Αφηρημένο

Helicobacter pylori

(

Η

.

pylori

) είναι ένα σπειροειδές σχήμα Gram-αρνητικό βακτήριο που προκαλεί την πιο κοινή χρόνια λοίμωξη στο ανθρώπινο στομάχι. Περίπου 1% -3% των μολυσμένων ατόμων αναπτύσσουν καρκίνο του στομάχου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους

Η

.

pylori

επάγει γαστρικού καρκίνου δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ του παράγοντα παθογένειας των

Η

.

pylori

, κυτοτοξίνη σχετιζόμενη γονίδιο Α (CagA), και γαστρικού καρκίνου. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό

Η

.

πυλωρού

μολυσματικότητα, ιδρύσαμε τρεις κυτταρικές σειρές μολύνοντας τις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901 και AGS με

CAGA

+

H

.

pylori

και επιμόλυνση SGC-7901 με ένα φορέα που φέρει το πλήρους μήκους

CagA

γονίδιο. Διαπιστώσαμε 135 διαφορετικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες από τις τρεις κυτταρικές γραμμές με χρήση τεχνολογίας πρωτεώματος και 10 απόκλιση πρωτεΐνες που είναι κοινές στα τρεις κυτταρικές γραμμές επιλέχθηκαν και αναγνωρίστηκαν με LC-MS /MS, καθώς και επαληθεύεται με κηλίδα western: β-ακτίνη, L-γαλακτικό αφυδρογονάση (LDH), διυδρολιποαμιδίου αφυδρογονάση (DLD), προ-mRNA επεξεργασίας συντελεστή 19 ομόλογο (PRPF19), ΑΤΡ συνθάσης, καλμοδουλίνη (CAM), Ρ64 CLCP, Ran-ειδικά ΘΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών (RanGAP), Ρ43 και Καλρετικουλίνης. Η ανίχνευση της έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών και γονιδίων που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς με πραγματικού χρόνου PCR (RT-qPCR) και στύπωμα Western αποκάλυψε ότι η έκφραση του

β-ακτίνης

,

LDH

,

DLD

,

PRPF19

και

CaM

γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και

RanGAP

ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και /ή μεταστατικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με περι-καρκινικούς ιστούς. υψηλή έκφραση του γονιδίου παρατηρήθηκε για

Η

.

πυλωρού

μόλυνση στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, η

LDH

,

DLD

και

CaM

γονίδια απομεθυλιωθεί στον υποκινητή -2325, -1885 και -276 περιοχές, αντίστοιχα, και το

RanGAP

γονίδιο ιδιαίτερα μεθυλιώνεται στην υποκινητή -570 και -170 sites στο

η

.

πυλωρού

-μολυσμένα και

CAGA

κύτταρα που υπερεκφράζουν. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τους στόχους μοριακή παθογένεση και θεραπεία για καρκίνο του στομάχου με το

Η

.

πυλωρού

λοίμωξη

Παράθεση:. Zhou J, Wang W, Xie Υ, Zhao Υ, Chen X, Xu W, et al. (2016) Πρωτεομική-Based εντοπισμός και η ανάλυση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το

Helicobacter pylori

σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 15 του Σεπτέμβρη 2015? Αποδεκτές: 19, Δεκ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 8, Ιανουαρίου, 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81260303, 31560326), Guizhou επαρχία ίδρυμα (QianJiaoHe [2014] 06) και βασικό έργο της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Guizhou επαρχία (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). Στην αρχική έκδοση, το έργο που υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81260303, 31560326) και βασικό έργο της Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Helicobacter pylori

(

η

.

πυλωρού

) προκαλεί την πιο κοινή χρόνια λοίμωξη του στομάχου στους ανθρώπους σε όλο τον κόσμο. Περίπου το ήμισυ του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί με το

Η

.

πυλωρού

, και η πλειοψηφία των αποίκισαν τα άτομα αναπτύσσουν ασυμπτωματική γαστρίτιδα. Μεταξύ μολυσμένα άτομα, περίπου το 10% -20% των ατόμων αναπτύσσουν πεπτικών ελκών και 1% -3% αναπτύσσουν καρκίνο του στομάχου [1,2]. Το 1994,

Η

.

πυλωρού

ταξινομήθηκε ως τύπου Ι καρκινογόνο για τον καρκίνο του στομάχου από το Διεθνή Οργανισμό του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για την Έρευνα για τον Καρκίνο.

