Αφηρημένο

Σε καρκίνου στον άνθρωπο, η έκφραση του

ας-7

οικογένειας μειώνεται σημαντικά, και αυτό συνδέεται με μικρότερο χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που οδηγούν σε

ας-7

προς τα κάτω ρύθμιση του καρκίνου είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Δεδομένου ότι η τροποποίηση του αριθμού αντιγράφων είναι μία από τις αιτίες του γονιδίου απορρύθμιση στον καρκίνο, εξετάσαμε αριθμό αντιγράφων αλλαγές του

ας-7

οικογένεια σε 2.969 καρκίνο δείγματα από μια υψηλής ανάλυσης σειρά SNP δεδομένων. Βρήκαμε ότι υπήρχε μια μείωση στον αριθμό των αντιγράφων του

ας-7

γονιδίων σε ένα ειδικό τρόπο καρκίνο τύπου. Είναι σημαντικό, κομβικό διαγραφή των τεσσάρων

ας-7

μέλη της οικογένειας βρέθηκε σε τρεις τύπους καρκίνου: μυελοβλάστωμα (

ας-7α-2

και

ας-7ε

), του μαστού καρκίνο (

ας-7α-2

), και του καρκίνου των ωοθηκών (

ας-7α-3

/

ας-7b

). Για παράδειγμα, το γονιδιακό τόπο που φιλοξενεί

ας-7α-3

/

ας-7b

διεγράφη το 44% των δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Βρήκαμε επίσης μια θετική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού αντιγράφου του

ας-7b

και ωριμάζουν

ας-7b

έκφραση στον καρκίνο των ωοθηκών. Τέλος, δείξαμε ότι η αποκατάσταση του

ας-7b

έκφραση δραματικά μειωμένη ανάπτυξη των ωοθηκών όγκου

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διαγραφή αριθμός αντιγράφων είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που οδηγεί στην αρνητική ρύθμιση της έκφρασης ειδικών

ας-7

μέλη της οικογένειας στην μυελοβλάστωμα, του μαστού, και των ωοθηκών. Αποκατάσταση του

ας-7

έκφραση στα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να παρέχει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wang Υ, Χου Χ, Greshock J, Shen L, Γιανγκ Χ, Shao Ζ, et al. (2012) Το γονιδιακό DNA Copy-Αριθμός αλλοιώσεις του

ας-7

Οικογένεια σε ανθρώπινους καρκίνους. PLoS ONE 7 (9): e44399. doi: 10.1371 /journal.pone.0044399

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 6, Αύγ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν όλω ή εν μέρει, από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Grant R01-CA142776 (LZ), Ρ50-CA83638-7951 Έργο 3 (LZ), Υπουργείο άμυνας Grant W81XWH-10-1-0082 (LZ), και η ωοθηκών Ταμείο Έρευνας του Καρκίνου (LZ). ZS υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο Υποτροφιών της Κίνας. JT υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης 5K12HD000849. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. LZ είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο χαρακτηρισμός των heterochronic μεταλλάξεις στο

Caenorhabditis elegans

αποκάλυψε μια εξελικτικά διατηρημένη γενετική μονοπάτι που ενορχηστρώνει τόσο το χρονισμό των κυτταρικών διαιρέσεων και κυτταρικής μοίρες, ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης του οργανισμού [1] – [5]. Σε αυτό το μονοπάτι, το microRNA (miRNA)

ας-7

ελέγχει την εξέλιξη του χρονισμού γεγονότα, εξασφαλίζοντας ότι η έξοδος του κυτταρικού κύκλου και την τερματική διαφοροποίηση συμβαίνουν στο σωστό χρόνο [6], [7]. Η

ας-7

γονιδίων στόχων

lin-28

(ένα RNA-δεσμευτικές πρωτεΐνες) και

lin-41

(ένα υποθετικό ουβικιτίνης λιγάση) μπλοκ

γράμ- 7

ωρίμανση και να αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες Argonaute, αντίστοιχα. Αυτές heterochronic γονίδια φαίνεται να σχηματίσουν δισταθής διακόπτες μέσω διπλού αρνητικός βρόχους ρυθμιστική ανάδραση [2] – [5]. Έκφραση του

LIN28

και

LIN41

είναι εξαιρετικά περιορισμένη σε αδιαφοροποίητα στάδια, όπως σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, πρώιμα έμβρυα, και ορισμένα σωματικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα. Αντίθετα, οι ρυθμιστικές τους miRNA,

ας-7

, δείχνει μια αμοιβαία πρότυπο έκφρασης διαχρονικά που αυξήθηκε δραματικά κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης και της ανάπτυξης, και είναι ευρέως εκφράζεται σε ενήλικες ιστούς [2] – [5]. Δεκατρία μέλη του

ας-7

οικογένειας έχουν εντοπιστεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα [7], [8], η οποία εμφανίζει δύο διακριτές και επικαλυπτόμενες λειτουργίες [8].

Ο ρόλος των

ας-7

στον καρκίνο ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά από την Johnson

et al.

