Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με πενταετή συνολική επιβίωση ποσοστό μόλις 15%. Νεοπλασματικές αναστολέας της ΡΡ2Α (CIP2A) είναι ένας ανθρώπινος αναστολή ογκοπρωτεΐνη ΡΡ2Α σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες. Ωστόσο, αν CIP2A μπορεί να είναι ένας νέος στόχος φαρμάκου για τον καρκίνο του πνεύμονα είναι σε μεγάλο βαθμό ασαφής.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

κανονικών και κακοηθών ιστών πνεύμονος προήλθαν από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα 60 από τη νότια Κίνα. RT-PCR, κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η έκφραση του CIP2A. Βρήκαμε ότι μεταξύ των 60 ασθενών, CIP2A ήταν μη ανιχνεύσιμη ή πολύ χαμηλή σε paratumor φυσιολογικούς ιστούς, αλλά ήταν δραματικά αυξημένα σε δείγματα όγκου σε 38 (63.3%) ασθενείς. CIP2A υπερέκφραση σχετίστηκε με το κάπνισμα τσιγάρων. Φίμωση CIP2A με siRNA ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και κλωνογονικού δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Περιέργως, βρήκαμε μια φυσική ένωση, rabdocoetsin Β το οποίο εξάγεται από μια παραδοσιακή κινεζική φαρμακευτικών βοτάνων Rabdosia coetsa, θα μπορούσε να προκαλέσει ρύθμιση προς τα κάτω των CIP2A και απενεργοποίηση της Akt μονοπατιού, και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε μια ποικιλία κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Συμπεράσματα /Σημασία

τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η έντονα CIP2A θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός στόχος για την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα τα ναρκωτικά, και οι θεραπευτικές δυνατότητες των παραγόντων CIP2A στόχευση δικαιολογούν την περαιτέρω έρευνα.

Παράθεση: Μα L, Wen ZS, Liu Ζ, Χου Ζ, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) Η υπερέκφραση και μικρό μόριο-σκανδαλισμό ρύθμιση προς τα κάτω των CIP2A στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10.1371 /journal.pone.0020159

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Ιανουαρίου 2011? Αποδεκτές: 12η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Πρόγραμμα Κλειδί για τη βασική έρευνα (973, 2010CB529201), το Έργο κλειδί της γνώσης Πρόγραμμα Καινοτομίας της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (KSCX1-YW-R-26 και KSCX2-YW-R-235), η εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81071930, 30871110), η εθνική Μείζονος Επιστημονικής και Τεχνολογικής Πρόγραμμα Drug Discovery (2009ZX09103-101), και η Επιστήμη και Τεχνολογία Σχεδιασμού Έργου της Guangzhou (2009Y-C011-2). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σχεδόν 1,5 εκατομμύριο άνθρωποι είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του πνεύμονα και 1,4 εκατομμύρια άνθρωποι εκτιμάται ότι θα πεθάνουν από αυτό το 2007 [1]. Οι δύο κύριες μορφές του καρκίνου του πνεύμονα είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC). Περίπου το 85% των καρκίνων του πνεύμονα NSCLC, η οποία μπορεί να χωριστεί σε τρεις μεγάλες ιστολογική υποτύπους: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα, και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου. SCLC αντιπροσωπεύει περίπου το 15% των καρκίνων του πνεύμονα [2]. Το κάπνισμα προκαλεί όλα τα είδη του καρκίνου του πνεύμονα, αλλά είναι πιο έντονα συνδέεται με SCLC και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα? αδενοκαρκίνωμα είναι ο πιο κοινός τύπος σε ασθενείς οι οποίοι δεν έχουν καπνίσει ποτέ [2]. Η τρέχουσα θεραπεία καθορίζεται από τον ιστολογικό τύπο του καρκίνου του πνεύμονα και το στάδιο κατά τη διάγνωση, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, η θεραπεία διπλή πλατίνα, ακτινοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία. Δυστυχώς, η πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα είναι φτωχό, με μόνο το 15% του συνολικού ποσοστού πενταετούς επιβίωσης για όλα τα στάδια σε συνδυασμό [1]. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική η ανάγκη να προσδιοριστούν πιο αποτελεσματική μοριακούς στόχους και νέες στοχευμένες θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Νεοπλασματικές αναστολέα της ΡΡ2Α (CIP2A) είναι ένα ανθρώπινο ογκοπρωτεΐνη που σταθεροποιεί c-Myc αναστέλλοντας την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α (ΡΡ2Α ) μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση MYC στη σερίνη 62 [3]. Εκτός από την αναστολή της αποικοδόμησης του c-myc, CIP2A φαίνεται να ρυθμίζεται σε ένα θετικό βρόχο ανάδρασης με c-Myc, προωθώντας την έκφραση του άλλου [4]. CIP2A υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο λαιμό και καρκινωμάτων κεφαλής, του παχέος εντέρου, του μαστού και του καρκίνου του στομάχου και συσχετίζεται αντίστροφα με την πορεία της νόσου σε γαστρικό καρκίνο [3] – [7]. Ωστόσο, αν CIP2A μπορούσε να είναι ένας νέος στόχος φαρμάκου για καρκίνους δεν είναι πλήρως διερευνηθεί, και η δραστικότητα κατά του όγκου παραγόντων CIP2A-στόχευση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Μελετήσαμε την έκφραση του CIP2A στον καρκίνο του πνεύμονα και διαλογή για ενώσεις μολύβδου οι οποίες θα μπορούσαν να στοχεύουν CIP2A [8]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι CIP2A είναι σημαντικά υπερεκφράζεται σε όγκους του καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων του ασθενούς-συμφωνημένα, και αναφέρουν ότι μια φυσική ένωση που προκαλεί αρνητική ρύθμιση των CIP2A παρουσιάζει σημαντική αντικαρκινική δράση σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Αποτελέσματα