καρκίνο του στομάχου είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, και περισσότερο από ό, τι 70% των νέων κρουσμάτων και των θανάτων συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες [3]. Παρά το γεγονός ότι η παγκόσμια συχνότητα εμφάνισης έχει μειωθεί για αρκετές δεκαετίες, γαστρικού καρκίνου εξακολουθεί να επικρατεί στις περισσότερες αναπτυσσόμενες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ιαπωνίας, της Κορέας και της Κίνας [4-6]. Το 2012, η ​​Ετήσια Έκθεση κινεζική Αρχείο Καρκίνου έδειξε ότι η γαστρική τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα από καρκίνο είναι δεύτερη και τρίτη θέση μεταξύ όλων των κακοήθων όγκων, αντίστοιχα.

Η πλειοψηφία των

Η

.

πυλωρού

στελέχη φέρουν το

CAG

παθογένειας νησιού (

CAG

PAI), το οποίο περιέχει 27 έως 31 γονίδια που κωδικοποιούν ένα βακτηριακό σύστημα έκκρισης τύπου 4 (T4SS) [7] . Το γονίδιο κυτοτοξίνη σχετιζόμενη Ένα γονίδιο (

CagA

), που βρίσκεται στο 3 ‘άκρο του

CAG

ΡΑΙ, κωδικοποιεί το μόνο γνωστό βακτηριακό ογκοπρωτεΐνη, CagA, το οποίο μετατοπίζεται σε κύτταρα ξενιστές με T4SS μετά βακτηριακή προσκόλληση στο στομάχι. Μόλις μέσα στα κύτταρα ξενιστή, CagA είναι φωσφορυλιωμένη τυροσίνη από μέλη των οικογενειών κινάσης Abl και Src και αλληλεπιδρά με πολυάριθμες ενδοκυτταρική τελεστές, που οδηγούν στην ενεργοποίηση των κατάντη μορίων σηματοδότησης [8]. Σε κλινικές μελέτες,

CagA

-θετικό στελέχη έχουν σταθερά συνδεθεί με πιο σοβαρή γαστρική φλεγμονή και έλκη, και ένα μικρό κλάσμα του ατόμων αναπτύσσουν γαστρικού καρκίνου [9]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τη σύνδεση των CagA με καρκίνο δεν έχουν διευκρινιστεί.

Πρωτεομική έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη τεχνολογική πλατφόρμα για την ορθολογική ταυτοποίηση βιοδεικτών και νέων θεραπευτικών στόχων για τις ασθένειες και τον προσδιορισμό των υποκείμενων μηχανισμών της καρκινογένεση [10]. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις σημαντικές πρωτεΐνες ανιχνεύονται με πρωτεομικής in vitro δεν έχουν επιβεβαιωθεί in vivo σε κλινικά δείγματα.

DNA μεθυλίωση και απομεθυλίωση παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και πρόοδο των καρκίνων με αποκλεισμό της δέσμευσης των παραγόντων μεταγραφής στο DNA και εμφανίζεται σχεδόν αποκλειστικά στο γονίδιο υποκινητή νησίδες CpG [11-13]. Μεταξύ όργανα, το στομάχι παρουσιάζει την υψηλότερη συχνότητα των μη φυσιολογικών νησί CpG μεθυλίωσης, ενδεχομένως

Η

.

πυλωρού

μεσολάβηση [14-16]. Αν και οι μελέτες της μεθυλίωσης του DNA αυξάνεται, τα κράτη γονίδιο μεθυλίωσης προκαλείται από

Η

.

pylori

δεν είναι ακόμη σαφείς.

Σε αυτό το έργο, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει συγκεκριμένες πρωτεΐνες που σχετίζονται με την

Η

.

pylori

μόλυνση χρησιμοποιώντας συγκριτική πρωτεομική και χαρακτηρίζουν την έκφραση γονιδίου και CpG μεθυλίωση νησί των πρωτεϊνών αυτών σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινοι ιστοί

Ανθρώπινοι ιστοί ελήφθησαν από δείγματα χειρουργική επέμβαση από 30 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς του καρκίνου και μεταστατικών λεμφαδένων σε Γκουιγιάνγκ Ιατρικό νοσοκομείο, Γκουιγιάνγκ Κίνα, μεταξύ Ιανουαρίου 2009 και Ιουνίου 2010. Οι διαγνώσεις επιβεβαιώθηκαν από δύο παθολόγους. Μεταξύ των ασθενών, 23 ήταν άνδρες και 7 γυναίκες. Οι ασθενείς είχαν ηλικία 38-77 ετών. Είκοσι δύο ασθενείς είχαν αδενοκαρκίνωμα εντερική τύπου, και 8 είχαν αδενοκαρκίνωμα διάχυτη τύπου. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Γκουιγιάνγκ Ιατρικό νοσοκομείο, και όλα τα θέματα που προβλέπονται έγγραφη συγκατάθεση.

