Αφηρημένο

Ιστορικό

Κανονική κυτταρική διαίρεση συντονίζεται από ένα διπολικό μιτωτικής ατράκτου, διασφαλίζοντας συμμετρική διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Τα καρκινικά κύτταρα, ωστόσο, περιστασιακά χωρίζουν σε τρία ή περισσότερες κατευθύνσεις. Τέτοιες πολυπολικό μιτώσεις έχουν προταθεί για τη δημιουργία της γενετικής ποικιλότητας και να συμβάλουν έτσι στην κλωνική εξέλιξη. Ωστόσο, αυτή η έννοια έχει λίγο επικυρωθεί πειραματικά.

Principal Εκτίμηση

χρωμόσωμα διαχωρισμού και το περιεχόμενο DNA σε θυγατρικά κύτταρα από πολυπολικό μιτώσεις αξιολογήθηκαν από πολυφωτονικών σταυρό τομής και in situ υβριδοποίηση σε καρκινικά κύτταρα και μη νεοπλαστικά μετασχηματισμένων κυττάρων. Η κατανομή του DNA που προκύπτει από πολυπολικό κυτταρική διαίρεση βρέθηκε να είναι εξαιρετικά μεταβλητή, με συχνές nullisomies στα θυγατρικά κύτταρα. Time-lapse απεικόνιση της Η2Β /GFP-επισημασμένο πολυπολικό μιτώσεις αποκάλυψε ότι ο χρόνος από την έναρξη της μετάφαση στην αρχή της ανάφαση παρατάθηκε και ότι οι πλάκες μετάφαση συχνά ενεργοποιημένη πολικότητα αρκετές φορές πριν μετάφαση-ανάφαση μετάβασης. Το πολυπολικό μετάφαση-ανάφαση μετάβαση συνοδεύτηκε από μια φυσιολογική μείωση των επιπέδων της κυτταρικής κυκλίνης Β, αλλά συνήθως συνέβησαν πριν από την ολοκλήρωση του κανονικού κύκλου δραστηριότητας separase. Κεντρομερική AURKB και ΜΑϋ2 εστίες παρατηρήθηκαν συχνά να παραμείνουν στα κεντρομερίδια του πολυπολικού χρωμοσώματα ana-τελόφασης, υποδεικνύοντας ότι πολυπολικό μιτώσεις ήταν σε θέση να παρακάμψει το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου με κάποια χρωματίδες αδελφή υπόλοιπα τα συνεχόμενα μετά την ανάφαση. Κατά συνέπεια, σημειώνοντας την κατανομή των επιμέρους χρωμοσωμάτων σε πολυπολικό κόρη πυρήνες αποκάλυψε μια υψηλή συχνότητα των γεγονότων μη αποσύνδεση, με αποτέλεσμα μια σχεδόν διωνυμική κατανομή της αδελφής χρωματίδες στα θυγατρικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

Η ικανότητα του πολυπολικού μιτώσεις να παρακάμψουν το σύστημα οδοφράγματος συναρμολόγηση ατράκτου συνήθως οδηγεί σε μια σχεδόν τυχαία κατανομή των χρωμοσωμάτων σε θυγατρικά κύτταρα. Ατράκτου πολυπολικότητα θα μπορούσε έτσι να είναι μια πολύ αποτελεσματική γεννήτρια γενετικά διαφορετικών κλώνων μειονότητας στην μετατραπεί κυτταρικούς πληθυσμούς

Παράθεση:. Gisselsson D, Hakanson U, Stoller P, Marti D, Jin Υ, Rosengren AH, et al. (2008) Όταν το γονιδίωμα Plays Dice: Καταστρατήγηση του άξονα Συνέλευσης Checkpoint και Εγγύς Τυχαία χρωμόσωμα Διαχωρισμός στον Καρκίνο πολυπολικό Μιτώσεις Cell. PLoS ONE 3 (4): e1871. doi: 10.1371 /journal.pone.0001871

Επιμέλεια: Cayetano Γκονζάλες, Ινστιτούτο για την Έρευνα στη Βιοϊατρική, Ισπανία

Ελήφθη: 22 Οκτ, 2007? Αποδεκτές: 22 Φεβρουαρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 2, Απριλίου 2008

Copyright: © 2008 Gisselsson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα των σουηδικών Παιδικό Καρκίνο, η σουηδική Εταιρεία Καρκίνου, το Συμβούλιο Έρευνας της Σουηδίας, το σουηδικό Ιατρικό Σύλλογο, το ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (Grant 3152A0-100431), τα Lund University Hospital Δωρεά ταμείων, το Ίδρυμα Gunnar Nilsson Καρκίνου, η ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου του Lund, το Ίδρυμα Crafoord, το Ίδρυμα Erik-Philip Sörensen, το Ίδρυμα Lundgren, και το Ίδρυμα γρασίδι. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στη διεξαγωγή της μελέτης, ή με τη συλλογή, ανάλυση, ερμηνεία των δεδομένων, ή για την προετοιμασία, την αναθεώρηση ή την έγκριση του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

σε φυσιολογικά κύτταρα, μιτωτική κυτταρική διαίρεση συνήθως συμβαίνει σε ένα διπολικό μόδας, με αποτέλεσμα σε δύο θυγατρικά κύτταρα με πανομοιότυπα πυρηνικά γονιδιώματα. Αυτή η περιορισμένη πολικότητας βασίζεται σε αυστηρό έλεγχο του κεντροσώματος κύκλου έτσι ώστε δεν υπάρχουν περισσότερες από δύο κεντροσωμάτια είναι ταυτόχρονα ενεργά κατά τη διάρκεια της μίτωσης [1], [2]. Ωστόσο, σε καρκινικά κύτταρα, ένας υπερβολικός αριθμός κεντροσωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε υπεράριθμα πόλους της ατράκτου που μπορεί να ενορχηστρώνουν ένα πολυπολικό μίτωση (ΜΜ), όπου το συμπλήρωμα χρωμόσωμα τραβιέται σε τρεις ή περισσότερες διευθύνσεις στο ανάφαση [3], [4]. Από τις πρώτες παρατηρήσεις του ΜΜ σε καρκινώματα από Hansemann το 1890 [5] έχουν πολυπολικό ατράκτους και centrosomal ανωμαλίες έχουν αναφερθεί σε πιο κοινούς καρκίνους [6] – [8]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι το MM μπορεί να είναι ένας ισχυρός δείκτης για δυσμενή πρόγνωση σε νόσο του όγκου [9] – [11]. Επιπλέον, διαταραχές στη κεντροσωμάτων αριθμό και τη δομή έχουν συνδεθεί με διαταραγμένη λειτουργία αρκετών μονοπατιών σηματοδότησης του κυτταρικού κύκλου, όπως απενεργοποίηση του TP53-, RB1- [12], [13], BRCA1- [14], [15], BRCA2 – [16], και CDKN1A-πρωτεΐνες [17], καθώς και AURKA υπερ-έκφραση [18]. Μέσω CCNE και PLK4, centrosomal διαταραχές έχουν επίσης συσχετιστεί με την έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες ιογενή, κυρίως υψηλού κινδύνου ιοί των θηλωμάτων [19], [20].