όταν διαπίστωσαν ότι το

ας-7

οικογένεια ρυθμίζει αρνητικά

ας-60 /RAS

στο

C. elegans

με σύνδεση σε πολλαπλές

ας-7

συμπληρωματικές θέσεις στο 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του (3’UTR) [9]. Επιπλέον, αφού διαπίστωσε ότι το

ας-7

έκφραση είναι χαμηλότερη σε όγκους του πνεύμονα σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό των πνευμόνων, ενώ η

RAS

πρωτεΐνης είναι σημαντικά υψηλότερη στους όγκους του πνεύμονα, πρότειναν ότι

γράμ- 7

είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο [9], η οποία είναι συνεπής με τις προηγούμενες κλινικές παρατηρήσεις στον καρκίνο του πνεύμονα [10]. Μειωμένη έκφραση του

ας-7

έχει συσχετιστεί με μικρότερη μετεγχειρητική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο [7], [11], [12], και ανάγκασε την έκφραση του

7 ας-

μέλη της οικογένειας μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τόσο

in vitro

και

in vivo

[13] – [16]. Η ανασταλτική λειτουργία του

ας-7

οικογένεια στον καρκίνο έχει επιβεβαιωθεί από έναν αριθμό ομάδων και σε διάφορους τύπους όγκων [7], [11], [12]. Είναι πιθανό ότι

ας-7

εκτελεί αυτές τις λειτουργίες με τη στόχευση διαφόρων γονιδίων. Για παράδειγμα,

ας-7

αναστέλλει πολλά καλά χαρακτηρίζεται ογκογόνων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των

KRAS

[9], [17], [18],

HRAS

[9] , [17], [18],

HMGA2

[18] – [21],

c-Myc

[22], και

NF2

[23]. Επιπλέον,

ας-7

στοχεύει συνδέονται πολλαπλές κυτταρικού κύκλου των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

cdc25A

[24],

CDK6

[24], και

CDK4

[25], καθώς και

η κυκλίνη Α

[25],

Δ1

[25],

D2

[24], και

D3

[25 ]. Τέλος,

ας-7

καταστέλλει την έκφραση του παράγοντα επαναπρογραμματισμό

LIN28

που λειτουργεί για να εμποδίσει τη διαφοροποίηση και τη διατήρηση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων του πληθυσμού [26].

Δεδομένου ότι έχει βρεθεί ότι ανθρώπινοι καρκίνοι εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη έκφραση του

οικογένεια ας-7

, και ότι αυτό σχετίζεται με μικρότερους χρόνους επιβίωσης σε αυτούς τους ασθενείς [7], [11], [12], ο χαρακτηρισμός των μηχανισμών οδηγώντας σε

ας-7

ρύθμιση προς τα κάτω στον καρκίνο έχει σημαντική κλινική σημασία. Μία αιτία των γενετικών απορρύθμισης στον καρκίνο είναι μια μεταβολή στην σωματική αριθμού αντιγράφων ενός συγκεκριμένου γονιδίου [27]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι ο αριθμός αντιγράφων miRNA μπορεί να μεταβληθεί κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [28], [29]. Αυτό μας οδήγησε να εξετάσει αν το αντίγραφο αριθμοί του

ας-7

οικογένειας είχαν μεταβληθεί σε καρκίνο.

Αποτελέσματα

Ορισμένα μέλη της

ας-7

οικογένεια έχει διαγραφές σε αριθμό αντιγράφων στο μυελοβλάστωμα, καρκίνο του μαστού και καρκίνο των ωοθηκών

Για τον καθορισμό του αριθμού αντιγράφων των

7 ας-

μέλη της οικογένειας, αναλύσαμε ένα υψηλής ανάλυσης SNP array (array Affymetrix 250 K Sty) σύνολο δεδομένων, Tumorscape, που δημιουργήθηκε από το Ινστιτούτο Broad του MIT και του Χάρβαρντ [27]. Δεκατέσσερα τύπους ανθρώπινων καρκίνων (συνολικά 2969 δείγματα όγκου) συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη μας (Πίνακας 1). Η τμηματική ανεπεξέργαστα δεδομένα των ανωτέρω SNP συστοιχίες ανακτήθηκαν και αναλύθηκαν ακολουθώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο που παρέχεται από τη βάση δεδομένων Tumorscape [27] και ορατές με την Integrative Genomics Viewer (IGV) (Σχήμα 1) [30]. Οι περιοχές του γονιδιώματος όπου ο αριθμός αντιγράφων αλλαγές εμφανίστηκαν σημαντικά συχνότερα από ό, τι το ποσοστό φόντο ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GISTIC αλγόριθμο [31]. Οι ακόλουθοι όροι, οι οποίοι ορίζονται από τη βάση δεδομένων Tumorscape [27], χρησιμοποιήθηκαν για να περιγράψουν τα αποτελέσματα μας. Συχνότητα υποδεικνύει το κλάσμα των καρκίνων που παρουσιάζουν ενίσχυση /διαγραφής στο γενωμικού τόπου που φιλοξενούν ένα δεδομένο

ας-7

γονίδιο. Χαμηλές τιμές Q (άνω όριο = 0.25) δείχνουν ότι πολλαπλασιασμούς /διαγραφές σε αυτό τον τόπο είναι σημαντικές και εμπλουτίζεται με επιλεκτική πιέσεις

Οι κατακερματισμένες ανεπεξέργαστα δεδομένα από τις συστοιχίες SNP (καρκίνος του μαστού, n = 293?. Καρκίνο των ωοθηκών , n = 110? μυελοϋπερπλαστική διαταραχή, n = 215) είχε ανακτηθεί από τη βάση δεδομένων Tumorscape, αναλύονται, τότε ορατά με την Ολοκληρωμένη Genomics Viewer. Αριστερό πλαίσιο: ολόκληρο το γονιδίωμα ευρεία άποψη του αριθμού αντιγράφων προφίλ από μυελοπολλαπλασιαστική διαταραχή, καρκίνο του μαστού, και των ωοθηκών (γονιδιωματική θέσεις είναι στα αριστερά? Δείγματα όγκου είναι πέρα ​​από την κορυφή). Το κόκκινο αντιπροσωπεύει την ενίσχυση και μπλε αντιπροσωπεύει τη διαγραφή. Δεξιά πίνακα:. Αντιγραφή αριθμού προφίλ του χρωμοσώματος 22 στην περιοχή του