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος AGS (ATCC CRL-1739TM) και SGC-7901 κύτταρα που αγοράζονται απευθείας από την American Type Culture Collection (ATCC) και κυττάρων της Τράπεζας Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), αντίστοιχα, και περάστηκαν για λιγότερο από 3 μήνες στο εργαστήριο μας μετά από την παραλαβή. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμοαπενεργοποιημένο βοοειδή, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2.

H

.

πυλωρού

πολιτισμό

Η

.

πυλωρού

στέλεχος NCTC11637 (ATCC 43504, ένα δώρο από το Κινεζικό Κέντρο του

Helicobacter pylori

στέλεχος Διαχείρισης και Συντήρησης, Πεκίνο, Κίνα), η οποία είναι

CagA

θετική, ήταν αναπτύσσονται σε επιλεκτικό μέσο σε μία πλάκα άγαρ Columbia που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και

H

.

πυλωρού

Selective Supplement (Oxoid Ltd, Αγγλία) στους 37 ° C υπό συνθήκες μικροαερόβιο.

μόλυνση των κυττάρων με το

Η

.

πυλωρού

Η

AGS και SGC-7901 κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-καλά για 24 ώρες και μολύνθηκαν με

Η

.

pylori

για 6 ώρες και 12 ώρες σε ένα πολλαπλότητες μόλυνσης (ΜΟΙ) από 1: 100, 1: 500 και 1: 1000, αντίστοιχα. Τα κύτταρα μολύνθηκαν για 12 ώρες σε ΜΟΙ 1: 1000 με το

H

.

πυλωρού

βρασμένο για 15 λεπτά ως μάρτυρες.

Η κατασκευή του φορέα έκφρασης pcDNA3.1 /

CAGA

Η

Το DNA που εξάγεται από

Η

.

πυλωρού

, και το full-length

CAGA

αλληλουχία συντέθηκε με PCR και κλωνοποιήθηκε σε pMD18-T πλασμίδια για την κατασκευή pMD18-Τ /

CagA

. Η

CAGA

γονίδιο ταυτοποιήθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας (GQ161098). pMD18-T /

CagA

υπέστη πέψη με τα ένζυμα περιορισμού

Pst

Ι και

Bam ΗΙ

, και

CagA

συνδέθηκε εντός pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) για την κατασκευή του ευκαρυωτικού φορέα έκφρασης pcDNA3.1 /

CagA

. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που παρέχονται στον Πίνακα 1.

Η

κυττάρων επιμόλυνση με pcDNA3.1 /

CAGA

Η

SGC-7901 κύτταρα επωάστηκαν για 12 ώρες σε τρυβλία 6 φρεατίων για να ληφθούν 80% συρρέοντα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα χωρίστηκαν 1:10 σε νέες πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε επιλεκτική Zeocin περιέχει (250 μg /mL) πρότυπο μέσο για 2 εβδομάδες μέχρι το σχηματισμό του κλώνου. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα pcDNA3.1 /Zeo (-) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι

εκχύλιση πρωτεϊνών και δυτική

κηλίδα

εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν με επαναιώρηση σφαιρίδια κυττάρων σε ένα ρυθμιστικό RIPA ή ομογενοποίηση 200. mg ιστών σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Συνολικά 30-50 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE γέλη, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) και στυπώθηκε όλη τη νύχτα με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-CagA αντίσωμα (1: 800, sc-28 368), μονοκλωνικό ποντικού αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα (ΡΥ99, 1: 300, sc-7020), αντίσωμα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-βήτα ακτίνης (1: 500, ab189073), αντίσωμα αντι-LDH πολυκλωνικό κουνελιού (1: 350 , ab125683), μονοκλωνικό ποντικού αντι-DLD (1: 800, SC-376890), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-PRPF19 (1: 400, ab27692), αντίσωμα συνθάσης αντι-ΑΤΡ μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1: 300, ab54880), κουνέλι πολυκλωνικό αντι -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), αντίσωμα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-RanGAP (1: 200, ab92360), αντίσωμα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-p64CLCP (1: 300, ab28722), αντίσωμα αντι-Καλρετικουλίνης πολυκλωνικό κουνελιού (1: 350, ΑΒ4) και -dehydrogenase μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH, 1: 8000) από την Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) και CangChen (Shanghai, Κίνα), αντίστοιχα, σε 5% BSA σε Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και 0,01% Tween-20. δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν και αναπτύχθηκαν με την ECL αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας Plus χρησιμοποιώντας Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Ποσοτικοποίηση των κηλίδων Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό. Κάθε πείραμα διεξήχθη 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα δείχνεται.

εκχύλιση πρωτεϊνών και δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής

Τα κυτταρικά ιζήματα διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και πρωτεΐνη καταβυθίστηκε με τρεις όγκους παγωμένης ακετόνης με επώαση στους 4 ° C για 2 ώρες. Τα δείγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 20.000 rpm για 30 λεπτά, και τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου και αποθηκεύεται σε 4 ° C όλη τη νύκτα.