Λαμβάνοντας υπόψη το εκτενείς πληροφορίες που διατίθενται σήμερα για τις μοριακές αλλαγές που προκαλούν άξονα πολυπολικότητα στα καρκινικά κύτταρα, έχουν εκπληκτικά λίγο πειραματικά δεδομένα έχουν παρουσιαστεί σχετικά με τις συνέπειες της ατράκτου πολυπολικότητα σε μετασχηματισμένα ανθρώπινα κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν περιοριστεί σε

in vitro

μοντέλα μη νεοπλασματικά κύτταρα από αρουραίος, βιζόν, βόδι, και Rhesus πιθήκου στον οποίο polyploidized κύτταρα προχώρησε μέσω πολυπολικού κυτταρικής διαίρεσης [21] – [24]. Σε αυτά τα μοντέλα, αδελφές χρωματίδες διαχωρίζονται συνήθως μέσω ΜΜ σε απλοειδή σύνολα, με αποτέλεσμα euploid αριθμούς χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα. Αυτό euploid σχέδιο διαχωρισμού αποτέλεσε τη βάση για τις συζητήσεις σχετικά με το ρόλο των ΜΜ σε ανθρώπινους όγκους [25]. Θα δείξουμε τώρα ότι το χρωμόσωμα διαχωρισμός σε ΜΜ σε ανθρώπινα ανευπλοειδικές μετασχηματισμένα κύτταρα σπάνια, αν όχι ποτέ, οδηγεί σε διαχωρισμό στις αναλογίες που αναμένονται από τις αρχές της euploid διαχωρισμού. Μάλλον, ένας συνδυασμός μιας συνολικής ασύμμετρη κατανομή του DNA και την καταστρατήγηση του οδοφράγματος της συναρμολόγησης του άξονα οδηγεί σε μια σχεδόν τυχαία ανακατανομή του συμπληρώματος χρωμοσωμάτων.

Αποτελέσματα

Πειραματική διάταξη

Οι αρχές της euploid μοντέλο διαχωρισμού συνάγεται ότι υπάρχει μηχανισμός που ρυθμίζει αυστηρά μετακίνηση ενός απλοειδή σύνολο χρωμοσωμάτων σε θυγατρικά κύτταρα κατά τη μίτωση [24]. Η παρέκταση αυτής της θεωρίας στα τυπικά ανευπλοειδικών καρυότυποι παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα σημαίνει ότι κάθε σύνολο ομόλογων χρωμοσωμάτων απομονώνει σαν ο συνολικός αριθμός των χρωμοσωμάτων θα ήταν σε θέση να διαιρεθούν σε ξεχωριστές αναλογίες ολικού αριθμού. Έτσι, τουλάχιστον ένα αντίγραφο του κάθε χρωμοσώματος θα είναι παρούσα σε κάθε θυγατρικό κύτταρο, με εξαίρεση τα φυλετικά χρωμοσώματα. Σε μια κυτταρική διαίρεση με δύο αντίγραφα ενός συγκεκριμένου χρωμοσώματος (disomic) διαιρώντας σε τρεις κατευθύνσεις (τριπολικό), αυτό θα συναχθεί ένα μοτίβο διαχωρισμού μέσω της οποίας δύο θυγατρικά χρωμοσώματα διαχωρίζονται σε ένα από τα θυγατρικά κύτταρα, ενώ το ένα χρωμόσωμα κόρη διαχωρίζονται σε κάθε ένα από τα άλλα δύο θυγατρικά κύτταρα (

δηλαδή

ένα 2-1-1 διαχωρισμού). Οι άλλες πιθανές disomic /τριπολικό μοτίβα διαχωρισμού (4-0-0, 3-1-0 και 2-2-0) όλα τα παραπάνω θα οδηγήσει σε ένα τουλάχιστον nullisomic κόρη κυττάρων και ως εκ τούτου δεν θα ήταν συνεπής με διαχωρισμό σε απλοειδή σύνολα.

για να ελεγχθεί αν τα πρότυπα διαχωρισμού των μεμονωμένων χρωμοσωμάτων στο ανθρώπινο διαιρέσεις πολυπολικό κύτταρο ήταν σύμφωνα με τις αρχές της euploid διαχωρισμού, χρησιμοποιήσαμε δύο καλά μελετηθεί καρκινικές κυτταρικές γραμμές στις οποίες μιτωτική πολυπολικότητα έχει συσχετισθεί με χρωμοσωμική αστάθεια (CIN),

δηλαδή

WiT49 από ένα αναπλαστικό όγκου Wilms με 7% MM [10], [26] και SW480 από ορθοκολικό καρκίνωμα με 4% MM [27], [28]. Για να συγκριθούν καρκινικές κυτταρικές σειρές σε μη νεοπλαστικά αθανατοποιημένα κύτταρα, συμπεριλάβαμε επίσης το μετασχηματισθεί με αδενοϊό ανθρώπινη εμβρυϊκή κυτταρική γραμμή ΗΕΚ293 με ένα σύμπλοκο καρυότυπος και 1% MM [29]. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, cross-επισήμανση των πόλων του DNA και της ατράκτου με βήτα-τουμπουλίνης αντισώματα έδειξε ότι η συντριπτική πλειοψηφία των πολυπολικού κυτταρικές διαιρέσεις ήταν είτε τριπολικό ή tetrapolar, ενώ & lt? 10% των ΜΜ είχε μια σειρά υψηλότερη πολικότητα (Σχήμα 1Α-D ). Σε κάθε κυτταρική σειρά, οι κεντρομερίδια δύο χρωμοσώματα τα οποία είχαν έδειξε μικρή μεσοκυττάρια δομική ετερογένεια [10], [28] σημάνθηκαν με φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH): χρωμοσώματα 12 και 17 σε WiT49, Χ και 18 σε SW480, και 3 και 4 σε ΗΕΚ293, αντίστοιχα. Αυτή η επιλογή έγινε για να ελαχιστοποιηθεί η σύγχυση από ανάφαση γεφύρωσης και άλλων μιτωτικών ανωμαλιών που οδηγούν κυρίως σε ανωμαλίες της δομής των χρωμοσωμάτων. Στη συνέχεια ελέγχονται για την κατανομή αυτών των χρωμοσωμάτων κατά την ανάφαση στη διπολική μίτωση και ΜΜ.

