Υπάρχουν

Αφηρημένο

συμπαγών όγκων σε ένα υποξικό μικροπεριβάλλον, και διαθέτουν υψηλής γλυκολυτικό μεταβολίτες. Για να αποφευχθεί η οξέωση, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να παρουσιάζουν ένα δυναμικό μηχανισμό (ες) κυτοσολικό ρύθμιση του ρΗ. Η τάση πύλη πρωτονίων κανάλι HV1 μεσολαβεί λειτουργία NADPH οξειδάσης αντισταθμίζοντας κυτταρική απώλεια ηλεκτρονίων με πρωτόνια. Εδώ, δείξαμε για πρώτη φορά, ότι η έκφραση HV1 είναι αυξημένη σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές, που σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι HV1 εκφράζεται ισχυρά σε αδενοκαρκινώματα αλλά όχι ή lowly εκφράζεται σε φυσιολογικό ορθοκολικό ή υπερπλαστικούς πολύποδες. HV1 έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέεται σημαντικά με το μέγεθος του όγκου, ταξινόμηση των όγκων, την κατάσταση των λεμφαδένων κλινικό στάδιο και την κατάσταση ρ53. Υψηλή HV1 έκφραση συσχετίζεται σημαντικά με την μικρότερη συνολική και ελεύθερη υποτροπής επιβίωση. Επιπλέον, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και ανοσοκυτταροχημεία έδειξε ότι HV1 εκφράζεται έντονα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, SW620, ΗΤ29, LS174T και ΟοΙο205, αλλά όχι σε SW480. Αναστολές της έκφρασης HV1 και δραστηριότητας στις άκρως μεταστατικά κύτταρα SW620 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και Zn

2+, αντίστοιχα, μειώνουν σημαντικά την εισβολή των κυττάρων και τη μετανάστευση, την εξώθηση πρωτονίων αυτοσυγκράτηση και την ενδοκυτταρική αποκατάσταση του pH. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HV1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή βιοδείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση του ορθοκολικού καρκινώματος, καθώς και ένα πιθανό στόχο για αντικαρκινικά φάρμακα σε ορθοκολικό θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wang Υ, Wu Χ, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) Ανθρώπινα τασεοελεγχόμενων Proton Κανάλι HV1: μια νέα πιθανή βιοδεικτών για τη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (8): e70550. doi: 10.1371 /journal.pone.0070550

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιαν, 2013? Αποδεκτές: 19 Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31271464). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο τασεοελεγχόμενων διαύλων πρωτόνιο HV1 αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική αναζητήσεις βασίζεται σε γνωστά κανάλια κατιόντων, η οποία εκφράζεται κυρίως σε ανοσοκύτταρα όπως τα μακροφάγα, ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και [1], [2]. HV1 σε φαγοκύτταρα θηλαστικών προτάθηκε να είναι υπεύθυνη για την οδό πρωτόνιο-μεταφοράς, η οποία ρυθμίζει ενδοκυτταρικό ρΗ κατά τη διάρκεια της κατανάλωσης οξυγόνου που συνδέονται με την φαγοκυττάρωση, που ονομάζεται «αναπνευστική έκρηξη» [3], [4]. HV1 ενεργοποιείται από αποπόλωση και ενδοκυτταρική οξίνιση, η δραστηριότητα των οποίων διατηρεί ουδέτερη να κρατήσει ενδοκυτταρικό ρΗ αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [5], [6]. HV1 ρυθμίζει όχι μόνο το ρΗ σε κυτταρόπλασμα, αλλά μπορεί επίσης να παρέχει πρωτόνια στο φαγόσωμα, ένα διαμέρισμα κλειστό μεμβράνη για τη θανάτωση και την πέψη ενός παθογόνου [3]. HV1 είναι εξαιρετικά εκλεκτική για H

+, χωρίς ανιχνεύσιμη διαπερατότητα σε άλλα κατιόντα [7], [8]. Η σχέση ενεργοποίηση της τάσης του HV1 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό τόσο από το ενδοκυτταρικό ρΗ (ρΗ

i) και εξωκυτταρικό ρΗ (ρΗ

o). Η αύξηση του pH

o ή μείωση του pH

i προωθεί H άνοιγμα

+ το κανάλι με τη μετατόπιση του κατωφλίου ενεργοποίησης για περισσότερο αρνητικά δυναμικά [3]. Επιπλέον, HV1 τρέχουσα αναστέλλεται από χιλιοστομοριακή συγκεντρώσεις Zn

2 + και Cd

2 + και άλλα δισθενή κατιόντα [9]

HV1 περιέχει τρία προβλεπόμενα πεδία:. Ν-τερματικό οξύ και προλίνη πλούσια τομέα, διαμεμβρανική περιοχή τάσης-αισθητήρα (VSD) και C-τερματικό τομέα. Οι Τάση-gated Κ

+ κανάλια που αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες, καθένα από τα οποία έχει ένα πεδίο πόρου και VSD. Οι τέσσερις τομείς πόρων έρχονται μαζί για να σχηματίσουν ένα ενιαίο κεντρικό πόρο, και τέσσερις περιφερειακές συστήματα μεταβλητής ταχύτητας ελέγχει την πύλη του πόρου [10]. Σε αντίθεση με την τασεοελεγχόμενων K