Ένα σύνολο 800 μα πρωτείνης ρυθμίστηκε σε όγκο 250 μL με διάλυμα επανυδάτωση, και ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συστήματος εστιάζοντας Ettan IPGphor II ισοηλεκτρικό (Amersham Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πρωτόκολλο για IEF ήταν 300 V γιά1Η, 500 V επί 2,5 ώρες, 1000 V επί 2 ώρες? 8000 V για 8 ώρες, 60 KVH (συνολικά).

Μετά την ολοκλήρωση IEF, οι λωρίδες IPG (Amersham Biosciences) εξισορροπήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης για 15 λεπτά και τοποθετήθηκε σε 12% γέλη SDS-PAGE των δικύκλων διαστάσεων ηλεκτροφόρηση στα 30 mA /γέλη. Το προκύπτον SDS-PAGE γέλη σταθεροποιήθηκε σε 20% TCA για 30 λεπτά και στη συνέχεια βάφτηκαν με κολλοειδές Coomassie G-250 [5].

Οι κηλίδες πρωτεΐνης στο πήκτωμα σαρώθηκαν και αναλύθηκαν αυτόματα. Διαφορικά εκφρασμένων κηλίδες πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκαν με Imaging Μάστερ 2D 5.0 ​​λογισμικό ανάλυσης (Amersham Biosciences). t-test του Student πραγματοποιήθηκε για την ποσοτική ανάλυση των 2D πηκτών. Διαφορική έκφραση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης ορίστηκε ως ≥2 φορές αλλαγή στην κηλίδα οπτικής πυκνότητας μεταξύ των δύο συνόλων συμφωνημένα εις διπλούν. Τα απόκλιση κηλίδες συνέχεια αποκόπηκε από τα πήγματα SDS-PAGE για την περαιτέρω ταυτοποίηση με LC-MS /MS.

εξαγωγή RNA και ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από 50 mg ιστού και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (RNase-free). Τα γονίδια ενισχύθηκαν με SYBR Green (Applied Biosystems, Αυστραλία). Η υποξανθίνη-γουανίνης (

HPRT

) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος κανονικοποίηση, και τα σχετικά επίπεδα mRNA υπολογίστηκαν με συγκριτική C

t μέθοδο χρησιμοποιώντας Βήμα-ένα λογισμικό (Applied Biosystems, Αυστραλία) [8]. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1.

εξαγωγή DNA και ανάλυση μεθυλίωσης των CpG νησίδων

DNA απομονώθηκε από τα κύτταρα και τροποποιημένα με όξινο θειώδες νάτριο, χρησιμοποιώντας ένα EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit

™ (Zymo Research, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο υποστηρικτής CpG νησίδες προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Methyl Primer Express και ενισχύθηκε από όξινο θειώδες-τροποποιημένο DNA με PCR χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες διαδικασίες: τη μετουσίωση στους 96 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 40 sec, ανόπτηση στους 60 ° C για 40 δευτερόλεπτα, και επιμήκυνση στους 72 ° C για 40 δευτερόλεπτα, με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα ενισχυμένα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε pMD19-T φορείς και αλληλουχήθηκε. Επιπλέον, DNA που απομονώθηκε από τους ιστούς όγκου χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση

H

.

πυλωρού

16S

rRNA

γονιδίων και

CagA

γονίδιο. Οι αλληλουχίες εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα 2.

Η

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 15.0 λογισμικού. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και t-test του Student χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων.

P

& lt?. 0.05 (δύο όψεων) θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Εισαγωγή CagA σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Επειδή CagA του

H

.

pylori

είναι ένας κρίσιμος παράγοντας λοιμοτοξικότητας στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου, του CagA ανιχνεύτηκε σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου με RT-PCR και κηλίδος western μετά από μόλυνση του SGC-7901 και τα κύτταρα AGS με

H

.

πυλωρού

και επιμόλυνση του SGC-7901 κύτταρα με

CagA

-φορέα. Η πρωτεΐνη CagA άρχισαν να εμφανίζονται σε μια αναλογία των κυττάρων σε βακτήρια του 1: 500 σε καλλιεργημένα κύτταρα στις 6 ώρες, και η περιεκτικότητα ήταν υψηλότερη σε αναλογία 1: 1000 σε 6 ώρες (Σχ 1Α και 1Β). Ωστόσο, φωσφορυλιωμένη CagA παρατηρήθηκε σε κύτταρα σε αναλογία 1: 500 μετά από καλλιέργεια για 12 ώρες, και το υψηλότερο περιεχόμενο παρατηρήθηκε σε κύτταρα σε αναλογία 1: 1000 μετά από 6 ώρες καλλιέργειας. CagA mRNA και πρωτεΐνη παρατηρήθηκαν επίσης σε σταθερά

CagA

υπερεκφράζουν SGC-7901 κύτταρα (Σχ 1C και 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CagA εισήχθη επιτυχώς στα τρία κυτταρικές σειρές και φωσφορυλιωμένη.

