NY). Πέντε φωτογραφίες επιλέχθηκαν τυχαία λαμβάνονται από κάθε slide (n = 3).

κυτταρικού κύκλου και σελήνιο αναλύσεις

κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο FACScalibur με πρόγραμμα CELLQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). ModFit LT (Έκδοση 3.0, Verity Software House, Topsham, ME) εφαρμόστηκε για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε υπέρθεση ιστογράμματα. Ενδοκυτταρικά συγκεντρώσεις σεληνίου προσδιορίσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40], [41].

απομόνωση του RNA και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε με τη χρήση χλωροφορμίου για διαχωρισμό φάσεων , ισοπροπανόλη για καταβύθιση του RNA, 75% αιθανόλη για πλύση RNA, RNase-free νερό για RNA επαναιώρηση, και ϋΝάση-επεξεργασία πριν cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription kit (Life technologyÃ) παρουσία του αναστολέα ΚΝάσης. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο SYBR Green σε Applied Biosystems 7500 Fast πραγματικό χρόνο (Applied Biosystems, Foster CIET, CA). Οι αλληλουχίες των εκκινητών για qPCR παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο S1 File.

Στατιστικά

Αυτά τα δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση του λογισμικού SAS 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

t-test

εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό στατιστικής σημαντικότητας (

σ

& lt? 0,05) δίπλευρη μαθητή. Μεταξύ της θεραπείας και τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου

Αποτελέσματα

Synergistic θνησιμότητα των MSeA και καρβοπλατίνη σε κύτταρα OVCA429 /NICD3

ωοθηκών καρκινώματα που εκφράζουν NICD3 είναι ανθεκτικά σε πλατίνα θεραπευτικούς παράγοντες [22], [30], [31]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η θεραπεία MSeA (LD

50, 4 mmol /L) σκοτώνει HCT116 ορθοκολικό, PC-3 προστάτη και U-2 OS κύτταρα οστεοσαρκώματος σε συνδυασμό με αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ

cs [12], [13]. Επειδή ROS εμπλέκονται επίσης σε Notch3 μονοπάτι [42] σηματοδότησης, [43], ελέγξαμε την υπόθεση ότι θα μπορούσαν να MSeA καταστέλλουν την απευαισθητοποίηση OVCA429 /NICD3 καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων σε καρβοπλατίνη. Τα αποτελέσματα από αναλύσεις επιβίωσης SRB έδειξε ότι MSeA (0,25-2 mmol /L, Σχήμα 1Α) ή καρβοπλατίνη (1-25 μmol /L, Σχήμα 1Β) και μόνο με δοσοεξαρτώμενο σκότωσε περισσότερους OVCA429 /pCEG από OVCA429 /NICD3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα από τη συνδυαστική θεραπεία (Πίνακας 1) πρότεινε ότι MSeA (2 μmol /L) και καρβοπλατίνη (1-25 μmol /L) συνεργιστικά ευαισθητοποιημένα OVCA429 /NICD3 κύτταρα (Σχήμα 1 D), αλλά δεν OVCA429 κύτταρα /pCEG (Σχήμα 1 C). Περαιτέρω αναλύσεις επιβεβαίωσαν CI ισχυρή συνέργεια μεταξύ MSeA (2 μmol /L) και καρβοπλατίνη (1-25 μmol /L) σε OVCA429 /NICD3 κυττάρων (Πίνακας 2). Η συνέργεια αυτή γραμμικά ενισχυμένη, καθώς οι συγκεντρώσεις καρβοπλατίνη αυξηθεί. Είναι ενδιαφέρον ότι, με βάση τιμές CI (Πίνακας 2), μέτριο έως ισχυρό ανταγωνισμό συνέβησαν μετά την ταυτόχρονη αγωγή με MSeA στα 2 μmol /L σε κύτταρα OVCA429 /pCEG και ≤ 1 μmol /L σε μερικά από τα κύτταρα OVCA429 /NICD3. Ειδικότερα, η MSeA (2 μmol /L) και καρβοπλατίνη (25 μmol /L) συν-θεραπεία ευαισθητοποιημένων τα πυρίμαχα OVCA429 κύτταρα /NICD3 σε βαθμό που θυμίζει ότι σε κύτταρα OVCA429 /pCEG (36.2 έναντι 30.2% επιβίωση). Στο σύνολό τους, MSeA μπορεί συνεργικά ευαισθητοποιήσει Notch3 ενεργοποιούμενη OVCA καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα με την παραδοσιακή θεραπεία καρβοπλατίνη σε φαρμακολογικώς επιτεύξιμες συγκεντρώσεις.

OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία συγκέντρωση βαθμίδα MSeA (

Α

) ή καρβοπλατίνη (

Β

) για 2 ημέρες. *,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα OVCA429 /pCEG. κύτταρα OVCA429 /pCEG (

C

) και κύτταρα OVCA429 /NICD3 (

D

) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρβοπλατίνη (0-25 μmol /L) σε απουσία ή παρουσία του MSeA (2 μmol /L) για 2 ημέρες. Οι τιμές είναι μέσες ± S.E.M. (N = 3). Διακεκομμένες γραμμές προβλέπουν την αθροιστική δράση των MSeA και καρβοπλατίνη.

Η

Η

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 συν-επεξεργασία με MSeA και καρβοπλατίνη

σε περίπτωση απουσίας του MSeA και καρβοπλατίνη, υπήρχαν μεγαλύτερες G2 /M και λιγότερο G1 και S πληθυσμούς (

ρ

& lt? 0,05) σε OVCA429 /NICD3 ό, τι σε κύτταρα OVCA429 /pCEG (Πίνακας 3). Δύο ημέρες μετά την συν-κατεργασία του MSeA (2 μmol /L) και καρβοπλατίνη (5 μmol /L), S και G2 /M πληθυσμός μειώθηκε σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) σε OVCA429 /pCEG και OVCA429 /κυττάρων NICD3, αντίστοιχα. OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα εμφανίζονται συγκριτικά μία χρονοεξαρτώμενη επαγωγή της κατάτμησης DNA μετά την συν-θεραπεία, όπως αποδεικνύεται από τους πληθυσμούς υπο-G1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συν-θεραπεία στοχεύουν διαφορικά τη φάση S σε κύτταρα OVCA429 /pCEG και το G2 /M φάση στα κύτταρα OVCA429 /NICD3.

Η

Επίδραση της NAC, KU 60019, και NU 7026 για η ευαισθησία του OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα στο MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία

στη συνέχεια, θα εξετασθεί αν οξειδοαναγωγική κατάσταση και τις δραστηριότητες της κινάσης των ΑΤΜ και DNA-PK

cs συμμετείχαν στην ευαισθησία OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα στο MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία. Με την παρουσία του NAC (10 mmol /L), η θανάτωση επίδραση της MSeA και καρβοπλατίνη ήταν πολύ ανακουφίζεται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήματα 2Α-2D). Αντίθετα, η παρουσία του KU 60,019 (3 ​​μmol /L) ή NU 7026 (10 μmol /L) δεν μετέβαλε την ευαισθησία του OVCA429 /pCEG ή OVCA429 /NICD3 κυττάρων σε κλίση συγκεντρώσεων MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία (Σχήμα 3 ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επαγωγή της ROS, αλλά δεν ATM ή DNA-PK

δραστηριότητες κινάσης cs, εμπλέκεται στην επίδραση δολοφονία MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία.

OVCA429 /pCEG (

ένα

,

C

) και OVCA429 /NICD3 (

Β

,

D

) κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MSeA και συγκέντρωση κλίσης του καρβοπλατίνη (

Α

,

B

) ή η καρβοπλατίνη και μία συγκέντρωση βαθμίδα MSeA (

C

,

D

) παρουσία ή απουσία NAC. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. Βιωσιμότητα των κυττάρων χωρίς καρβοπλατίνη (

Μια

,

Β

) ή MSeA (

C

,

D

) θεραπεία ορίστηκε ως 100%. Οι τιμές είναι μέσες ± S.E.M. (N = 3). *,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με MSeA ή καρβοπλατίνη μόνη θεραπεία

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MSeA και μια βαθμίδα καρβοπλατίνη (

Μια

–

D

). Ή καρβοπλατίνη και κλίση συγκέντρωσης του MSeA (

E

–

η

) παρουσία ή απουσία KU 60019 (

Μια

,

Β

,

E

,

F

) και NU 7026 (

C

,

D

,

G

,

Η

). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. Οι τιμές είναι μέσες ± S.E.M. (N = 3).