CIP2A υπερεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα και σχετίζεται με το κάπνισμα τσιγάρων

Ελέγξαμε την έκφραση του CIP2A σε επίπεδο πρωτεΐνης σε μη κακοήθεις και κακοήθη κύτταρα, και βρήκαν ότι CIP2A ήταν εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (Α549, H1975, 95d και L78) σε σύγκριση με το φυσιολογικό ανθρώπινο εμβρυϊκές ινοβλάστες πνεύμονα (HLF και MRC5) και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEpiC) (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια αναλύθηκαν CIP2A σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα 60 από τους ασθενείς προέρχονταν από τη νότια Κίνα, της οποίας τα βασικά χαρακτηριστικά ήταν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Δείξαμε ότι CIP2A υπερεκφράστηκε σε 38 δείγματα (63,3%) του όγκου προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, στις 60 παρακείμενων φυσιολογικών ιστών των πνευμόνων του ασθενούς αντιστοίχιση, CIP2A ήταν ανιχνεύσιμη σε 57 (95%) δείγματα, και ήταν ασθενώς εκφράζεται σε 3 (5%) δείγματα όπου η έκφραση του ήταν πολύ χαμηλότερη από ότι σε δείγματα όγκων από τους ίδιους ασθενείς . Σε δείγματα από 2 ασθενείς με φλεγμονώδη ψευδοόγκος, CIP2A δεν ανιχνεύθηκε τόσο στην pseudotumor και γειτονικούς ιστούς πνεύμονα (Σχήμα 1 C). δοκιμασία ανοσοϊστοχημεία επιβεβαίωσε ότι CIP2A δραματικά αυξημένα με την υψηλότερη βαθμολογία ανοσολογική αντίδραση σε δείγματα όγκου σε 26 από 39 ασθενείς (66,7%) που εξετάστηκαν (Σχήμα 1D). Στο επίπεδο mRNA,

CIP2A

ήταν επίσης υπερ-εκφράζεται σε ιστούς όγκου πνεύμονα σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του πνεύμονα σε 39 από 58 (67,2%) ασθενείς που εξετάστηκαν (Σχήμα 1 Ε). Στο σύνολό τους, CIP2A δραματικά αυξημένα σε δείγματα όγκων καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων

(Α):. Ανάλυση Western blot των CIP2A σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Α549, H1975, 95d και L78), εμβρυϊκά ινοβλαστών πνεύμονος κύτταρα (HLF και MRC-5), και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEpiC). (Β): αναλύσεις Western blot CIP2A πρωτεΐνης σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (Ν). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται και οι αριθμοί αναφέρονται σε μεμονωμένους ασθενείς. (C): αναλύσεις Western blot CIP2A πρωτεΐνης σε φλεγμονώδεις ψευδοόγκος (Ρ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (Ν). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D): Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερό πάνελ) και σκορ (δεξί πάνελ) της χρώσης ανοσοϊστοχημεία για έκφραση CIP2A σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (Ν). (Ε): RT-PCR αναλύσεις

CIP2A

mRNA σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (Ν).

GAPDH

χρησιμοποιείται ως μάρτυρας φόρτωσης. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται και οι αριθμοί που αναφέρονται σε μεμονωμένους ασθενείς.