(Α και Β) ανάλυση κηλίδας Western των CagA και φωσφορυλιωμένων CagA σε

H

.

πυλωρού

-μολυσμένα SGC-7901 (Α) και τα κύτταρα AGS (Β). Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με την υποδεικνυόμενη αναλογία των κυττάρων να

H

.

pylori

για τον υποδεικνυόμενο χρόνο συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση, και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Κύτταρα που έχουν μολυνθεί με το

Η

.

pylori

βρασμένο για 15 λεπτά σε ΜΟΙ 1: 1000 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Γ και Δ) Ανίχνευση CagA mRNA και πρωτεΐνης σε

CagA

υπερεκφράζουν SGC-7901 κυττάρων με RT-PCR (C) και στύπωμα Western (D). GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Hp

,

Η

.

πυλωρού

? P-CagA, φωσφορυλιωμένη CagA? GAPDH, αφυδρογονάση 3-φωσφορικό άλας αφυδρογονάση.

Η

Αναγνώριση των διαφορικών πρωτεϊνών σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Μετά από κύτταρα που έχουν μολυνθεί με το

Η

.

του πυλωρού

για 6 ώρες σε ΜΟΙ 1: 1000 ή επιμολυσμένα με

CagA

-φορέα, μια πρωτεομική τεχνική χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία έξι δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2-DE) χάρτες από τις τρεις κυτταρικές σειρές και αντίστοιχους ελέγχους τους (Σχήμα 2), και 135 απόκλιση κηλίδες ανιχνεύθηκαν, εκ των οποίων 73 ήταν ελεγχόμενες up-και 62 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Δέκα διαφορικό είδε την κίνηση του κοινού για εντοπίστηκαν από LC- MS /MS και επαληθεύεται από κηλίδα western όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων 6 έως ρυθμίζεται πρωτεϊνών: β-ακτίνη, LDH, DLD, PRPF19, ΑΤΡ συνθάσης και καλμοδουλίνης (CAM), και 4 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες όπως RanGAP, Ρ64 CLCP, P43 και Καλρετικουλίνης (Πίνακας 3 και Σχήμα 3Α).

SGC-7901 και AGS κύτταρα μολυσμένα με

η

.

pylori

για 6 ώρες σε ΜΟΙ 1: 1000 (. Κυττάρου σε

H

pylori

) και SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με pcDNA3.1 /

CagA

για 48 ώρες συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη χρήση Bradford χρωματομετρία. Ένα σύνολο 800 μα πρωτείνης φορτώθηκαν για διδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Κύτταρα μολυσμένα με βραστό

Η

.

pylori

ή επιμολυσμένα με κενό φορέα χρησίμευσαν ως μάρτυρες για τα μολυσμένα ή διαμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. (Α) SGC-7901 κύτταρα μολυσμένα με

Η

.

πυλωρού

. (Β) AGS κύτταρα μολυσμένα με

Η

.

πυλωρού

. (C) SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με το

CagA

-φορέα. (D) μεγεθυμένη εικόνα των 10 διαφορική σημεία. Β4, Β11, C6, C7, C8 και C9 σημεία ήταν πάνω ρυθμισμένα, ενώ D12, D16, Ε2 και Ε11 κηλίδες κάτω-ρυθμίζονται. Αυτές οι κηλίδες που προσδιορίζονται στον Πίνακα 3.

Η

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών στα κύτταρα ελέγχου (1),

H

.

pylori

μολυνθέντα SGC-7901 κύτταρα (2) και

CAGA

-overexpressed SGC-7901 κύτταρα (3). GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR των υποδεικνυόμενων γονιδίων σε 30 γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος Ct φορές σε σύγκριση με περι-καρκινικούς ιστούς, όπου περι-καρκινικούς ιστούς τέθηκαν σε 1. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών σε 30 γαστρικό καρκινικούς ιστούς. 200 mg ιστοί ομογενοποιήθηκαν και οι ολικές πρωτεΐνες συλλέχθηκαν. Ένα σύνολο 50 μg πρωτεΐνης εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-PAGE. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Δ) Ανίχνευση του

Η

.

πυλωρού

16S

rRNA

γονιδίων και

CAGA

γονιδίου σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς με PCR (Άνω). Μ αντιπροσωπεύει το DNA δείκτη μοριακού βάρους. Η λωρίδα 1 είναι ο θετικός έλεγχος. Η λωρίδα 2 είναι ο αρνητικός έλεγχος. Οι διαδρομές 3, 4 και 6 είναι θετικά δείγματα. Λωρίδες 5 είναι αρνητικά δείγματα. Ποσοτική RT-PCR ανάλυση των υποδεικνυόμενων γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς με και χωρίς

H

.