+ κανάλια, ο HV1 περιέχει ένα VSD αλλά στερείται τομέως πόρου. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι λειτουργεί HV1 ως διμερές στο οποίο το C-τερματικό πεδίο ενδοκυτταρική είναι υπεύθυνη για την διμερή αρχιτεκτονική της πρωτεΐνης, και κάθε υπομονάδα περιέχει τη δική πρωτονίων μεταφοράς μονοπάτι της [11] – [14]. Η ενδοκυτταρική C-τελική περιοχή του HV1 σχηματίζει ένα διμερές μέσω ενός παράλληλου

α

ελικοειδούς τυλιγμένης σπείρας και είναι απαραίτητη για την πρωτεΐνη εντοπισμού [14].

Τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται συχνά σε μια υποξική μικροπεριβάλλον, και κατέχουν υψηλή γλυκολυτική δραστικότητα και παράγουν όξινο μεταβολίτες [15], [16]. Για να αποφευχθεί η οξέωση που προκύπτει από τη μείωση σε κυτοσολικά ρΗ, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να εξωθηθεί excessing κυτοσολικό πρωτόνια για να διατηρηθεί το ρΗ του κυτοσολίου, η οποία οδηγεί σε όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου. Η υποξική και όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, την εξέλιξη και τη μετάσταση [15]. προηγούμενες εργασίες μας έδειξαν ότι HV1 εκφράζεται ειδικά σε πολύ μεταστατικός ιστούς ανθρώπινων όγκων του μαστού και κυτταρικές σειρές, και προωθεί την πρόοδο του καρκίνου του μαστού κυττάρων και τη μετάσταση, μέσω ρύθμισης των καρκινικών κυττάρων του μαστού intracelular ρΗ [17], [18]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση της HV1 σε παχέος ιστούς όγκων και κυτταρικές σειρές και τις δυνατότητες σύνδεσης της με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και μετα-resectional επιβίωσης. Αναστολές της έκφρασης και της δραστηριότητας HV1 στα ιδιαίτερα μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μειώνουν σημαντικά την εισβολή των κυττάρων και τη μετανάστευση, την εξώθηση πρωτονίων αυτοσυγκράτηση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HV1 υπερ-έκφραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανεξάρτητο βιοδείκτη για την πρόγνωση και τη διάγνωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα των διαδικασιών που έγιναν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και τις σχετικές πολιτικές στην Κίνα. Έχουμε λάβει τη γραπτή συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη μας. Η έγκριση της μελέτης λήφθηκε δεοντολογίας για τη μελέτη μας από την επιτροπή δεοντολογίας της Tonghua Κέντρο Νοσοκομείου.

Ασθενείς και δείγματα

δείγματα καρκίνος του παχέος εντέρου ιστού ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε συνήθη θεραπευτική χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα Χειρουργικής , Tonghua Κέντρο Νοσοκομείο μεταξύ του 2001 και του 2007. Οι ασθενείς δεν υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. 139 παχέος καρκινικούς ιστούς και αντιστοιχισμένο παρακείμενους ιστούς παχέος μη-όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 1. Επιπλέον, για την επαλήθευση της έκφρασης του HV1 σε προκαρκινικές αλλοιώσεις δυσπλαστικές, 10 φυσιολογικούς ορθοκολικό, 18 υπερπλαστικών πολυπόδων και 20 ιστοί αδένωμα εξετάστηκαν επίσης με χρήση ανοσοϊστοχημείας. κλινική κατάσταση του κάθε ασθενούς ταξινομήθηκε σύμφωνα με την παθολογική βαθμό του όγκου, το μέγεθος του όγκου, την κατάσταση των λεμφαδένων. διαφοροποίηση του όγκου βαθμολογήθηκε με το σύστημα βαθμολόγησης Edmondson. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Tonghua Κέντρο Νοσοκομείου και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

Η

Δημιουργία ενός αντι-HV1 πολύκλωνο αντίσωμα

Ένα αντι-HV1 πολυκλωνικό αντίσωμα δημιουργήθηκε έναντι του καρβοξύλ τερματικό πεδίο της HV1 (κατάλοιπα 221-273 του HV1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). Η πρωτεΐνη καθαρίστηκε έως ομοιογένεια μετά από έκφραση σε

Escherichia coli

[19]. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη εγχύθηκε σε ποντικούς και το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HV1 καθαρίστηκε με στήλη rProtein Α Sepharose (GE, Healthcare). HRP-συζευγμένο IgGs αντι-ποντικού κατσίκας αγοράστηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, ΡΑ).