Η

CIP2A υπερέκφραση συνδέεται με

κάπνισμα τσιγάρων

Εμείς ανέλυσε τη συσχέτιση μεταξύ CIP2A υπερέκφραση και μερικά κλινικοπαθολογική μεταβλητές. Τα δεδομένα έδειξαν ότι CIP2A υπερέκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα συσχετίστηκε σημαντικά με ιστολογικό τύπο του καρκινώματος πλακωδών κυττάρων (ρ = 0,003) και του αρσενικού φύλου (p = 0,008) (Πίνακας 1) που έδειξαν να συνδέουν ισχυρά με το κάπνισμα τσιγάρων [2], [ ,,,0],9]. Επιπλέον, τα στοιχεία μας σαφώς έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση της CIP2A συσχετίστηκε με ασθενείς καπνιστής (p = 0.004). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην κατάσταση CIP2A παρατηρήθηκε σύμφωνα με την παθολογική στάδιο (p = 0,639) και την ηλικία (0,082) (Πίνακας 1). Σε μια προσπάθεια να αποσαφηνιστεί τους πιο σημαντικούς παράγοντες που σχετίζονται με την CIP2A υπερέκφραση, οι πολυμεταβλητών αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν, και η πολυμεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (Πίνακας 2) έδειξαν ότι το κάπνισμα τσιγάρων ήταν η μόνη σημαντική μεταβλητή που σχετίζεται με CIP2A υπερέκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα (ρ = 0.008 ).

η νιτροζαμίνη 4- (methylnitro-samino) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη, ή η νικοτίνη που προέρχεται νιτροζαμίνη κετόνη (ΝΝΚ), είναι ένα βασικό συστατικό της καρκινογόνο καπνό που συστημικά επάγει όγκους του πνεύμονα σε αρουραίους, ποντίκια και τα χάμστερ και επίσης παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του πνεύμονα [10], [11]. Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον ΝΝΚ θα μπορούσε να προκαλέσει άμεσα προς τα πάνω ρύθμιση της CIP2A ή όχι. Για να γίνει αυτό, HBEpiC (Σχήμα 2Α) και BEAS-2Β (Σχήμα 2Β) βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα εκτέθηκαν σε ΝΝΚ στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, λύθηκαν, και στύπωμα western πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η έκφραση του CIP2A. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με ΝΝΚ κατά 0,1 έως 10 μΜ για μέχρι και 18 ημέρες δεν θα μπορούσε να διαταράξει την έκφραση CIP2A (Σχήμα 2, Α και Β). Σε αυτή τη μελέτη, δεν είχαμε δοκιμάσει την μακροπρόθεσμη επίδραση της ΝΝΚ στην έκφραση CIP2A

in vitro

ή

in vivo

Η

(Α):. Κύτταρα HBEpiC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΝΝΚ σε διάφορες συγκεντρώσεις για υποδεικνύεται χρονικά σημεία, και στύπωμα western πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί έκφραση CIP2A. (Β): κύτταρα BEAS-2Β υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΝΝΚ σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, και στύπωμα western πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί έκφραση CIP2A. 0.05% και 0.1% DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος διαλύτη που αντιστοιχεί σε 5 μΜ και 10 μΜ ΝΝΚ, αντιστοίχως.

Η

CIP2A απαιτείται για καρκινικά κύτταρα πνεύμονα ανάπτυξη και μεταμόρφωση

CIP2A ειδικό siRNA χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ρόλο σε παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (NC), CIP2A σίγηση (Σχήμα 3Α) οδήγησε σε αναστολή των κλωνογόνων δραστηριότητα των κυττάρων Α549, που ανιχνεύεται με τον σχηματισμό εστιών ( Εικόνα 3, Β και C) και το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ (Εικόνα 3, D και Ε) δοκιμασίες [3]. Αυτά τα φαινόμενα επιβεβαιώθηκαν από τα αποτελέσματα της CIP2A φίμωση στα L78 κύτταρα (Σχήμα S1, Α έως Ε). Στη συνέχεια, τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με NC ή CIP2A-ειδικό siRNA (Σχήμα 3F) και εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά και αριστερά πλευρά 8 γυμνών ποντικών αντίστοιχα, και οι όγκοι του όγκου υπολογίστηκαν κάθε δύο ημέρες [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, CIP2A ειδικό siRNA ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με NC-siRNA (Σχήμα 3, G μέσω Ι). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CIP2A είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα και ογκογένεση, και θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός στόχος

