Αφηρημένο

Τα καρκινώματα σε συγκρότημα μικροπεριβάλλον που αποτελείται από πολλαπλές ξεχωριστές επιθηλιακών καταγωγές που περιβάλλεται από μια ποικιλία κυτταρικών τύπων στρωματικών. Κατανόηση αιτίες του καρκίνου απαιτεί την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ των κυτταρικών τύπων κατά την έναρξη της νόσου και μέσω της εξέλιξης. Γενετικά τροποποιημένα ποντικού (GEM) μοντέλα διευκολυνθεί ο μελλοντικός εξέταση των πρώιμων ογκογόνο γεγονότα, τα οποία δεν είναι δυνατόν σε ανθρώπους. Δεδομένου ότι οι περισσότεροι συμπαγείς όγκους λιμάνι εκτροπές στο δίκτυο RB, έχουμε αναπτύξει έναν επαγόμενο προσέγγιση GEM για τη δημιουργία και την αξιολόγηση της έναρξης καρκινώματος σε ένα ευρύ φάσμα των επιθηλιακών ιστών και των υποτύπων κατά την απενεργοποίηση της RB-μεσολάβηση καταστολή του όγκου (RB-TS). Το σύστημα επιτρέπει την ανεξάρτητη εκτίμηση των επιθηλιακών υποτύπων που εκφράζουν είτε κυτοκερατίνες (Κ) 18 ή 19. Με Cre-εξαρτώμενη έκφραση μιας πρωτεΐνης που αδρανοποιεί δεσπόζει RB και λειτουργικά περιττές πρωτεΐνες ρ107 και ρ130, μπορεί να ξεκινήσει νεοπλασία είτε Κ18 ή Κ19 κυττάρων που εκφράζουν πολυάριθμων ιστών. Από τη σχεδίαση, επειδή μόνο μία εκτροπή οδός κατασκευάστηκε, καρκινώματα αναπτύσσονται στοχαστικά μόνο μετά από μακρά λανθάνουσα κατάσταση. Ως εκ τούτου, το σύστημα αυτό, το οποίο επιτρέπει την έναρξη καρκίνωμα ειδικού τύπου κατευθύνεται κυττάρων, διευκολύνει περαιτέρω τον ορισμό των γεγονότων που μπορεί να προχωρήσει νεοπλάσματα σε επιθετικών καρκίνων μέσω μηχανικής, καρκινογόνο που προκαλείται και /ή αυθόρμητη εξέλιξη

Παράθεση:. Τραγούδι Υ , Gilbert D, O’Sullivan TN, Γιανγκ C, Παν W, Fathalizadeh A, et al. (2013) Καρκίνωμα Μύηση μέσω Rb Ογκοκατασταλτικής αδρανοποίηση: Ένα ευέλικτο προσέγγιση στα επιθηλιακά Δευτερεύων-εξαρτώμενου καρκίνου Κίνηση σε διάφορους ιστούς. PLoS ONE 8 (12): e80459. doi: 10.1371 /journal.pone.0080459

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 3 Οκτ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Δεκεμβρίου του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, στο πλαίσιο της συμβάσεως αριθ HHSN261200800001E, και εν μέρει από τις επιχορηγήσεις RO1-CA046283 από NCI και PC040619 από το Υπουργείο άμυνας, και του προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου στο TVD. YS υποστηρίχθηκε από το βραβείο μεταδιδακτορική εκπαίδευση (PC050306) από το Υπουργείο Άμυνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Το περιεχόμενο αυτής της δημοσίευσης δεν αντανακλά απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Τμήματος Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών, ούτε η αναφορά εμπορικών επωνυμιών, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

οι κακοήθεις καρκίνους εξελίσσονται μέσω μηχανισμών επιλεκτικής ανάπτυξης, επιβίωσης, και επεμβατική ιδιότητες σε ένα ευρύ μικροπεριβάλλον. Έτσι, οι καρκίνοι είναι ετερογενής με μια σύνθετη εκλογική πολλαπλών τύπων κυττάρων. Γενετικά ποντίκι (GEM) μοντέλα παρέχουν μια ισχυρή προσέγγιση για την αξιολόγηση και τις δύο σχέσεις αιτίου /αιτιατού και ευαισθησία κυτταρικό τύπο. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, έχει σημειωθεί πρόοδος στην ταυτοποίηση μοριακών ανωμαλιών που μπορεί να συμβάλει στην ογκογένεση, προσφέροντας έτσι τη διορατικότητα των πιθανών μηχανισμών συνάφειας και θεραπευτικών στόχων. Ωστόσο, δεδομένου ότι πολλές εκδηλώσεις έχουν σχεδιαστεί μαζί και συχνά δεν κινεί τη νόσο, σχετικά λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει την αιτιολογία της εξέλιξης του όγκου από την έναρξη μέχρι την εξέλιξη της νόσου σε προχωρημένο στάδιο. Εδώ, επιδιώξαμε να αναπτύξουν «GEM καρκίνο εκκινητή» μοντέλα που θα μπορούσαν να προκληθούν να κινήσει ογκογένεσης σε ευρεία ποικιλία επιθηλιακών ιστών και σε διακριτά διαμερίσματα υπότυπο για περαιτέρω χρήση στον καθορισμό των μηχανισμών ιστών και των κυττάρων-ειδικό για την εξέλιξη καρκίνωμα.