φορέα έκφρασης και την επιμόλυνση

HV1 cDNA κλωνοποιήθηκε σε ρΕΟΡΡ-Ν1 (Clontech ) για να δημιουργηθεί HV1 πλασμιδίου έκφρασης pHV1-EGFP, συντήκονται με την ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP) τμήμα (προσαρτημένο στο Ο-τελικό άκρο του HV1 [14]. 293 κύτταρα Τ καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Dulbecco τροποποιημένο μέσο του Eagle? GIBCO) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό συν αντιβιοτικά (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, GIBCO) σε 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ΝΤΟ. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σε 50-70% συρροή σε μια πλάκα έξι φρεατίων επιμολύνθηκαν παροδικά με pHV1-EGFP πλασμιδίου χρησιμοποιώντας lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα 36-48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με ένα αντι-HV1 πολυκλωνικό αντίσωμα (1 mg /ml) όπως περιγράφεται ανωτέρω με τελική αραίωση 1 1000. Οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 12.5% ​​SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (GE, Healthcare) με το βρέξιμο συσκευές ηλεκτροστύπωση. Η μη ειδική απορρόφηση πρωτεϊνών αποτράπηκε χρησιμοποιώντας 5% (w /v) αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 0.1% Tween 20 (PBS-T) για 1 ώρα. Πρωτογενής επώαση αντίσωμα σε PBS-T πραγματοποιήθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η HRP-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε σε τελική αραίωση 1 15,000 σε PBS-T, και HRP αποκαλύφθηκε με ένα σύστημα ανίχνευσης χημιφωταύγειας (Millipore).

Ανοσοϊστοχημεία

Ιστολογική διαγνώσεις καρκινικών και μη καρκινικών σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί επιβεβαιώθηκαν σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές-χρωματίζονται. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HV1. Το αντι-HV1 αντίσωμα (1,0 mg /ml) αραιώθηκε 100 φορές με PBST (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 0.1% Tween-20) που περιέχει 1% (w /v) BSA. Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές γεμίζουν με 10 mM ρυθμιστικού αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) (ρΗ 8.0) θερμάνθηκαν σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 12 λεπτά. Μετά την ψύξη, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά, που εκτίθενται σε 3% (ν /ν) υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) επί 10 λεπτά για την αναστολή της ενδογενούς δραστηριότητας της υπεροξειδάσης . Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν σε PBST που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου και 2% BSA για 30 λεπτά για τη μείωση της μη ειδικής σύνδεσης. Η επώαση με πρωτογενές αντίσωμα διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. HRP-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε σε τελική αραίωση 1 400 για 1 ώρα. Τέλος, το σήμα οπτικοποίηση αναπτύχθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB) και τα πλακίδια χρωματίσθηκαν για αντίθεση σε αιματοξυλίνη. Αρνητικός έλεγχος διεξήχθη για την θεραπεία με μη-άνοσο ορό ποντικού ως το πρωτογενές αντίσωμα αντί του αντι-HV1 αντίσωμα.

χρωματισμένες τομές αξιολογήθηκαν με τυφλό τρόπο, χωρίς προηγούμενη γνώση των κλινικών πληροφοριών με τη χρήση της γερμανικής ανοσοαντιδραστικό σκορ, ανοσο-Reactive-Score (IRS). Εν συντομία, η IRS αναθέτει επιμέρους βαθμολογίες για ανοσοδραστικών διανομής (0-4) και την ένταση (0-3), στη συνέχεια να πολλαπλασιάζει για να αποδώσει το σκορ IRS. Το ποσοστό θετικότητας βαθμολογήθηκε ως «0» (& lt? 5%), «1» (5-25%), «2» (25-50%), «3» (50-75%), «4» ( & gt? 75%). Η ένταση χρώσης ήταν αποτέλεσμα ανάλογα με τον τομέα του HV1-θετικών κυττάρων χρώση ως «0, -« ​​(αρνητικό, & lt? 5%), «1, +» (ασθενώς θετική, 5-25%), «2, ++ «(θετική, 25-50%), και το» 3, +++ »(έντονα θετικές, & gt? 50%). Το τελικό σκορ έκφραση HV1 υπολογίστηκε από τις τιμές της βαθμολογίας τοις εκατό θετικότητα και χρώση βαθμολογία της έντασης, η οποία κυμαίνεται από 0 έως 12. Θα εκτιμάται IRS από το μέσο όρο των τιμών σε οκτώ τομείς στους × 500 μεγέθυνσης για κάθε δείγμα. HV1 επίπεδα έκφρασης ορίστηκαν ως εξής: χαμηλή έκφραση (βαθμολογία ≤3) και υψηλή έκφραση (βαθμολογία & gt? 3). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση και βαθμολόγηση διεξήχθησαν από δύο ανεξάρτητους έμπειρους παθολόγους.

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι ανθρώπινες ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές SW620, ΗΤ29, LS174T, ΟοΙο205 και SW480 καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα από 95% αέρα και 5% CO

2 με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 20 mM L-γλουταμίνη.