ας-7α-3

/

ας-7b

συμπλέγματος

Η

όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, το

ας-7

οικογένεια είναι παρούσα ως δεκατρία μέλη βρίσκονται σε οκτώ θέσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα [7], [11], [12]. Όλες οι οκτώ γονιδιωματική loci αναλύθηκαν στη μελέτη μας. Τα περισσότερα από τα μέλη της οικογένειας, όπως

ας-7α-1

,

ας-7f-1,

και

ας-7η

, σύμπλεγμα μαζί. (Η

ας-7

γονίδια ονομάζονται με ένα γράμμα για να υποδηλώσει μια ξεχωριστή ώριμη ακολουθία, και έναν αριθμό για να δείξει ότι η ίδια ώριμη ακολουθία είναι παρούσα σε διακριτή γονιδιωματική τόπους.) Εν συντομία, βρήκαμε ότι τέσσερα

ας-7

τόπους που φιλοξενούν πέντε

ας-7

μέλη έδειξαν σημαντικές διαγραφές σε αριθμό αντιγράφων σε ένα συγκεκριμένο τρόπο τον καρκίνο του τύπου (Σχήμα 2). Εστιακό διαγραφές από αυτά

ας-7

μέλη της οικογένειας βρέθηκαν σε τρεις τύπους καρκίνου: μυελοβλάστωμα (

ας-7α-2,

συχνότητα 25%?

ας-7ε,

συχνότητα 9%), ο καρκίνος του μαστού (

ας-7α-2,

συχνότητα 47%), και του καρκίνου των ωοθηκών (

ας-7α-3

/

ας-7b,

συχνότητα 44%). Αυτό υποδηλώνει ότι γενωμική εστιακό αριθμός αντιγράφων εξαλείψεις

ας-7

μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης στις παραπάνω τύπους καρκίνου. Επιπλέον, δύο μη-εστιακό διαγραφές (

ας-7α-3

/

ας-7b,

συχνότητα 40%?

ας-7

g, συχνότητα 36%) επίσης βρέθηκαν στον καρκίνο του μαστού, και μόνο μη εστιακό διαγραφές βρέθηκαν σε μελάνωμα (

ας-7α-2,

συχνότητα 43%) και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (

ας-7ε,

συχνότητα 31%). Τέλος, μόνο ένα

ας-7

μέλος της οικογένειας,

ας-7i

, βρέθηκε να ενισχύεται (σε ​​καρκίνωμα πνεύμονα μη-μικρών κυττάρων). Ωστόσο, αυτό εμφανίστηκε ένα χρωμόσωμα χέρι-επίπεδο, μη εστιακούς ενίσχυσης, αναφέροντας ότι θα μπορούσε να είναι ένα «επιβάτης» γενετική μεταβολή. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η μείωση του αριθμού αντιγράφων του ειδικού

ας-7

γονίδια μέλος της οικογένειας ήταν συχνές σε μυελοβλάστωμα, του μαστού, και των ωοθηκών.

Περίληψη αριθμού αντιγράφων DNA αλλοιώσεις του η

ας-7

οικογένεια σε 14 είδη καρκίνων του ανθρώπου (n = 2.969). Η

ας-7

οικογένεια αποτελείται από δεκατρία μέλη που βρίσκονται σε οκτώ θέσεις του ανθρώπινου γονιδιώματος. Πολλοί από αυτούς, όπως

ας-7α-1

,

ας-7f-1

και

ας-7η

, σύμπλεγμα μαζί (Α). Χαμηλές τιμές Q (άνω όριο = 0.25) δείχνουν ότι πολλαπλασιασμούς /διαγραφές σε αυτό τον τόπο είναι σημαντικές και εμπλουτίζεται με επιλεκτική πιέσεις. Σκούρο πράσινο αντιπροσωπεύει εστιακό διαγραφή του

οικογένειά ας-7

.

Η

Αντιγραφή Αριθμός Τροποποίηση του

ας-7b

συσχετίζεται θετικά με Ώριμη

γράμ- 7β

έκφραση σε καρκίνο των ωοθηκών

Για να προσδιορίσετε αν αριθμού αντιγράφων μεταβολές του

ας-7b

επηρεάζουν ώριμη

ας-7

έκφρασης σε καρκίνο, εξετάσαμε ένα καρκίνο των ωοθηκών σύνολο δεδομένων από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA) [32], επειδή αυτό το ανεξάρτητο γονιδιωματικής σύνολο δεδομένων περιέχει προσαρμοσμένα δεδομένα τόσο για τον αριθμό αντιγράφων του γονιδιώματος σε επίπεδο (array SNP) και ώριμη έκφραση των miRNAs (array miRNA) από μια μεγάλη συλλογή από δείγματα ανθρώπινου ωοθηκικού όγκου. δεδομένα επιπέδου 3 (κατά διαστήματα SNP δεδομένων πίνακα και κανονικοποιημένα δεδομένα array miRNA) ανακτήθηκε από TCGA [32]. Εντοπίστηκαν συνολικά 537 όγκους με δεδομένα τόσο από το SNP και συστοιχίες miRNA. Σε συμφωνία με τα δεδομένα από την ανάλυση μας Tumorscape, υπήρχε μια διαγραφή σε αριθμό αντιγράφων στο