υποτύπους κυττάρων από ένα επιθήλιο μπορεί να χαρακτηριστεί από τα προφίλ έκφρασης ειδικά ζεύγη κυτοκερατίνης (Κ) [1] – [3]. Κερατίνες είναι κυτταροσκελετού ενδιάμεσο πρωτεΐνης νήματα συναρμολογούνται από ετεροδιμερείς υπομονάδες των όξινων βασικού τύπου ΙΙ (Κ1-Κ8 και Κ71-Κ80) πρωτεΐνες [4] τύπου Ι (Κ9-Κ28) και. Κ18, συνήθως σε συνδυασμό με Κ8, είναι η πρώτη κερατίνη που εκφράζεται στο στάδιο των οκτώ κυττάρων της ανάπτυξης ποντικού [5], [6], που ακολουθείται από Κ19 και Κ7 [7]. Ωστόσο, K19, το μικρότερο γνωστό όξινο κερατίνη, δεν έχει καμία γνωστή βασικού τύπου II συνεργάτη κερατίνη. Παρά το γεγονός ότι τόσο Κ18 και Κ19 εκφράζονται σε απλές επιθήλια, αυτοί εκφράζονται διαφορικά σε υποτύπους κάποιου επιθήλια (π.χ. K18 σε ομπρέλα κύτταρα και Κ19 στην βασική και ενδιάμεσα κύτταρα του ουροθηλίου [2], [3], [8]). Ως εκ τούτου, διακριτά πρότυπα έκφρασης κερατίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βάση για τη στόχευση εκδηλώσεις την έναρξη του όγκου σε συγκεκριμένες επιθηλιακά υποτύπους.

ρετινοβλάστωμα 1 (RB) είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού στο ευκαρυωτικό κυτταρικό κύκλο, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαφοροποίησης [ ,,,0],9], και η οδός RB διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση. Η ανώμαλη δραστηριότητα μονοπάτι RB, που προκύπτει από ατέλειες στο ίδιο το RB, CDKN2A, CCND1, ή CDK4, παρατηρείται στους περισσότερους ανθρώπινους καρκίνους στερεού [10]. Στις λίγες τύπους καρκίνου όπου νωρίς ανθρώπινο ιστό είναι συνήθως προσβάσιμες, όπως εκτροπές είναι συχνά παρόντες, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο στην έναρξη [11] – [15]. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, η πρώτη ένωση RB μονοπάτι εκτροπής είναι εμφανής σε πιο προχωρημένο καρκίνο, υποστηρίζοντας ένα ρόλο στην εξέλιξη [16]. Πράγματι, σχέσεις αιτίας και αποτελέσματος πιθανό να εξαρτάται από πολλαπλές μεταβλητές, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων και των ιστών της προέλευσης και της στοχαστικής τάξης του αιτιώδους γεγονότα, τονίζοντας την ανάγκη για συστήματα μοντέλο για να καθορίσει εύλογο ρόλους στην αιτιολογία της νόσου. Λόγω της λειτουργικής πλεονασμός μεταξύ των RB και τα μέλη ρ107 της οικογένειας του και ρ130 στους περισσότερους τύπους κυττάρων ποντικού [17] – [20], έχουμε χρησιμοποιήσει δεσπόζουσα πρωτεΐνη απενεργοποίησης, Τ

121, για την αδρανοποίηση RB καταστολής όγκου (RB-TS) στον ποντικό [21] – [25]. Τ

121 προέρχεται από το Ν-τερματικό 121 αμινοξέων ιό πιθήκου 40 (SV40) μεγάλο Τ αντιγόνο, η οποία εξελίχθηκε για την αδρανοποίηση του RB μεσολάβηση φρένο του κυτταρικού κύκλου. Όταν κατευθύνεται από συγκεκριμένους προωθητές ιστού σε διαγονιδιακά ποντίκια, Τ

121 είναι επαρκής για να κινήσει ογκογένεση σε προστάτη [26], του μαστού [27], των ωοθηκών [28] και χοριοειδές πλέγμα [29] επιθηλιακά κύτταρα, καθώς και σε κεντρικό νευρικό αστροκύτταρα συστήματος [30], [31]. Ο φαινότυπος έναρξη εξαρτάται από την Τ

121 RB /ρ107 /ρ130 θέση πρόσδεσης, όπως καταδεικνύεται από το σημείο μεταλλαξογένεση [32]. Σε κάθε περίπτωση που εξετάστηκε μέχρι τώρα, η έναρξη σχετίζεται με ανώμαλο πολλαπλασιασμό που συνοδεύεται από απόπτωση, και την εξέλιξη του όγκου έχει οδηγηθεί από μηχανικής ή /και στοχαστική εκτροπή του ειδικού σχετίζονται με τον καρκίνο μοριακό δίκτυα [28], [31], [33].

Εδώ, περιγράφουμε διαγονιδιακές σειρές ποντίκι στο οποίο RB-TS αδρανοποίηση μπορεί να προκληθεί είτε Κ19 ή Κ18-εκφράζουν επιθηλιακά υποτύπους σε Cre ανασυνδυαστάση-εξαρτώμενο τρόπο. Διαγονιδιακές σειρές καθιερώθηκαν στην οποία Cre-υπό όρους έκφραση της Τ

121 οδηγήθηκε κάτω cytokeratin18 ή 19 μεταγραφικό έλεγχο χρησιμοποιώντας βακτηριακού τεχνητού χρωμοσώματος (BAC) διαγονίδια που διατηρούν ενδογενή μοτίβα έκφρασης σε διάφορους ιστούς. Έτσι, ένα μόνο στέλεχος για κάθε υπότυπο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να οδηγήσει την έναρξη του καρκίνου του ιστού-ειδικά μέσω οργάνου-ειδική έκφραση της Cre μετά βλαστικής γραμμής ή σωματικών εισαγωγή ενός

Cre

διαγονιδίου. Με την επιλεκτική αδρανοποίηση του RB-TS σε K18- ή Κ19-κύτταρα που εκφράζουν, έχουμε αποδείξει την ευρεία χρησιμότητα αυτών των «καρκίνος-εμπνευστής» ποντίκια σε μηχανιστικές μελέτες της ανάπτυξης του καρκίνου και δείχνουν ρόλους για RB-TS αδρανοποίηση και επιθηλιακών υποτύπου εξειδίκευση σε νεοπλασματικά έναρξη στο πλαίσιο των πολυάριθμων επιθηλιακά όργανα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από φροντίδας των ζώων και της Επιτροπής Χρήση (ACUC) της UNC-Chapel Hill (Αριθμός Άδειας: 04-232.0), και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (Αριθμός Άδειας: 11-030) (NCI) -Frederick. Όλα τα ζώα σε αυτή τη μελέτη υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με τις «Κατευθυντήριες γραμμές για την ευθανασία των ποντικών και αρουραίων έμβρυα και νεογνά», όπως ορίζεται από την ACUC της UNC-Chapel Hill και NCI-Frederick να ελαχιστοποιήσει τον πόνο και τη δυστυχία.

