Αφηρημένο

Σκοπός

ενεργοποιούνται ανωμάλως σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι σημαντική σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) ανάπτυξη. Οι μεταγενέστεροι γονιδιακή έκφραση που περιλαμβάνει η /β-κατενίνης καταρράκτη Wnt να προκύψει μέσα από τις πρωτεΐνες του παράγοντα Τ-κυττάρων (TCF). Εδώ, δείχνουμε την ογκογόνο δυναμικό του ανθρώπινου TCF-4 ισομορφές με βάση την έκφραση ενός ενιαίου συντηρημένο μοτίβο SxxSS.

Μέθοδοι

Ερευνήσαμε το ζεύγος ισομορφή TCF-4J και Κ χαρακτηρίζεται από το παρουσία (K) ή απουσία (J) του μοτίβου SxxSS. Τα προφίλ έκφρασης του mRNA εξετάστηκαν σε 47 ζεύγη ανθρώπινων HCCs και των παρακείμενων μη καρκινικούς ιστούς ήπατος με RT-PCR. Πολλαπλασιασμό, αναλύσεις σφαίρα και ανάλυση ανοσοστύπωσης έγιναν υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία συνθήκες. Η ικανότητα των κυττάρων HCC υπερεκφράζουν TCF-4J (J κύτταρα) και Κ (κύτταρα Κ) να αυξηθεί ως στερεοί όγκοι σε γυμνά ποντίκια εξερευνήθηκε.

Αποτελέσματα

έκφραση TCF-4J ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω στο HCC όγκους σε σύγκριση με το αντίστοιχο peritumor και φυσιολογικό ήπαρ και κατά προτίμηση εκφράζεται σε ελάχιστα διαφοροποιημένα HCCs. Σε αντίθεση, TCF-4K είχε μειωτικά στα ίδια όγκους HCC. TCF-4J-κύτταρα που υπερεκφράζουν HCC (J κύτταρα) αποκάλυψε ένα πλεονέκτημα επιβίωσης σε συνθήκες υποξίας, υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και σχηματισμό συσσωματωμάτων /σφαίρες σε σύγκριση με υπερέκφραση του TCF-4K (Κ κύτταρα). Τα υποξικά κύτταρα J είχαν υψηλά επίπεδα έκφρασης του HIF-2α και EGFR ως πιθανούς μηχανισμούς για την προώθηση της ογκογένεσης. Αυξημένη σταθερότητα του HIF-2α υπό υποξία σε κύτταρα J συσχετίστηκε με μειωμένο επίπεδο της πρωτεΐνης νοη Hippel-Lindau (VHL), μια γνωστή Ε3 λιγάση για HIF-αδ. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, τα κύτταρα J αναπτύσσεται ραγδαία όγκους σε σύγκριση με τα κύτταρα Κ. ιστούς όγκων που προέρχονται από κύτταρα J παρουσίασαν υψηλά επίπεδα έκφρασης του HIF-2α και EGFR σε σύγκριση με την αργή ανάπτυξη και τα μικρά προέρχεται όγκους Κ κύτταρο.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συγκεκριμένη TCF-4J ισομορφή, η οποία στερείται κανονιστικού μοτίβο SxxSS, έχει ισχυρή δυναμικό ογκογενή κάτω από συνθήκες υποξίας

Παράθεση:. Koga Η Tsedensodnom O, Tomimaru Υ, Walker EJ, ο Lee HC, Kim KM, et al. (2012) Απώλεια της SxxSS Μοτίβο σε ένα Ανθρώπινα Τ-κυττάρων Παράγοντας-4 Ισόμορφης Συνεισφέρει υποξία Αντοχή σε καρκίνο του ήπατος: ογκογόνο Διακόπτης στη σηματοδότηση Wnt. PLoS ONE 7 (6): e39981. doi: 10.1371 /journal.pone.0039981

Επιμέλεια: Vincenzo Coppola, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Comprehensive Cancer cente, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 30η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Koga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Institutes of Health (CA-123 544 για να JRW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μονοπάτι σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αποφασιστικότητα μοίρα των κυττάρων και βλαστικών ανανέωση των κυττάρων σε ενήλικους ιστούς [1], [2]. Γενετική ή /και επιγενετικών απορρύθμιση αυτού του μονοπατιού οδηγεί σε παρεκκλίνουσα πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης όπου δεσμεύεται με Τ-κυττάρων παράγοντα-4 (TCF-4) για να σχηματίσει ένα μεταγραφικό σύμπλοκο [3]? Αυτό το γεγονός οδηγεί την έκφραση του γονιδίου, όπως γ

Myc έχει

,

κυκλίνη D1

, και

EpCam

[4], [5], [6], η οποία συμβάλλει σε μια κακοήθη φαινότυπο.

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η τρίτη συχνότερη αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [7]. Ανωμάλως ενεργοποιούνται σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης λόγω υπερέκφραση ανάντη συστατικά αυτής της οδού, όπως Frizzled (FZD) υποδοχέων και συνδετήρων Wnt είναι ένα κοινό πρώιμο συμβάν στην μοριακή παθογένεση αυτής της ασθένειας [8], [9], [10] . Ωστόσο, δεν έχει ακόμη να εξεταστεί η συμμετοχή των κανονικών πρωτεϊνών τελεστών Wnt TCF-4 σε αυτή τη διαδικασία.