ας-7a-3

/

ας-7b

τόπο σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 3Α ). Δεδομένου ότι η ώριμη

ας-7

μια ακολουθία κωδικοποιείται από τρία

ας-7

ένα γονίδια, τα οποία βρίσκονται σε τρεις διαφορετικές χρωμοσωμική τόπους, δεν θα μπορούσαμε να εξετάσουμε τη συσχέτιση μεταξύ του αριθμού αντιγράφων και της έκφρασης για

ας-7α-3

. Έτσι, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ διαγραφές σε το

ας-7α-3

/

ας-7b

τόπο και την έκφραση των ώριμων

ας-7b

σε αυτό το σύνολο δεδομένων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 Β και C, η έκφραση του ώριμου

ας-7b

σημαντικά και θετικά με

ας-7b αριθμός

αντίγραφο σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (ρ & lt? 0,0001, R = 0,46, η = 537). Εμείς δεν κατάφερε να βρει τον συσχετισμό μεταξύ οποιωνδήποτε άλλων

7 ας-

μέλη της οικογένειας με το

ας-7b αριθμό

αντιγράφου (Σχήμα 3D). Αυτό αποδεικνύει ότι η μείωση του αριθμού αντιγράφων του

ας-7b

οδηγεί σε μείωση στην έκφραση του ώριμου

ας-7b

στον καρκίνο των ωοθηκών.

Επίπεδο δεδομένων 3 (κατά διαστήματα τα δεδομένα array SNP και κανονικοποιημένα δεδομένα array miRNA) ανακτήθηκε από TCGA. Εντοπίστηκαν συνολικά 537 όγκους και με τους δύο SNP και τα δεδομένα συστοιχίες miRNA. Α Αριστερός πίνακας: ολόκληρο το γονιδίωμα ευρεία άποψη του προφίλ αριθμού αντιγράφων στον καρκίνο των ωοθηκών (γονιδιωματική θέσεις είναι στα αριστερά? Δείγματα όγκων είναι πέρα ​​από την κορυφή). Το κόκκινο αντιπροσωπεύει την ενίσχυση και μπλε αντιπροσωπεύει τη διαγραφή. Δεξιά πίνακα: Copy-αριθμό προφίλ από το χρωμόσωμα 22 στην περιοχή του

ας-7α-3

/

ας-7b

συμπλέγματος. Β Θερμότητας χάρτη των ώριμων

ας-7

επίπεδα έκφρασης της οικογένειας σε συμφωνημένα δείγματα TCGA. Τα δείγματα διατάσσονται με την ίδια σειρά όπως τα δεδομένα SNP. Γ συσχετίσεις μεταξύ

ας-7b αριθμό αντιγράφων

DNA και ωριμάζουν

ας-7b

επίπεδα έκφρασης στον καρκίνο των ωοθηκών από το σύνολο δεδομένων TCGA. Δ συσχετίσεις μεταξύ

ας-7b επίπεδα αριθμό και την έκφραση αντίγραφο

DNA του ώριμου miRNA άλλων

ας-7

μέλη της οικογένειας του καρκίνου των ωοθηκών από το σύνολο δεδομένων TCGA.

Η

Αποκατάσταση του

ας-7b

Έκφραση μειώνει σημαντικά ωοθηκών ανάπτυξη όγκου

in vitro

η

Focal απώλεια σε αριθμό αντιγράφων του

ας-7

οικογένεια μέλη σε μυελοβλάστωμα, του μαστού και των ωοθηκών υποδηλώνει σαφώς ότι

ας-7

μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Ως εκ τούτου, αποκαθιστώντας την έκφρασή του θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου σε αυτούς τους καρκίνους. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή

in vitro,

έχουμε επιμολυσμένα δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, Α2780 και το 2008, με μια 7β ας-

μιμούνται (ένα διπλό σκέλος ολιγονουκλεοτιδίων RNA). Ένα καλλιεργημένα ανθρώπινα επιθηλιακά επιφάνεια των ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος, και την ανάπτυξη των κυττάρων παρακολουθήθηκε μέσω προσδιορισμού ΜΤΤ. Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, διαπιστώσαμε ότι το

ας-7b

μιμούνται μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 3 Α και Β). Δεν υπήρξε καμία μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4C). Αυτό υποδηλώνει ότι η αποκατάσταση του

ας-7b

έκφραση σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να έχουν μεγάλες θεραπευτικές δυνατότητες για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Ο

ας-7b

μιμούνται και τον έλεγχο ολιγο (30 ηΜ) διαμολύνθηκαν στην Α2780 (Α), 2008 (Β) και τον εύκαμπτο σωλήνα (C) κύτταρα με lipofectamine. Η ανάπτυξη των κυττάρων παρακολουθήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

Αποκατάσταση του

ας-7b

Έκφραση μειώνει σημαντικά ωοθηκών Ανάπτυξη Όγκου

in vivo

Η

Για να αξιολογηθεί η

in vivo

θεραπευτικές δυνατότητες του

ας-7b

μιμούνται, ένα ορθοτοπικό όψιμο στάδιο των ωοθηκών μοντέλο ποντικού καρκίνος δημιουργήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 10 × 10

6 καρκίνο των ωοθηκών ( Α2780) κύτταρα σε θηλυκούς γυμνούς ποντικούς (Σχήμα 5Α). Μετά από δύο εβδομάδες, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες, να αντιμετωπίζονται είτε με το