Η

Επίδραση των MSeA και καρβοπλατίνη στην έκφραση του mRNA των γονιδίων στόχων Notch στην OVCA429 /pCEG και κύτταρα OVCA429 /NICD3

Είμαστε δίπλα καθοριστεί αν η έκφραση του mRNA του Notch γονιδίων στόχων μπορεί να μεταβάλλεται με MSeA και καρβοπλατίνη θεραπεία. Όπως ήταν αναμενόμενο,

HES1 και HEY1

, κλασική γονίδια στόχους Notch, ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε κύτταρα OVCA429 /NICD3 (Σχήμα 4).

HES1

έκφραση του mRNA αυξήθηκε (

σ

& lt? 0,05) 6 και 12 ώρες μετά τη θεραπεία MSeA στις δύο OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα, η πολλαπλάσια επαγωγή της οποίας ήταν μεγαλύτερη σε ο πρώην από την τελευταία. Η MSeA που προκαλείται

HES1

έκφραση mRNA υποχωρήσει σε 12 ώρες. Σε αντίθεση, καρβοπλατίνη θεραπεία οδήγησε σε μέτρια και καθυστερημένη επαγωγή

HES1

έκφρασης. Ωστόσο,

HEY1

έκφραση του mRNA που δεν επηρεάζονται από MSeA ή καρβοπλατίνη θεραπείας και στις δύο OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα. Συνολικά, MSeA επάγει την έκφραση του mRNA της

HES1

ανεξάρτητα από καρβοπλατίνη ή έκφραση NICD3.

Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν με εκείνα της β-ακτίνης και παρουσιάζονται ως φορές αλλάζει σε σχέση με το OVCA429 /pCEG κύτταρα χωρίς MSeA (2 μmol /L) και καρβοπλατίνη (/L 25 μmοl) θεραπεία. Οι τιμές είναι μέσες ± S.E.M. (N = 3). *,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με OVCA429 κύτταρα /pCEG. #,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς MSeA και καρβοπλατίνη θεραπεία.

Η

Επίδραση των MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία για το σχηματισμό της pATMS1981, pDNA-PK

csS2056 και γH2AX σε OVCA429 /pCEG και OVCA429 /κύτταρα NICD3

επόμενο αξιολογούνται κυτταρική απόκριση βλάβης του DNA σε συν-θεραπεία. Στις 24 ώρες, ρϋΝΑ-ΡΚ

επίπεδο csS2056 αυξήθηκαν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) και η επαγωγή θα μπορούσε να αντιστραφεί τελείως με την παρουσία του NU 7026 και στις δύο OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3 κύτταρα ( Εικόνα S1A στο S1 αρχείου). Η παρουσία του NAC εξασθενημένου ρϋΝΑ-ΡΚ

έκφραση csS2056 σε OVCA429 /pCEG αλλά όχι σε κύτταρα OVCA429 /NICD3. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση pATMS1981 επάχθηκε (

ρ

& lt? 0,05) από την συν-θεραπεία σε OVCA429 /pCEG αλλά όχι σε κύτταρα OVCA429 /NICD3 (Σχήμα S1B σε S1 File). Η επαγωγή της έκφρασης pATMS1981 κατεστάλη με την παρουσία του KU 60,019 ή NAC. Η MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία δεν προκάλεσε σχηματισμό γH2AX (Εικόνα S2 σε File S1), το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι η θεραπεία καρβοπλατίνη, ακόμη και σε πολύ υψηλή δόση (100 μmol /L), προκαλεί μόνο ελαφρά τον σχηματισμό γH2AX σε OVCAR-3 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [44], [45]. Συνολικά, pDNA-PK