Δημιουργία υποτύπου ειδικά κερατίνη-σκηνοθεσία BAC διαγονιδιακά ποντίκια

Ένα floxed eGFP σταματήσει Τ

121 κασέτας (κασέτα διαγονιδίου, Σχήμα 1Α) προήλθε από το MFT

121 κατασκεύασμα [34]. Τ

121 αποτελείται από τα πρώτα 121 αμινοξέα (αα) του μεγάλου αντιγόνου Τ SV 40 ακολουθούμενο από 11 παρερμηνεύσιμη αμινοξέα που προκύπτουν από μια διαγραφή 31 bp. Το διαγονίδιο δεν μπορεί να εκφράσει μικρό t αντιγόνο οφείλεται σε μια δεύτερη διαγραφή η οποία αφαιρεί αποδέκτη ματίσματος θέση του [35]. Τ

121 αδρανοποιεί RB και τα μέλη της οικογένειας ρ107 και ρ130 και δεν περιέχει την p53 και p300 αδρανοποίηση τομέα [36]. Η βιβλιοθήκη γενωμικού DNA RPCI-22 ποντικού υποβλήθηκε σε διαλογή με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών έχουν σχεδιαστεί για K18 (Krt1-18 στο χρωμόσωμα 15) και Κ19 (Krt1-19 στο χρωμόσωμα 11) μέσω της υπηρεσίας ελέγχου RPCI BAC (Roswell Park Cancer Institute, ΝΥ). Θετικοί κλώνοι χρησιμοποιούνται για recombineering-κατευθυνόμενη εισαγωγή [37], [38] της floxed eGFP-stop-Τ

121 κασέτες σε εξώνιο 1 κωδικόνια έναρξης των Κ18 και Κ19. BAC DNA καθαρίστηκε (MTR Scientific, Ijamsville, MD) και εγχύθηκαν σε γονιμοποιημένα ωάρια συλλέγονται από ένα σταυρό B6D2F1 (JAX Laboratory, Bar Harbor, Maine) σε συγκέντρωση 4 ng /ul χωρίς γραμμικοποίηση όπως περιγράφεται [39]. Με αποτέλεσμα και επόμενων γενεών διαγονιδιακά ποντίκια πιστοποιήθηκαν με PCR ενίσχυση ενός 215-bp χρησιμοποιώντας εκκινητές 5 ‘GAATCTTTGCAGCTAATGGACC 3’ και 5 ‘GCATCCCAGAAGCTCCAAAG 3’ και digit- ή αυτί που προέρχεται από γενωμικό DNA ως μήτρα. Το προφίλ ποδηλασία ήταν: 94 ° C, 2 λεπτά? που ακολουθείται από 35 κύκλους των 94 ° C, 20 δευτερόλεπτα? 62 ° C, 45 δευτερόλεπτα? 72 ° C, 45 δευτερόλεπτα? και μια τελική επώαση 72 ° C, 2 λεπτά. γραμμές του ποντικιού διατηρήθηκαν από το ζευγάρωμα με τα ποντίκια B6D2F1 άγριου τύπου και ως εκ τούτου ορίζονται ως

Β6? D2-Tg (K18GT

121) TVD

(

TgK18GT

121

) και

Β6? D2-Tg (K19GT

121) TVD

(

TgK19GT

121

)

Α.. διαγονιδιακή κασέτα: Μια κασέτα διακοπής eGFP ήταν περιστοιχίζεται από θέσεις ΙοχΡ και το Τ

121 γονίδιο τοποθετήθηκε προς τα κάτω. B. κερατίνη βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα (BAC) τρανσγονικά κατασκευάσματα: α διαγονιδιακή κασέτα (Α) εισήχθη ανοδικά της έναρξης ΑΤΟ κωδικόνιο στο εξόνιο 1 του Κ18 (. Που προέρχεται από το χρωμόσωμα ποντικού (CHR) 15) και του Κ19 (που προέρχεται από ποντικό Chr 11) στην ΠΑ, χρησιμοποιώντας recombineering. Η θέση εισαγωγής για την ΙοχΡ-eGFP-stop-ΙοχΡ-T

121 κασέτα υποδεικνύεται από μία διακεκομμένη «V». Αντιπροσωπευτικά γονίδια κατάντη της κερατίνης γονιδίων που αναφέρεται στις θέσεις. Μαύρες μπάρες δείχνουν εξόνια (Ε). Γ διαγονιδίου αριθμού αντιγράφων ανά διπλοειδή γονιδιώματος προσδιορίστηκε με qPCR.

Η

διαγονιδιακά αναπαραγωγής Στρατηγικές

TgK18GT

121

και

TgK19GT

121

ποντίκια διασταυρώθηκαν με

β-ακτίνης Cre

ποντίκια (FVB ή C57BL6 /NCr φόντο), και

TgK19GT

121

να

K19CreER

ποντίκια ( C57BL /6 υπόβαθρο, που παρέχονται από τον Δρ Guoqiang Gu στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt) [40] για τον προσδιορισμό της ικανότητα πυροδότησης όγκου κατά RB-TS αδρανοποίηση σε Κ19 και Κ18 υποτύπους.

διαγονιδιακή Αριθμός αντιγραφής Προσδιορισμός

ουράς γενωμικό DNA εκχυλίσθηκε χρησιμοποιώντας Qiagen DNeasy αιμοποιητικού και κιτ ιστών, και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αριθμούς αντιγράφου διαγονιδίου. ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν σε πλάκες 96 φρεατίων στον ανιχνευτή αλληλουχία ΑΒΙ 7500. 30 δείγματα ul περιλάμβανε 10 ul (50 ng) γονιδιωματικού DNA δείγματος και 20 μΙ μίγματος αντιδράσεως PCR. Η ενίσχυση ήταν με 10 λεπτά στους 94 ° C που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15 δευτερολέπτων στους 94 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Εκκινητές και αλληλουχίες ανιχνευτή για Τ

121 γονιδίου ήταν: προς τα εμπρός: 5 ‘CTT TGC AGC ΤΑΑ ΤΟΟ ACC TTC 3’, αντίστροφη: 5 ‘TGC CTT TCT CAT CAG AGG ΑΑΤ 3’, και ανιχνευτής: 5 ‘Fam TC CCC CAG GCA CTC CTT TCA AGA C Tamra 3 ‘. Οι ενδογενείς εκκινητές ελέγχου του γονιδίου της β-ακτίνης ήταν: προς τα εμπρός: 5 ‘CTG ΚΔ GAC GGC CAG GTC 3’, αντίστροφη: 5 «CAA GAA GGA ΑΓΓ CTG GAA Α.Ε.Ε. Α 3 ‘, και ανιχνευτής: 5’ Fam CA CTA TTG GCA ACG AGC GGT TCC G Tamra 3 ‘. Σχετικές διαφορές του αριθμού αντιγράφων του διαγονιδίου υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια πρότυπη μέθοδο dCt με μια γνωστή ποσότητα του πλασμιδίου ελέγχου.

Η ιστοπαθολογική εξέταση και Ανοσοσήμανση

Τα διαγονιδιακά ιστοί αποκόπηκαν στην υποδεικνυόμενη ηλικίες και σταθερά τη διάρκεια της νύχτας σε ουδέτερη 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, μεταφέρθηκαν σε 70% αιθανόλη, συνήθως υποβάλλονται σε επεξεργασία, και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Οι ιστοί τεμαχίσθηκαν για 10 διαδοχικές στρώσεις κατά διαστήματα 5 μm εκτός λεμφοειδείς ιστούς (4 μm) και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για ιστοπαθολογική εξέταση. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) και ανοσοφθορισμού (IF) αναλύσεις διεξήχθησαν επί τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Αντισώματα περιλαμβάνονται: αντι-Κ8 /18 (1:500, πολύκλωνα ινδικό χοιρίδιο, GP11, Progen Biotechnik, GmbH, Heidelberg, Germany), αντι-Κ19 (1:200, μονοκλωνικά κουνέλι, Epitomics, CA), αντι-Κ14 (1 :1000, κουνελιού πολυκλωνικό, pRB-155P, Covance), αντι-GFP (1:500, b-2, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Santa Cruz), αντι-SV40 Τ αντιγόνο (1:100, μονοκλωνικό ποντικού, DP02-200UG, Calbiochem ), και αντι-Ki-67 (1:500, κουνελιού πολυκλωνικό, 06-570, BD Pharmingen, San Diego, CA). Για διπλή χρώση IF, το πρώτο πρωτεύον αντίσωμα (Αντι-ΕΟΡΡ ή αντι-SV40 Τ αντιγόνο) επωάστηκε όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα (αντι-Κ19, αντι-Κ14, ή αντι-Κ18) επώαση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου . Μικτή Alexa φθόριο 488 και 594 (1:200 αραίωση, Life Technologies) υπηρέτησε ως δευτερογενή αντισώματα. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπια φωτός, ανοσοφθορισμό, ή Zeiss συνεστιακού. επίπεδα απόπτωσης ανιχνεύθηκαν σε τμήματα χρησιμοποιώντας το τερματικό άκρο επισήμανση nick (ΤΟΥΝΕΛ) δοκιμασία dUTP-βιοτίνη δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης μεσολάβηση (ApopTag υπεροξειδάσης

In Situ

απόπτωση Detection Kit, S7100 Millipore) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή [26]. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό Ki-67 θετικών κυττάρων, τυχαία 5-10 Ki-67-θετικά πεδία με την ίδια μεγέθυνση αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Zeiss, και Ki-67 θετικών και αρνητικών κύτταρα μετρήθηκαν με το χέρι. Θετικότητα υπολογίστηκε ως το μέσο ποσοστό των συνολικών κυττάρων.

Στατιστικές Αναλύσεις

Φοιτητής Mann-Whitney τεστ rank άθροισμα t ή πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των γονοτύπων και των ιστών. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Έκφραση διαγονιδίου αντικατοπτρίζει με ακρίβεια Επιθηλιακά ειδικότητα υποτύπου

Για να στοχεύσετε RB-TS αδρανοποίηση σε επιθηλιακά υποτύπους, που απασχολούνται ρύθμιση κερατίνη μέσα ΠΑ. για να οδηγήσει έκφραση διαγονιδίου υπό όρους. Μια Cre-υπό όρους ΙοχΡ-eGFP-stop-ΙοχΡ (LSL) T

121 κασέτα (Σχήμα 1Α) εισήχθη στο πρώτο εξόνιο είτε του Κ18 ή το γονίδιο Κ19 στο πλαίσιο των αντίστοιχων BACs για να δημιουργήσει

TgK18GT

121

και

TgK19GT

121

διαγονιδιακά ποντίκια (Εικόνα 1Β). Έτσι, eGFP εκφράστηκε υπό Κ18 ή Κ19 κανονισμού μέχρι την έκφραση /ενεργοποίηση της Cre, η οποία με τη μεσολάβηση

eGFP

διαγραφή και προκαλείται από Τ

121 έκφρασης. Δύο μετάδοση γραμμές ιδρυτής για κάθε κατασκεύασμα παράχθηκαν και χαρακτηρίστηκαν. Όπως εκτιμάται από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR, τα ποντίκια έτρεφε ένα αντίγραφο διαγονιδίου σε γραμμές

TgK19GT

121-34

και

-43,

και

TgK18GT

121-36

, και 3 αντίγραφα διαγονιδίου σε γραμμή

TgK18GT

121-34

(Σχήμα 1C).

για την ανίχνευση της ενδογενούς Κ19 και Κ18 της έκφρασης, και, συνεπώς, τα πρότυπα για την ακριβή ρύθμιση του διαγονιδίου, άγριου τύπου επιθηλιακά ιστών εξετάστηκαν από την IHC ή IF. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν [2], [3], [8], και οι δύο Κ19 και Κ18 ευρέως εκφράζεται σε μια ποικιλία ιστών επιθηλιακής ποντικού (Σχήμα S1 και Πίνακας S1).

TgK18GT

121

και

TgK19GT

121

eGFP έκφραση του διαγονιδίου οπτικοποιήθηκε σε ολόκληρη ιστούς χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού στερεοφωνικού (Stereo Discovery.V20, Carl Zeiss Meditec, Inc). Ισχυρή πράσινο φθορισμό παρατηρήθηκε σε ορισμένους ιστούς και των δύο γραμμών του

TgK19GT

121

ποντίκια (π.χ. έντερο, το στομάχι, την ουροδόχο κύστη, και της χοληδόχου κύστης), αλλά αδύναμη ή καθόλου πράσινο φθορισμό σε άλλες (π.χ. μαστικό αδένα, ωοθήκες, και το πάγκρεας, το σχήμα S2). Πολλούς ιστούς έδειξε ισχυρή πράσινο φθορισμό σε δύο γραμμές του

TgK18GT

121

ποντίκια (π.χ. έντερο, στομάχι, θύμο, μαστικού αδένα, των ωοθηκών, των σιελογόνων αδένων, της ουροδόχου κύστης και σπερματικού πόρου, επιδιδυμίδα, και της χοληδόχου κύστης), αλλά όχι στο πάγκρεας, πνεύμονα και ήπαρ (Σχήμα S3). Στις

TgK19GT

121

ποντίκια, ανοσοχρώση τομών ιστού έδειξε σταθερά ισχυρή και ευρεία έκφραση eGFP στο έντερο, στομάχι, η ουροδόχος κύστη, η χοληδόχος κύστη, και νεφρικής πυέλου επιθήλιο. Εύκολα ανιχνεύσιμη χρώση περιορίστηκε σε ένα μικρότερο ποσοστό των κυττάρων στον πνεύμονα, μαστικό αδένα, και του προστάτη (Σχήμα S4 και στον Πίνακα S1). Άλλοι ιστοί είχαν πολύ αδύναμη ή μη ανιχνεύσιμη έκφραση eGFP (Πίνακας S1). Σε

TgK18GT

121

ποντίκια, η έκφραση eGFP ήταν ευρέως διαδεδομένη στα περισσότερα Κ18-θετικά επιθηλιακών ιστών (Σχήμα S5 και τον πίνακα S1). Είναι σημαντικό ότι, με βάση την διπλή IF, eGFP ήταν συν-εκφράζεται με τις αντίστοιχες ενδογενείς keratins στο

TgK19GT

121

(Σχήμα S4) και

TgK18GT

121

ποντίκια (Σχήμα S5), αλλά εξαιρούνται από την Κ14 κύτταρα (Σχήμα S6). Ωστόσο, δεν είναι όλα τα θετικά κύτταρα Κ19 ή Κ18 εξέφρασε eGFP. Και οι δύο γραμμές του

TgK19GT

121

ποντίκια έδειξαν παρόμοια έκφραση eGFP. Οι ιστοί από

TgK18GT

121-34

ποντίκια έδειξαν εντονότερη χρώση eGFP σε σύγκριση με εκείνους από το

TgK18GT

121-36

ποντίκια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), πιθανώς λόγω της υψηλότερης αριθμό αντιγράφων διαγονιδίου σε γραμμή 34 (Σχήμα 1 C).

RB-TS Αδρανοποίηση επάγεται σε ειδικές Επιθηλιακά υπότυποι

Για να καθοριστεί εάν Τ

121 έκφραση θα μπορούσε να προκληθεί σε ένα ευρύ φάσμα επιθηλιακών ιστών με ειδικότητα υποτύπου και να αξιολογηθεί η επίδραση του RB-TS αδρανοποίηση, περάσαμε ημίζυγος διαγονιδιακών ποντικών από όλες τις γραμμές με διαγονιδιακά

β-ακτίνης Cre

ομόζυγα ποντίκια. Πιθανόν να οφείλεται σε ευρεία αδρανοποίησης RB-TS σε Κ19 εκφράζουν εμβρυϊκά κύτταρα (βλέπε παρακάτω), μερικές εμβρυονική θνησιμότητα παρατηρήθηκε σε

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια. Live-γεννημένος bi-διαγονιδιακών ποντικών ήταν υπο-εκπροσωπούνται σε σχέση με τους ελέγχους της ίδιας γέννας (34% έναντι 66% για το

TgK19GT

121-34

, 45% έναντι 55% για το

TgK19GT

121-43

, αντίστοιχα? Πίνακας S2), γεγονός που υποδηλώνει ότι RB λειτουργία στα κύτταρα Κ19 μπορεί να είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη. Στους επιβιώσαντες ποντικοί, σύμφωνα με το εύρος της έκφρασης ενδογενούς K19 (Εικόνα S1), Τ

121 έκφραση παρατηρήθηκε εύκολα σε μια ποικιλία ιστών πρώτης εκτιμάται σε ηλικία 2 μηνών (Σχήμα 2), ακόμη και αν η έκφραση eGFP ήταν χαμηλό ή κάτω από το επίπεδο IHC ανίχνευση σε ορισμένες από αυτούς τους ιστούς (π.χ. ωοθήκη, μαστικό αδένα και το πάγκρεας, τα σχήματα S2 και S4, και ο Πίνακας S1). Είναι σημαντικό ότι, όπως eGFP ήταν πιστά εκφράστηκε σε κύτταρα Κ19, Τ

121 εκφράστηκε επίσης σε Κ19-θετικά κύτταρα (δεν δείχνεται), αλλά εξαιρούνται από κύτταρα Κ14 (Εικόνα S6). Τ

121 επίπεδα έκφρασης ήταν συγκρίσιμα μεταξύ των

TgK19GT

121-34? β-ακτίνης Cre

και

TgK19GT

121-43? β-ακτίνης Cre

ποντίκια (δεν φαίνεται).

Ισχυρή καφέ χρώση δείχνει θετικά Τ

121 έκφρασης.

Η

Σε αντίθεση με

TgK19GT

121 ? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, οι δύο γραμμές του

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια ανέπτυξαν με φυσιολογική Μέντελ συχνότητες (δεν φαίνεται). Τ

121 ήταν ευρέως εκφράζεται σε Κ18 εκφράζοντας επιθήλιο ορισμένων ιστών από 2 μηνών

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια (π.χ. θύμος, μαστικού αδένα, και ωοθηκών), αλλά έδειξε περιορισμένη επαγωγή σε άλλες, αν και στα κατάλληλα κύτταρα (π.χ. έντερο, προστάτη και πάγκρεας? Σχήμα 3), ακόμη και αν η έκφραση eGFP ήταν πιο διαδεδομένη σε ορισμένες περιπτώσεις (Σχήματα S3 και S5, και ο Πίνακας S1). Είναι σημαντικό ότι, Τ

121 εκφράστηκε σε Κ18 θετικά κύτταρα (Σχήμα 3Β), αλλά εξαιρούνται από κύτταρα Κ14 (Εικόνα S6). Η ένταση του Τ

121 έκφρασης ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των

TgK18GT

121-34? β-ακτίνης Cre

και

TgK18GT

121-36? β-ακτίνης Cre

γραμμές (δεν φαίνεται), αν και η έκφραση eGFP ήταν υψηλότερη σε

TgK18GT

121 – 34

από

TgK18GT

121-36

ποντίκια (δεν δείχνεται) . Η παρατήρηση αυτή μπορεί να αντανακλά σωματικές Cre μεσολάβηση μείωση του αριθμού αντιγράφων από διαδοχική συστοιχία γονίδιο.

Α. Τ

121 έκφρασης από την IHC. Μαύρα βέλη δείχνουν Τ

121 θετικά κύτταρα. Κλίμακα bar = 50 μΜ. B. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού των Τ

121 ως πράσινο και ενδογενή Κ18 όπως το κόκκινο σε ιστούς εμφανίζεται ως συγχωνεύονται ομοεστιακό εικόνες. Λευκά βέλη δείχνουν εντερικά επιθηλιακά κύτταρα θετικά τόσο για ενδογενή Κ18 και Τ

121. . Γραμμή κλίμακας = 25 μΜ

Η

RB-TS αδρανοποίηση Προκαλεί Νεοπλασία

Σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (Σχήμα S7A), όλα τα

TgK19GT

121 – 43? β-ακτίνης Cre

ποντίκια ανέπτυξαν πολυεστιακή υπερπλαστικών αλλοιώσεων στις περισσότερες K19 θετικά επιθηλιακών ιστών [π.χ. παγκρέατος (παγκρεατική επιθήλιο πόρου), μαστικού αδένα, ωοθήκη (επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών, OSECs), του πνεύμονα βρογχιόλιο, ήπατος χολή ductule, της χοληδόχου κύστης, των νεφρών (νεφρική πύελο επιθηλιακά κύτταρα), την ουροδόχο κύστη, τον προστάτη, λεπτό έντερο, κόλον, στομάχου αδενικό foveolar κύτταρα? Σχήμα 4 και στον Πίνακα 1]. Αυτός ο φαινότυπος ήταν ταυτόχρονη με υψηλά ποσοστά πολλαπλασιασμού στα προσβεβλημένα κύτταρα (Σχήματα 5 και 6) σε σύγκριση με τους ιστούς αγρίου τύπου (σχήματα 6 και S8). Όπως και σε προηγούμενες εκθέσεις της περιορισμένης ιστούς [26], [27], [30], αυξημένο πολλαπλασιασμό στους ιστούς του

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια συνοδεύτηκε από μία σημαντική αύξηση της απόπτωσης (Εικόνα S9) σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών φυσικού τύπου (Εικόνα S10). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το RB είναι σημαντικό για την καταστολή της υπερπλασίας του K19 θετικά κύτταρα. Μερικά

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια ανέπτυξαν απειλητικές για τη ζωή διμερείς ή μονομερείς υδρονέφρωση, αρχίζοντας από ηλικία 2 μηνών (Σχήμα S11A). Η υδρονέφρωση ερμηνεύτηκε να είναι δευτερεύουσα σε σημειώνονται υπερπλασία του μεταβατικού επιθηλίου κυττάρων στη διασταύρωση της νεφρικής πυέλου και ουρητήρα που καταλήγει σε απόφραξη της εκροής ούρων από το νεφρό (Σχήμα S11A). Άλλα ποντίκια από τη γραμμή 34 έπρεπε να ευθανασία λόγω της διευρυμένης thymuses, η οποία οδήγησε σε απειλητική για τη ζωή του θώρακα πίεση, σε 7 μήνες της ηλικίας (Σχήμα S11B)

Παρατηρήθηκε υπερπλασία στους περισσότερους ιστούς (του πνεύμονα και του παχέος εντέρου.: υποδεικνύεται από τα μαύρα βέλη). Πολυεστιακή πορογενές υπερπλασία παρατηρήθηκε στο πάγκρεας, καθώς επίσης και ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία προστάτη ποντικού (mPIN) στον προστάτη, και υδρονέφρωση όπως υποδεικνύεται από λευκά βέλη στο νεφρό. Όλα τα δείγματα βάφτηκαν με Η &?. Ε

Η

Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με Ki-67 IHC (καφέ) σε ιστούς του 2 μηνών ποντικούς. Τα βέλη δείχνουν τα κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακά (OSECs) θετικά για Ki-67. μπαρ Κλίμακα = 50 μΜ.

Η

ποσοστά διάδοσης του παγκρέατος, του μαστικού αδένα, των ωοθηκών, του προστάτη (dorsolateral λοβού), και της ουροδόχου κύστης ήταν ποσοτικά σε τομές ιστών χρωματίστηκαν με Ki-67. * Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο WT (p & lt? 0.001)? #significantly διαφορετικές μεταξύ

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre και TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

(p = 0.007)? @ Σημαντικά διαφορετική μεταξύ

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

και WT (p = 0,043)

Η

Παρόμοια με

TgK19GT

121.? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, αδρανοποίηση του RB-TS σε Κ18-θετικά κύτταρα κυρίως οδήγησε στην υπερπλασία (Σχήμα 7 και Πίνακα 1), η οποία συσχετίζεται με Τ

121 έκφρασης σε αυτούς τους ιστούς (Σχήμα 3). Με την ευρεία επαγωγή από το

β-ακτίνης Cre

αλληλόμορφο, τόσο

TgK18GT

121 έως 34

και

TgK18GT

121-36

ποντίκια ανέπτυξαν σοβαρή θυμικά επιθηλιακά υπερπλασία και επακόλουθη λεμφική υπερπλασία (Πίνακας 1 και Σχήμα 7). Ανοσοχρώση ανέφεραν υψηλά Τ

121 έκφρασης στην Κ18 του φλοιού του θύμου αδένα επιθήλιο (Εικόνα S12B) που συνδέονται με την υψηλή πολλαπλασιασμό (με βάση το Ki-67 IHC) και την απόπτωση (TUNEL) τιμές (Σχήμα S12C). Επειδή αυτά τα ποντίκια σε κίνδυνο λόγω της θωρακικής πίεση απειλητική για τη ζωή από διευρυμένη θύμων (Σχήμα S12A) και απαιτείται ευθανασία με ηλικία των 6 μηνών,

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

φαινοτύπων σε άλλους ιστούς, δεν θα μπορούσε να εξεταστεί παρελθόν αυτή την ηλικία. Σε 1-6 μήνες της ηλικίας, ήπια υπερπλασία εστιακή παρατηρήθηκε στο μαστικό αδένα, επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών, του εντέρου και του προστάτη (Σχήμα 7 και Πίνακας 1), η οποία συσχετίζεται με αυξημένα ποσοστά πολλαπλασιασμού και αυξημένη απόπτωση (Σχήματα 6, 8, και S13 ). Για το μεγαλύτερο μέρος, σε σύγκριση με

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, η έκταση της υπερπλασίας ήταν λιγότερο διαδεδομένη στην

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, τα οποία συσχετίζονται με την περιορισμένη έκταση της Τ

121 έκφρασης σε αυτούς τους ιστούς. Τα υψηλά ποσοστά πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε τόσο στην Κ19 και Κ18 θετική μαστικών επιθήλια και επιθήλια επιφάνεια των ωοθηκών (38,6% έναντι 49,2% του μαζικού και 51,2% έναντι 34,2% στις ωοθήκες, αντίστοιχα, Σχήμα 6), το οποίο θα μπορούσε να εξηγηθεί από συν- έκφραση K19 και Κ18 σε αυτούς τους ιστούς (Σχήμα S1). Ωστόσο, αυτό δεν είναι η περίπτωση για άλλες τοποθεσίες συν-έκφραση (π.χ. προστάτη, Εικόνα 6), υποδηλώνοντας ότι η ιστο-ειδικότητα μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην βελτίωση της αποτελεσματικότητας ανασυνδυασμού Cre.

Υπερπλασία παρατηρήθηκε σε ορισμένους ιστούς (ωοθήκη και του προστάτη: υποδεικνύονται με βέλη). Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε 1-7 μήνες της ηλικίας, λόγω του θώρακα πίεση απειλητικές για τη ζωή που προκαλείται από διευρυμένη θύμους. Όλα τα δείγματα βάφτηκαν με Η &?. Ε

Η

Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε όπως στο σχήμα 5 σε ποντικούς ηλικίας 2 μήνα. Παρόμοια επίπεδα πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκαν στο λεπτό έντερο, κόλον, στομάχι και ωοθυλάκιο με εκείνη των ποντικών φυσικού τύπου που φαίνεται στο Σχήμα S8. Μαύρο βέλη δείχνουν Ki-67 θετικών κυττάρων. μπαρ Κλίμακα = 50 μΜ.

Η

Απενεργοποίηση του RB-TS σε Ενηλίκων-περιορισμένη K19 + κύτταρα είναι επαρκής για Tumor Έναρξη

Για να παρακάμψουν τις αναπτυξιακές ανωμαλίες που παρατηρήθηκαν σε

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια και να αποδειχθεί η χρησιμότητα αυτών των μοντέλων για τη μελέτη της ανάπτυξης του καρκίνου σε ενήλικες όργανα, περάσαμε

TgK19GT

121 – 34

με ταμοξιφαίνη επαγόμενο

K19CreER

ποντικούς [40]. Σε αντίθεση με

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια,

TgK19GT

121? K19CreER

ποντίκια γεννήθηκαν με την αναμενόμενη Μέντελ συχνότητες (δεν φαίνεται), υποστηρίζοντας περαιτέρω τον κρίσιμο ρόλο της RB-TS στο K19 θετικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ποντικιού . Οι ποντικοί προκλήθηκαν με ταμοξιφένη σε ηλικίας 6-8 εβδομάδων, και Τ

121 έκφρασης εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Τ

121 ήταν το πρώτο ευκόλως ανιχνεύσιμη σε χοληδόχο κύστη στις 2 εβδομάδες μετά την επαγωγή (δεν φαίνεται) και ήταν ευρέως διαδεδομένη σε διάφορους ιστούς σε 4-6 εβδομάδες μετά την επαγωγή (Σχήμα S14A). Επιπλέον, το Τ

121 συν-εκφράζεται με K19 (Εικόνα S14B). Συνεπής με την έκφραση του eGFP πριν Cre έκφρασης, και, χαρακτηριστικό της διαγονιδιακής έκφρασης, Τ

121 εκφράστηκε σε ένα υποσύνολο K19 θετικών κυττάρων σε ένα δεδομένο ιστό.

Για να καθοριστεί εάν RB-TS αδρανοποίηση προδιάθεση ενηλίκων K19-επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν στην ογκογένεση, ταμοξιφαίνη που προκαλείται

TgK19GT

121? K19CreER

ποντίκια ήταν ηλικίας. Συνεπής με τη γενική υπερπλασίας φαινότυπο που παρατηρείται σε

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, μια μεγάλη συχνότητα άτυπη υπερπλασία παρατηρήθηκε στους περισσότερους επιθηλιακών ιστών (π.χ. στομάχου αδενικό επιθήλιο 85,7% στους άνδρες και 90% στις γυναίκες, και του πνεύμονα βρογχιόλιο επιθήλιο 92,9% στους άνδρες και 90% στις γυναίκες? Πίνακας 2), σύμφωνα με αυξημένους ρυθμούς πολλαπλασιασμού (δεν φαίνεται). Ενώ μια χαμηλή συχνότητα κακοήθους νεοπλασίας συνέβη σε ορισμένους ιστούς (π.χ. αδενοκαρκίνωμα του στομάχου 13,3% στους άνδρες και 14,3% στις γυναίκες? Πίνακα 3 και το Σχήμα 9), χαμηλής βλάβες βαθμού παρόν στα περισσότερα όργανα έδειξαν ότι RB-TS αδρανοποίηση ήταν επαρκής για να κινήσει αλλά όχι για την πρόοδο της νόσου. Αυτό είναι συνεπές με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας σε μαστικούς [27], του προστάτη [26], χοριοειδές πλέγμα [29] και των ωοθηκών επιθήλιο [28], και εγκεφαλικά αστροκύτταρα [30], [31]. Παρόμοια με

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, νεφρική υδρονέφρωση παρατηρήθηκε επίσης σε 75% των ανδρών και 40% των γυναικών της επαγόμενης

TgK19GT

121? K19CreER

ποντίκια σε 9-16 μήνες μετά την επαγωγή (Πίνακας 2 ). Ωστόσο, σε αντίθεση με

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντίκια, η αιτία θανάτου ήταν απόφραξη της ουροδόχου κύστης λόγω της υψηλής έκφρασης του Κ19 σε ενδιάμεσα και βασικά κύτταρα του επιθηλίου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα S7B) και υψηλή συχνότητα ανάπτυξης αδενώματος στην κύστη (Πίνακας 3 και Σχήμα 9 ). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε νωρίτερα έναρξη της ουροδόχου κύστεως σε αδενώματος αρσενικά σε σύγκριση με τα θηλυκά (9 μήνες έναντι 14 μήνες μετά την επαγωγή? Πίνακας 3). Ο υποκείμενος μηχανισμός είναι άγνωστος.

Ουροποιητικού αδένωμα της ουροδόχου κύστης, του πνεύμονα αδένωμα, το αδενοκαρκίνωμα στομάχου, νεφρικού καρκινώματος, και το έντερο ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (τζιν), και mPIN βλάβες στον προστάτη εμφανίζονται σε χαμηλές και υψηλές μεγεθύνσεις. Ήπια υπερπλασία του παγκρεατικού πόρου παρατηρήθηκε στο πάγκρεας όπως υποδεικνύεται από τα βέλη. Όλα τα δείγματα χρωματίστηκαν με Η & amp?. Ε

Η

Η

Συζήτηση

Οι μελέτες που χρησιμοποιούν γονιδίου ιστο-ειδική στόχευση σε γενετικά μοντέλα ποντικών έχουν συμβάλει σε μεγάλο βαθμό στην κατανόηση του πολυπλοκότητα του καρκίνου και η μοριακή και κυτταρική βάση της ογκογένεσης. Εδώ περιγράφουμε την δημιουργία διαγονιδιακών μοντέλα ποντικών (

TgK18GT

121

και

TgK19GT

121

) με τη χρήση κερατίνης γονίδιο μεταγραφικά ρυθμιστικές αρχές να οδηγούν υπό όρους επιθηλιακά υποτύπου-ειδική απενεργοποίηση των Κβ TS. Υψηλή πιστότητα των αντίστοιχων προτύπων έκφρασης κερατίνη ειδικές επιτεύχθηκε με τη χρήση διαγονιδίων BAC που ήταν επίσης σχεδιασμένο για την αξιολόγηση των ιστών ενδιαφέροντος μέσω έκφρασης αναφοράς GFP. Έχουμε αποδείξει ότι αυτά τα μοντέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με συγκεκριμένα προγράμματα οδήγησης Cre να κινήσει ογκογένεση σε ένα ευρύ φάσμα των επιθηλιακών ιστών είτε Κ19 ή Κ18 εκφράζουν υποτύπους. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι η απενεργοποίηση RB-TS μπορεί πράγματι να προκαλέσει προ-καρκινικές βλάβες των κυττάρων αυτόνομα σε όλες τις ελεγχόμενες επιθηλιακών ιστών, συμπεριλαμβανομένης και της επαγωγής αυστηρά σε ενήλικες όργανα, και ότι η έγκαιρη νεοπλασία είναι ομοιόμορφα σχετίζεται με ανώμαλο πολλαπλασιασμό και την απόπτωση.

χρησιμοποιώντας υποτύπου-ειδική στόχευση, ένα ευρύ φάσμα των Κ18 ή Κ19 θετική υποτύπων εντός επιθηλιακών ιστών ήταν επιρρεπή σε νεοπλασματικά επαγωγή από RB-TS αδρανοποίηση. Ούτε

TgK18GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντικούς (μέχρι 6 μήνες) ούτε

TgK19GT

121? β-ακτίνης Cre

ποντικούς (μέχρι και 8 μήνες) που αναπτύχθηκε αδενώματα ή καρκινώματα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι η RB-TS αδρανοποίηση στις πληγείσες επιθήλια ξεκινά μόνο μια νεοπλασματική φαινότυπο. Με βάση προηγούμενες μελέτες εξέλιξης του όγκου σε Τ

121 που ενεργοποιείται κύτταρα, αναμένουμε ότι επιπλέον βλάβες σε συγκεκριμένα γονίδια του καρκίνου θα πρέπει να οδηγούν αυτό το πρώιμο νεοπλασματικών φαινοτύπου σε αντίστοιχα καρκίνους.