Η ανοσοκυτταροχημεία

SW620, ΗΤ29, LS174T, ΟοΙο205 και SW480 κυττάρων που αναπτύσσονται σε γυάλινες καλυπτρίδες σε συρροή σε πλάκες καλλιέργειας ιστών έξι φρεατίων σταθεροποιήθηκαν με 4% (w /v) παραφορμαλδεϋδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS, υπέστη επεξεργασία με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 20 λεπτά, που εκτίθενται σε 3% (ν /ν) υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) για 15 λεπτά, και δεσμεύτηκαν με 5% εμβρυϊκό βόειο ορό και 2% BSA σε PBST για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποκλεισμένα καλυπτρίδες επωάστηκαν με το αντίσωμα αντι-HV1 (1,0 mg /ml) σε αραίωση 1 200 με PBST που περιέχει 1% (w /v) BSA στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά την πλύση σε PBS για τρεις φορές, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν περαιτέρω με δευτερογενές αντίσωμα HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού σε τελική αραίωση 1 400 για 1 ώρα. Σήματα κατέστησαν ορατά με το σύστημα HRP /DAB. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με αιματοξυλίνη.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της HV1 σε SW620, ΗΤ29, LS174T, ΟοΙο205 και κύτταρα SW480, αξιολογήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο RNAiso (Takara) και μεταγράφηκε ανάστροφα με MMLV σούπερ μεταγραφάσης (Takara). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής διεξήχθη με κιτ SYBR PrimeScriptTM RT-PCR (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές ήταν ως ακολούθως: HV1, 5′-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3′ (αντίστροφο)? GAPDH, 5’-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’ (αντίστροφο). PCR θερμική κατάσταση που χρησιμοποιήθηκε ήταν: 94 ° C για 30 s? ανόπτηση, 52 ° C για 30 s? επέκταση, 72 ° C για 30 s. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA των πρωτεϊνών υπολογίστηκαν σύμφωνα με την εξίσωση: 2

-ΔΔCT, στην οποία ΔΔCT = (CT

HV1 – CT

GAPDH) – (CT

HV1 – CT

GAPDH )

SW620. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ανοσοφθορισμού

SW620 και SW480 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες στερεώθηκαν με 4% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS, υπέστη επεξεργασία με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 20 λεπτά, και δεσμεύτηκαν με 5% ορό εμβρύου μόσχου και 2% BSA σε PBST για 1 ώρα. Τα αποκλεισμένα καλυπτρίδες επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-HV1 (1,0 mg /ml) σε αραίωση 1 200 σε 2% BSA σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση με PBS για 5 λεπτά για τέσσερις φορές, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν περαιτέρω για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ένα FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG σε αραίωση 1 400 σε 2% BSA, ακολουθούμενο από ένα άλλο πλύσιμο όπως περιγράφεται ανωτέρω . Ομοεστιακή εικόνες FITC φθορισμού των SW620 και SW480 κυττάρων καταγράφηκαν σε Leica TCS SP5 συνεστιακή μικροσκοπία (LEICA, Γερμανία) με το σετ FITC-φίλτρο για HV1 και το φίλτρο DAPI ορίζεται για την βαφή των πυρηνικών DAPI. Οι εικόνες αργότερα επεξεργασία από το λογισμικό Adobe Photoshop.

έκφραση Παρεμπόδιση HV1 mRNA

Η αλληλουχία του siRNA που στοχεύει το γονίδιο HV1 ήταν 5′-CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 ‘, και η ακολουθία τυχαίων αίσθηση ήταν 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘, και οι δύο εκ των οποίων ελήφθησαν από Ribobio (Guangzhou, Κίνα) [17]. κύτταρα SW620 αναπτύχθηκαν σε συρροή πέρασαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 30% συρροή και επωάσθηκαν όλη τη νύκτα, στη συνέχεια μορφομετατρέπονται με το siRNA και του αρνητικού ελέγχου, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση του siRNA ήταν 100 ηΜ. Αποσιώπηση εξετάστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η αποτελεσματικότητα των siRNA στην καταστολή HV1 έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR, ανοσοκυτταροχημεία και western αποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-HV1 αντίσωμα όπως περιγράφεται παραπάνω.

κινητική Μετανάστευση

Για να εξεταστεί η επίδραση του HV1 σχετικά με την μεταναστευτική ικανότητα κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, μεταναστεύσεις των SW620, SW480, και τα κύτταρα SW620 ρυθμισμένα προς τα κάτω έκφραση HV1 και ανέστειλε δραστηριότητα HV1 με siRNA και Ζη

2+ αντίστοιχα, αξιολογήθηκαν σε πληγωμένο μοντέλο μονοστιβάδας. Για να ρυθμίζουν προς τα κάτω HV1 έκφρασης, SW620 κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή και επιμολύνθηκαν με siRNA και αρνητικού ελέγχου για 24 ώρες, αντίστοιχα. Για την αναστολή HV1 δραστικότητα, 1 διάλυμα Μ ΖηΟ προστέθηκε στο μέσο ϋΜΕΜ σε τελική συγκέντρωση 100 μΜ [1], [2]. Τα κύτταρα SW620 και SW480 φυτεύτηκαν σε μια πλάκα 24 φρεατίων (1.5 χ 10

5 ανά φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν για 24vh προς συρροή και ακολούθως τραυματίες με μια άκρη. μετακίνηση των κυττάρων παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, και συνελήφθησαν με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή κάθε 12 ώρες.