ας-7

μιμούνται ή το ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου από ε.π. ένεση. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή κάθε τρεις ημέρες για ένα σύνολο τέσσερις θεραπείες (Σχήμα 5Α), και οι κόμβοι του όγκου συλλέχθηκαν τρεις ημέρες μετά την τελευταία θεραπεία (Σχήμα 5Β). Βρήκαμε ότι το βάρος των κόμβων του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη στους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με 7β-ας

μιμητικό σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 5 Β και C). Παρακολουθήσαμε επίσης ενδογενείς

ας-7b

δραστηριότητα μέσω μιας εκφράζουν συντακτικά

ας-7b δημοσιογράφος

λουσιφεράσης που περιείχε αλληλουχίες συμπληρωματικές προς

ας-7

στην 3’UTR [33 ], [34]. Βρήκαμε συνέπεια ότι η θεραπεία με την 7β ας-

μιμούνται μειώθηκε σημαντικά η δράση της λουσιφεράσης

in vivo

σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5 D και E). Τέλος, βρήκαμε ότι η θεραπεία με το

ας-7b

μιμούνται αύξησε σημαντικά τον 7b ας-

επίπεδα έκφρασης στην θεραπεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (7,03 ± 5,73 φορές, p = 0,047) . Εν τω μεταξύ, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των γνωστών

ας-7

γονίδια-στόχους, όπως

CCND1

,

cdc25A

,

HMGA2

,

IL6

και

LIN28B

ήταν σημαντικά μειωμένα από το

ας-7b

μιμούνται τη θεραπεία. Στο σύνολό τους, αυτό αποδεικνύει ότι η

in vivo

παράδοση ένα

ας-7b

μιμούνται μπορεί λειτουργικά να αποκαταστήσει

ας-7

έκφρασης και εντυπωσιακά να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα προ- κλινική ζωικό μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών.

Χρονοδιάγραμμα της μεταμόσχευσης των κυττάρων όγκου με ενδοπεριτοναϊκή ένεση, θεραπεία, απεικόνισης, και τη συλλογή των δειγμάτων όγκου στο ορθοτοπικό προχωρημένο στάδιο μοντέλο ποντικού καρκίνου των ωοθηκών. κόμβους Β Tumor συλλέγονται από κάθε ποντικό τρεις ημέρες μετά την τελευταία θεραπεία. C. Σύνοψη των βαρών των κόμβων όγκου από κάθε ποντικό. Δ Η ενδογενής

ας-7b

δραστηριότητας σε κάθε ποντίκι, όπως παρακολουθείται από ένα

αισθητήρα

λουσιφεράσης 7β ας-. Ε Περίληψη της έντασης της λουσιφεράσης κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Η

Συζήτηση

Το

ας-7

οικογένεια είναι μια από τις πρώτες οικογένειες ογκοκατασταλτικό miRNA αποδειχθεί ότι είναι που εμπλέκονται στον καρκίνο του ανθρώπου. Έκφραση των μελών του

ας-7

οικογένεια έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε πολλούς τύπους καρκίνου, και αυτό μειώθηκε

ας-7

έκφρασης έχει συσχετισθεί με τις φτωχότερες κλινικές εκβάσεις. Δύο μοριακοί μηχανισμοί που έχουν προταθεί που μπορεί να οδηγήσει σε παγκόσμια ρύθμιση προς τα κάτω του

ας-7

έκφραση στον καρκίνο. Πρώτον, βασικές πρωτεΐνες στην οδό βιογένεση miRNA, όπως Dicer και Drosha, μπορεί να απελευθερωθεί αξιοσημείωτα στον καρκίνο [35]. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μη εκλεκτική, η παγκόσμια ρύθμιση προς τα κάτω του miRNAs, συμπεριλαμβανομένης της οικογένειας ας-7. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη δέσμευσης RNA,

LIN28,

η οποία αναστέλλει επιλεκτικά μερικές οικογένειες miRNA, συμπεριλαμβανομένων των

ας-7

οικογένεια [36] – [41], είναι ενεργοποιείται σε ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών με καρκίνο [42] – [51]. Ωστόσο, οι δύο παραπάνω μηχανισμοί δεν μπορούν να εξηγήσουν τη διαπίστωση ότι, στα περισσότερα είδη καρκίνου, μόνο μερικά

ας-7

μέλη της οικογένειας είναι μειωτικά. Για παράδειγμα, η έκφραση του

ας-7

a,

ας-7

c, και

ας-7

g έχουν βρεθεί να μειωτικά επιλεκτικά στον καρκίνο του μαστού [ ,,,0],52], γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχουν και άλλοι ανεξάρτητοι μηχανισμοί που επηρεάζουν την έκφραση του κάθε ατόμου

ας-7

μέλος της οικογένειας.