(Α):. Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτείνης CIP2A σε κύτταρα Α549 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με αρνητικά ελέγχου (NC) ή CIP2A ειδικό siRNA. (Β και Γ): δοκιμασία σχηματισμού κλώνος Επίπεδη πλάκα για την κλωνογόνο δραστηριότητα των κυττάρων Α549 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (Β): εκπρόσωπος φως miscroscopy εικόνες. (C): Η ποσοτικοποίηση των καταμέτρησης εστιών. Ορατή είναι μέση τιμή + SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. (Δ και Ε): Soft-agar δοκιμασία σχηματισμού αποικίας για κύτταρα Α549 επιμολύνονται με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (D): εκπρόσωπος φως miscroscopy εικόνες. (Ε): Η ποσοτικοποίηση των καταμέτρησης εστιών. (F): Ανάλυση Western blot των CIP2A πρωτεΐνης σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με NC ή CIP2A ειδικό siRNA για 72 ώρες. (G): Γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με κύτταρα Α549 επιμολύνονται με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (Η): Η καμπύλη ανάπτυξης όγκου για το πείραμα που φαίνεται στο (G). Ορατή είναι μέση τιμή + SD των μέσων όγκων του όγκου. (Ι) Εικόνα όγκων ξενομοσχεύματος ελήφθη από ποντικούς που φαίνεται στο (G). * P & lt? 0,01, δοκιμασία t του Student

Η

Rabdocoetsin Β είναι ένα CIP2A στόχευση φυσική ένωση

κεντρική Στόχος μας ήταν να εντοπίσει νέους στόχους ναρκωτικών και να παρέχουν ενώσεις μολύβδου για την ανάπτυξη φαρμάκων.. Θα προβληθεί για CIP2A στόχευση μικρών μορίων, αναλύοντας τις επιπτώσεις τους στην έκφραση CIP2A, και εντόπισε μια φυσική ένωση που εξάγεται από ένα κινεζικό φαρμακευτικά βότανα Rabdosia coetsa, rabdocoetsin Β [13], [14] (Εικόνα 4Α), θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω CIP2A σε επίπεδο πρωτεΐνης σε 5 έως 20 μΜ σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 4Β). Σε H1975 κύτταρα, Rabdocoetsin Β προκάλεσε επίσης προς τα κάτω ρύθμιση των CIP2A σε 5 έως 10 μΜ (Σχήμα 4C). Αναλύσαμε τον μηχανισμό της CIP2A ρύθμιση προς τα κάτω που προκαλείται από Rabdocoetsin Β, και βρήκαν ότι rabdocoetsin Β ανέστειλε σημαντικά την μεταγραφή του CIP2A με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4D), που αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

(Α): Δομή του rabdocoetsin Β (Β): κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β (RdB) σε διάφορες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Western blots χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης της πρωτεΐνης CIP2A (άνω πάνελ) και η έκφραση πρωτεΐνης CIP2A προσδιορίστηκαν ποσοτικά και κανονικοποιήθηκαν έναντι έκφραση β-ακτίνης (κάτω πάνελ) (C): H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Western blots χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης της πρωτεΐνης CIP2A (άνω πάνελ) και η έκφραση πρωτεΐνης CIP2A προσδιορίστηκαν ποσοτικά και κανονικοποιήθηκαν έναντι έκφραση β-ακτίνης (κάτω πάνελ) (D): κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β σε διάφορες συγκεντρώσεις για 48 ώρες, και η έκφραση του mRNA της

CIP2A

αναλύθηκε χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο RT-PCR.

η

Rabdocoetsin Β αναστέλλει CIP2A-διαμορφωμένο φωσφορυλιωμένη Akt

Στα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, CIP2A up-ρυθμίζει φωσφο-Akt (pAkt) και μειώνει δραστικότητα ΡΡ2Α Akt που σχετίζονται ενώ φίμωση CIP2A επανενεργοποιεί ΡΡ2Α [15]. Δεδομένου Akt είναι ουσιαστικά δραστική σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και προάγει την κυτταρική επιβίωση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοβολία [16], [17], εξετάσαμε την επίδραση της CIP2A επί pAkt στον καρκίνο του πνεύμονα. Δείξαμε ότι CIP2A σίγηση από ειδικές siRNA είχε ως αποτέλεσμα μειορύθμιση της pAkt αλλά όχι Perk, PCNA, β-κατενίνης, EGFR ή Src (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια ερευνήθηκε κατά πόσον rabdocoetsin Β θα μπορούσε διαμορφώνουν την έκφραση pAkt, και βρέθηκε ότι η θεραπεία με rabdocoetsin Β σε 5 έως 10 μΜ επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω pAkt σε Α549 (Σχήμα 5Β) και κύτταρα H1975 (Σχήμα 5C). Δείξαμε επίσης ότι σε H1975 κύτταρα κατά rabdocoetsin Β στα 10 μΜ, CIP2A ήταν σημαντικά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε 6 έως 12 ώρες και έγινε μη ανιχνεύσιμο σε 48 h (Σχήμα 5D), ενώ ρΑΚΤ μειώθηκε σε 18 ώρες (Εικόνα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β (Σχήμα 5Ε), υποδεικνύοντας ότι αυτή η ένωση μπορεί να αναστέλλει την CIP2A-Akt μονοπάτι στον καρκίνο του πνεύμονα