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασίες

vitro

δοκιμασίες εισβολή και τη μετανάστευση Στο ήταν για την εκτίμηση των επιπτώσεων της HV1 στην επεμβατική και μεταναστευτικές ικανότητες των SW620 και SW480 κύτταρα. SW620 και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκα έξι φρεατίων σε μέσο DMEM με 10% FBS σε συρροή, επιμολυσμένα με το siRNA και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα, για 24 ώρες, και στη συνέχεια επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν και μετρήθηκαν. Για κύτταρο εισβολή, transwells με φίλτρα μέγεθος πόρων 8 μm (Millipore) καλύφθηκαν με matrigel (Becton Dickinson) και εισήχθη εντός πλακών 24 φρεατίων. Και για την κυτταρική μετανάστευση, οι transwells δεν επικαλύφθηκαν με matrigel. μέσο ϋΜΕΜ (500 μλ) που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο, και 200 ​​μΙ ενός κυτταρικού εναιωρήματος (5 × 10

4 κύτταρα) τοποθετήθηκε στον ανώτερο θάλαμο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 για 24 ώρες. Για την αναστολή HV1 δραστικότητα, 1 διάλυμα Μ ΖηΟ προστέθηκε στο μέσο ϋΜΕΜ σε τελική συγκέντρωση 100 μΜ [1], [2]. Τα διεισδύσει κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα, και φωτογραφήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη τέσσερις φορές. Τα ποσοστά μετανάστευσης και της εισβολής υπολογίστηκαν ως [κυτταρική μετανάστευση αρ δοκιμών /κυτταρικής μετανάστευσης Νο ελέγχου

SW620] × 100% και [εισβολή κυττάρων Αρ θάλαμο δοκιμής /εισβολή Νο ελέγχου

SW620] × 100%, αντίστοιχα.

δραστηριότητα του HV1 καναλιού

Η δραστηριότητα των HV1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα αξιολογήθηκε ως αλλαγή στο ενδοκυτταρικό pH (pH

i) ως απάντηση στην μεμβράνη εκπόλωση με BCECF φθορισμού [11]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 3,0 μΜ BCECF-ΑΜ (Molecular Probe) εντός μέσου DMEM ελεύθερο ορού για 30 λεπτά, αντίστοιχα, και πλύθηκε με διάλυμα PSS (140 mM NaCl, 5 mM ΚΟΙ, 5 mM γλυκόζη, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, ρΗ 7,5) για 3 φορές. Τα κύτταρα επωάστηκαν με NH

4Cl /NMDG (Ν-μεθυλο ϋ-γλουκαμίνη) διάλυμα (100 mM NMDG, 40 mM ΝΗ

4Cl, 5 mM ΚΟΙ, 5 mM γλυκόζη, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, ρΗ 7.3) για 20 λεπτά και πλύθηκε με διάλυμα ελεύθερο αμμωνίου (140 mM NMDG, 5 mM ΚΟΙ, 5 mM γλυκόζη, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, ρΗ 7,4), ταχέως επαγωγής ενδοκυτταρική οξίνιση [5]. αποπόλωση της μεμβράνης επιτεύχθηκε με τη φόρτωση διάλυμα Κ +

(145 mM ΚΟΙ, 5 mM γλυκόζη, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, ρΗ 7,5). Η ενδοκυτταρική pH αλλάζει οξύ-φορτωμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με φθορίζοντα διερευνητή BCECF σε μήκη κύματος διέγερσης 490 nm και 440 nm και ένα μήκος κύματος εκπομπής 525 nm υπό μεμβράνη αποπόλωσης κατάσταση χρησιμοποιώντας RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Ιαπωνία).

Μετρήσεις του ενδοκυτταρικού ρΗ

η ενδοκυτταρική ρΗ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ευαίσθητη στο ρΗ φθορίζοντα ιχνηλάτη BCECF-ΑΜ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδες επωάστηκαν με 3,0 μΜ BCECF-ΑΜ (Molecular Probe) σε διττανθρακικό-ελεύθερο DMEM μέσο στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά τη φόρτωση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό HEPES για να απομακρυνθεί το εξωκυτταρικό χρώμα, και έκανε να παραμείνει στο πανομοιότυπο ρυθμιστικό. Το ρυθμιστικό HEPES περιείχε 140 mM NaCl, 5 mM ΚΟΙ, 1 mM θειικό μαγνήσιο

4, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM ΝαΗ

2 ΡΟ

4, 5,5 mM γλυκόζη και 20 mM HEPES, ρΗ 7.4. Ο φθορισμός σε μήκος κύματος διέγερσης 490 nm και 440 nm καταγράφηκε σε ένα μήκος κύματος εκπομπής 525 nm χρησιμοποιώντας RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Ιαπωνία). Η βαθμονόμηση του φθορισμού έναντι του ρΗ πραγματοποιήθηκε με εξισορρόπηση των εξωτερικών και εσωτερικών ρΗ με νιγερικίνη (10 μΜ) σε μία υψηλή Κ

+ ρυθμιστικό με ένα εύρος ρΗ από 5,5 έως 8,0. Η υψηλή K

+ ρυθμιστικό διάλυμα περιείχε 145 mM KCl, 5 mM γλυκόζη, 1 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, και 20 mM HEPES (ή MES). Οι τιμές λόγου σχετικού φθορισμού σχεδιάστηκαν έναντι αντίστοιχης pH

i αξιών, η οποία επέτρεψε τον προσδιορισμό της άγνωστης pH

i.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας SPSS16.0 λογισμικό. Μέτρηση δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Σύγκριση του μέσου μεταξύ των ομάδων έγινε με

t

δοκιμής.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. ανάλυση επιβίωσης αξιολογήθηκε με τη χρήση Kaplan-Meier μέθοδο και την επιβίωση ποσοστό αυτό συγκρίνεται με την δοκιμασία log-rank.