πυλωρού

λοίμωξη (Lower). Οι τιμές παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος Ct φορές σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς

H

.

πυλωρού

λοίμωξη, η οποία είχε οριστεί σε 1. Η εικόνα παρουσιάζει τον μέσο όρο των 30 δειγμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. LDH, L-γαλακτική αφυδρογονάση. DLD, διυδρολιποαμιδίου αφυδρογονάση. PRPF19, προ-mRNA επεξεργασία συντελεστή 19 ομόλογο. RanGAP, πρωτεΐνη Ran-ειδικά ΘΤΡάσης ενεργοποίησης. Cam, καλμοδουλίνης. P64 CLCP, πυρηνική χλωριούχο πρωτεΐνη διαύλου ιόντων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με περι-καρκινικού ιστού (Β και C) και τους ιστούς χωρίς

H

.

πυλωρού

λοίμωξη (D).

Η

Η

.

πυλωρού

μόλυνση προάγει την έκφραση των διαφορικών πρωτεϊνών σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς

Επειδή

Η

.

pylori αποικίζει

επιλεκτικά το ανθρώπινο στομάχι να ενεργοποιήσει μια σειρά από παθολογικές διεργασίες, η έκφραση του γονιδίου της 10ης απόκλιση πρωτεϊνών σε 30 δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου του εκτιμήθηκε με ποσοτική RT-PCR. Από τα 10 γονίδια, η έκφραση

β-ακτίνης

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

και

CaM

στην γαστρικούς καρκίνους και /ή μεταστατικούς λεμφαδένες ήταν πάνω ρυθμισμένα σε σύγκριση με περι-καρκινικούς ιστούς, ενώ η έκφραση του

RanGAP

ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Ομοίως, οι 6 πρωτεΐνες επίσης αφύσικα εκφράζεται με τους ίδιους ιστούς (σχήμα 3Β και 3C). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των άλλων γονιδίων.

H

.

πυλωρού

αποικισμό σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς μετρήθηκε με την ανίχνευση των 16S

rRNA

γονιδίων και

CAGA

γονίδιο του

Η

.

πυλωρού

με PCR.

Η

.

πυλωρού

ήταν παρούσα σε 20 από τα 30 δείγματα (θετικό ποσοστό 67%), και το σύνολο των

Η

.

πυλωρού

στελέχη είναι

CagA

θετική. Τα επίπεδα mRNA της

β-ακτίνης

,

LDH

,

DLD

,

PRP19 και το έκκεντρο

ήταν υψηλότερες σε

Η

.

πυλωρού

-θετικό ιστούς από ό, τι στα αρνητικά δείγματα (Σχήμα 3D).

Η

.

pylori

επάγει παρεκκλίνουσα μεθυλίωση DNA σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Σε τρεις κυτταρικές γραμμές, τα προϊόντα PCR από τα νησιά CpG των παραπάνω γονιδίων επιτυχώς αποκτήθηκαν ακόλουθη κατεργασία όξινου θειώδους και αλληλουχήθηκε. Σε αυτά τα γονίδια,

LDH

,

DLD

και

CaM

γονίδια απομεθυλιωθεί στον υποκινητή -2325, -1885 και -276 περιοχές, αντίστοιχα, και το

RanGAP

γονίδιο ήταν ιδιαίτερα μεθυλιώνεται στην υποκινητή -570 και -170 θέσεις (Σχήμα 4).

(Α) Ηλεκτροφορητική ανάλυση των νησιών προαγωγού CpG των υποδεικνυόμενων γονιδίων με τροποποίηση όξινου θειώδους-PCR. sites (Β) μεθυλίωση του CpG νησίδες στις υποδεικνυόμενες υποκινητές γονιδίων.

LDH

, L-γαλακτική αφυδρογονάση.

DLD

, διυδρολιποαμιδίου αφυδρογονάση.

RanGAP

, Ran-ειδικά ΘΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών.

CaM

, Καλμοντουλίνη. Μ, δείκτης μοριακού βάρους. 1, μη επεξεργασμένα SGC-7901 κύτταρα? 2,

Η

.

πυλωρού

-μολυσμένα SGC-7901 κύτταρα? 3,

CAGA

υπερεκφράζουν SGC-7901 κύτταρα. Τα βέλη δείχνουν ανώμαλες θέσεις μεθυλίωσης.

Η

Συζήτηση

Συσωρευτική στοιχεία δείχνουν ότι

Η

.