(Α):. Κύτταρα Α549 επιμολύνονται με NC ή CIP2A- ειδικό siRNA για 72 ώρες, και η έκφραση των πρωτεϊνών που αναφέρεται ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες Western. (Β και C): Α549 (Β) και κύτταρα H1975 (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β (RdB) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 και 24 ώρες, αντίστοιχα, και στυπώματα Western διεξήχθησαν για να αναλυθεί η έκφραση των πρωτεϊνών που υποδεικνύεται. (Δ και Ε): H1975 (D) και Α549 κύτταρα (Ε) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β (RdB) για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, και ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα ειδικά για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Επιδράσεις της Rabdocoetsin Β σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της rabdocoetsin B για τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων που εκφράζουν ευρύ τύπου (WT ) ή μεταλλαγμένου EGFR. Δείξαμε ότι rabdocoetsin Β εμφανίζουν σημαντικά κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί Α549, ΝΟΙ-H1975, HCC827, SPC-Α-1, GLC-82, L78 και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα 95d (Σχήμα 6, Α και Β). Rabdocoetsin Β επαγόμενη απόπτωση κυττάρων Α549 (Εικόνα 6C) με την ενεργοποίηση του Casp-8 και Casp-9 και διάσπαση της PARP (Σχήμα 6D). Rabdocoetsin Β προκάλεσε επίσης την ενεργοποίηση του Casp-8 και Casp-9 και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε NCI-H1975 κυττάρων (Σχήμα 6Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι rabdocoetsin Β αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω ενεργοποίησης των ενδογενών και εξωγενών οδών απόπτωσης

(Α):. Ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Rabdocoetsin Β (RdB) (από 1 μΜ έως 10 μΜ) και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 48 ώρες με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Β): η IC50 των κυττάρων σε επεξεργασία με rabdocoetsin Β (Γ): Rabdocoetsin Β προκαλεί απόπτωση των κυττάρων Α549, προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Δ και Ε): Κηλίδες Western διεξήχθησαν για την ανίχνευση της έκφρασης των ρυθμιστικών αρχών απόπτωση στα Α549 (D) και H1975 κύτταρα (Ε)

Η

Συζήτηση

CIP2A είναι μια αυτόματη. αντιγόνο [7] που είναι πάνω-εκφράζεται σε ανθρώπινα νεοπλάσματα [3] – [7], [18] – [21]. Peng [22] έδειξε ότι σε ασθενείς αμερικανική βάση, CIP2A αυξάνεται σε 61 από τα 72 (84,7%) δείγματα καρκίνου του πνεύμονα ιστού, η οποία είναι σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς πνεύμονα (14,3%, 9/63). Πρόσφατα, Dong et al [23] ανέφεραν ότι σε 29 ασθενείς από τη Βόρεια Κίνα,

CIP2A

υπερεκφράζεται σε επίπεδο mRNA σε 24 περιπτώσεις (82,7%) σε δείγματα όγκων συγκριτικά με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς τους? CIP2A πρωτεΐνη (που ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία) βρίσκεται να είναι υπερ-εκφράζεται σε 72,2% των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα 90 και συσχετίστηκε με κακή επιβίωση. Δοκιμάζουμε έκφραση CIP2A σε 60 ασθενείς από τη Νότια Κίνα [8], και αναφέρουν ότι CIP2A αυξάνεται δραστικά στο 63,3% (ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western) ή 67,2% (σε επίπεδο mRNA) των δειγμάτων όγκου σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1) .

Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι CIP2A υπερέκφραση συνδέεται με το κάπνισμα τσιγάρων. Στο 60 πνεύμονα ασθενείς με καρκίνο που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη, 28 από 36 (77,8%) ασθενείς καπνιστής παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση των CIP2A στα δείγματα όγκου σε σύγκριση με γειτονικά φυσιολογικά δείγματα τους, ενώ 10 από 24 (41,7%) περιπτώσεις μη καπνίστρια έκθεμα up-ρυθμίζονται CIP2A σε επίπεδο πρωτεΐνης (p = 0,004) (Πίνακας 1). Επί του παρόντος, το κάπνισμα εξακολουθεί να είναι περισσότερο διαδεδομένη μεταξύ των ανδρών (63%) από τις γυναίκες (3,8%) [24]. Αναφέρουμε εδώ ότι CIP2A υπερεκφράζεται σε 30/40 (75%) και 8/20 (40%) σε άνδρες και γυναίκες ασθενείς (p = 0,008) (Πίνακας 1), αντίστοιχα. Διαπιστώνουμε επίσης ότι CIP2A είναι αυξημένη σε 17/19 (89.5%) ασθενείς με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, ενώ 17/35 (48,6%) ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα έχουν υπερ-εκφράζεται CIP2A (p = 0,003) (Πίνακας 1). Η πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης δείχνει σαφώς ότι το κάπνισμα είναι η μόνη σημαντική μεταβλητή που σχετίζεται με CIP2A υπερέκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα στην ρύθμιση μας (p = 0,008) (Πίνακας 2). Ενώ το συνολικό ποσοστό του καπνίσματος στους τομείς Βόρεια και Βορειοανατολική είναι υψηλότερη από ότι στο νότο και ανατολικά της Κίνας, η επικράτηση της έκθεσης στον καπνό του περιβάλλοντος μεταξύ των μη καπνιστών στη Βόρεια Κίνα είναι σημαντικά υψηλότερο από ότι σε μη καπνιστές στη Νότια Κίνα [24], [ ,,,0],25]. Αυτά μπορούν να συμβάλλουν στη διαφορά στην έκφραση CIP2A μεταξύ των ασθενών στο περιβάλλον μας και η έκθεση Dong του [23]. Ο καπνός του τσιγάρου που προκαλεί περίπου 5-6 εκατομμύρια θανάτους ετησίως και 31% και το 6% όλων των θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα σε μεσήλικες άνδρες και τις γυναίκες αντίστοιχα [26], μπορεί να προκαλέσει γενετικές και επιγενετικές αλλαγές και μειώνουν την ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA [2]. Zhao et al [27], πρόσφατα έδειξε ότι το ανθρώπινο γαστρικό κυτταρικές σειρές,

Helicobacter pylori

λοίμωξη μπορεί να επάγει την έκφραση CIP2A μέσω βακτηριακής ογκοπρωτεΐνη CagA-προκάλεσε την ενεργοποίηση της Src και μονοπάτια σήμα /ERK ΜΕΚ. Αν και ΝΝΚ (0,1 έως 50 μΜ) αδυνατεί να ρυθμίζει αυξητικά CIP2A σε κύτταρα HBEpiC και BEAS-2Β σε έως και 18 ημέρες στη μελέτη μας (Σχήμα 2), δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι ΝΝΚ μπορεί να διαταράξει την έκφραση του ογκοπρωτείνης σε μεγαλύτερο έκθεση πορεία του χρόνου, και η υπόθεση αυτή δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση.

CIP2A είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, αφού CIP2A knockdown από ειδικά siRNA ως αποτέλεσμα σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μετασχηματισμού in vitro και in vivo (Σχήμα 3 και Εικόνα S1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CIP2A θα μπορούσε να είναι ένας ελκυστικός στόχος για νέα φάρμακα κατά του καρκίνου αντι-πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον, έχουμε προσδιορίσει μια φυσική ένωση rabdocoetsin Β, μπορεί να ρυθμίζει προς τα κάτω CIP2A πρωτεΐνης σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 4, Α έως Γ) με αναστολή της έκφρασης του σε επίπεδο mRNA (Εικόνα 4D). Οι μελέτες δείχνουν ότι CIP2A μπορούν να ρυθμίζουν pAkt [15], και τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι CIP2A σίγηση μπορεί να μειώσει pAkt (Εικόνα 5Α). Δείχνουμε ότι η περαιτέρω rabdocoetsin Β αναστέλλει επίσης pAkt (Σχήμα 5, Β έως Ε). Rabdocoetsin Β αναστέλλει την ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση μιας ποικιλίας κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 6, Α έως Ε). Τα στοιχεία μας παρέχουν έτσι μια ένωση μολύβδου για CIP2A στόχευση θεραπευτικών αντι-όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ασθενών

Η χρήση των δειγμάτων εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών του Ινστιτούτου Ζωολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών και το Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, η Sun Yat-Sen University. Όλα όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών δειγμάτων ιστού ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς στο Νοσοκομείο του καρκίνου, η Sun Yat-Sen University. Για ανάλυση RT-PCR, τα δείγματα ιστού αλέστηκαν σε υγρό άζωτο ψυγμένο κονιάματος, RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το ΤπζοΙ (Invitrogen), και τα πειράματα RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PrimeScript® Ένα βήμα RT-PCR Kit Ver.2 (Takara) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για

CIP2A

έχουν ως εξής: προς τα εμπρός 5′-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 ‘, _ αντίστροφη 5′-GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3’ [5]