Αποτελέσματα

κλινικοπαθολογική ευρήματα

κλινικοπαθολογική προφίλ από τις 139 περιπτώσεις που έχουν επιλεγεί για αυτό το μελέτη εξετάστηκαν στον πίνακα 1. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 62,4 έτη (εύρος, 36-76), συμπεριλαμβανομένων των 68 αρσενικά και 71 θηλυκά. Οι θέσεις των καρκίνων τους ήταν 29 αριστερής πλευράς και 43 δεξιάς του παχέος εντέρου και του ορθού 47 περιπτώσεις, αντίστοιχα. Μεταξύ των 139 εκτομή περιπτώσεις, η κύρια μέγεθος του όγκου ποικίλες ως εξής: & lt? 5 cm σε 72 περιπτώσεις, και ≥5 cm σε 67 περιπτώσεις. Είκοσι από 139 όγκων έδειξε κακή κυτταρολογική διαφοροποίηση. Η έκταση του όγκου ήταν περιορισμένη (Τ1 ή Τ2) σε 45 περιπτώσεις και προηγμένες (Τ3 ή Τ4) σε 94 περιπτώσεις. Μετάσταση όγκου στους λεμφαδένες παρατηρήθηκε σε 59 από 139 περιπτώσεις.

Αυξημένη έκφραση του HV1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου

HV1 που εκφράζεται σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σχετίζεται με «αναπνευστική έκρηξη» [3], [ ,,,0],4], αλλά η λειτουργία του σε ογκογένεση δεν έχει ταυτοποιηθεί. Για να διερευνηθεί HV1 για χρήση ως πιθανή βιοδείκτη και θεραπευτικός στόχος για καρκίνο του παχέος εντέρου, η έκφραση HV1 σε 139 παχέος καρκινικούς ιστούς και αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς, 10 φυσιολογικούς ορθοκολικό, 20 ορθοκολικού αδενώματος και 18 υπερπλαστικών ιστών πολύποδα, ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία με ένα αντι-HV1 πολυκλωνικό αντίσωμα που δημιουργήθηκε στο σπίτι. Για να εξεταστεί η εξειδίκευση του αντισώματος, 293 κύτταρα Τ επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο έκφρασης pHV1-EGFP. Και η έκφραση του HV1-EGFP ανιχνεύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία και κηλίδωση Western με το αντίσωμα, και ο φθορισμός EGFP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αντίσωμα αναγνωρίζει ειδικά HV1 και EGFP είναι ένας δείκτης για την έκφραση HV1 (Εικ. 1Α και Β).

Α, 293 κύτταρα Τ επιμολύνθηκαν με pHV1-EGFP πλασμιδίου και παρατηρήθηκαν από ένα Leica TCS SP5 εστιακό μικροσκόπιο. ένα, παρατήρηση με φθορισμό EGFP. HV1-EGFP φθορισμού εκπροσωπείται στο πράσινο. β, αντι-HV1 ανοσοφθορισμού (TRITC μήκη κύματος) (κόκκινο). γ, DAPI λεκέ για να απεικονίσει τους πυρήνες (μπλε). d, εικόνα συγχωνευθεί είναι σύνθετο EGFP φθορισμού, αντι-HV1 ανοσοφθορισμού, και DAPI κηλίδα. Β, 293 κύτταρα Τ επιμολύνθηκαν με φορέα pcDNA3.1 και ροϋΝΑ-HV1 πλασμιδίου, αντίστοιχα. Και HV1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. C, HV1 εκφράζεται σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Α (100 Χ) και β (500 ×), c (100 Χ) και d (500 Χ), η κανονική του παχέος ιστούς? e (100 ×) και f (500 ×), ιστούς αδένωμα? g (100 Χ) και h (500 ×), i (100 Χ) και ι (500 ×), k (100 Χ) και l (500 ×), ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Στην κανονική του παχέος ιστούς, υπερπλαστικούς πολύποδες και του παχέος ιστούς αδένωμα, η χρώση ήταν αρνητική ή ασθενώς θετική. Σε ιστούς όγκων, παρατηρήθηκε έντονη ανοσοαντιδραστικότητα για HV1. HV1 παρατηρείται κυρίως σε μεμβράνη πλάσματος (h, j και L) (όπως υποδεικνύεται από βέλη). Το HV1 βάφονται σε καφέ, ενώ οι πυρήνες φόντο είναι μπλε.

Η

Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C και ο Πίνακας 2, χρώση HV1 ήταν κυρίως μέτρια ή ισχυρά θετική παχέος καρκινικούς ιστούς, αλλά όχι σε φυσιολογικό ορθοκολικό και υπερπλαστικών ιστών πολύποδα. HV1 παρατηρήθηκε κυρίως στην μεμβράνη των κυττάρων του όγκου σε ορθοκολικό ιστούς του πλάσματος, όπως φαίνεται στο Σχ. 1C (h, j και L) (όπως υποδεικνύεται από βέλη). Σε ορθοκολικό αδένωμα ιστών, η χρώση ήταν αρνητική ή ασθενώς θετική (Σχήμα 1 C, e και f?. Πίνακας 2). HV1 σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά εκφράστηκε σε σύγκριση με εκείνη στην κανονική του παχέος εντέρου, υπερπλαστικούς πολύποδες και τους ιστούς αδένωμα, υποδηλώνοντας ότι HV1 μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση του παχέος. Συνολικά, 106 από τους 139 (76,3%) περιπτώσεις έδειξαν υψηλή HV1 έκφρασης στους ιστούς του όγκου (IRS πάνω από 3), ενώ το 33 (23,7%) των περιπτώσεων έδειξαν χαμηλή έκφραση (IRS 0-3). Σε γενικές γραμμές, HV1 πυκνότητα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με ιστούς αδένωμα (7,20 ± 3,25 έναντι 2,20 ± 2,12) (Πίνακας 2).

Η

έκφραση υψηλού HV1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση

Οι συσχετίσεις μεταξύ HV1 έκφρασης και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον πίνακα 3. Υπήρξαν σημαντικές συσχετίσεις με το βάθος της κατάταξης όγκου (

P

= 0,007), την ηλικία (

P

= 0,021) , το μέγεθος του όγκου (

P

= 0.000), την κατάσταση των λεμφαδένων (

P

= 0.000), κλινικό στάδιο (

P

= 0.000) και p53 κατάσταση (

P

= 0,014) σε ασθενείς που είχαν υψηλή έκφραση HV1 σε σύγκριση με τους ασθενείς που είχαν χαμηλή έκφραση HV1. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης HV1 και τα άλλα κλινικά χαρακτηριστικά, όπως το φύλο, τη διαφοροποίηση και Ki-67 έκφρασης. Επιπλέον, οι συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του p53, Ki-67, TopoII, GST-π και Ρ-gp και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά είχαν έδειξε στον Πίνακα 4. ρ53 κατάσταση που σχετίζονται με την ταξινόμηση όγκου (

P = 0,011

), Ki-67 σε διαφοροποίηση (

P

= 0,010), TopoII στη διαφοροποίηση (

P

= 0,010), και GST-π για το μέγεθος του όγκου (

P

= 0.007) και η διαφοροποίηση (

P

= 0.000). Ωστόσο, P-gp δεν έδειξαν στατιστική σημαντικότητα με κλινικοπαθολογική παραμέτρους.

Η

Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς που είχαν υψηλή έκφραση HV1 ήταν πιο πιθανό να έχουν μικρότερη συνολική επιβίωση (

P

= 0.008, Σχ. 2Α) και επιβίωσης χωρίς υποτροπή (

P

= 0.008, Σχ. 2Β) σε σύγκριση με τους ασθενείς που είχαν χαμηλή έκφραση HV1, γεγονός που υποδηλώνει ότι HV1 υπερ-έκφραση μπορεί να είναι που συνδέονται με την κακή κλινική πρόγνωση. Οι ασθενείς οι οποίοι είχαν υψηλή HV1 έκφρασης είχε μια κακή επιβίωση χωρίς υποτροπή (

P

= 0,008) σε σύγκριση με τους ασθενείς που είχαν χαμηλή έκφραση HV1 (μονοπαραγοντική ανάλυση) (Πίνακας 5). Η συνολική επιβίωση εξετάστηκε από Cox μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε επίσης ότι η υψηλή έκφραση της HV1 συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη επιβίωση (

P

= 0,008). αναλύσεις παλινδρόμησης μονοπαραγοντική Cox έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης HV1 συσχετίστηκε σημαντικά με την ελεύθερη υποτροπής και συνολική επιβίωση, ενώ άλλα κλινικά χαρακτηριστικά χάσει προγνωστική σημασία τους. Επιπλέον, πολυμεταβλητή παλινδρόμηση Cox αναλύσεις αποκάλυψαν ότι η υψηλή έκφραση του HV1 ήταν ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για τη συνολική επιβίωση (σχετικός κίνδυνος [RR] = 0.443,

P

= 0.015) και επιβίωσης χωρίς υποτροπή (RR = 0,427,

P

= 0,026) (Πίνακας 6). Οι ασθενείς οι οποίοι είχαν υψηλή έκφραση του HV1 ήταν επιρρεπείς να έχουν μια πρώιμη υποτροπή σε σύγκριση με τους ασθενείς που είχαν χαμηλή έκφραση του HV1 (37,4 ± 3,0 έναντι 47,2 ± 10,7,

P

& lt? 0.008). (Πίνακας 5)

Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση έχουν μεγαλύτερη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση από τους ασθενείς με υψηλή έκφραση.