Ένα χρωμοσώματος 12 ειδικές α-δορυφορικό ανιχνευτή (πράσινο) σε συνδυασμό με ανοσοφθορισμό για τη β τουμπουλίνης (κόκκινο) και DNA-αντιχρωματισμός με DAPI ( μπλε) δείχνει tetrasomic /διπολική κυτταρική διαίρεση στη μετάφαση /νωρίς ανάφαση (Α) και αργά ανάφαση (Β) και ένα disomic /τριπολικό κυτταρική διαίρεση σε μετάφαση (C) και τελόφασης (D)? το μοτίβο διαχωρισμός είναι 4-4 στο (Β) και 3-1-0 σε (D). Time-lapse μικροσκοπία του

Η2Β /GFP

επιμολυσμένα ΗΕΚ293 κύτταρα δείχνουν διαδοχή ενός τριπολικό διαμόρφωση μετάφαση (Ε? Πόλοι συμβολίζεται αγ) μέσω δύο διαδοχικών γεγονότων χρωμόσωμα διαχωρισμός σε τέσσερις κόρη πυρήνες και από μια διαμόρφωση tetrapolar μετάφαση (F) μέσα από ένα τριπολικό ana-τελόφασης σε τρεις πυρήνες κόρη φαίνεται από τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός συνεστιακού στοίβα εικόνα σε Τ = 40 λεπτά (Τ, ο χρόνος από την πρώτη εικόνα).

Η

Η euploid μοντέλο διαχωρισμού μπορεί να είναι αντέκρουσε

Συνολικά 15 490, 9 000 και 36 667 μιτώσεις ελέγχθηκαν σε SW480, WiT49 και ΗΕΚ293, αντίστοιχα, και τα κύτταρα ana-τελόφασης επιλέχθηκαν για την ανάλυση των χρωμοσωμάτων διαχωρισμού (Πίνακας 1). Για να ελέγξετε την ακρίβεια του συστήματος καθετήρα που προβλήθηκε πρώτη μορφολογικά κανονική διπολική ana-telophases, όπου θα μπορούσε να αναμένεται 1:01 διαχωρισμού. Όλες αυτές οι κυτταρικές διαιρέσεις (2 323, 1 350 και 5 500 κύτταρα σε WiT49, SW480 και ΗΕΚ293, αντίστοιχα) παρουσίασαν ίσο αριθμό των χρωμοσωμάτων στα δύο πόλους κόρη (Σχήμα 1Β). Δειγματοληψία πολυπολικού anaphases πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια, συμπεριλαμβανομένης της disomic κύτταρα SW480 και disomic καθώς tetrasomic κύτταρα σε WiT49 και ΗΕΚ293. Ο λόγος για αυτή την επιλογή ήταν ότι σε SW480 & lt? 10% των κυττάρων έδειξαν αριθμό αντιγράφων διαφορετικό από 2, αλλά σε WiT49 και ΗΕΚ293 περίπου το 20% των κυττάρων ήταν tetrasomic για τα επιλεγμένα χρωμοσώματα. Ένα σύνολο 158, 54, και 49 αναλύθηκαν πολυπολικό κύτταρα ανάφαση στην WiT49, SW480, και ΗΕΚ293, αντίστοιχα, βαθμολογήθηκαν. Με σπάνιες εξαιρέσεις οι πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις ως αποτέλεσμα την άνιση διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων από τα θυγατρικά κύτταρα (Εικόνα 1D). Συνοψίζοντας τα δεδομένα για disomic /τριπολικό διαιρέσεις, 2-1-1 διαχωρισμός ήταν πιο συχνή (43%), ακολουθούμενη από 3-1-0 (28%), 2-2-0 (23%), και 4-0- 0 (6%) διαχωρισμούς. Μεταξύ tetrasomic /διαιρέσεις τριπολικό κύτταρο, το 3-3-2 διαχωρισμός ήταν η πιο συχνή (22%), ακολουθούμενη από το σύστημα 4-3-1 (20%), και 4-2-2 (18%), ενώ οι άλλες συνθέσεις είχε συχνότητες & lt? 10%. Τέλος, για τις disomic /tetrapolar διαμορφώσεις, η διαμόρφωση 2-1-1-0 (42%) ήταν η πιο κοινή, ενώ στις tetrasomic /tetrapolar κύτταρα του 4-2-2-0, 3-2-2-1 και 2-2-2-2 διαμορφώσεις (κάθε κατά 19%) ήταν η πιο κοινή.

η

Έτσι, σε αντίθεση με την κανονική διπολική μίτωση, MM τυπικά σαν αποτέλεσμα την άνιση αριθμού αντιγράφων του σπούδασε χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα. Επιπλέον, οι περισσότεροι πολυπολικό μιτώσεις οδήγησε σε σημαντική αναλογία των κυττάρων με nullisomy σε τουλάχιστον ένα από τα θυγατρικά κύτταρα: 55% (78/143) των disomic /τριπολικού, 31% (26/85) των tetrasomic /τριπολικού, 92% ( 11/12) της disomic /tetrapolar, και 48% (10/21) των tetrasomic /tetrapolar μιτώσεις, αντίστοιχα. Αυτό αντικρούει την υπόθεση ότι πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις σε μετασχηματισμένες κυτταρικές διαιρέσεις μπορεί να διαμορφώνεται μετά τις euploid πρότυπα χρωμόσωμα διαχωρισμού βρίσκονται σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα [25].