Για δοκιμασία κηλίδος Western, ιστό. δείγματα αλέστηκαν σε υγρό άζωτο ψυγμένο κονιάματος, σκόνη ιστός αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 1 mM na

3νο

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης) και καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση. Ίσες ποσότητες των δειγμάτων διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-CIP2A ή αντι-β-ακτίνης αντισώματος.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση και βαθμολόγηση της ανοσοαντιδραστικότητας διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [28]. Φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα καρκίνου του πνεύμονα ιστού (5 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ένα στάδιο ανάκτησης επιτόπου θερμο-διεγερμένα επί 2 λεπτά. Η H

2O

2 (3%) χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης για 10 λεπτά. Οι τομές μετά πλύθηκαν με PBS. Το αντίσωμα αντι-κουνελιού πολυκλωνικό CIP2A εφαρμόστηκε στα πλακίδια σε αραίωση 1:500 στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η ανίχνευση επιτεύχθηκε με το κιτ ανοσοϊστοχημείας (pv-6001) (Zhongshan Χρυσή Γέφυρα Βιοτεχνολογία Co, Ltd, Πεκίνο, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές χρωματίζονται με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) και με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ξυλόλιο, και τοποθετημένα. τα επίπεδα πρωτεΐνης CIP2A βαθμολογήθηκαν όπως περιγράφεται [29].

Πράκτορες

Rabdocoetsin Β εκχυλίζεται από Rabdosia coetsa από τον καθηγητή Han-Dong Κυρ Το 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-Z-y1) -3, 5-δι- phenytetrazoliumromide (ΜΤΤ) αγοράστηκε από Amresco, Inc. (Solon, ΟΗ). kit PE Annexin V-7ΑΑΌ ανίχνευσης απόπτωσης ελήφθη από BD Biosciences (San Jose, CA, USA)

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως εξής: α. αντι-β-ακτίνης (Sigma)? αντι-Casp-9 (C9), αντι-Casp-8 (1C12)? αντι-PARP, αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ, αντι-ΕΟΡΚ, αντι-Src και αντι-β-κατενίνης (κυτταρική σηματοδότηση), αντι-CIP2A (2G10-3B5), αντι-ρΑΚΤ και ΑΤΚ (Santa Cruz Biotechnology) ? αντι-ERK2 (Abcam)? αντι-ΡΟΝΑ (Abmart)? αντι-κουνελιού ή δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού (Pierce)? Κουνέλι Πολυκλωνικά αντι-CIP2A (Novus Biologicals, Inc). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κιτ ανίχνευσης χημιφωταύγειας Western (Cell Signaling).

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι γραμμές καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-H1975 και Α549 κύτταρα και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ-293 ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC) και ανθρώπινων εμβρυϊκών πνευμόνων ινοβλαστών MRC-5 κύτταρα αγοράστηκαν από το κινητό Resource Center, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο). Φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEpiC, Αριθμός Καταλόγου: 3210) αγοράστηκαν από την ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, California). Ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρικές σειρές πλακώδες καρκίνωμα L78 και ιδιαίτερα μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα μεγάλης κυτταρικές γραμμές κυττάρων 95d ελήφθησαν από την τράπεζα κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη), και ανθρώπινα εμβρυϊκά κύτταρα HLF πνεύμονα ινοβλαστών αγοράστηκαν από Kenqiang Μέσο Co, Ltd ( Σαγκάη, Κίνα). BEAS-2Β βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα που παρέχονται από τον καθηγητή Hongbin Ji στη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Α549, HLF και BEAS-2Β κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Gibco /BRL, Grand Island, ΝΥ), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. κύτταρα HBEpiC καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο ορού Βρογχικό επιθηλιακών κυττάρων Medium (BECM, Cat. Νο 3211, ScienCell Research Laboratories) που περιέχει ουσιώδη και μη ουσιώδη αμινοξέα, βιταμίνες, ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες και ιχνοστοιχεία. L78, 95d και ΝΟΙ-H1975 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Gibco /BRL, Grand Island, ΝΥ), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. MRC-5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ /EBSS συμπληρωμένο με μη απαραίτητα αμινοξέα, 10% ορό εμβρύου βοός. (FBS? Gibco /BRL, Grand Island, ΝΥ), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη

Εκτίμηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Rabdocoetsin Β για ενδεικνυόμενη συγκέντρωση και χρονικά σημεία. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με αποκλεισμό trypan blue χρωστικής. Εξωτερίκευσης της φωσφατιδυλσερίνης ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΡΕ αννεξίνη V-7 Ανίχνευση AAD απόπτωση σετ (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ποσοτική πραγματικού time PCR πραγματοποιήθηκε σε CFX

TM96 σύστημα πραγματικού χρόνου (Bio-Rad) χρησιμοποιώντας SYBR® Προμίγματα Ex Taq ™ (Perfect Real Time) (Takara Κωδικός: DRR041) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκκινητές για ακτίνη CIP2A και είχαν ως εξής: CIP2A: εμπρός αλληλουχία, 5′-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 ‘, αντίστροφη αλληλουχία, 5′-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3′? Actin: εμπρός αλληλουχία, 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ‘, ανάστροφη ακολουθία, 5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3’. Τα επίπεδα του mRNA CIP2A εκφράστηκαν ως αναλογία έναντι ακτίνης με βάση τις τιμές CT.