Η

Η

Διανομή HV1 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές παχέος

Για να εξεταστεί αν HV1 εκφράζεται επίσης στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές, η έκφραση του HV1 σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, SW620, ΗΤ29, LS174T, ΟοΙο205 και SW480, ανιχνεύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, τα επίπεδα έκφρασης του HV1 μεταξύ αυτών των ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές έχουν σημαντική διαφορά. HV1 εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σε SW620, ΗΤ29, LS174T, και τα κύτταρα ΟοΙο205, αλλά όχι σε κύτταρα SW480. Ο εντοπισμός του HV1 σε κύτταρα SW620 προσδιορίστηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, HV1 εκφράζεται έντονα σε SW620 κύτταρα, τα οποία είναι εντοπισμένη σε αμφότερες τις ενδοκυτταρικές θέσεις και μεμβράνη πλάσματος (όπως υποδεικνύεται με βέλη), ενώ HV1 δύσκολα εκφράζεται σε κύτταρα SW480. Το αποτέλεσμα ότι η έκφραση HV1 είναι υψηλότερη στα κύτταρα SW620 από ότι στα κύτταρα SW480 είναι ταυτόσημη με τα αποτελέσματα από ανοσοκυτταροχημεία (Εικ. 3Α) και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR (Σχ. 3Β).

Α, ΗΤ29 (α , 200 ×), LS174T (b, 200 ×), ΟοΙο205 (c, 200 ×), SW480 (d, 200 ×), SW620 (ε, 200 Χ) και SW620 (f, 500 ×) ανιχνεύεται με ανοσοκυτταροχημεία. Β, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της HV1 σε SW620, ΗΤ29, LS174T, ΟοΙο205 και κύτταρα SW480 εκτιμήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Οι τιμές είναι μέσοι ± SD (

n

= 3). *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα SW620. C, SW620 (α, β και γ) και SW480 (d, e και f) κύτταρα που αναπτύσσονται σε γυάλινες καλυπτρίδες σε συρροή σε μια πλάκα έξι φρεατίων ιστοκαλλιέργειας χρωματίστηκαν με αντι-HV1 αντίσωμα και παρατηρήθηκαν από ένα Leica TCS μικροσκοπία SP5 συνεστιακή . Α και D, αντι-HV1 ανοσοφθορισμού (FITC, πράσινο). β και ε, DAPI λεκέ για να απεικονίσει τους πυρήνες (μπλε). γ και στ, εικόνες συγχωνεύονται είναι σύνθετα αντι-HV1 ανοσοφθορισμό και DAPI λεκέ. HV1 παρατηρείται σε μεμβράνη πλάσματος και ενδοκυτταρικές θέσεις στα υψηλά μεταστατικά κύτταρα SW620 (όπως υποδεικνύεται από βέλη), αλλά όχι στα ελάχιστα μεταστατικά κύτταρα SW480. D, η έκφραση της HV1 σε ΗΤ29, SW620 και SW480 κύτταρα, ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης HV1 διεξήχθη από siRNA που στοχεύει HV1 (ΗΤ29-σι, SW620-σι και SW480-σι).

Η

Η αναστολή της δραστηριότητας HV1 μειώνει την εισβολή και τη μετανάστευση σε εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

εισβολή και η μετανάστευση είναι δύο εξέχοντα χαρακτηριστικά της κακοήθειας του όγκου. Για να αξιολογηθεί η συνεισφορά του HV1 σε επεμβατικές και μεταναστευτικών δυναμικό σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς εισβολή και τη μετανάστευση. Πρώτον, εξετάσαμε την κινητική της μεταναστευτική ικανότητα SW620, SW480 και κύτταρα ΗΤ29. Σύκο. 4Α, Β και Γ έδειξε την κινητική μετανάστευση των SW620 (Εικ. 4Α), SW480 (Εικ. 4Β) και ΗΤ29 (Εικ. 4C) των κυττάρων. Μια τραυματίες μονοστιβάδα κυττάρων SW620 που επιτρέπεται για το κλείσιμο της πληγής μετά από 48 ώρες (Σχ. 4Α, α, β, γ, δ και ε). SW620 και ΗΤ29 (Εικ. 4C, α, β, γ, δ και ε) τα κύτταρα έκλεισε το τραύμα δραματικά γρηγορότερα από SW480 κύτταρα (Σχ. 4Β, α, β, γ, δ και ε). Για να τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης HV1 και αναστολή της δράσης της HV1, το siRNA που στοχεύει HV1 και μια τελική συγκέντρωση 100 μΜ ΖηΟ

2 [1], [2] χρησιμοποιήθηκαν, αντίστοιχα. Οι αποδόσεις του HV1 knock-down με siRNA σε SW620, SW480 και κύτταρα ΗΤ29 αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western, η οποία έδειξε την μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης HV1 κατόπιν siRNA knockdown στο SW620 και κύτταρα ΗΤ29 (Σχ. 3D). Καταστολές έκφρασης HV1 με siRNA (f, g, h, i και j στο Σχ. 4Α, Β και C) και δραστηριότητα HV1 με 100 μΜ ΖηΟ

2 (k, l, m, n και o στο Σχ. 4Α Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.