Το ανθρώπινο γονίδιο TCF-4 (

TCF7L2

) αποτελείται από 17 εξόνια και έχει αρκετές εναλλακτικές θέσεις ματίσματος στα εξώνια 13-17 και εξόνιο 4 [11]. Οι εναλλακτικές θέσεις ματίσματος στην κεντρική περιοχή του TCF-4 μπορούν επίσης να δημιουργήσουν ισόμορφα με ή χωρίς την συντηρημένη LVPQ και SxxSS μοτίβα που βρίσκεται στο τέλος του εξονίου 7 και την αρχή του εξονίου 9, αντίστοιχα [11], [12]. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε 14 (12 από τα οποία είναι μοναδικά) TCF-4 ισομορφές που προκύπτουν από HCC ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές [13]. Μεταξύ τέτοιων ισομορφές, τρεις δομικά πανομοιότυπα ζεύγη (TCF-4J και Κ? TCF-4Α και Β? TCF-4G και Η) παρατηρήθηκαν που διέφερε μόνο από την παρουσία (Κ, Α, και Η) ή απουσία (J, Β, και G) ενός μοτίβου SxxSS. Σε αυτό το πλαίσιο, δύο ζεύγη των ισομορφών (TCF-4Α και Β, και TCF-4Η και G) είναι σύντομες μορφές, ενώ TCF-4K και J είναι μακρύς μορφές λόγω της συμπερίληψης ενός Ο-τερματική ουρά (εξόνιο 13-17 ) [13]. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν ότι το μοτίβο μπορεί να διαμορφώσει SxxSS μεταγραφική δραστικότητα του TCF-4 [12]? Ωστόσο, τόσο το κύτταρο-based και

in vivo

λειτουργικές συνέπειες της έκφρασης μοτίβο SxxSS καθώς και κανονιστική δραστηριότητα μετέπειτα γονίδιο δεν έχουν καθοριστεί.

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι τόσο τα εμβρυϊκά (ES) , τα κύτταρα επαγώγιμων πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPS) [14] ενηλίκων και προτιμούν συνθήκες υποξίας για την ανάπτυξη και την επιβίωση [15]. Η υποξία δημιουργεί ποικίλα κυτταρικά σήματα μέσω της σταθεροποίησης του υποξία παραγόντων (HIF-αδ) όπως HIF-1α και HIF-2α. Πρόσφατες μελέτες αποκαλύπτουν ότι HIF-αδ αλληλεπιδρούν με β-κατενίνης και, ως εκ τούτου, μπορεί να ρυθμίζει TCF-4-καθοδηγείται γονιδιακή έκφραση όχι μόνο σε βλαστικά /προγονικά αλλά επίσης κύτταρα όγκου που βιώνουν συνθήκες υποξίας κατά τη διάρκεια της ταχείας ανάπτυξης [16], [17]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι Wnt /β-κατενίνης /TCF-4 σηματοδότηση μπορεί να ρυθμίζεται άμεσα από το επαγγελματικό σύστημα οξυγόνου αίσθησης στον πυρήνα. Για παράδειγμα, σταθεροποιημένο HIF-2α, έναν συνεργάτη του β-κατενίνης και βρίσκονται συχνά στην υποξική πυρήνα του όγκου, ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και μπορούν να συμβάλουν στην ανάπτυξη του όγκου [18]. Στην ανθρώπινη HCC, οι HIF-αδ εμπλέκονται στη διαδικασία πολλών σταδίων του αποδιαφοροποίηση όγκου μέσω προαγωγής της αγγειογένεσης [19]. Κατά συνέπεια, καθορίζεται αν διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες του TCF-4 ισομορφές που σχετίζεται με την κακοήθη φαινότυπο HCC ρυθμίζονταν στο πλαίσιο ενός SxxSS μοτίβο που εξαρτώνται από μηχανισμούς κάτω από συνθήκες στέρησης οξυγόνου.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Πλήρης δεοντολογική έγκριση ελήφθη για όλες τις συλλογές ανθρώπινου δείγματος είτε από το Ιατρικό Κέντρο επιτροπής Ασάν Δεοντολογίας ή την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kurume. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με γραπτή συγκατάθεση. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και εγκρίθηκαν από την επιτροπή διάρκεια ζωής Μέριμνας Ζώων του Rhode Island Hospital, Providence, RI (αριθμός άδειας A3922-01).

Ανίχνευση TCF-4 ισομορφές HCC όγκοι με RT-PCR

Παρασκευάσματα της ανθρώπινης TCF-4A, B, J και Κ πλασμίδια-myc έχουν περιγραφεί προηγουμένως [13]. Δύο ανεξάρτητες αναλύσεις RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 47 ζεύγη ανθρώπινων HCCs (Πίνακες 1 και 2) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

Γραμμές κύτταρο και καλλιέργειες

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Hep3B, Huh7, HepG2, και ΗΕΚ293 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). FOCUS κυτταρική γραμμή ελήφθη από τον Dr. Ραβδί (Συκώτι Research Center, το νησί Νοσοκομείο Rhode, RI). HAK-1Α και 1Β HAK-κύτταρα που παρέχονται από τον Δρ Yano (Kurume University School of Medicine, Ιαπωνία). Η απαθανάτισε προέρχεται ηπατοκυττάρων κυτταρική σειρά OUMS-29 ήταν ένα είδος δώρο από Drs. Namba και Kobayashi (Okayama University, Japan). Hep3B, Huh7, HepG2, και κυτταρικές σειρές FOCUS είναι ο ιός της ηπατίτιδας Β (HBV)-σχετικές κύτταρα HCC. HAK-1Α και 1Β HAK-κύτταρα είναι ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) φύσης που κυτταρικές σειρές HCC. Όλα τα κύτταρα έχουν περιγραφεί και χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες (Hep3B [20], Huh7 [21], HepG2 [20], ΗΕΚ293 [22], FOCUS [23], και HAK-1Α και 1Β HAK-[24]). Για την παραγωγή σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα HAK-1A επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο φορέα TCF-4 ή κενό χρησιμοποιώντας διαμετακόμιση LT1 Αντιδραστήριο (Mirus Bio Co., Madison, WI) και επιλέγονται από G418.