δοκιμασίες siRNA

χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο HiPerFect Transfection (Qiagen, Crawley, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, τα κύτταρα επιμολυσμένα με 100 ηΜ δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια siRNA [3]. Οι αλληλουχίες siRNA ήταν 5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 ‘(CIP2A siRNA1), 5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′ (CIP2A siRNA2) [3], και 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(αρνητικός έλεγχος (NC) siRNA).

κλωνογόνος

δοκιμασία

Για εστίες σχηματισμού, Α549 ή L78 κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα ή CIP2A ειδικό siRNA σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 35 mm (300 κύτταρα ανά πλάκα). Μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Giemsa και οι κλώνοι που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Για δοκιμασία σχηματισμού μαλακού άγαρ αποικία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 1 ml ϋΜΕΜ (για κύτταρα Α549) ή RPMI 1640 (για L78 κύτταρα) που περιείχε 0.3% χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζης (Amresco, Solon, ΟΗ) και 10% FBS και επιστρώθηκαν σε ένα κάτω στρώμα που περιέχει 0,6% αγαρόζη σε χιλιοστά plat 35 (1000 κύτταρα /πλάκα) εις τριπλούν. Μετά από 2-3 εβδομάδες καλλιέργειας, οι πλάκες βάφτηκαν με Giemsa και οι αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός.

Μοντέλα ποντικών

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Animal το Ινστιτούτο Ζωολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, με το αναγνωριστικό έγκριση AEC2010070202. Όλοι οι ποντικοί που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο περιβάλλον χωρίς. Γυμνά ποντίκια (η = 8) εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα Α549 (4 × 10

6) επιμολυσμένα με NC ή CIP2A ειδικό siRNA σε δεξιά και αριστερά πλευρές αντίστοιχα, και του όγκου υπολογίστηκε όπως περιγράφεται [12].

Η στατιστική ανάλυση

οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δεδομένα αξιολογήθηκαν ως προς την σημαντικότητα χρησιμοποιώντας Student

t-test

των αταίριαστα στοιχεία, χ

2 δοκιμών ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και Bonferroni μετά -δοκιμή. Ο όγκος του όγκου αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA και ανεξάρτητο δείγμα

t

δοκιμής χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 12.0 για Windows (Chicago, IL). Η συσχέτιση μεταξύ CIP2A υψηλή έκφραση και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικό αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας είτε χ

2 δοκιμή ή την ακριβή δοκιμασία Fisher, και προς τα πίσω σταδιακή πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη για να διερευνήσει τις πιο σημαντικές μεταβλητές που σχετίζονται με CIP2A υπερέκφραση μετά την προσαρμογή . Ρ τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Τα αποτελέσματα της εξάντλησης CIP2A στην ανάπτυξη και trasnsformation των κυττάρων L78 ». (Α): ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτείνης CIP2A σε L78 κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (Β και Γ): δοκιμασία σχηματισμού κλώνος Επίπεδη πλάκα για κλωνογόνο δραστηριότητα των κυττάρων L78 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (Β): Εκπρόσωπος εικόνες μικροσκόπιο φωτός. (C): Η ποσοτικοποίηση των καταμέτρησης εστιών. Ορατή είναι μέση τιμή + SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Δ και Ε): Soft-agar δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των L78 κύτταρα επιμολυσμένα με NC ή CIP2A ειδικό siRNA. (D): Εκπρόσωπος εικόνες μικροσκόπιο φωτός. (Ε): Η ποσοτικοποίηση των εστιών καταμέτρηση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020159.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθηγητές Zhu Chen, Sai- Juan Chen και το Τζεν-Yi Wang στο Shanghai Ινστιτούτο Αιματολογίας για μακροχρόνια υποστήριξή τους. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον καθηγητή Jukka Westermarck στο Πανεπιστήμιο του Turku, Φινλανδία για την παροχή της κατασκεύασμα pcDNA3.1-CIP2A, και ο καθηγητής Hongbin Ji στη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών για την παροχή των κυττάρων BEAS-2Β.