περιεχόμενο DNA σε πολυπολικό θυγατρικά κύτταρα είναι εξαιρετικά μεταβλητή

για να ποσοτικοποιηθεί η συνολική κατανομή του DNA σε πολυπολικό ana-telophases, επιλέχθηκε WiT49 για περαιτέρω ανάλυση, διότι αυτή η κυτταρική γραμμή περιείχε την υψηλότερη συχνότητα των ΜΜ. Προηγούμενες μελέτες του DNA περιεχομένου σε μιτώσεις των καρκινικών κυττάρων έχουν διεξαχθεί με χρώση Feulgen σε ένα δισδιάστατο ρύθμιση [30]. Ωστόσο, ΜΜ έχουν συχνά μεγαλύτερο όγκο χρωματίνη από το κανονικό μιτώσεις με διάμετρο έως και 100 μπι και ένα περίπλοκο τρισδιάστατο δομή [31]. Για να είναι σε θέση να προσδιορίσει ποσοτικά το σχετικό DNA περιεχόμενο της κόρης ana-telophases υπό αυτές τις συνθήκες, θα εφαρμοστεί ποσοτικοποίηση φθορισμού DAPI-σημασμένο DNA από πολυφωτονικών σταυρό τομή μικροσκόπιο. Αυτή η τεχνική παρέχει υψηλή χωρική ανάλυση απεικόνισης σε ένα τρισδιάστατο σκηνικό, λόγω της μη γραμμικής γενιά σήμα στην εστίαση λέιζερ [32]. Η εντοπισμένη διέγερση μειώνει σημαντικά out-of-focus φθορισμού και φωτο-λεύκανση. Για να αντικειμενοποιεί την ανάλυση περαιτέρω, μια σειρά από διαφορετικά κατώτατα όρια για DAPI έντασης επιλέχθηκε, που εκτείνονται από κοντά στο πάτωμα θορύβου. Για κάθε τιμή κατωφλίου, ο λόγος της ποσότητας του φθορισμού σε κάθε περιοχή με εκείνη της πρώτης περιοχής υπολογίστηκε. Μία μέση περιεκτικότητα σχετική DNA για κάθε πόλο ana-τελόφασης υπολογίστηκε στη συνέχεια από το μέσο όρο των αποτελεσμάτων για όλα τα κατώτατα όρια (Σχήμα 2Α-C).

Ανακατασκευή τρισδιάστατο πολυφωτονικών εγκάρσια τομή εικόνες ενός διπολικού (Α) και ένα πολυπολικό (Β) τελόφασης κυττάρων σε WiT49 δείχνουν ασύμμετρη DNA-διανομή στην τελευταία διαμόρφωση. Ποσοτικοποίηση της σχετικής ποσότητας της χρωματίνης (C) σε διπολική (μαύρο), τριπολικό (κόκκινο) και tetrapolar (πράσινο) κύτταρα ana-τελόφασης επιβεβαιώνει ευρεία διακύμανση στο περιεχόμενο DNA του πολυπολικού θυγατρικών κυττάρων (άξονας Χ δείχνει σειρά κατάταξης σύμφωνα με DNA περιεχόμενο). Μέτρηση του ποσοστού των BrdU-θετικών διπολικής (μπλε) και πολυπολικό (κόκκινο) μιτωτικών κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επισήμανση (D) δείχνουν καθυστερημένη έξοδος από την μίτωση για πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις σε WiT49 και ΗΕΚ293 (ράβδοι σφάλματος υποδεικνύουν την τυπική απόκλιση). Ώρα, μεσολάβηση απεικόνιση των κυττάρων Η2Β /GFP ΗΕΚ293 δείχνουν μια παρατεταμένη μετάφασης-ανάφαση διάστημα, και μειωμένη ανάφαση-μεσόφαση διάστημα σε σύγκριση με πολυπολικό διπολική κυτταρικές διαιρέσεις (Ε)? μονόκλινα και δίκλινα αστερίσκοι δείχνουν σημαντικότητα σε & lt? 0.05 και & lt? 0,01 επίπεδα αντίστοιχα (Mann-Whitney U-test). Μία ανά λεπτό, ώρα, μεσολάβηση απεικόνισης (F) της 12ης πολυπολικού μιτώσεις, έκαστο των οποίων αντιστοιχεί σε μία ροή χρωματισμένα βέλη, παρουσιάζει συχνές μεταμορφώσεις πολικότητα (Ι = ενδιάμεση φάση, PM = προμεταφασικά, M2 = διπολική μετάφαση, Μ3 = τριπολικό μετάφαση, M4 = tetrapolar μετάφαση, Α = ανάφαση, Τ = τελόφασης). Η ποσοτικοποίηση της συνολικής έντασης σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού σε σχέση με centrosomal γάμμα τουμπουλίνης φθορισμού (G) δείχνει μια ισχυρή μείωση των επιπέδων separase σε τελόφασης σύγκριση με μετάφαση στη διπολική αλλά όχι σε πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις (ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση). Diplochromosomes (Η, βέλη) στο G-κλιμακωτά μερική μετάφασης εξαπλώνεται από WiT49.

Η

Η μέθοδος δοκιμάστηκε για πρώτη φορά στις 20 μεθανόλη-σταθερό μορφολογικά φυσιολογικό κόρη ana-telophases από διπολική κυτταρικές διαιρέσεις. Σε αυτές, η σχετική περιεκτικότητα του DNA των μεμονωμένων πόλων σύγκριση με το συνολικό ποσό του χρωμοσωμικού DNA σε κάθε κυτταρική διαίρεση ήταν περίπου 50%, που αντιστοιχεί καλά με το αναμενόμενο 1:01 διαχωρισμού. Στη συνέχεια αξιολογούνται πόλους κόρη σε τριπολικό και tetrapolar ana-telophases, αντίστοιχα. Εδώ η σχετική περιεκτικότητα DNA της κόρης ana-telophases έδειξε εκτεταμένη μεταβλητότητα, 18-46% της συνολικής περιεκτικότητας σε κυτταρικό DNA σε τριπολικό διαιρέσεις και 16 έως 34% σε tetrapolar διαιρέσεις. Το γεγονός ότι το DNA δεν διαχωρίζει σε σταθερές, επαναλαμβανόμενες αναλογίες υποστηρίζεται περαιτέρω ένα μη euploid μοντέλο του χρωμοσώματος διαχωρισμού και έδειξε υψηλό βαθμό αποδιοργάνωσης σε αυτές τις κυτταρικές διαιρέσεις.

πολυπολικό μετάφασης είναι παρατεταμένη και υφίσταται διακόπτες πολικότητας

Η φαινομενικά σύνθετη συμπεριφορά των χρωμοσωμάτων σε ΜΜ μας ώθησε να διερευνήσει τη χρονική πορεία σε πολυπολικό σε σύγκριση με διπολική μιτώσεις. Να αξιολογήσει το συνολικό χρόνο που δαπανάται σε μίτωση, πρέπει πρώτα να επισημανθεί χρωμοσωμάτων στα κύτταρα WiT49 και ΗΕΚ293 με βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU). Μετά διακοπή του κυτταρικού κύκλου με ορό ασιτίας, BrdU ενσωματώθηκε επί 1 ώρα σε μέσο χωρίς ορό πλούσια μετά την οποία τα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε δεύτερη ώρα. Η μιτωτική πισίνα κύτταρο που ήταν στη φάση S κατά τη διάρκεια της περιόδου σήμανσης στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με αντι-BrdU-αντισώματα. Μεταξύ των διπολικών μιτώσεις στις δύο κυτταρικές σειρές, η επισημασμένη πισίνα κύτταρο αποτελούσαν την πλειονότητα των διαιρούμενων κυττάρων μετά από 4 ώρες, ενώ πολύ λίγοι επισημασμένα μιτωτικά κύτταρα παρέμειναν μετά από 8 ώρες (Εικόνα 2D). Μεταξύ ΜΜ, το επισημασμένο κυτταρικό πληθυσμό κορυφώθηκε επίσης μετά από 4 ώρες, αλλά στη συνέχεια παρέμεινε για να αποτελούν ένα μεγάλο ποσοστό των διαιρούμενων κυττάρων, ακόμη και μετά από 8 ώρες. Αυτό έδειξε ότι MMs πήρε ουσιαστικά περισσότερο από διπολική κυτταρικές διαιρέσεις για να βγείτε από τη μίτωση.

Για να επικυρώσετε το εύρημα αυτό, έχουμε δημιουργήσει ένα σταθερό ΗΕΚ293 επιμόλυνσης που εκφράζουν μια ιστονών-2B /πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη σύντηξης, επιτρέποντας σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της κυτταρική διαίρεση (Ταινία S1) [33]. Στη συνέχεια ακολούθησαν 10 διπολική και 12 πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις από προμεταφασικά στην επόμενη ενδιάμεση φάση και μετρώνται τα διαστήματα από την έναρξη της μετάφασης σε μετάφαση-ανάφαση μετάβασης και από την μετάφαση-ανάφαση μετάβαση σε τελόφασης-ενδιάμεσης μετάβασης. Στη διπολική διαιρέσεις, ο μέσος χρόνος από την έναρξη της μετάφαση στην αρχή της ανάφαση ήταν 34 λεπτά (εύρος 23-49), ενώ στην MM ήταν εξαιρετικά μεταβλητή, αλλά συνολικά επεκταθεί σημαντικά (P & lt? 0,05? Mann-Whitney U test) με σημαίνει 91 min (εύρος 16-220 min? Σχήμα 2Ε). Αντίθετα, ο χρόνος από την έναρξη της ανάφασης μέχρι μεσόφαση ήταν ελαφρώς μικρότερη σε ΜΜ σε σχέση με διπολική μιτώσεις (μέση 23 λεπτά σε σύγκριση με 32 λεπτά? Ρ & lt? 0,01).

Από τις 12 πολυπολική μιτώσεις που παρακολουθήθηκαν, ένας δεν διαχωρίζει σε θυγατρικά κύτταρα, αλλά συνελήφθη στην τριπολικό μετάφαση και, στη συνέχεια, επανήλθε στην μεσόφαση (Σχήμα 2F). Από τις υπόλοιπες 11 κύτταρα, τέσσερις υποβλήθηκαν είτε τριπολικό ή tetrapolar μίτωση, χωρίς καμία αλλαγή στην διαμόρφωση. Τα άλλα επτά κύτταρα έδειξαν έναν ή περισσότερους διακόπτες πολικότητας. Ένα κύτταρο υποβλήθηκε χρωμόσωμα διαχωρισμό σε δύο διακριτά στάδια, πρώτα πηγαίνοντας από τριπολικό μετάφαση να τριπολικό ανάφαση στην οποία ένα από τα τρία πόλων πάλι χωρίζεται, συνολικά παράγουν τέσσερα κόρη πυρήνες (Σχήμα 1 Ε? Ταινία S2). Τα άλλα έξι κύτταρα μετατοπίζεται μεταξύ των διαφόρων μετάφαση διαμορφώσεις, πριν προβεί σε ανάφαση (Εικόνα 1F? Ταινίες S3 και S4). Από τα 11 κύτταρα που ακολουθήθηκαν από προμεταφασικά μέσω τελόφασης, τρεις δεν δείχνουν σαφή διαχωρισμό των ανάφαση πόλους, φαινομενικά περνώντας από μια πολύπλοκη ρύθμιση εταφάσεως άμεσα δύο τελόφασης (Ταινία S5), με το χρονικό διάστημα μεταξύ αυτών των σταδίων είναι 10 λεπτά ή λιγότερο. Επειδή η απεικόνιση time-lapse διεξήχθη μόνο σε δύο διαστάσεις, δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι τουλάχιστον κάποιες από τις παρατηρούμενες μετατοπίσεις πολικότητας οφείλονταν περιστροφές των μιτωτικών σχημάτων στην Ζ-επίπεδο, παρόλο που καμία τέτοια περιστροφές ήταν εμφανείς. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η δυναμική της MM ήταν σαφώς διαφορετική από διπολική μίτωση, συνήθως με μεγαλύτερη διάρκεια μετάφαση στην οποία θα μπορούσε να συμβεί διακόπτες πολικότητας.

Αδελφή-χρωματιδικές διαχωρισμός είναι μη συγχρονισμένη σε πολυπολικό μιτώσεις

η ακανόνιστη και γρήγορη μετάβαση από την μετάφαση να τελόφασης-μεσόφαση στο ΜΜ, και η απουσία σαφών διαμορφώσεις ανάφαση σε μερικά κύτταρα έδειξαν ότι η αδελφή-χρωματιδικές διαχωρισμός δεν θα μπορούσε να συμβεί σε ένα κανονικό τρόπο. Να παρακολουθεί την αδελφή διαχωρισμό χρωματίδων με περισσότερες λεπτομέρειες στο ΜΜ, χρησιμοποιήσαμε το κεντρομερική σύστημα καθετήρα που περιγράφεται παραπάνω και επιλεγμένα τέλη μετάφαση /αρχές κύτταρα ανάφαση για ανάλυση στην οποία τουλάχιστον ένα ζεύγος της αδελφής κεντρομερών στην /στις αρχές πλάκα ανάφαση μετάφαση είχε διαχωριστεί, όπως αποδεικνύεται με τη διασπασμένη FISH-σήματα σε ένα σχηματισμό διπλής dot. Σε αμφότερα WiT49 και ΗΕΚ293, η συντριπτική πλειοψηφία (97% και 98%, αντίστοιχα? Πίνακας 2) των κυττάρων με διπολική διαμόρφωση στην οποία ένα κεντρομερές είχε διαχωριστεί έδειξε διαχωρισμό επίσης των άλλων κεντρομεριδίου (s), υποδεικνύοντας μια καλά συντονισμένη μεταφάσεως -anaphase μετάβαση σε αυτά τα κύτταρα. Σε πολυπολικό κύτταρα σε WiT49 και ΗΕΚ293, που επιλέγονται με τα ίδια κριτήρια, λιγότερο από το ήμισυ των αναλύθηκαν κυτταρικές διαιρέσεις ομοίως συντονισμένες. Στην πραγματικότητα, το 59% και 55%, αντίστοιχα, αυτών των κυττάρων εμφάνισαν διαχωρισμό μόνο μερικές από τις αδελφή που ανιχνεύτηκε κεντρομεριδίων ενώ οι άλλοι παρέμειναν μη διαχωρισμένα (Σχήμα 3Α). Αδελφή χρωματιδίων σε ΜΜ ήταν έτσι συχνά έχουν συγχρονιστεί, σε σύγκριση με την κανονική κυτταρικές διαιρέσεις.

ανίχνευση FISH (Α) του χρωμοσώματος 17, κεντρομερίδιο (πράσινο) σε συνδυασμό με ανοσοφθορισμό για τη β τουμπουλίνης (κόκκινο) δείχνει τον διαχωρισμό των αδελφής κεντρομερών της ένα (βέλος) αλλά όχι της άλλης ομολόγου (κεφαλή βέλους). ανίχνευση ανοσοφθορισμού separase (πορτοκαλί) και βήτα τουμπουλίνης (πράσινο) δείχνει εντοπισμός του separase να άτρακτο πόλους σε μετάφαση (Β) και στις αρχές του ανάφαση (C) και χρώση ασθενή ένταση στην μέσου σώματος στο τελόφασης (D). Συν-εντοπισμό των separase (κόκκινο) και κεντροσωμάτια (γάμμα τουμπουλίνης σε πράσινο) παρατηρείται σε πρώιμα διπολική ανάφαση (Ε, πάνω αριστερά), ενώ αρκετές επιπλέον εστίες separase είναι παρούσες σε μία γειτονική tetrapolar νωρίς κύτταρο ανάφαση (Ε, κάτω δεξιά). Co-επισήμανση των separase (πορτοκαλί) και βήτα-τουμπουλίνης (πράσινο) επιβεβαιώνει αυτή τη διαπίστωση (F, tetrapolar στην επάνω αριστερή και τη διπολική στο κάτω δεξιά), και δείχνει εξάντληση των separase σε ένα διπολικό τελόφασης κυττάρων (G, δεξιά), ενώ αρκετές εστίες παραμένουν σε tetrapolar κύτταρο τελόφασης (G, αριστερά). Ανοσοφθορισμός για CCNB1 (πράσινο) και AURKA (κόκκινο) αποδίδει κυτταροπλασματική χρώση σε διπολική (H) και πολυπολικό (J) κύτταρα μετάφασης ενώ δεν χρώση παρατηρείται σε διπολική (Ι) και πολυπολικό (K) κύτταρα ανάφαση? AURKA βάφει τα pericentrosomal περιοχές, τόσο σε μετάφαση και ανάφαση. Ανοσοφθορισμό για τη β τουμπουλίνης (πράσινο) και AURKB (κόκκινο) δείχνει εντοπισμό του AURKB αποκλειστικά για κεντρομεριδίων σε διπολική (L) και πολυπολικό (Μ) μετάφαση, και αποκλειστικά με την άτρακτο midzone σε διπολική ανάφαση (Ν)? Σε αντίθεση, τα κύτταρα πολυπολικό ana-τελόφαση (O, P) εμφανίζουν AURKB στην midzone καθώς και σε διάφορα χρωμοσώματα, αναφέροντας αποτυχία να διαχωρίσει τις αδελφές χρωματίδες μερικών χρωμοσωμάτων (O, βέλος). Ανοσοφθορισμό για τη β τουμπουλίνης (πράσινο) και MAD2L1 (κόκκινο) δείχνει MAD2L1 εντοπισμού για να κεντρομεριδίων σε διπολική προμεταφασικά (Q)? σε διπολική ana-τελόφασης MAD2L1 εστίες είναι παρούσα μόνο σε χρωμοσώματα που δεν ενσωματώθηκαν στην μιτωτική διαδικασία (R, βέλος), ενώ, σε πολυπολικό ana-τελόφασης, πολλαπλές εστίες MAD2L1 υπάρχουν στα χρωμοσώματα (S).

Η

πολυπολικό μετάφαση-ανάφαση μετάβαση πραγματοποιείται από αδράχτι ολίσθηση οδοφράγματος του συγκροτήματος

Για να διερευνήσουν περαιτέρω μετάφαση-ανάφαση μετάβαση στο ΜΜ, ανιχνεύσαμε την ενδοκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης (separase) ESPL1 κατά τα διάφορα στάδια της κυτταρικής διαίρεσης . Σε κύτταρα θηλαστικών, αυτό πρωτεάση είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων με διάσπαση υπομονάδων kleisin cohesin, αλλά δεν είναι απαραίτητο για τις άλλες πτυχές της εξέλιξης μιτωτικών όπως κυτοκίνηση [34]. Ανθρώπινα separase κατοικεί κυρίως γύρω από τα κεντριόλια μέχρι αργά ανάφαση όταν αποικοδομείται από μια αυτοκαταλυτική διαδικασία που ενεργοποιείται από τη δική ενεργοποίηση της η ανάφαση-προώθηση συγκρότημα [35] – [38]. Ανοσοφθορισμού (IF) ανίχνευση με ένα αντίσωμα έναντι του κεντρικού τμήματος του separase (αμινοξέα 1200-1300) στη διπολική μιτώσεις από WiT49, ΗΕΚ293, και κυτταρικές γραμμές ελέγχου χωρίς ΜΜ (ινοβλάστες και κύτταρα νευροβλαστώματος CHP212) αναλόγως οδήγησε σε φθορισμό περιορίζεται στην άτρακτο πόλους σε μετάφαση και νωρίς ανάφαση (Εικόνα 3Β και C). Στη διπολική μετάφαση, υπήρχαν επίσης περιστασιακά εστίες επιπλέον separase βρίσκεται στη μιτωτική άτρακτο και επικάλυψη με τη θέση των χρωμοσωμάτων, παρόμοια με την κατανομή προηγουμένως αναφερθεί σε κύτταρα ζύμης που εκφράζουν μια πρωτεΐνη σύντηξης separase-GFP [39]. Στη διπολική κύτταρα τελόφασης, separase είχε εξαφανιστεί από αυτές τις θέσεις και θα μπορούσε να παρατηρηθεί μόνο σε μια μειοψηφία (1-10%) των κυττάρων που δείχνει ένα αχνό σήμα στην μέσου σώματος (Σχήμα 3D). Περαιτέρω ποσοτικοποίηση του ολικού κυτταρικού φθορισμού separase σε 30 διπολικό κυτταρικές διαιρέσεις από κάθε κυτταρική γραμμή έδειξε μία σημαντική μείωση στο τελόφασης, όπως αναμένεται από την κανονική ενεργοποίηση separase ακολουθούμενη από αυτοκαταλυτική αποδόμηση (Ρ & lt? 3 × 10

-5 σε όλες τις κυτταρικές σειρές, t-test? Σχήμα 2G). Separase συνέχεια ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά σε πολυπολικό μετάφαση και νωρίς ανάφαση κύτταρα από WiT49 και ΗΕΚ293 (21 και 15 κύτταρα ποσοτικοποιούνται, αντίστοιχα). Παρόμοια με διπολική διαιρέσεις, separase βρίσκεται σε κεντροσωμάτια σε αυτά τα τμήματα, αλλά το επιπλέον-centrosomal φθορισμού ήταν πιο έντονη από ό, τι στη διπολική τμήματα (Σχήμα 3Ε και F). Σε πλήρη αντίθεση με διπολική κύτταρα, πολυπολικό κύτταρα τελόφασης διατηρούνται τόσο centrosomal και ατράκτου που βρίσκεται separase, και το συνολικό φθορισμού separase δεν μειώθηκε σε αυτή τη φάση σε σύγκριση με μετάφαση (Σχήματα 2G και 3G? P = 0,83 και 0,37 σε WiT49 και ΗΕΚ293 αντίστοιχα ).

Η ελλιπής υποβάθμιση των separase στα κύτταρα τελόφασης έδειξαν ότι πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις ήταν σε θέση να παρακάμψει το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου (SAC) που αποτρέπει κανονικά μετάφαση-ανάφαση μετάβαση πριν από όλα κινητοχώρους συνδέονται με αντίθετους πόλους της ατράκτου. Έχει Έχει αναφερθεί ότι η SAC σε κύτταρα σπονδυλωτών δεν συλλαμβάνει την μιτωτική διαδικασία μόνιμα. Στην πραγματικότητα, τα κύτταρα μπορεί τελικά να οδηγηθούν μέσω της μίτωσης με μια από πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποικοδόμηση της κυκλίνης Β (CCNB) [40]. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτό το φαινόμενο θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί πολυπολικό μιτώσεις προχώρησε μέσω ανάφαση παρά την ελλιπή κύκλο separase, CCNB1 και CCNB2 ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα σε διμερές και πολυμερές επίπεδο μιτώσεις στην WiT49 και ΗΕΚ293. Τα κύτταρα εγκάρσια-επισημασμένου με aurora κινάση Α (AURKA) αντισωμάτων προκειμένου να εντοπίσει εύκολα διαιρούμενα κύτταρα. AURKA εντοπίζεται κυρίως στην περιοχή pericentriolar και εκφράζεται από την εποχή του κεντροσώματος η επικάλυψη στο G2 μέχρι μιτωτική έξοδο [41]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η συντριπτική πλειοψηφία των διπολικών προμεταφασικά και μεταφασικά κύτταρα ήταν έντονα θετικά για CCNB1 και CCNB2, ενώ η διπολική κύτταρα ανάφαση ήταν αρνητικό και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Η και εγώ? P & lt? 7 × 10

-15 για pro /μετάφαση έναντι ανάφαση? ακριβές τεστ του Fisher? 69-197 κύτταρα σκόραρε σε κάθε κυτταρική σειρά). Ομοίως, πολυπολικό προμεταφασικά και μεταφασικά κύτταρα ήταν θετικά, ενώ όλοι οι ανάφαση κύτταρα ήταν αρνητικά τόσο για CCNB1 και CCNB1 (Σχήμα 3J και Κ? P & lt? 2 × 10

-4? 20-55 κυττάρων σκόραρε).

για την περαιτέρω εξέταση της υπόθεσης που MMs θα μπορούσε να περάσει από μετάφαση στην ανάφαση με υποβάθμιση CCNB παρά την αποτυχία να ικανοποιήσει πλήρως το SAC, aurora κινάση Β (AURKB) και MAD2L1 ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό σε WiT49 διπολική και πολυπολικό μιτώσεις. Σε κανονικές μετάφαση, AURKB εντοπίζεται στο κεντρομεριδίων έως ότου ληφθεί bi-προσανατολισμένη κατάσχεση κινητοχώρους, μετά την οποία μετακομίζει στην midzone άξονα σε αναλύσεις και τελόφασης [41]. Δεν είναι γνωστό πώς ακριβώς αυτό μετεγκατάσταση ρυθμίζεται, αλλά έχει προταθεί ότι η ένταση μεταξύ δι-προσανατολισμένο αδελφές χρωματίδες απομονώνει AURKB στο εσωτερικό κεντρομερίδιο, περιορίζοντας έτσι τη δυνατότητα πρόσβασης αυτής της κινάσης σε υποστρώματα του και την ανακούφιση του οδοφράγματος συγκρότημα ατράκτου [42] . MAD2L1 τοποθετεί στα kinetochores των χρωμοσωμάτων που δεν έχουν ακόμη bi-προσανατολισμό, και οι καθυστερήσεις ανάφαση εμφάνιση με σύνδεση προς και αναστολής CDC20 έως ότου όλα τα χρωμοσώματα ευθυγραμμίζονται επί της πλάκας μετάφασης? μετά την κανονική μετάφαση-ανάφαση μετάβασης, MAD2L1 δεν είναι πλέον ανιχνεύσιμη στο κεντρομεριδίων [43]. Κατά συνέπεια, ανοσοφθορισμού για AURKB βάφονται τα κεντρομερική περιοχές όλων των χρωμοσωμάτων σε διμερές και πολυμερές επίπεδο WiT49 προμεταφασικά και μετάφαση κύτταρα (Σχήμα 3L και Μ) και την άτρακτο midzone στη συντριπτική πλειοψηφία (97%) των διπολικών κυττάρων ανάφαση (Σχήμα 3Ν). Αντίθετα, η πλειοψηφία (76%) του πολυπολικού κύτταρα ana-τελόφασης παρουσίασαν AURKB εστίες όχι μόνο στο midzone αλλά διατήρησε χρώση σε ορισμένα χρωμοσώματα (Σχήμα 3Ο και Ρ? P & lt? 1.1 × 10

-16 για τη διπολική εναντίον πολυπολικός ? 189 ana-telophases σκόραρε). Σε ορισμένα κύτταρα ανάφαση, οι εστίες AURKB ήταν σαφώς ορατή στα χρωμοσώματα με τα συνεχόμενα χρωματίδες αδελφή (Σχήμα 3Ο). Όπως ήταν αναμενόμενο, εστίες MAD2L1 εντοπίστηκαν στα χρωμοσώματα του σε διμερές και πολυμερές επίπεδο προμεταφασικά κύτταρα (Εικόνα 3ο τρίμηνο). Στη διπολική κύτταρα ana-τελόφασης παρατηρήθηκαν MAD2L1 εστίες μόνο σε σπάνιες κυτταρικές διαιρέσεις με το χρωμόσωμα που υστερούν (Σχήμα 3Κ) και η πλειοψηφία (97%) των μορφολογικά κανονική διπολική ana-telophases ήταν MAD2L1 αρνητικά. Αντίθετα, η πλειοψηφία (92%) του πολυπολικού ana-telophases έδειξε δύο ή περισσότερες MAD2L1 εστίες (Σχήμα 3δ? P & lt? 2 × 10

-17 για τη διπολική εναντίον πολυπολικός? 168 ana-telophases σκόραρε). Έτσι, MMS ήταν σε θέση να υποβαθμίσει CCNB και μίτωση έξοδο χωρίς παγκοσμίως ικανοποίηση της SAC, όπως αποδεικνύεται από τη διατήρηση των AURKB και MAD2L1 εστίες σε ορισμένα χρωμοσώματα ana-τελόφασης.

Δυνατότητα συναρμολόγησης ατράκτου οδοφράγματος ολίσθηση δεν περιορίζεται σε πολυπολικό μιτώσεις

για να διερευνηθεί κατά πόσο η ικανότητα να παρακάμψουν το SAC περιορίστηκε σε πολυπολικό κυτταρικές διαιρέσεις, εκθέσαμε ινοβλάστες φυσιολογικό και κυττάρων WiT49 στην άτρακτο διαταραχής παράγων κολσεμίδη για 18 ώρες, μετά την οποία τα κύτταρα βάφτηκαν με αντισώματα για να AURKA και CCNB1. Μετά την έκθεση κολκεμίδης των ινοβλαστών, η αναλογία των CCNB-θετικών κυττάρων μετάφασης να CCNB-αρνητικά κύτταρα ana-τελόφασης (Μ /Α) μετατοπιστεί δραματικά από 1,8 (133/74) σε 15,2 (214/14). Σε μη εκτεθειμένο WiT49 το M /A αναλογία ήταν 2,0 (528/258) για τη διπολική μιτώσεις, ενώ ήταν 5,9 (100/17) για το MM (P & lt? 2 × 10

-5 για τη διπολική εναντίον πολυπολικός). Η χαμηλότερη συχνότητα των συνθέσεων ana-τελόφασης μεταξύ πολυπολικό μιτώσεις είναι συνεπής με μετάφαση παρατείνεται σε σύγκριση με ανάφαση στο ΜΜ. Μετά την έκθεση κολκεμίδης, το M /A δείκτης αυξήθηκε και στις δύο διπολική και πολυπολική μιτώσεις WiT49, σε 50,3 (302/6) και 27,5 (110/4), αντίστοιχα, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ τους (P = 0,47). Έτσι, ένα μικρό κλάσμα (2-6%) των μιτώσεων και στις δύο ινοβλάστες και τα κύτταρα WiT49 ήταν σε θέση να παρακάμψει το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου ανεξάρτητα από την πολικότητα, υποδεικνύοντας ότι αυτό το σημείο ελέγχου μηχανισμός ολίσθηση δεν είναι μοναδική για πολυπολικός μιτώσεις.

Checkpoint ολίσθηση οδηγεί σε συχνές μη αποσύνδεση σε πολυπολικό μίτωση

Η διαπίστωση ότι πολυπολικό μιτώσεις αποχώρησε μίτωση χωρίς πλήρη ενεργοποίηση separase και διατήρησε χρωμοσωμικές MAD2L1- και AURKB εστίες προέβλεψε ότι τουλάχιστον ορισμένα χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα που προκύπτουν θα αποτελείται από την αδελφή χρωματίδες που παρέμεινε επισυνάπτεται στην κεντρομερίδια τους. Τέτοιες diplochromosomes περιγραφεί ως ένα χαρακτηριστικό των κυττάρων separase-διαγραφεί και έχουν ληφθεί ως απόδειξη ότι separase είναι απαραίτητη για την αδελφή χρωματιδικές διαχωρισμού [34]. [9].