υποξία Επαγωγή

συνθήκες υποξίας (1% οξυγόνο) παρήχθησαν από μια θερμοκοιτίδα εξοπλισμένο με ένα σύστημα οξυγόνου ρυθμιστή συγκέντρωση (ASTEC, Φουκουόκα, Ιαπωνία). Εναλλακτικά, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποξία-μιμητικό χλωριούχο χημική κοβάλτιο (COCI

2, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) [25].

συνεστιακής λέιζερ μικροσκοπίας σάρωσης

Cells , που καλλιεργούνται σε διάμετρος 35 χλστ Glass Bottom Πιάτα (MatTek, Ashland, ΜΑ), μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη /μεθανόλη (1:01) για 10 λεπτά, και στη συνέχεια πλένονται σε PBS που περιέχει 0.05% Tween 20 (PBS-T). Η μη ειδική αντιδράσεις αποκλείστηκαν με Protein Block Serum-Free (ϋΑΚΟ Βόρεια Αμερική, Carpinteria, CA) και στη συνέχεια επωάζονται με ένα αντίσωμα αντι-Μγο-tag ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή ενός κουνελιού αντι-HIF-2α αντίσωμα (Abcam, Cambridge, UK) σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση σε PBS-Τ, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Alexa Fluor κατσίκας αντι-ποντικού ή IgG αίγας αντι-κουνελιού (Η + L) αντίσωμα (Molecular Probes, Eugene, OR) για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με Vectashield Mounting Medium με 4 ‘, 6-διαμινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Burlingame, CA). Η Zeiss LSM 510 Συνεστιακό Μικροσκόπιο Σάρωσης Λέιζερ (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, ΝΥ) εξοπλισμένο με το λογισμικό διεπαφής χρήστη Zen 2008 χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τη χρώση ανοσοφθορισμού για Myc-tag ή HIF-2α και πυρηνικό εντοπισμό παρεσχέθη από DAPI. Οι αρνητικοί μάρτυρες ελήφθησαν με επώαση κυττάρων με μη ειδική IgG ποντικού ή IgG κουνελιού, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως και Ανοσοκαταβύθιση

Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κατά για Myc-tag, β- κατενίνης, ακτίνη, γ-τουμπουλίνης, λαμίνη A /C, HIF-1α, c-myc, και ουβικιτίνη (Santa Cruz Bio, Santa Cruz, CA), TCF-4, EpCAM, και νοη Hipple-Lindau (VHL) (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), HIF-2α (Abcam, Cambridge, UK), και της κερατίνης-19 (Κ-19) (DAKO, Carpinteria, CA). Μια TCF-4 κουνέλι προέρχεται mAb (Cell Signaling Technology, Cat # 2569) αναγνωρίζει γύρω από το Leu330 της ανθρώπινης TCF-4 και ανιχνεύει τα ενδογενή TCF-4 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων τόσο βραχυπρόθεσμα όσο και μακροπρόθεσμα ισομορφές. Για ανοσοκαθίζηση, κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [26]. Συνολικά κυτταρικό λύμα ή εκχύλισμα πυρήνων επωάστηκαν με αντισώματα έναντι HIF-1α, 2α-HIF, και VHL που ακολουθείται από Ανασυνδυασμένη Πρωτεΐνη G αγαρόζης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα ανοσοστυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντισώματα σε ουβικιτίνη, HIF-1α, 2α-HIF, και VHL και ανιχνεύεται με HRP-σημασμένο αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) με τη χρήση ECL Σύνθετη κιτ (Amersham). Θετικά σήματα συλλήφθηκαν από τον αναλυτή εικόνας ΣΕΝ-1000plus (Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία), και η ένταση ζώνη της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μετρητή Image έκδοση 3.45 (Fujifilm).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2,5 χ 10

3 /φρεάτιο. Μια χρωματομετρική δοκιμασία (CellTiter 96® Υδατικό One Λύση Κυττάρου Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός? Promega, Madison, WI) διεξήχθη τις ημέρες 0, 1, 3, 5, και 7, και τα σήματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Spectra Max M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Anchorage-ανεξάρτητο Ανάπτυξης (Σφαίρα Δοκιμασία)

Single-εναιωρήματα κυττάρων τέθηκαν σε Ultra Low Συνημμένο πλάκες 6 φρεατίων (Corning, Lowell, MA). Μετά από 27 ημέρες, ο αριθμός των κυτταρικών συσσωματωμάτων /σφαίρες ανά φρεάτιο προσδιορίστηκε ποσοτικά και φωτογραφήθηκε κάτω από την Zeiss Axiovert 200 Μ Μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss MicroImaging). Η περιοχή των κυτταρικών συσσωματωμάτων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph 6.0 (Molecular Devices)

Αξιολόγηση της Πρωτεΐνης Σταθερότητας

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 5 μg /mL κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ? Sigma-Aldrich). για 0 ​​ή 60 λεπτά στην τελευταία φάση του 48 h CoCl

2 θεραπεία. Σύνολο κύτταρο lystes χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ανοσοκηλίδος για να αξιολογήσει τα επίπεδα έκφρασης HIF-1α και HIF-2α μετά την σύνθεση πρωτεΐνης ανεστάλη με CHX.