οι πρόσφατες εξελίξεις στην υψηλής απόδοσης τεχνολογίες χαρακτηρισμό του γονιδιώματος έχουν αποκαλύψει ότι τα γονιδιώματα του καρκίνου είναι εξαιρετικά διαταραγμένο, με εκτεταμένες αλλαγές στη δομή των χρωμοσωμάτων και αριθμούς αντιγράφων του γονιδίου. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η αντιγραφή είναι οι αριθμοί των miRNAs συνήθως μεταβάλλεται σε ανθρώπινο καρκίνο [28], [29]. Για παράδειγμα, το

Mir-16-1 /mir-15α

συμπλέγματος στο χρωμόσωμα 13q14 διεγράφη σε περισσότερο από το 50% των ασθενών χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας [53]. Επιπλέον, η ενίσχυση του

C13orf25 /mir-17~92

συμπλέγματος στο χρωμόσωμα 13q31-32 έχει αναφερθεί σε ασθενείς με λέμφωμα [54], [55]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δείξει ότι τρεις

ας-7

τόπους, τα οποία φιλοξενούν τέσσερα

ας-7

μέλη (

ας-7α-2

,

ας-7α-3

,

ας-7b

, και

ας-7ε

), έχουν διαγραφές σε αριθμό αντιγράφων σε καρκίνο του τύπου ειδικό τρόπο μυελοβλάστωμα, καρκίνο του μαστού, και καρκίνος ωοθηκών. Το πιο σημαντικό, έχουμε επιβεβαιώσει την αντιστοιχία μεταξύ της

ας-7

αριθμού αντιγράφων αλλαγές και ωριμάζουν

ας-7

έκφραση στον καρκίνο των ωοθηκών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η διαγραφή του αριθμού αντιγράφων είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που οδηγεί στην αρνητική ρύθμιση του ειδικού

ας-7

μέλη της οικογένειας σε τουλάχιστον αυτούς τους τρεις τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, ο μηχανισμός αυτός είναι πιθανό καρκίνο συγκεκριμένο τύπο, δεδομένου ότι δεν βρήκαμε σημαντικό αριθμό αντιγράφων αλλαγές του

ας-7

οικογένειας σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως του παχέος εντέρου και του προστάτη.

Είναι σημαντικό, κομβικό μειώσεις στους αριθμούς αντίγραφο του

ας-7

οικογένειας δείχνουν ότι η διαγραφή του

ας-7

μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, και προτείνει την αποκατάσταση έκφραση αυτών em

ας-7

μέλη της οικογένειας μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του μυελοβλάστωμα, καρκίνο του μαστού, και των ωοθηκών. Τρέχουσες ραγδαίες εξελίξεις στον /θεραπεία νανοσωματιδίων ολιγονουκλεοτιδίων δημιουργήσει ρεαλιστικής αισιοδοξίας για την ίδρυση της miRNAs ως ένα νέο και ισχυρό θεραπευτικό στόχο ή /και χημειοθεραπεία διαμορφωτή στον καρκίνο. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, παραδώσαμε ένα μικρό RNA μιμούνται για

ας-7b

, η διαγραφή πιο συχνά

ας-7

μέλος της οικογένειας σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, τον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα

στο vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε ότι η αποκατάσταση του

έκφραση ας-7b

δραματικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις μας, την αποκατάσταση του

ας-7

έκφρασης έχει επίσης αποδειχθεί ότι μειώνει την ανάπτυξη του όγκου σε προ-κλινικά μοντέλα άλλων τύπων καρκίνου, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα [13] – [16], στην οποία η

ας-7

οικογένεια μειώθηκε συνολικά [9], [10]. Δεδομένου ότι

ας-7

αναστέλλει ταυτόχρονα πολλαπλές ογκογόνο μονοπάτια που εμπλέκονται στα περισσότερα στάδια της ογκογένεσης (όπως

RAS, MYC

, και

HMGA2)

, την αποκατάσταση της

ας-7

έκφραση σε κύτταρα όγκου παρέχει μία νέα θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον, διαπιστώσαμε ότι μας

ας-7b

αγωγή δεν επηρέασε σημαντικά φυσιολογική ανάπτυξη επιφανειακών επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών, προτείνοντας ότι θεραπεία για την αποκατάσταση της

ας-7

έκφρασης μπορεί να είναι λιγότερο τοξικά από τα παραδοσιακά χημειοθεραπεία. Αυτό το εύρημα μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τα φυσιολογικά κύτταρα εκφράζουν ήδη υψηλότερα επίπεδα ενδογενούς

ας-7

και επομένως η παράδοση των πρόσθετων

ας-7

δεν αυξάνει σημαντικά γονιδιακή σίγηση της δραστηριότητα σε φυσιολογικά κύτταρα. Μια άλλη εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι η κατάντη κυψελοειδές πλαίσιο είναι διαφορετικό στα κύτταρα όγκου εναντίον των κανονικών κυττάρων. Για παράδειγμα, ορισμένοι άμεσοι στόχοι του

ας-7,

όπως

LIN28, RAS, MYC

και

HMGA2,

δεν εκφράζονται ή ενεργοποιείται σε φυσιολογικά κύτταρα, αλλά είναι γονίδια του «οδηγού» προωθώντας την ανάπτυξη των κυττάρων σε όγκους

έχει αποδειχθεί από ανεξάρτητα εργαστήρια που η καταστολή στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου-στόχου τους από miRNAs είναι σχετικά ήπια [56] – [59]., αν και κάθε miRNA μπορεί ειδικά και ταυτόχρονα στοχεύουν εκατοντάδες μεταγραφών mRNA [56], [59]. Σε συνάδουν με την κοινή αυτή συμπεριφορά των miRNAs, δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των πολλών γνωστών

ας-7

γονίδια-στόχους, όπως

CCND1

,

cdc25A

,

HMGA2

,

IL6

και

LIN28B

ήταν σημαντικά μειωμένα από το

ας-7b

μιμούνται τη θεραπεία (όλα τα p & lt? 0,05). Ωστόσο, οι επιπτώσεις καταστολή στα επίπεδα του mRNA από το

ας-7b

είναι συνήθως μέτρια (από 58,0% ± 0,03% έως 78,9% ± 0,08%). Θα μπορούσε να αποφέρει σημαντικά θεραπευτικά οφέλη για το