πυλωρού

λοίμωξη είναι ένας σημαντικός παράγοντας για

Η

.

pylori

-associated παθήσεις του στομάχου και ότι CagA είναι η προώθηση παράγοντα για καρκίνο του στομάχου [17,18]. Κατασκευάσαμε τρεις πειραματικές κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων και δύο γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου μολυνθεί με

H

.

πυλωρού

(

CAGA

+) και γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή που υπερεκφράζουν

CagA

, και διαπίστωσε ότι CagA άρχισαν να εμφανίζονται στα κύτταρα 6 ώρες μετά τη μόλυνση και για έως και 12 ώρες. Στη συνέχεια, φωσφορυλιωμένη CagA άρχισαν να εμφανίζονται, συνεπής με την έγχυση και την επακόλουθη φωσφορυλίωση της CagA εντός γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων από το T4SS του

H

.

pylori

μετά τη μόλυνση του ανθρώπινου γαστρικού βλεννογόνου. Η φωσφορυλιωμένη CagA ενεργοποιεί καθοδικά μονοπάτια σηματοδότησης και παίζει ένα παθολογικό ρόλο. Παρατηρήσαμε επίσης CagA σε κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με το

CagA

-φορέα. Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν την επιτυχή κατασκευή των τριών πειραματικών κυτταρικών σειρών.

Πρωτεομική έχει χρησιμοποιηθεί για να μελετηθεί η σχέση μεταξύ των

Η

.

pylori

μόλυνση και ασθένειες του στομάχου, και πολλά διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών έχουν ταυτοποιηθεί [19-22]. Ωστόσο, η σύνδεση αυτών των πρωτεϊνών με CagA και την έκφρασή τους σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς παραμένουν ασαφείς. Έχουμε λάβει συνολικά 135 διαφορικό σποτ από τις τρεις κυτταρικές σειρές, εκ των οποίων 73 είχαν ρυθμιστεί μέχρι-και 62 ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Δέκα απόκλιση κηλίδες ήταν κοινή σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων 6 επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες (β-ακτίνη, LDH, DLD, PRP19, συνθάσης ΑΤΡ, και CAM) και 4 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες (Ρ64 CLCP, RanGAP, P43 και καλρετικουλίνη) , της έκφρασης και των 10 πρωτεΐνες »ελέγχθηκαν με κηλίδα western σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι πρωτεΐνες εμπλέκονται στο μεταβολισμό της ενέργειας, σκελετός αναδιάταξη, επεξεργασία προ-mRNA, μεταγωγής σήματος, και άλλες πρωτεΐνες που συνδέονται στενά με την ανάπτυξη και την εξέλιξη πολλών ανθρώπινων καρκίνων [23,24]. Εμείς ποσοτικά ανίχνευσε την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες 10 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς, η οποία αποκάλυψε ότι

β-ακτίνης

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

και

CaM

ήταν σταθερά υψηλή έκφραση και

RanGAP

ήταν κακώς εκφράζονται τόσο σε καρκινικούς ιστούς και /ή μεταστατικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με περι-καρκινικό ιστό. Η παρεκκλίνουσα έκφραση αυτών των πρωτεϊνών επαληθεύτηκε επίσης με western blot σε καρκίνο του στομάχου και μεταστατικούς λεμφαδένες. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι

CAGA

+

Η

.

pylori

αποικίσει σε 20 από 30 γαστρικού καρκινικούς ιστούς και προώθησε ή ανέστειλε την έκφραση αυτών των γονιδίων σε βιολογικό περιβάλλον.

LDH και DLD συνδέεται στενά με το μεταβολισμό της ενέργειας. Διαταραχή του μεταβολισμού ενέργειας θεωρείται ένας σημαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Σε αντίθεση με τα κανονικά κύτταρα, τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη εξάρτηση από την γλυκολυτική οδό με αρκετό οξυγόνο, ονομάζεται αερόβια γλυκόλυση. Μια μεγάλη ποσότητα του πυροσταφυλικό οξύ, ένα τελικό προϊόν της οδού, μετατρέπεται σε γαλακτικό οξύ από LDH, την προώθηση της γλυκολυτικής οδού και του μεταβολισμού της ενέργειας ανισορροπία [25]. Το γαλακτικό οξύ μπορεί επίσης να μειώσει το ρΗ του μικροπεριβάλλοντος κυττάρου, αυξάνοντας έτσι νεοαγγειακή απόκριση σε παράγοντες αγγειογένεσης για την προώθηση των καρκινικών κυττάρων της μετάστασης [26,27]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας,

LDH

ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ιστούς καρκίνου σε 61,8% των ασθενών με καρκίνο του στομάχου? ασθενείς με υπερέκφραση LDH είχε μικρότερη επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση [28]. Kim

et al

. [29] παρατήρησε ότι

DLD

έκφραση αυξάνει με την εξέλιξη του όγκου, παρέχοντας έτσι περισσότερη ενέργεια για την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Ως εκ τούτου, η υψηλή έκφραση της LDH και DLD είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου, και

Η

.

πυλωρού

λοίμωξη προωθεί την έκφραση αυτών των δύο γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς.

Η βήτα-ακτίνη, ένα βασικό συστατικό του κυτταρικού σκελετού, διατηρεί τη δομή, την κίνηση και την διαίρεση των κυττάρων κάτω από κανονικές συνθήκες.

β-ακτίνης

είναι αφύσικα εκφράζεται σε πολλές ασθένειες [30]. Η πρωτεΐνη PRPF19 πιστεύεται ότι λειτουργεί σε μάτισμα προ-mRNA. Ουβικιτινίωση PRPF19 μπορούσε να οδηγήσει σε βλάβη του DNA, και μη φυσιολογική επιδιόρθωση του DNA είναι μια σημαντική αιτία της ογκογένεσης [31]. Καλμοδουλίνη είναι μια πρωτεΐνη σύνδεσης ασβεστίου που ρυθμίζει πολλές οδούς σηματοδότησης και έτσι συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, της μίτωσης και γονιδιακή μεταγραφή. Calmodulin προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο ήπαρ καρκινωμάτων σε συνδυασμό με ΡΙ3Κ και η μετάβαση από την G1 στην S φάση σε συνδυασμό με κυκλίνη Ε [32]. Ένας αναστολέας των συλλήψεων καλμοδουλίνη κυττάρων σε φάση G1 για την αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης [33]. Συνεπής με αυτά τα αποτελέσματα, αποφασίσαμε ότι

Η

.

pylori

μπορεί να συμμετέχει στην ανάπτυξη καρκίνου του γαστρικού ιστών επάγοντας την υψηλή έκφραση αυτών των τριών πρωτεϊνών.

Επιπλέον, παρατηρήσαμε τα κάτω ρύθμιση του

RanGAP

γονιδίου σε καρκινικούς ιστούς με

Η

.

πυλωρού

λοίμωξη. RanGAP είναι ένα ΘΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών. Μετά την υδρόλυση του GTP σε GDP από ΟΤΡάσης, ενεργό RanGTP καθίσταται ανενεργή RanGDP, που οδηγεί στην παρεμπόδιση της κυτταρικής σηματοδότησης για την αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου [34]. Ομοίως, η μειωμένη δραστικότητα που προκαλείται από RanGAP ουβικιτινίωση προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου [35].

μεθυλίωσης του DNA μπορεί να επάγει μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση.

Η

.

pylori

μόλυνση αυξάνει τα επίπεδα μεθυλίωσης μερικών γονιδίων και οδηγεί σε καρκινογένεση του γαστρικού βλεννογόνου [36,37]. Η μεθυλίωση του DNA εμφανίζεται συνήθως στα νησιά CpG των προαγωγών γονιδίου. Διαπιστώσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των νήσων CpG αυτών των γονιδίων στις κατασκευασμένες κυτταρικές σειρές και προσδιορίστηκε ότι το

LDH

,

DLD

και

CaM

γονίδια απομεθυλιωθεί στον υποκινητή -2325, -1885 και -276 περιοχές, αντίστοιχα, και το

RanGAP

γονίδιο ιδιαίτερα μεθυλιώνεται στην υποκινητή -570 και -170 περιοχές, σύμφωνα με την υψηλή έκφραση του

LDH

,

DLD

και

CaM

γονίδια και η χαμηλή έκφραση του

RanGAP

γονιδίου σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς με

CAGA

+

η

.

πυλωρού

λοίμωξη.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι

Η

.

pylori

μόλυνση, μέσω CagA μετατόπιση, μπορούν να προκαλέσουν την ανώμαλη μεθυλίωση των γονιδίων αυτών να οδηγήσει σε δυσλειτουργικές γονιδιακής έκφρασης σε γαστρικά ιστούς και τα κύτταρα του καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια νέα κατανόηση της μοριακής παθογένεσης του καρκίνου του στομάχου με το

Η

.

πυλωρού

λοίμωξη. Μελλοντικές μελέτες θα διερευνήσουν τις επιπτώσεις αυτών των τροποποιημένων προτύπων μεθυλίωσης σχετικά με την παθογένεση του καρκίνου του στομάχου σε κλινικά δείγματα.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε το Κινεζικό Κέντρο του

Helicobacter pylori

Διαχείρισης στέλεχος και Συντήρησης για την παροχή

Η

.

πυλωρού

NCTC11637 και ο Δρ Γιανγκ Wenxiu και Wu Jiahong για τεχνική βοήθεια.