ξενομοσχεύματος όγκου Μοντέλο σε γυμνά ποντίκια

HAK-1A που προέρχεται σταθεροί κλώνοι χρησιμοποιήθηκαν? γονικά κύτταρα HAK-1Α δεν σχηματίζουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς, και είναι επομένως κατάλληλο για την εκτίμηση του κακοήθους μετασχηματισμού ακόλουθες σταθερή επιμόλυνση με TCF-4 ισομορφές [24]. Κύτταρα (1 χ 10

6) ήταν υποδορίως με ένεση στο πίσω μέρος του 5-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c γυμνά ποντίκια (η = 12) (Taconic Farms, Cranbury, NJ). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα, και ο όγκος του όγκου (mm

3) εκτιμήθηκε με τη χρήση της εξίσωσης μήκος χ (πλάτος)

2 χ 0,5. Όταν ο πλέον διάμετρος έφθασε 10 mm, οι ποντικοί θανατώθηκαν και οι όγκοι παρασκευάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

ανοσοϊστοχημεία Ξενομοσχεύματος Όγκων

εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και θερμάνθηκαν σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό στους 120 ° C για 5 λεπτά για ανάκτηση αντιγόνου. Οι τομές προ-μπλοκαριστεί από Protein Block Serum-Free (ϋΑΚΟ) και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για HIF-2α (Abcam) και EGFR (D38B1 XP ™) (Cell Signaling Technology). Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με EnVision δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με συμπλέγματα HRP-πολυμερές (ϋΑΚΟ) και παρατηρήθηκαν με 0,1% 3-3 » – διαμινο-βενζιδίνη-τετραϋδροχλωρίδιο. Οι κυτταρικές πυρήνες με αιματοξυλίνη. Υπόδειγμα επωάστηκαν με IgG ποντικού ή κουνελιού ορίστηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα που εκτελούνται από το Mann-Whitney U χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.0 λογισμικό (San Diego, CA) .

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. συντελεστή συσχέτισης του Pearson χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του TCF-4J και Κ

Αποτελέσματα

διαφορική έκφραση Προφίλ του TCF-4J και TCF-4K Ανθρώπων HCC ιστοί

η έκφραση του TCF-4 ισομορφές με ή χωρίς το μοτίβο SxxSS μπορούν να επηρεάσουν μεταγραφική δραστηριότητα τους [12], [13], [27]. Ως εκ τούτου, καθορίζεται αν τα τρία ζεύγη των ισομορφών (TCF-4Α και Β? TCF-4G και H? Και TCF-4J και Κ) παρουσίασαν διαφορετικά προφίλ έκφρασης που μπορεί να υποδηλώνουν SxxSS-εξαρτώμενη ρύθμιση σε ανθρώπινους όγκους HCC. Μετρήθηκαν οι σχετικά επίπεδα mRNA αυτών των TCF-4 ισομορφές σε 27 ζεύγη των όγκων HCC και αντίστοιχων γειτονικών ηπατικού ιστού που λαμβάνονται από χρόνια HBV που σχετίζονται με (26/27) της νόσου. Οι συγκρίσεις έγιναν σε τρία δείγματα φυσιολογικού ήπατος με ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχ. 1Α, το Σχ. S1 Α και C, και Πίνακας 1) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. έκφραση TCF-4J ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όγκους HCC σε σύγκριση με peritumor ιστό και φυσιολογικό ήπαρ. Μεταξύ των 27 ζεύγη δειγμάτων, το 85% είχαν αυξημένη έκφραση TCF-4J στο HCC σε σύγκριση με συμφωνημένα-peritumor ιστού. Σε αντίθεση, TCF-4K ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε όγκους σε σύγκριση με το φυσιολογικό ήπαρ και peritumor ιστού (Εικ. 1Α). Επιπλέον, ένα παρόμοιο προφίλ έκφρασης αυτών των TCF-4 ισομορφές παρατηρήθηκε σε μια δεύτερη ομάδα από HCC-γειτονικών ζευγών μη εμπλεκόμενο ιστό από άτομα όπου το 85% (17/20) των όγκων ήταν συνδεδεμένοι με χρόνια λοίμωξη HCV (Σχ. 1 Β, πίνακας 2). Ωστόσο, αυτό το μοτίβο διαφορική έκφραση δεν παρατηρήθηκε σε δύο άλλα ζεύγη κοντών ισομορφών (TCF-4Α και Β, G και H) (Εικ. S1). TCF-4A, μια σύντομη μορφή του Κ ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε HBV που σχετίζονται με HCC όγκου σε σύγκριση με το φυσιολογικό ήπαρ, καθώς και peritumor ιστού. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του TCF-4Β, μια σύντομη μορφή J, βρέθηκε να είναι παρόμοια μεταξύ φυσιολογική, του όγκου, και peritumor ιστούς (Εικ. S1 Α). Επιπλέον, το άλλο ζεύγος των TCF-4 ισομορφές (G και Η) αποκάλυψε επίσης καμία διαφορά των επιπέδων έκφρασης τους μεταξύ φυσιολογικό, HCC όγκου, και ιστών περι-όγκου (Σχ. S1c). Σε HCV που σχετίζονται με ιστούς HCC, ωστόσο, και οι τέσσερις ισομορφές (TCF-4Α και Β, G και Η) ήταν σημαντικά κατιούσα ρύθμιση και στις δύο peritumor και καρκινικών ιστών σε σύγκριση με το φυσιολογικό ήπαρ? επιπλέον διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ των δειγμάτων όγκου και peritumor (Σχ. S1B και D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση της SxxSS μοτίβο στην παραγωγή ενός κακοήθους φαινοτύπου HCC μπορεί να σχετίζεται με το μακρύ (TCF-4J και Κ), δεν σύντομο ισομορφές (TCF-4Α και Β, G και Η).

(Α) Συγκριτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης TCF-4J και Κ mRNA σε 27 HBV που σχετίζονται με όγκους HCC (Τ) πλησίον peritumor ιστού (ΡΤ) και ιστολογική φυσιολογικό ήπαρ (Ν) με RT-PCR. Οι τιμές κανονικοποιούνται προς GAPDH. Κόκκινο ορθογώνια δηλώνουν ελάχιστα διαφοροποιημένα (PD) HCC. WD, καλά διαφοροποιημένα? MD, μετρίως διαφοροποιημένων. Τα στατιστικά αποτελέσματα από όλους τους ιστούς ή PD HCC εκφράζονται ως μέση τιμή + SD (δεξί πάνελ). (Β) Ένα άλλο 20 HCC όγκους μεταξύ των οποίων πέντε WD HCCs από μια διαφορετική κλινική ιστοσελίδα. Δεκαεπτά άτομα είχαν HCV που σχετίζονται με χρόνια ηπατική νόσο, και το υπόλοιπο είχε χρόνια λοίμωξη HBV. Βλέπε επίσης Πίνακες 1 και 2. (C) Τα επίπεδα έκφρασης του TCF-4J και Κ mRNA σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HepG2 (G2), Hep3B (3Β), Huh-7 (Η7), FOCUS (FO), HAK-1Α (1A ), HAK-1Β (1Β), OUMS-29 (OU), και ΗΕΚ293 (293). (D) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της TCF-4J και έκφραση Κ σε όλα τα HCC (αριστερό πάνελ) και του Π.Δ. HCC (δεξιά πλευρά). Σημειώστε την αδύναμη αντίστροφη συσχέτιση σε όλες τις περιπτώσεις (

r

= 0.297), ενώ αυξήθηκε αντίστροφη συσχέτιση με το ΠΔ HCC (

r

= 0.437). *

σ

& lt? 0,01? **

σ

& lt?. 0.05

Η

Η

Στη συνέχεια, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και έκφραση αυτών των TCF-4 ισομορφές (Πίνακας 3, Πίνακας S1). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μόνο ο βαθμός (ες) της διαφοροποίησης του όγκου συσχετίζεται σημαντικά με τα επίπεδα έκφρασης TCF-4J και Κ (Πίνακας 3). Πράγματι, το επίπεδο TCF-4K μειώθηκε σημαντικά σε ελάχιστα διαφοροποιημένα (PD) HCC όγκους, η οποία ήταν σε αντίθεση με το υψηλό επίπεδο του TCF-4J βρέθηκαν στις ίδιες αυτές όγκους HCC (Εικ. 1Α και Β, Πίνακας 3). Οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η υπερέκφραση του TCF-4J μπορεί να είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των PD HCC. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, TCF-4J ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε αμφότερα HBV που σχετίζονται με (HepG2, Hep3B, Huh7, και FOCUS) και σχετίζονται με HCV (HAK-1A και HAK-1Β) κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 C). Αυτή η ισομορφή επίσης εκφράζεται σε OUMS-29 και ΗΕΚ293. Αντιθέτως, το επίπεδο έκφρασης TCF-4K ήταν πολύ χαμηλή σε όγκους HCC PD και κυτταρικές γραμμές εκτός από την HAK-1Β και ΗΕΚ293 (Εικ. 1Α, Β και C). Αντίθετα, τα δύο ζεύγη κοντών ισομορφών (TCF-4Α και Β, ή G και H) δεν έδειξαν μια τέτοια συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την έκφρασή τους του μοτίβου SxxSS (Πίνακας S1).

Η

Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση TCF-4J στο HCC ήταν σημαντικά αντιστρόφως ανάλογη με TCF-4K (Σχήμα 1D, αριστερό πάνελ?.

σ

= 0,0031, συντελεστής συσχέτισης

r

= 0,297). Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της TCF-4J και τα επίπεδα έκφρασης Κ ήταν πιο εμφανής σε PD HCC (Εικ 1D, δεξιά πάνελ?.

σ

= 0,0077,

r

= 0.437). Έτσι, η απώλεια του μοτίβου SxxSS στις μακρές ισομορφές του TCF-4 οφείλεται σε ένα συμβάν ματίσματος συνδέθηκε με φαινότυπο PD HCC.

υποκυτταρικός εντοπισμός της TCF-4J και Κ ισομορφές στην HAK-1Α HCC Κυττάρων γραμμή

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τον τρόπο έκφρασης του μοτίβου SxxSS μπορεί να προωθήσει την κακοήθη φαινότυπο του HCC

in vitro

, εξετάσαμε πρώτα τον εντοπισμό του TCF-4J και K στο HCC κυτταρικές σειρές HAK-1A μετά από παροδική επιμόλυνση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, κυτταρική έκφραση παρατηρείται κυρίως στον πυρήνα όπως αξιολογείται με συνεστιακή μικροσκοπία και μελέτες πυρηνικής /κυτταροπλασματικής κλασματοποίηση, υποδηλώνοντας ότι η εξωγενής έκφραση του TCF-4J και πρωτεΐνες K θα εντοπίζεται στο διαμέρισμα πυρήνα.

(Α) Οργανισμός του «μικρή» (Α, Β) και τα «μεγάλη» (J, K) ισομορφές? TCF-4Β και J στερούνται το μοτίβο SxxSS. μικροσκοπία (Β) Ομοεστιακή λέιζερ σάρωσης δείχνει πυρηνικό εντοπισμό του TCF-4J και TCF-4K (πράσινο). Πυρήνες είναι αντιχρωματίζεται με DAPI. (C) Πυρηνική (Nuc) /κυτταροπλασματική (Cyto) κλασματοποίηση ακολουθήθηκε από ανάλυση ανοσοαποτύπωσης επιβεβαιώνει την πυρηνική εντόπιση του TCF-4J και ισομορφές Κ. Lamin (lamin A /C) και γ-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως πυρηνικών και κυτταροπλασματικών δείκτες, αντίστοιχα.