ας-7b θεραπεία

αναπλήρωσης σε σύγκριση με τις στρατηγικές siRNA που βασίζεται: Πρώτον, οι παρενέργειες της αποκατάστασης του

ας-7b

σε ασθενείς με καρκίνο μπορεί να είναι ήπια και περιορισμένη. Δεύτερον, πολλαπλών ογκογόνων γονιδίων /μονοπάτια, όπως ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η απάντηση βλάβη στο DNA, διαφοροποίησης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και της φλεγμονής θα μπορούσαν να απευθύνονται ταυτόχρονα. Σε συμφωνούν με αυτή την υπόθεση, πράγματι, δεν βρήκαμε ότι το

7β ας-θεραπεία

αντικατάστασης επηρεάζεται σημαντικά από την φυσιολογική ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων σε θεραπευτική δόση (Σχήμα 4C). Επιπλέον, συμπεριλαμβανομένων miRNAs

ας-7

ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου-στόχου από δύο κύριους μηχανισμούς, δηλαδή mRNA διάσπασης (επίπεδο της μεταγραφής) και /ή μεταφραστικά καταστολή (μεταφραστικό επίπεδο), σε μία αλληλουχία-ειδικό τρόπο [7] , [8], [11], [12]. Αυτό θα μπορούσε να είναι μια άλλη εξήγηση γιατί βρήκαμε μόνο μέτρια καταστολή της έκφρασης γονιδίου-στόχου σε επίπεδα mRNA που ανιχνεύτηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τέλος, η δοσολογία για το

ας-7b

παράδοσης στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε με ένα πείραμα δοσο-εξαρτώμενη. Χρησιμοποιήσαμε την ελάχιστη λειτουργική απόκριση δόσης (30 ηΜ) για πραγματικού χρόνου RT-PCR πειραμάτων μας. Όταν αυξήσαμε τη δόση του

ας-7b

παράδοση, βρήκαμε τα αποτελέσματα του

θεραπεία αντικατάστασης ας-7b

σε γονίδια στόχους της ήταν εξαιρετικά αυξημένη.

Έχει έχουν επίσης αποδειχθεί ότι η ώριμη

ας-7

έκφρασης είναι ένα ισχυρό βιοδείκτη για να προβλέψει την κλινική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο. Για παράδειγμα, μια συστηματική ανασκόπηση 43 δημοσιευμένων μελετών δείχνουν ότι

ας-7

είναι το miRNA πιο συχνά και σχετίζεται σημαντικά με την κλινική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο [60]. Να εξετάσει τη συσχέτιση μεταξύ του

ας-7b /ας-7Α3

αριθμού αντιγράφων συμπλέγματος αλλαγές (διαγραφή vs μη διαγραφή) και την κλινική έκβαση των ασθενών, συνολικά 491 προχωρημένου σταδίου (στάδιο-III και -IV ) όγκους με καλά σχολιασμένα πληροφορίες επιβίωση εξετάστηκε με ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. Ωστόσο, δεν βρήκαμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των

ας-7b /ας-7Α3

αριθμό αντιγράφων συμπλέγματος αλλαγές και τη συνολική επιβίωση σε αυτό το σύνολο του δείγματος (p = 0,343). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι ο αριθμός αντιγράφων του DNA μεταβολή δεν είναι ο μόνος λόγος με τον οποίο η ώριμη

ας-7

έκφραση είναι μειωμένη σε καρκίνο. Σε συμφωνούν με αυτή την παρατήρηση, έχουμε και άλλες ανεξάρτητες ομάδες έχουν αναφέρει ότι miRNA απορρύθμιση στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών οδηγήθηκε μέσω πολλαπλών μηχανισμών [29], [61], [62]. Πρώτον, έχει αποδειχθεί ότι τα περισσότερα πρωτογενή miRNAs σε μεταγραφή από υποκινητή ροΙ II και ρυθμίζεται από μεταγραφικούς παράγοντες. Πολλά παραδείγματα που δείχνουν miRNA απορρύθμιση στον καρκίνο των ωοθηκών από την μεταγραφική απορύθμιση έχουν αναφερθεί. Δεύτερον, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι επιγενετικές μεταβολές παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην απορρύθμιση έκφρασης miRNA σε ανθρώπινους καρκίνους των ωοθηκών. Τρίτον, η μετάλλαξη θα μπορούσε επίσης να συμβάλει στην προς τα κάτω ρύθμιση των ώριμων miRNAs. Τέλος, οι βασικές πρωτεΐνες στην οδό βιογένεση miRNA μπορεί να είναι δυσλειτουργικό ή απορυθμισμένη στον καρκίνο, και μπορεί να ενισχύσει την ογκογένεση. Ως εκ τούτου, η μεταγραφική απορρυθμίσεις, επιγενετικές μεταβολές, μεταλλάξεις, ανωμαλίες αριθμό αντιγράφων του DNA και ελαττώματα στο μηχανισμό βιογένεσης miRNA μπορεί να καθένα να συμβάλει, είτε μόνος του, αλλά πιο πιθανό από κοινού, για να το

ας-7

οικογένεια απορρύθμιση στον καρκίνο του ανθρώπου [29 ], [61], [62]. Στην παρούσα μελέτη, ανέφερε ότι

ας-7b /ας-7Α3

συμπλέγματος διαγραφεί ποσοστό πάνω από το 40% των καρκίνων των ωοθηκών και του μαστού. Πιστεύουμε ότι είναι ένας από τους σημαντικούς μηχανισμούς για να μειώσετε

ας-7

έκφραση σε αυτές τις ασθένειες, αν και οι άλλοι μηχανισμοί, όπως η μεταγραφική απορυθμίσεις, επιγενετικές μεταβολές, μεταλλάξεις και ανωμαλίες στο μηχανισμό βιογένεσης miRNA που απαιτούνται για την περαιτέρω χαρακτηρίζεται σε καρκίνους των ωοθηκών και του μαστού.