csS2056 και pATMS1981 ανταποκρίνονται διαφορετικά σε MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία και δεν συσχετίζονται άμεσα με το φαινόμενο θανάτωσης των κυττάρων OVCA429 /pCEG και OVCA429 /NICD3.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι MSeA μπορούν να ενισχύσουν συνεργικά την αποτελεσματικότητα της καρβοπλατίνη στη δολοφονία του OVCA429 /NICD3 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα, προτείνοντας μια νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση της υψηλής ποιότητας των ωοθηκών καρκίνωμα που εμφανίζουν ενεργοποίηση Notch3. Τέτοια συνεργική δράση είναι πιθανή αποδίδεται στην διαμόρφωση του NICD3 γεγονότων μετενεργοποίησης ρυθμίζονται από MSeA και καρβοπλατίνη. θεραπεία καρβοπλατίνη ή η έκφραση του NICD3 δεν επηρεάζει το περιεχόμενο σελήνιο στην MSeA-κατεργασμένα κύτταρα (OVCA429 κύτταρα /pCEG, 21,5 ± 2,6 έναντι 24,7 ± 1,4 ng /mg πρωτεΐνης? κύτταρα OVCA429 /NICD3, 26,8 ± 2,9 έναντι 25,1 ± 1,4 ng /mg). ROS μπορεί να συμβάλλουν στο φαινόμενο θανάτωσης MSeA και καρβοπλατίνη, αλλά δεν απαιτούνται για τη συνέργεια σε κύτταρα OVCA429 /NICD3. Επειδή οι συγκεντρώσεις σεληνίου στον ορό και η καρβοπλατίνη έχουν αναφερθεί ότι ανέρχεται 15 και 105 μmol /L, αντίστοιχα [46], [47], οι δόσεις των MSeA και καρβοπλατίνη χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είναι κλινικά σημαντικές και φαρμακολογικά εφικτό. Παρ ‘όλα αυτά, είναι το μέλλον ενδιαφέρον για την επιβεβαίωση της συνέργεια σε άλλες Notch3-ενεργοποιημένα τα καρκινικά κύτταρα και σε προ-κλινικές και κλινικές ρυθμίσεις.

HES1

και

HEY1

είναι κλασική NICD3 γονιδίων στόχων. HES1 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας του οποίου ρόλους στην οδό σηματοδότησης Notch έχουν αρχίσει να εκτιμηθεί [30], [48]. NICD3 διαενεργοποιεί

HES1

έκφραση με αποσύνδεση συν-καταστολείς της και επιτρέποντας συν-ενεργοποιητές να δεσμεύσει. Ως μεταγραφικός καταστολέας, HES1 συνέχεια μπορούν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αν και HES1 πάνω ρύθμιση είναι γνωστό ότι προάγει την καρκινογένεση [49], υπάρχουν πολυάριθμες αναφορές που δείχνουν προς τα κάτω ρύθμιση των HES1 σε συνδυασμό με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [50] και σε επιθετικούς όγκους [51]. Από MSeA επάγει την έκφραση του mRNA της

HES1

αλλά όχι

HEY1

, MSeA δεν μπορεί να ενεργήσει άμεσα για NICD3. Επιπλέον, MSeA προκαλεί μια μεγαλύτερη

HES1

έκφραση mRNA σε OVCA429 /pCEG από ό, τι στα κύτταρα OVCA429 /NICD3, γεγονός που υποδηλώνει ότι MSeA μπορεί να τονώσει τη δέσμευση των συν-ενεργοποιητών ανεξάρτητα από NICD3. Είναι επίσης πιθανό ότι Notch1 και Notch2 ευθύνονται για τη σημαντική επαγωγή HES1 στο OVCA429 κύτταρα /pCEG. Η διαφορική ρύθμιση των MSeA και καρβοπλατίνη για την έκφραση του mRNA των γονιδίων στόχων NICD3 μπορεί να εξηγήσει τουλάχιστον εν μέρει την συνέργεια σε OVCA429 κύτταρα /NICD3. Ωστόσο, επειδή η θεραπεία με τις ίδιες δόσεις MSeA και καρβοπλατίνη αντί να οδηγήσει σε ανταγωνισμό σε κύτταρα OVCA429 /pCEG, πρέπει να ληφθούν υπόψη αφορούν προσεκτικοί το κύτταρο-ειδική και δοσοεξαρτώμενη φύση της συνέργειας. Αυτή η έννοια είναι συνεπής με την κατανόηση ότι το εύρος των αποτελεσματικών χημειοπροφύλαξη σελήνιο είναι στενό και ειδική για τον καρκίνο [39]. Επιπλέον, η θεραπεία MSeA μπορεί να προάγει την έκφραση κάποιων καρκίνο προώθηση selenoproteins στο OVCA429 κύτταρα /pCEG [52]. Οι μελλοντικές μελέτες για να διαλευκανθεί αυτό το MSeA επαγόμενη μεταγραφική ρύθμιση και να ελέγξει το ρόλο της HES1 και άλλων γονιδίων-στόχων Notch σε προ-κλινικά μοντέλα και κλινικά δείγματα καρκίνου των ωοθηκών.

Χαμηλή τοις εκατό του πληθυσμού της φάσης S, όπως εμφανίζεται σε κύτταρα OVCA429 /NICD3, είναι ενδεικτική της αντιγραφής του DNA ταχεία και η κακή απόκριση σε χημειοθεραπεία [53], [54]. Μετά την MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία, το ποσοστό του πληθυσμού φάση S πέφτει σε κύτταρα OVCA429 /pCEG ενώ το ποσοστό G2 /M του πληθυσμού μειώνεται στο OVCA429 /NICD3. Η πτώση ποσό παρόμοια με την αύξηση του πληθυσμού υπο G1, προτείνοντας ότι ο συν-θεραπεία μπορούν να στοχεύουν φάσης S σε κύτταρα OVCA429 /pCEG και G2 /M φάση σε κύτταρα OVCA429 /NICD3 για απόπτωση. Είναι πιθανό ότι το άγχος αναδιπλασιασμό και DNA που επάγονται από τα διαλείμματα καρβοπλατίνη και MSeA ευαισθητοποιούν κύτταρα OVCA429 /pCEG στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, αλλά ομόλογο ανασυνδυασμό ενεργοποιείται σε OVCA429 /NICD3 κύτταρα. Ως εκ τούτου, αυτό θα απαιτούσε μια συνδυαστική θεραπεία για την πρόκληση μιτωτική άγχος και G2 στόχου /Μ φάσης OVCA429 /NICD3 κύτταρα σε θάνατο. Παρά το γεγονός ότι ένας συνδυασμός γαλλικό και σουλφοραφάνης ευαισθητοποιεί προχωρημένο στάδιο τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών στη σισπλατίνη θεραπεία μέσω G2 /M σύλληψης [55], η MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία φαίνεται να στοχεύουν φάση S OVCA429 κύτταρα /pCEG και G2 /M φάση OVCA429 /NICD3 κύτταρα .

Αντιοξειδωτική θεραπεία έχει προταθεί για να μειώσει τις παρενέργειες σε σχέση με τη θεραπεία με καρβοπλατίνη, συμπεριλαμβανομένων ωτοτοξικότητα, νεφροτοξικότητα, και γαστρεντερική τοξικότητα [56] – [59]. Ωστόσο, η επίδραση του οξειδωτικού στρες ή αναγωγική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών δεν είναι σαφής. Επειδή η θεραπεία NAC desensitizes OVCA429 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με καρβοπλατίνη και MSeA συν-θεραπεία ανεξάρτητη της έκφρασης NICD3, το οξειδωτικό στρες φαίνεται να είναι μια γενική, αλλά όχι μια συγκεκριμένη απαίτηση για την αποτελεσματική καταστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Σε συμφωνία με την παρατήρηση μας, NAC έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την σισπλατίνη απόπτωση τόσο των πνευμόνων και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [56].

Είναι ενδιαφέρον ότι ο MSeA και καρβοπλατίνη συν-θεραπεία ενεργοποιεί διαφορικά ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ

cs κινάσες, αλλά η αναστολή των δραστηριοτήτων κινάσης τους δεν έχουν επίδραση στην συνέργεια των MSeA και καρβοπλατίνη στη δολοφονία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Μετά την συν-θεραπεία, ROS φαίνεται να απαιτείται για την ενεργοποίηση του ATM αλλά συνεισφέρουν εν μέρει σε DNA-ΡΚ

cs ενεργοποίηση κινάσης σε κύτταρα OVCA429 /pCEG. Ωστόσο, ΑΤΜ κινάσης δεν έχει ενεργοποιηθεί και DNA-PK

cs ενεργοποιείται ανεξάρτητα από NAC στην OVCA429 /NICD3 κύτταρα. Αν και ΑΤΜ είναι ανάντη της ΟΝΑ-ΡΚ

cs στην απόκριση του MSeA που προκαλείται οξειδωτικό στρες σε μη καρκινικά κύτταρα [39], DNA-ΡΚ

cs ενεργοποίηση από την συν-θεραπεία σε κύτταρα OVCA429 /NICD3 φαίνεται να να είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση ΑΤΜ. Επειδή η ενεργοποίηση του DNA-PK

cs μπορεί να αντέξει ενδοκυτταρικό οξειδωτικό στρες μετά τη θεραπεία MSeA [39], η έκφραση της NICD3 μπορεί να προδιαθέτουν τα κύτταρα σε οξειδωτικό στρες. Από την άλλη πλευρά, αν και ΑΤΜ κινάση ενεργοποιείται με οξειδωτικό στρες σε HCT116, PC-3 και τα καρκινικά κύτταρα U2-OS [12] – [14], είναι εντυπωσιακό ότι ΑΤΜ κινάση δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί σε κύτταρα OVCA429 /NICD3 μετά την συν -θεραπεία. Από ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα ATM [22], ο ρόλος των ΑΤΜ στον καρκίνο των ωοθηκών καρβοπλατίνη ανθεκτικά αναμένει περαιτέρω επαλήθευση.

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών στις Ηνωμένες μελών. Επειδή οι περισσότεροι ασθενείς διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο λόγω δοκιμή ακυρωθεί διαλογής και μη ειδικά συμπτώματα που παρουσιάζονται, χρειάζονται ένα συνδυασμό χειρουργικής επέμβασης debulking και χημειοθεραπεία. Ωστόσο, οι ασθενείς συνήθως έχουν υποτροπιάζοντα καρκίνο μετά τη θεραπεία και ακόμη και να αναπτύξουν χημειοαντίσταση. Έτσι, ξεπερνώντας την αντίσταση στη χημειοθεραπεία είναι ένας από τους ελπιδοφόρες στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Εκτός από την συνδυαστική δράση των MSeA με πακλιταξέλη, κουρκουμίνη, ή ΑΒΤ-737 στο αποπτωτικό θάνατο του προστάτη και του καρκίνου του μαστού κύτταρα [60] – [62], τα δεδομένα μας προσφέρει άμεση υποστήριξη για ένα συνθετικό θανατηφόρο αλληλεπίδραση μεταξύ MSeA και καρβοπλατίνης εντός τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που εκφράζουν και εμφανίζουν NICD3 χημειοαντίσταση. Εν κατακλείδι, MSeA και καρβοπλατίνη συνθετικό θνησιμότητα είναι μια ελπιδοφόρα προοπτική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών προχωρημένο στάδιο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0101664.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Changhui Zhao για την καλλιέργεια μερικά από τα κύτταρα, Craig Lacher και William Martin για ανάλυση σελήνιο, και ο Δρ Νικόλαος Gaiano για την παροχή του πλασμιδίου pCEG-NICD3.

Εγκρίθηκε για δημοσίευση ως χειρόγραφο αρ J-12536 του Μισισιπή Γεωργικών και πειραματικού σταθμού Δασών, Κρατικό Πανεπιστήμιο του Μισισιπή.