Η

TCF-4J-υπερεκφράζουν HCC κύτταρα έχουν ένα πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα σε συνθήκες υποξίας

Κατά τη διαδικασία πολλαπλών βημάτων του ηπατοκαρκινογένεσης, λιγότερο διαφοροποιημένα κύτταρα HCC προκύπτουν από το κέντρο του οζιδίων όγκου HCC αποκαλύπτοντας ένα «οζίδιο-in-οζίδιο» ιστολογική εμφάνιση στην παθολογική εξέταση τομών ιστού [28]. Η κεντρική περιοχή του όγκου δημιουργεί υποξικά στρες σε καρκινικά κύτταρα και προάγει την απόπτωση [18], [29]. Ωστόσο, μπορεί να υπάρχει μια υποξία ανθεκτικά πληθυσμό κυττάρων HCC που επιβιώνουν υπό αυτές τις ακραίες συνθήκες για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου μέσω της επιταχυνόμενης αγγειογένεση και η αγγειακή εισβολή. Αυτά τα δύο φαινόμενα που ρυθμίζονται από HIF-1α και HIF-2α [30], [31]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η υψηλή έκφραση του TCF-4J σε PD HCC ήταν μια πιθανή αντανάκλαση μιας επαγόμενης υποξίας ανθεκτικό φαινότυπο HCC. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, σταθερών κλώνων κυττάρου που υπερεκφράζει TCF-4J (J κύτταρα) και TCF-4K (κύτταρα Κ) καθορίστηκαν, και οι συγκρίσεις έγιναν για να αδειάσει κλώνους κυττάρων φορέα-επιμολυσμένα (κύτταρα EV), καθώς και με το γονικό HAK α-1Α κύτταρα. Υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, η μορφολογική εμφάνιση των κλώνων αυτών ήταν παρόμοια και συγκρίσιμα με τα γονικά κύτταρα (Εικ. 3Α), η οποία ήταν σε αντίθεση με την HAK-1A που προέρχεται αποδιαφοροποιημένα κυττάρων κλώνος HAK-1B [24].

(Α) μικροσκοπία φάσης-αντίθεσης της γονικής HAK-1A (1Α) και 1Α-προερχόμενα σταθερών κλώνων, συμπεριλαμβανομένου τον κενό φορέα-επιμολυσμένα κλώνος (EV2), οι TCF-4J-επιμολυσμένων κλώνων (J1 και J15), και οι TCF-4K-επιμολυσμένων κλώνων (Κ2 και Κ5). Η μορφολογική εμφάνιση του εξαιρετικά κακοήθους κυτταρικής γραμμής HAK-1Β (1Β), έναν κλωνικώς αποδιαφοροποιημένα τύπο κυττάρου από 1Α, παρουσιάζεται επίσης για σύγκριση. Bar = 50 μm. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των σταθερών κυτταρικών κλώνων. Τα θετικά σήματα για Myc-tag φαίνεται στο J1, J15, Κ2, και Κ5. κύτταρα HepG2 (G2) είναι γνωστό ότι εκφράζουν τόσο πλήρους μήκους (92 kDa) και κολοβωμένη β-κατενίνης (75 kDa), εμφάνισαν μια χαμηλότερη ζώνη για β-κατενίνη (β-Cat) HepG2 χρησιμοποιήθηκε επίσης ως ένας θετικός έλεγχος για EpCAM και έκφραση Κ-19. ΗΕΚ293 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για το Κ-19. συντελεστές (Γ) Η κυτταρική ανάπτυξη σταθερών κλώνων υπό τις συνθήκες υποξίας που δημιουργούνται από CoCl

2 (150 μΜ) για 7 ημέρες. Ρυθμός ανάπτυξης αντιπροσωπεύεται ως το πτυσσόμενο αύξηση σε σύγκριση με την ημέρα 0. (D) Η κυτταρική ανάπτυξη σταθερών κλώνων σε νορμοξία (20% O

2) ή υποξικές συνθήκες (1% O

2) Τα κύτταρα εκτέθηκαν είτε σε 20% ή 1% οξυγόνο για 5 ημέρες. Σημειώστε ότι η μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης σε υποξικά contidions ήταν μικρότερη σε κύτταρα J (13%) σε σύγκριση με EV (22%) και Κ (27%) των κυττάρων. (Ε) Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης (δοκιμασία σφαίρα). Οι αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές προβολές των αντιπροσωπευτικών κυτταρικών συσσωματωμάτων που εμφανίζονται στο 0, 75, και 150 μΜ CoCl

2. Bar = 300 μm. Σημειώστε την εντυπωσιακή διαφορά στο ρυθμό ανάπτυξης των αποικιών και την εμφάνιση στα 150 μΜ CoCl

2. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης συχνά συσχετίζεται με βλαστικά μοριακές αλλαγές κυττάρων που μοιάζουν [32], [33]. Από την άποψη αυτή, η έκφραση του EpCAM, ενός υποθετικού βλαστοκυττάρων καρκίνο του ήπατος (CSC) δείκτη και ένα β-κατενίνης /TCF-4 κατάντη προϊόν του γονιδίου-στόχου [6], δεν ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, η έκφραση του Κ-19, μια χολική δείκτης γράμμωσης για μια επιθετική φαινότυπο HCC [34], αυξήθηκε σε κύτταρα J αλλά όχι σε Κ, EV, ή γονικών κυττάρων HAK-1Α (Εικ. 3Β).

Σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας στα κύτταρα Huh7 [13], J κύτταρα είχαν αυξημένο βασικό ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με τα κύτταρα Κ και ελέγχου EV. Τα κύτταρα J ήταν ανθεκτικά κάτω από χημικά που προκαλείται, σοβαρές συνθήκες υποξίας (150 μΜ CoCl

2), πολλαπλασιαστεί σημαντικά ταχύτερη από ό, τι Κ ή κύτταρα EV (Σχ. 3C). Το εύρημα αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1% οξυγόνο για 5 ημέρες (Σχ. 3D). Η κυτταρική ανάπτυξη σε υποξία (1% οξυγόνο) μειώθηκε σε EV και Κ κυττάρων σε σύγκριση με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε φυσιολογική οξυγόνωση (20% οξυγόνο) κατά 22 και 27%, αντίστοιχα, ενώ J κύτταρα αποδείκνυεται μόνο μείωση 13% στην ανάπτυξη των κυττάρων. Επιπλέον, ισχυρή αντίσταση σε σοβαρή υποξία στα κύτταρα J επίσης εκτεθεί σε μία δοκιμασία σφαίρα. Στο πλαίσιο αυτό, τα κύτταρα J σχηματίζονται τα μεγαλύτερα συσσωματώματα κυττάρων σε όλα τα

2 συγκεντρώσεις CoCl απασχολούνται. δυναμικό των κυττάρων J »για αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη ήταν πιο εμφανής με σοβαρή υποξία που προκαλείται από 150 μΜ CoCl

2 (Σχ. 3Ε).

Απώλεια του SxxSS Motif Συμβάλλει με τα επίπεδα έκφρασης της HIF- αs

με βάση τα υποξίας-ανθεκτικά χαρακτηριστικά παρουσιάζεται από κύτταρα J, προσδιορίσαμε αν αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν HIF-αs υπό υποξία. Τόσο HIF-1α και έκφραση HIF-2α σε κύτταρα J και Κ διερευνήθηκαν αφού HIF-2α έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι ένα βασικό μόριο που προάγει την επιβίωση των ΚΕΠ υπό υποξικές συνθήκες [35], [36], [37]. Όπως αναμενόταν, ο HIF-1α και HIF-2α έκφραση επάχθηκαν με μέτρια υποξία (75 μΜ CoCl

2) σε EV, J και κυττάρων Κ? Ωστόσο, κάτω από αντίξοες συνθήκες υποξίας (150 μΜ CoCl

2), μόνο J κύτταρα διατηρούνται αυτά τα υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης (Εικ. 4Α). Σταθεροποιημένο HIF-2α, που βρίσκονται συχνά στο υποξικό πυρήνα του όγκου, ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση του EGFR που μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη του όγκου [18], και την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης EGFR συνδέθηκε με την ανάπτυξη του K-19-θετικά HCC [ ,,,0],38]. Σε κύτταρα J, η έκφραση του EGFR και Κ-19 συσχετίστηκε με αυξημένο επίπεδο του HIF-2α (Σχ. 4Α). Η συνεπής απόκριση HIF παρατηρήθηκε επίσης σε 1% κύτταρα J οξυγόνο εκτεθειμένη (Σχ. 4Β). Επιπλέον, η 150 μΜ CoCl

2 επαγόμενη HIF-2α έκφραση εντοπίστηκε στους πυρήνες των κυττάρων J όπως αξιολογείται με χρώση ανοσοφθορισμού (Εικ. 4C).

(Α και Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των κενών διάνυσμα-επιμολυσμένα (EV), TCF-4J-υπερεκφράζουν (J), και TCF-4K-κύτταρα που υπερεκφράζουν (K). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 και 150 μΜ CoCl

2 (Α) ή από καλλιέργεια κάτω από 1% τάση οξυγόνου επί 48 ώρες (Β). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανίχνευση HIF-αδ και έκφραση TCF-4 ισομορφή πρωτεΐνη Μγο-tag. Τα επίπεδα έκφρασης καταρτίστηκαν σε διάγραμμα ως αναλογία προς ακτίνη (δεξί πάνελ). (Γ) συνεστιακή μικροσκοπία για πυρηνικό εντοπισμό των πρωτεϊνών HIF-2α. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 μΜ (νορμοξία) ή 150 μΜ (υποξία) CoCl

2 και χρωματίστηκαν με αντι-HIF-2α αντίσωμα (πράσινο). DAPI χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση. (Δ) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του συνολικά κυτταρολύματα από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0 ή 150 μΜ CoCl

2 για 48 ώρες. Α και Β παριστάνουν κύτταρα HAK-1A που υπερεκφράζουν TCF-4A ( «σύντομη μορφή» του TCF-4K) και η TCF-4Β ( «σύντομη μορφή» του TCF-4J), αντίστοιχα (βλέπε Εικόνα 2Α). Σημειώστε την ισχυρή αύξηση στην έκφραση του HIF-1α και HIF-2α σε Β κύτταρα.

Η

Επίσης, καθορίζεται αν HIF-αs ρύθμιση προς τα άνω υπό σοβαρή υποξία στα κύτταρα J συνδέθηκε με την απώλεια του μοτίβου SxxSS. Εάν συνέβαινε αυτό, ένα παρόμοιο αποτέλεσμα θα μπορούσε να βρεθεί στην TCF-4B κύτταρα που υπερεκφράζουν (Β κύτταρα), το λεγόμενο «βραχεία ισομορφή» του TCF-4J (Εικ. 2Α). Από αυτή την άποψη, το σύνολο των προϊόντων λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως να συγκρίνει Β με κύτταρα όπου TCF-4Α υπερεκφράζεται ως «βραχεία μορφή» ομόλογό του TCF-4K (Εικ. 2Α). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η αύξηση της συνολικής κυτταρικής λύσης έκφραση HIF-α ήταν εμφανής σε κύτταρα Β (Εικ. 4D) και υποδηλώνει ότι το μοτίβο SxxSS μπορεί να έχει ένα ρυθμιστικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης του HIF-αδ υπό ακραίες συνθήκες υποξίας που παράγεται από 150 μΜ CoCl

2 σε δύο ζεύγη TCF-4 ισομορφές.

Ταχεία ουμπικουϊτίνη εξαρτώμενη από Υποβάθμιση του HIF-αs στην Κ κύτταρα

Επειδή HIF-αs πρωτεΐνες είναι ιδιαίτερα υποβαθμισμένη από την ουβικιτίνης εξαρτώμενη από μονοπάτι πρωτεασώματος, υποτέθηκε ότι μπορεί να υπάρχει ένα διαφορικό HIF-αs μηχανισμό αποδόμηση κάτω από σοβαρή υποξία στο J και K κύτταρα. Τα επίπεδα του HIF-1α και HIF-2α αυξήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα Κ αγωγή με έναν αναστολέα πρωτεασώματος (MG-132) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα Κ? σε αντίθεση παρατηρήσαμε λιγότερο της αύξησης αυτών των πρωτεϊνών σε EV και κυττάρων J (Εικ. 5Α). Συσσώρευση του HIF-αδ στα MG-132-K αγωγή κύτταρα υποδηλώνει έντονα ότι SxxSS μοτίβου που φιλοξενούν τα κύτταρα Κ μπορεί να υποβαθμίσει HIF-αδ υπό συνθήκες υποξίας σε πρωτεασώματος-εξαρτώμενο τρόπο. Πράγματι, η σταθερότητα της πρωτεΐνης του HIF-αδ βρέθηκε να μειώνεται σε K κύτταρα (Σχ. 5Β). Βρήκαμε ότι το επίπεδο της VHL πρωτεΐνη, ένα γνωστό Ε3 λιγάση για HIF-αδ, σε κύτταρα Κ ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με κύτταρα J στον πυρήνα, αλλά όχι κυτταρόπλασμα, η οποία συνέπεσε με την έντονη πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α και HIF-2α σε κύτταρα J υπό συνθήκες υποξίας (Εικ. 5C). Εξετάσαμε περαιτέρω αλληλεπίδραση μεταξύ HIF-2α και VHL σε πυρηνικά εκχυλίσματα και διαπίστωσε ότι η πυρηνική VHL σε κύτταρα Κ έντονα αλληλεπίδρασε με HIF-2α σε σύγκριση με J κύτταρα για την προώθηση της HIF-2α ουβικιτινίωση στον πυρήνα (Σχ. 5D). Επιπλέον, τα κύτταρα Κ αποκάλυψε πολυ-ουβικουϊτινίωση του HIF-2α σε σύγκριση με J κύτταρα τα οποία υποστηρίζει την ιδέα της επιταχυνόμενης αποικοδόμησης του HIF-α σε κύτταρα Κ (Σχ. 5Ε). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο για την πυρηνική VHL στη ρύθμιση της σταθερότητας του HIF-αδ στις TCF-4 κύτταρα που υπερεκφράζουν ισομορφή.

(Α) Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 150 μΜ CoCl

2 για 36 ώρες που ακολουθείται με επώαση με ή χωρίς MG-132 (10 μΜ) για 2 ώρες. Σύνολο κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ανοσοστυπώματος. Σχετική έκφραση του HIF-αδ κανονικοποιήθηκε προς ακτίνη. (Β) Η σταθερότητα της πρωτεΐνης του HIF-αδ αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοστυπώματος, όπου τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 5 μg /mL κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ) να αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση για 0 ​​ή 60 λεπτά στην τελευταία φάση του 48 hr CoCl

2 περιόδου θεραπείας. (Γ) έκφραση του VHL σε TCF-4J και Κ κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή 0 ή 150 μΜ CoCl

2 και πυρηνικά και cytoplamic κλάσματα παρασκευάστηκε για ανάλυση ανοσοστυπώματος. Το επίπεδο έκφρασης του HIF-2α και VHL ομαλοποιήθηκε με λαμίνη (κάτω πίνακας)? VHL-C, κυτταροπλασματική VHL. (Δ) Αλληλεπίδραση μεταξύ VHL και HIF-2α στον πυρήνα του TCF-4J και τα κύτταρα Κ. (Ε) Polyubiquitination του HIF-2α στην κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα TCF-4J και τα κύτταρα Κ. Ανοσοκαταβύθιση (IP) /immunoblot ανάλυση (ΙΒ) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντισωμάτων για HIF-2α και ουβικιτίνη (Ub)? *, IgG βαριά αλυσίδα. Σημειώστε την μειωμένη ουβικιτινίωση HIF-2α και αδύναμα VHL-HIF-2α αλληλεπίδραση σε κύτταρα J, η οποία ήταν σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις σε κύτταρα Κ.

Η

TCF-4J Ισόμορφης έκφραση συνεισφέρει ένα Ογκογονικά φαινότυπο HCC κύτταρα

Ο ογκογόνο δυναμικό των EV, J, και Κ κύτταρα αξιολογήθηκε σε γυμνά ποντίκια. Όπως θα μπορούσε να προβλεφθεί από το

in vitro

ευρήματα, J κύτταρα ήταν πολύ ογκογόνο. Αν και τα κύτταρα Κ δημιουργούνται μικροί όγκοι, εμφανίστηκαν αργότερα (περίπου 40 ημέρες) μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου και μεγάλωσε πολύ αργά (Σχ. 6Α). κύτταρα ελέγχου (EV) δεν παράγουν όγκους, όπως έχει ήδη αναφερθεί [24].

(Α) Αντιπροσωπευτικό πείραμα που αποδεικνύει την ανάπτυξη του όγκου ξένου μοσχεύματος και το ρυθμό ανάπτυξης. EV2, τον έλεγχο? J1, J κυττάρων? κυτταρικοί κλώνοι Κ2 και Κ5, Κ. (Β) Protein έκφραση των υποδεικνυόμενων μορίων στο J1 όγκους (1-5) και οι όγκοι Κ2 (13-17) με ανάλυση ανοσοστυπώματος.