Υλικά και Μέθοδοι

SNP και miRNA μικροσυστοιχιών Ανάκτηση δεδομένων και Ανάλυση

τα τμηματική ανεπεξέργαστα δεδομένα από τις μικροσυστοιχίες SNP (Affymetrix 250 array Κ Sty) έγινε λήψη από τη βάση δεδομένων Tumorscape (που δημιουργήθηκε από το Ινστιτούτο Broad του MIT και του Χάρβαρντ) [27] και αναλύονται παρακάτω ένα πρότυπο πρωτόκολλο που παρέχεται από Tumorscape, στη συνέχεια, οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας την Ολοκληρωμένη Genomics Viewer (IGV) (Σχήμα 1) [30]. Δεκατέσσερα τύπους ανθρώπινων καρκίνων (συνολικά 2969 δείγματα όγκου) συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη μας (Πίνακας 1). Τα δεδομένα επιπέδου 3 (κατά διαστήματα SNP δεδομένων πίνακα και κανονικοποιημένα δεδομένα array miRNA) ήταν λήψη από το Cancer Genome Atlas (TCGA) σύνολο δεδομένων [32], και συνολικά 537 όγκους και με τους δύο SNP και τα δεδομένα πίνακα miRNA εντοπίστηκαν. Οι περιοχές του γονιδιώματος όπου ο αριθμός αντιγράφων αλλαγές εμφανίστηκαν σημαντικά συχνότερα από ό, τι εντοπίστηκαν το ποσοστό φόντο χρησιμοποιώντας την Genomic εντοπισμό σημαντικών Στόχοι στον Καρκίνο (GISTIC) αλγόριθμο [31]. Οι πληροφορίες για τους τύπους όγκου των δειγμάτων από τη βάση δεδομένων Tumorscape ήταν διαθέσιμο στην πύλη του Tumorscape (https://www.broadinstitute.org/tumorscape) [27]. Του μαστού και των ωοθηκών κλινικές πληροφορίες ήταν διαθέσιμες από τις δημοσιευμένες προφίλ (GSE7545 και GSE19399) [27], [63], [64]. Όλα τα δείγματα TCGA καρκίνο των ωοθηκών είναι υψηλής ποιότητας ορώδεις όγκους των ωοθηκών, τα οποία συλλέχθηκαν από νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ορώδες αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών που είχαν υποστεί χειρουργική εκτομή και είχαν λάβει καμία προηγούμενη θεραπεία για τη νόσο τους, συμπεριλαμβανομένης της χημειοθεραπείας ή της ακτινοθεραπείας. Όλες οι περιπτώσεις έπρεπε να είναι ορώδες ιστολογίας, αλλά συλλέχθηκαν ανεξάρτητα από το χειρουργικό στάδιο ή ιστολογική βαθμού. Περιπτώσεις οργανώθηκαν σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης 1988 ΦΥΓΩ. Η λεπτομέρεια κλινικών πληροφοριών των δειγμάτων από τη βάση δεδομένων TCGA ήταν διαθέσιμο στην πύλη TCGA δεδομένων (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [32].

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμός

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και της Διεύθυνσης θεραπεία του καρκίνου και διάγνωση (DCTD) Tumor /κυτταρική Γραμμή Repository. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). ανθρώπινα κύτταρα επιφάνεια επιθηλιακά ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia) [65]. κύτταρα ΣΩΛΗΝΑ καλλιεργήθηκαν 1:01 στο Media 199:. MCDB 105 (Sigma), συμπληρωμένο με 15% FBS

ας-7b

Μιμούνται

in vitro

Επιμόλυνση

Ο

ας-7b

μιμούνται και τον έλεγχο ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Invitrogen. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Η διαμόλυνση των ολιγονουκλεοτιδίων miRNA (30 ηΜ)

in vitro

διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

ΜΤΤ Δοκιμασία

προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν σε πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας ένα κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις έως έξι φρεάτια αναλύθηκαν για κάθε δείγμα. Το προκύπτον χρωματισμένο διάλυμα προσδιορίζεται ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ELx800 απορρόφηση Microplate Reader (BioTek) στα 570 nm με ένα μήκος κύματος αναφοράς 630 nm.

δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Ο φορέας αναφοράς ας-7 ήταν επιμολύνονται σε Α2780 κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Fugene6 Transfection (Roche). Το μέσο αλλάχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και οι σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με νεομυκίνη για 14 ημέρες. Οι σταθεροί κλώνοι που εκφράζουν το let-7 δημοσιογράφος επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με δοκιμασία λουσιφεράσης.

Δημιουργία ορθοτοπική ωοθηκών μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου

Έξι έως οκτώ εβδομάδων θηλυκά γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από το εργαστήριο Jackson . Υποσυρρέοντα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (Α2780) τρυψινοποιήθηκαν και αιωρήθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), στη συνέχεια 10 × 10

6 κυττάρων σε ένα συνολικό όγκο 0,1 ml εγχύθηκαν εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικών.